一种卵巢癌早期诊断蛋白标志物四粘蛋白的纯化方法

专利名称：一种卵巢癌早期诊断蛋白标志物四粘蛋白的纯化方法
技术领域：
本发明属于医学和生物学领域，具体而言，本发明涉及一种卵巢癌早期诊断蛋白标志物四粘蛋白的纯化方法。
目前卵巢癌在我国妇科癌症中的发病率已由八十年代占第三位而上升为第一位。卵巢癌在全世界范围一直是妇科肿瘤中治愈率最低、死亡率最高的恶性肿瘤。卵巢癌在早期不易被发现，约有80％以上的卵巢癌初诊患者已到晚期(III期或IV期)，即使立刻手术，术后五年生存率也仅仅不到15％。由于卵巢癌的发病机理至今仍不请楚，因此很难采取有效的预防措施。为了降低卵巢癌的危害，关键仍在早期发现、早期治疗。目前临床上大多以糖链抗原125(CA125)单项指标作为卵巢癌的诊断指标。由于CA125也用于其它恶性肿瘤的检测，因此对卵巢癌并不是特异性指标；而且CA125只在浆液性卵巢癌患者血清中有升高，对非浆液性卵巢癌、尤其是粘液性卵巢癌则没有反应。CA125对早期卵巢癌也不敏感。
一种蛋白标志物四粘蛋白(Tetranectin，简称TN)在发生卵巢癌时会明显改变，可以解决目前临床上使用单项CA125作为卵巢癌诊断指标的不足。TN是一个分子量为68KD的四聚体蛋白质，等电点为5.8。卵巢癌病人血清TN水平的降低在卵巢癌处于I期或II期时就已经出现，而且这种降低与卵巢癌的分级呈正相关。卵巢癌病人血清TN水平的降低不但包括浆液性卵巢癌，也包括粘液性卵巢癌。制备TN检测试剂盒的关键是先制备TN纯品，然而目前国内外市场上尚无TN纯品可以购买。本发明的目的正是为了填补这一空白，提供了一种卵巢癌早期诊断蛋白标志物的纯化方法。在获得TN纯品后即可进行TN抗体制备和检测试剂盒的制作，应用于临床上提高卵巢癌的捡出率，特别是早期卵巢癌的检出率以及粘液性卵巢癌的检出率，以便能尽早采取有效的综合治疗方案，达到提高存活率、降低死亡率的目的。
因此，本发明的目的是提供了一种卵巢癌蛋白标志物四粘蛋白(Tetranectin，即TN)的纯化方法。
使用本发明方法获得的TN纯品可用于TN多克隆抗体或单克隆抗体的制备，以及ELISA(酶联免疫反应测定)试剂盒、RIA(放射免疫测定)试剂盒、化学发光试剂盒等多种试剂盒的制备。这些检测试剂盒可在临床上用于卵巢肿瘤的良、恶性的诊断，特别是早期卵巢癌的检测以及粘液性卵巢癌的检测，也可用于卵巢癌术后化疗的监测及预后评估。
本发明的上述目的是通过下列技术方案实施的用于制备一种卵巢癌早期诊断蛋白标志物四粘蛋白的分离纯化方法，其特征在于它由TN蛋白的粗分离、中度纯化和精细纯化三个主要步骤组成；它还包括了TN纯品的鉴定方法。
1.TN蛋白的粗分离工艺采用饱和硫酸铵沉淀法，它主要包括以下两个步骤a)饱和硫酸铵沉淀在血浆中加入等量的生理盐水，再按比例加入固体硫酸铵至50％饱和度；b)pH值调整待蛋白质析出后将溶液的pH调至5.8；待沉淀过程结束后进行离心，收集沉淀、透析除盐，即获得TN蛋白粗品。
2.TN蛋白的中度纯化工艺主要包括离子交换层析和亲和层析两个步骤，两种层析步骤的顺序可以调换。
a)离子交换层析根据TN蛋白所带电荷的特性，选用弱碱性阴离子交换层析。阴离子交换剂可选用游离基团为二乙基氨基乙基(DEAE)、介质为葡聚糖(Sephadex)、琼脂糖(Sepharose)或纤维素的商品(比如Pharmacia公司、Carl-Schloicher & Schuell公司、或上海有机化学研究所等)。本发明方法中采用型号为DEAE Sepharose Fast Flow的离子交换凝胶(Pharmacia公司产品)。按常规方法灌柱，与蛋白质纯化仪(Pharmacia公司产品或其它公司类似产品)相联。本发明方法中采用型号为AKDA系列Purifier 100蛋白质纯化仪(Pharmacia公司产品)。将步骤1所得TN蛋白粗品用适量层析缓冲液溶解后上柱进行层析，层析缓冲液可以是不同浓度、不同PH值的三羧甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐(PBS)缓冲液或其它缓冲液；本发明方法中选用的层析缓冲液为0.02M Tris-HCl缓冲液(PH7.2)。洗脱方法可采用NaCl梯度洗脱法或采用NaCl线性洗脱法；本发明方法中选用NaCl梯度洗法。流速一般为1～3ml/min；本发明方法中选用流速3ml/min。洗脱蛋白峰用紫外吸收法监测，各个蛋白峰的活性测定采用抗原-抗体反应法。收集具有活性的目标蛋白峰，经脱盐、浓缩后备用。
b)亲和层析根据TN蛋白与肝素(Heparin)和赖氨酸(Lysine)均具有良好亲和性的特性，可选用肝素亲和层析或赖氨酸亲和层析。亲和层析凝胶可以购买(比如Pharmacia公司、Bio-Rad公司等)。层析缓冲液可以是不同浓度、不同PH值的Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液或其它缓冲液。本发明方法中使用HeparinSepharose 6 Fast Flow或Lysine Sepharose 4B亲和层析凝胶(均为Pharmacia公司产品)，层析缓冲液分别为PH7.2的0.02M Tris-HCl缓冲液或PBS缓冲液，流速为1ml/min；洗脱方法、蛋白峰的监测和活性测定、目标蛋白峰的收集和处理方法均与步骤2a)相同。
3.TN蛋白的精细纯化工艺采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，它主要包括蛋白质变性、电泳、目标蛋白回收三个步骤a)蛋白质变性将从步骤2所获中度纯化的TN蛋白按常规进行变性，将TN蛋白由分子量为68KD的四聚体还原为17KD的单体。操作方法如下加入适量含有1％SDS(十二烷基磺酸钠)、1％巯基乙醇的磷酸缓冲液(0.01M，PH7.2)，在100℃加热2～5分钟后备用；b)电泳可选用国产的或进口的垂直板型电泳槽及配套的制胶模具，本发明方法中使用Bio-Rad公司的垂直板型电泳槽及配套的制胶模具。根据TN蛋白的分子量选用7.5％或10％浓度的聚丙烯酰胺凝胶；按常规配制凝胶缓冲液、电极缓冲液和样品缓冲液，并按常规制胶程序进行制胶、加样、电泳；电泳结束后按照常规进行取胶、固定、染色和脱色，在17KD的位置可见一条明显的条带，即为TN蛋白纯品；c)目标蛋白回收将17KD处的胶条小心切下，用国产的或进口的电洗脱仪进行蛋白洗脱，本发明方法中使用422 Electro-Eluter电洗脱仪(Bio-Rad公司)。电洗脱缓冲液为含有0.1％SDS的碳酸盐缓冲液(浓度为50mM)；操作程序包括碎胶、膜帽预处理、在洗脱管中加入凝胶颗粒及缓冲液、电洗脱等步骤。待电洗脱程序结束后，收集膜帽中的溶液即得到TN纯品。
4.TN纯品的鉴定包括如下内容a)蛋白含量鉴定采用Bradford法，主要步骤包括配制最终浓度为0.01％考马氏亮蓝、4.7％乙醇、和8.5％磷酸的蛋白试剂，并取适量该蛋白试剂与适量由步骤3c)所得TN纯品混合；配制标准蛋白质溶液，即配制5个不同浓度的牛血清白蛋白(BSA)溶液，分别加入适量蛋白试剂并混合；将上述所有溶液各取0.2ml加入微孔板各孔，反应结束后在紫外分光光度仪上于595nm处测定光吸收(OD)值；以BSA溶液的不同浓度值作为横坐标、相应的OD值作为纵坐标绘制标准曲线；由待测TN纯品溶液所测得的OD值，从标准曲线上查出它的蛋白含量。由本发明方法分离纯化得到的TN纯品的蛋白含量大于2.5mg/ml。
b)纯度和分子量鉴定采用SDS-PAGE凝胶电泳法，主要步骤包括按常规配制凝胶储液并制备10％凝胶；按常规配制样品缓冲液，并用该样品缓冲液配制由步骤3c)所得TN纯品，以及蛋白质标准品；根据TN蛋白的分子量，本发明方法中使用中分子量蛋白质标准品，其分子量范围为14～97KD；按常规方法进行电泳，包括配制电极缓冲液、将制备好的凝胶放入电泳槽、蛋白样品变性、加入样品、电泳；电泳过程结束后按常规进行取胶、染色、脱色。测量各样品在凝胶上的迁移距离，并按照公式计算出相对迁移率；以蛋白质标准品中各个蛋白质的分子量为纵坐标、相应的相对迁移率的对数为横坐标绘制标准曲线；根据待测TN蛋白所得到的相对迁移率，从标准曲线上查出它的分子量。由本发明方法分离纯化得到的还原型TN纯品的分子量为17KD，与文献相符。同时用凝胶成象仪对凝胶进行扫描和分析，即可得到待测TN纯品的纯度。由本发明方法分离纯化得到的TN纯品的蛋白纯度大于95％。
c)等电点(PI)鉴定采用聚丙烯酰胺等电聚焦电泳法，主要步骤包括用硅油处理玻璃板、预备灌胶槽、配制凝胶溶液、灌胶、加样(包括已知PI值的蛋白标准品、待测TN纯品)、电泳，以及凝胶的固定、染色和脱色；用已知PI值的蛋白为标准，根据它们经电泳后所处的位置，以PI值为纵坐标、在凝胶上的相应距离为横坐标绘制PI梯度曲线；根据待测TN蛋白经电泳后所处的位置，从梯度曲线上查出它的等电点。由本发明方法分离纯化得到的TN纯品的等电点为5.8，与文献相符。
d)活性鉴定采用抗原-抗体反应法，主要步骤包括用TN抗体包被微孔酶标板，抗体浓度为2ug/孔；加入不同浓度的待测TN蛋白纯品溶液，在37℃水浴保温60分钟；待抗原-抗体反应完成后，再加入适量用辣根过氧化物酶(HRP)标记的TN抗体进行酶联反应；TN抗体和HRP酶标TN抗体可以购买(比如，DAKO公司)；然后再进行显色、比色、和结果分析；根据不同浓度的待测TN蛋白纯品在450nm处测得的OD值得出待测TN蛋白纯品的活性。由本发明方法分离纯化得到的TN纯品的活性为浓度为2.4ng/ml的TN纯品即具有与2ug TN抗体发生明显抗原-抗体反应的活性。
e)特异性鉴定采用Western-Blot法，主要步骤包括SDS-PAGE凝胶电泳的基本操作与步骤4b)基本相同，注意加样时在同一块凝胶上按加样顺序做一份重复加样；配制电转移缓冲液，将电泳凝胶与孔径为0.45um的硝酸纤维素膜(NC膜)、Whatman泸纸(规格3mm)一起制作成“凝胶三明治”；将“凝胶三明治”置入盛有电转移缓冲液的电泳槽内进行电泳；电泳完毕将一半NC膜直接染色以显示蛋白区带；另一半带有重复加样的NC膜经缓冲液冲洗、牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭后，置于稀释的TN抗体溶液中缓慢摇动2小时；再加入适量HRP酶标第二抗体，继续反应2小时；NC膜经冲洗、显色后与直接染色的那一半NC膜进行对照，即可得知待测TN样品的特异性。由本发明方法分离纯化得到的TN纯品经Western-Blot法鉴定在17KD位置与TN抗体有明显的特异结合区带。
本发明方法与已有的方法相比较具有以下优点1.在TN蛋白粗品分离时采用的饱和硫酸铵沉淀工艺中，增加了PH值调整的操作步骤，使得目标蛋白TN在其等电点(PH5.8)时具有最小的溶解度，因此能够比较完全地沉淀下来。国外文献中、也是一般的饱和硫酸铵沉淀操作步骤中只考虑所加入饱和硫酸铵的百分比，而往往忽略了反应体系的PH值与目标蛋白等电点之间的差距。本发明方法克服了这一缺点，有效地防止了目标蛋白的丢失，具有较高的回收率；2.本发明方法比现有技术中的方法更加方便。在TN蛋白中度纯化工艺的亲和层析工艺中采用了肝素亲和层析和赖氨酸亲和层析，代替了现有文献中采用的血纤溶蛋白溶酶原K4环亲和层析所带来的繁琐和不便。因为血纤溶蛋白溶酶原K4环亲和层析介质必须自行制备，而肝素亲和层析和赖氨酸亲和层析介质是可以购买的，(比如Phamacia公司)；3.本发明增加了精细纯化步骤，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳提高了TN纯品的纯度，克服了用现有技术获得的TN纯品的纯度不够高的缺点，使得可以保证在使用该TN纯品去制备抗体时，能够获得特异性高的抗体，从而降低ELISA检测方法中可能存在的非特异性反应的影响，提高检测试剂盒的特异性和准确性。
下面用实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数。
实施例一一种卵巢癌蛋白标志物四粘蛋白纯化方法用于制备一种卵巢癌早期诊断蛋白标志物四粘蛋白的分离纯化方法，其特征在于它由TN蛋白的粗分离、中度纯化和精细纯化三个主要步骤组成。
1.TN蛋白的粗分离工艺采用一步饱和硫酸铵沉淀法，它主要包括以下两个步骤(1)饱和硫酸铵沉淀取50ml人血浆，尼龙网过泸后加入等量生理盐水，混匀；再加入31.3g固体硫酸铵至50％饱和度；于4℃在磁力搅拌器上旋转1小时；(2)PH值调整待蛋白质析出后用4N盐酸将溶液的PH调至5.8，继续于4℃在磁力搅拌器上旋转1小时；待沉淀过程结束后于4℃在12000rmp离心30分钟，收集沉淀；用0.02M磷酸缓冲液(PH7.2)溶解沉淀，装透析袋于4℃透析除盐，即获得TN蛋白粗品。
2.TN蛋白的中度纯化工艺主要包括DEAE离子交换层析和赖氨酸(Lysine)亲和层析两个步骤，仪器选用型号为“AKDA系列Purifier 100”的蛋白质纯化仪(Pharmacia公司产品)。
(1)DEAE离子交换层析选择离子交换凝胶选用型号为DEAE Sepharose Fast Flow的弱碱性离子交换凝胶(Pharmacia公司产品)；层析柱规格2.6×40cm；配制层析缓冲液0.02M Tris-HCl缓冲液(PH7.2)，1M NaCl溶液；洗脱方法采用NaCl梯度洗脱法；操作步骤如下a)按常规灌柱方法将DEAE离子交换凝胶灌入层析柱；b)将离子交换层析柱、样品收集器与蛋白质纯化仪相联；c)用0.02M Tris-HCl缓冲液稀释由步骤1(2)获得的TN蛋白粗品，按常规上样方法上样，上样量为15ml；d)用UHICRN V400软件编程，自动控制层析过程，包括NaCl梯度洗脱的控制和蛋白峰的紫外吸收监测，流速为3ml/min，样品收集2ml/管；e)用ELISA法测定各个蛋白峰的活性，收集具有TN活性的蛋白峰，装透析袋，透析脱盐、浓缩后备用。
(2)赖氨酸亲和层析选择亲和凝胶选用型号为Lysine Sepharose 4B d1亲和层析凝胶(Pharmacia公司产品)；层析柱规格1.6×40cm；配制层析缓冲液0.02M磷酸盐缓冲液(PH7.2)，1M NaCl溶液；洗脱方法采用NaCl梯度洗脱法；操作步骤如下a)按常规灌柱方法将Lysine亲和层析凝胶灌入层析柱；b)将亲和层析柱、样品收集器与蛋白质纯化仪相联；c)用0.02M磷酸盐缓冲液稀释由步骤2(1)经DEAE离子交换层析柱纯化获得的TN蛋白制品，按常规加样方法上样，上样量为5ml；d)用UHICRN V400软件编程，自动控制层析过程，包括NaCl梯度洗脱的控制和蛋白峰的紫外吸收监测，流速为1ml/min，样品收集1ml/管；e)同步骤2(1)e)。
3.TN蛋白的精细纯化工艺采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，它主要包括蛋白质变性、电泳、目标蛋白回收三个步骤
(1)蛋白质变性配制含2％SDS、2％巯基乙醇的磷酸缓冲液(0.02M，PH7.2)；取该缓冲液0.5ml，加入从步骤2(2)所获的中度纯化TN蛋白0.5ml，混匀；在100℃水浴中加热3分钟后备用，此时TN蛋白的浓度为5ug/ul；(2)电泳电泳槽为垂直板型电泳槽，仪器使用Bio-Rad公司电泳仪，操作步骤如下A.配制磷酸缓冲液(0.2M，PH7.2)取0.2M磷酸二氢钠溶液280ml，加入0.2M磷酸氢二钠溶液720ml，混匀后将PH调至7.2；B.配制凝胶储液丙烯酰胺(Acr)30g、亚甲基双丙烯酰胺(Bis)0.8g、蒸馏水100ml；C.配制样品缓冲液取十二烷基硫酸钠(SDS)100mg、巯基乙醇0.1ml、甘油1ml、溴酚篮2mg、磷酸缓冲液0.5ml，加蒸馏水至10ml；D.配制凝胶缓冲液称取SDS 0.2g，加磷酸缓冲液100ml；E.配制电极缓冲液称取SDS 1.0g，加磷酸缓冲液500ml，加蒸馏水至1000ml；；F.配制染色液称取0.25g考马斯亮蓝R-250，加入454ml 50％甲醇和46ml冰乙酸；G.配制脱色液将50ml甲醇、75ml冰乙酸与875ml蒸馏水混合。
H.蛋白质分子量标准品的选择选用中分子量蛋白质标准品(Bio-Rad产品)，分子量范围14～97KD；I.样品孔模板(梳子)规格为2×10mm；J.操作步骤如下a)10％凝胶制备取凝胶储液6.67ml，加入凝胶缓冲液10ml、1％TENED(四甲基乙二胺)2ml、蒸馏水1.23ml，该混合液需要脱气10分钟；加入新鲜配制的10％过硫酸铵0.1ml；混匀后立即加到凝胶板模具中，聚合作用约需30分钟完成；b)样品的制备将变性后的TN蛋白制品和蛋白质标准品分别与等量样品缓冲液混合，备用；c)加样拔去梳子，用电极缓冲液冲洗凝胶样品孔，每孔加样20ul；d)电泳接通电源，将电流调至50～80mA，待样品中的蓝色染料迁移至距凝胶下端约1cm处，停止电泳。e)染色和脱色按照常规进行取胶、固定、染色和脱色，在17KD的位置可见一条明显的条带，即为TN蛋白纯品；(3)目标蛋白回收将17KD处的胶条小心切下，用422 Electro-Eluter电洗脱仪(Bio-Rad公司)进行目标蛋白的洗脱回收。主要操作步骤如下a)配制电洗脱缓冲液(50mM，PH9.4的碳酸盐缓冲液)取0.1mM碳酸钠溶液10ml，加入0.1mM碳酸氢钠溶液40ml，与蒸馏水50ml混匀；b)碎胶用眼科尖镊子将切下的胶条小心夹碎，使之成为1mm大小的凝胶颗粒；c)膜帽预处理膜帽使用前需在电洗脱缓冲液中浸泡1小时；d)洗脱管安装在膜帽中加满电洗脱缓冲液，并将洗脱管平移安装于膜帽上；e)电洗脱将凝胶颗粒和适量电洗脱缓冲液放入洗脱管，洗脱管插孔，将洗脱装置放入电泳槽，接通电源进行电洗脱，恒流5～6小时。f)蛋白回收待电洗脱程序结束后，回收电洗脱溶液即可获得TN纯品。
实施例二一种卵巢癌蛋白标志物(Tetranectin，四粘蛋白，TN)纯化方法用于制备一种卵巢癌早期诊断蛋白标志物(Tetranectin，四粘蛋白，TN)的分离纯化方法，其特征在于它由TN蛋白的粗分离、中度纯化和精细纯化三个主要步骤组成。
1.TN蛋白的粗分离工艺采用两步饱和硫酸铵沉淀法，它主要包括以下两个步骤(1)两步饱和硫酸铵沉淀a)第一步取50ml人血浆，尼龙网过泸后加入等量生理盐水；混匀后先加入22.8g固体硫酸铵至30％饱和度；于4℃在磁力搅拌器上旋转1小时；于4℃每分钟12000转离心30分钟，收集上清液；b)第二步再加入13.1g固体硫酸铵至50％饱和度；于4℃在磁力搅拌器上旋转半小时；(2)PH值调整与实施例一步骤1(2)相同。
2.TN蛋白的中度纯化工艺主要包括肝素(Heparin)亲和层析和DEAE离子交换层析两个步骤。仪器选用“AKDA系列Purifier 100”蛋白质纯化仪(Pharmacia公司)。
(1)肝素亲和层析选择亲和凝胶选用Heparin Sepharose 6 Fast Flow亲和层析凝胶(Pharmacia公司产品)；层析柱规格1.6×40cm；配制层析缓冲液0.02M Tris-HCl缓冲液(PH7.2)，1M NaCl溶液；洗脱方法采用NaCl梯度洗脱法；操作步骤如下a)按常规灌柱方法将Heparin亲和层析凝胶灌入层析柱；b)将亲和层析柱、样品收集器与蛋白质纯化仪相联；c)用0.02M Tris-HCl缓冲液稀释由步骤1(2)获得的TN蛋白粗品，按常规上样方法上样，上样量为5ml；d)与实施例一步骤2(2)d相同；e)与实施例一步骤2(2)e)相同。
(2)DEAE离子交换层析选择离子交换凝胶选用型号为DEAE Sepharose Fast Flow的离子交换凝胶(Pharmacia公司产品)；层析柱规格2.6×40cm；配制层析缓冲液0.02M Tris-HCl缓冲液(PH7.2)，1M NaCl溶液；洗脱方法采用NaCl梯度洗脱法；操作步骤如下a)按常规灌柱方法将DEAE离子交换凝胶灌入层析柱；b)将离子交换层析柱、样品收集器与蛋白质纯化仪相联；c)用0.02M Tris-HCl缓冲液稀释由步骤2(1)经过Heparin亲和层析柱纯化获得的TN蛋白制品，按常规上样方法上样，上样量为15ml；d)与实施例一步骤2(1)d)相同；e)与实施例一步骤2(1)e)相同。
3.TN蛋白的精细纯化工艺采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，它主要包括蛋白质变性、电泳、目标蛋白回收三个步骤电泳槽采用垂直板型电泳槽仪器，使用Bio-Rad公司电泳仪。
(1)蛋白质变性与实施例一步骤3(1)相同；(2)电泳电泳槽采用垂直板型电泳槽仪器，使用Bio-Rad公司电泳仪。
A.配制三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液(0.1M，PH7.2)取0.2M Tris溶液50ml，加入0.2M盐酸溶液22.5ml，加蒸馏水至100ml，混匀后将PH调至7.2；B.配制样品缓冲液取十二烷基磺酸钠(SDS)100mg、巯基乙醇0.1ml、甘油1ml、溴酚蓝2mg、Tris-HCl缓冲液0.5ml，加蒸馏水至10ml；C.配制凝胶缓冲液称取SDS 0.2g，加Tris-HCl缓冲液100ml；D.配制电极缓冲液称取SDS 1.0g，加Tris-HCl缓冲液500ml，加蒸馏水至1000ml；；E.配制凝胶储液、染色液和脱色液的配方分别与实施例一步骤3(2)b)、3(2)f)、3(2)g)相同；F.蛋白质分子量标准品的选择与实施例一步骤3(2)H相同；G.样品孔模板(梳子)规格为4×10mm；H.操作步骤如下a)7.5％凝胶制备取凝胶储液5.0ml，加入凝胶缓冲液10ml、1％TENED(四甲基乙二胺)2ml、蒸馏水3.0ml，该混合液需要脱气10分钟；加入新鲜配制的10％过硫酸铵0.1ml；混匀后立即加到凝胶板模具中，聚合作用约需40分钟完成；b)样品的制备与实施例一步骤3(2)Jb)相同；c)加样拔去梳子，用电极缓冲液冲洗凝胶样品孔，每孔加样40ul；d)电泳过程及染色、脱色程序分别与实施例一3(2)Jd)和3(2)Je)相同。按照常规进行取胶、固定、染色和脱色，在17KD的位置可见一条明显的条带，即为TN蛋白纯品；(3)目标蛋白回收操作与实施例一步骤3(3)相同。
实施例三一种卵巢癌蛋白标志物(Tetranectin，四粘蛋白，TN)纯品鉴定方法应用本发明方法从人血浆中制备的一种卵巢癌早期诊断蛋白标志物(Tetranectin，四粘蛋白，TN)纯品，其鉴定步骤包括如下内容1.蛋白含量鉴定采用Bradford法，主要步骤包括(1)配制蛋白试剂称取100mg考马氏亮蓝G-250，溶于50ml 95％乙醇，加入100ml 85％磷酸，用蒸馏水将溶液稀释至1000ml，配制成最终浓度为0.01％考马氏亮蓝、4.7％(w/v)乙醇、和8.5％(w/v)磷酸的蛋白试剂；(2)配制待测TN纯品样品取10ul经应用本发明方法获得的TN纯品，用蛋白试剂稀释至1ml，备用；(3)配制标准蛋白质溶液即配制5个不同浓度的牛血清白蛋白(BSA)溶液(BSA标准品购自Bio-Rad公司)，它们的浓度是80ug/ml、40ug/ml、20ug/ml、10ug/ml、5ug/ml；(4)紫外检测将上述所有溶液各取0.2ml加入微孔板各孔，每种溶液均取平行双孔，在紫外分光光度仪上于595nm处测定光吸收(OD)值；(5)计算结果以BSA溶液的不同浓度值作为横坐标、相应的双孔OD平均值作为纵坐标绘制标准曲线求出待测TN纯品溶液所测得的双孔OD平均值，从标准曲线上查出它的蛋白含量为28.5ug/ml；乘以稀释倍数100，计算结果为TN纯品的蛋白含量为2.85mg/ml。
2.纯度和分子量鉴定采用SDS-PAGE凝胶电泳法，仪器选用Bio-Rad公司电泳仪，电泳槽为垂直板型电泳槽。主要步骤包括(1)配制磷酸缓冲液(0.2M，PH7.2)取0.2M磷酸二氢钠溶液280ml，加入0.2M磷酸氢二钠溶液720ml，混匀后将PH调至7.2；(2)配制凝胶储液丙烯酰胺(Acr)30g、亚甲基双丙烯酰胺(Bis)0.8g、蒸馏水100ml；(3)用磷酸缓冲液配制下列溶液a)样品缓冲液取十二烷基磺酸钠(SDS)100mg、巯基乙醇0.1ml、甘油1ml、溴酚蓝2mg、磷酸缓冲液0.5ml，加蒸馏水至10ml；b)凝胶缓冲液称取SDS 0.2g，加磷酸缓冲液100ml；
c)电极缓冲液称取SDS 1.0g，加磷酸缓冲液500ml，加蒸馏水至1000ml；；d)配制染色液称取0.25g考马斯亮蓝R-250，加入454ml 50％甲醇和46ml冰乙酸；e)配制脱色液将50ml甲醇、75ml冰乙酸与875ml蒸馏水混合。
样品孔模板(梳子)规格为0.5×0.75mm；(4)操作方法如下a)10％凝胶制备取凝胶储液6.67ml，加入凝胶缓冲液10ml、1％TENED(四甲基乙二胺)2ml、蒸馏水1.23ml；该混合液脱气10分钟后，加入新鲜配制的10％过硫酸铵0.1ml；混匀后立即加到凝胶板模具中，约经30分钟完成凝胶聚合；b)待测样品的制备将TN蛋白纯品用磷酸缓冲液稀释至浓度约为2ug/ul的待测样品溶液，取25ul，加入25ul样品缓冲液混合，备用；c)蛋白质标准品的制备中分子量蛋白质标准品购自Bio-Rad公司(分子量范围14～97KD)；取10ul，加入10ul样品缓冲液混合，备用；d)蛋白质变性将由步骤b)制备的TN蛋白纯品待测溶液和步骤c)制备的蛋白质标准品溶液均在100℃水浴中加热3分钟；e)加样将制备好的凝胶放入电泳槽，加满电极缓冲液，拔去梳子，用电极缓冲液冲洗凝胶样品孔后，每孔加样20ul；f)电泳接通电源，将电流调至50～80mA，待样品中的蓝色染料迁移至距凝胶下端约1cm处，停止电泳g)染色和脱色按照常规进行取胶、染色和脱色，在17KD的位置可见一条明显的条带，即为TN蛋白纯品；(5)分子量的计算测量蛋白质标准品中各个蛋白质在凝胶上的迁移距离，并按照公式计算出相对迁移率；以蛋白质标准品中各个蛋白质的分子量为纵坐标、相应的相对迁移率的对数为横坐标绘制标准曲线；测量待测TN蛋白纯品的相对迁移率，从标准曲线上查出它的分子量为17KD，与文献相符。
(6)纯度的计算用凝胶成象仪对凝胶进行扫描和分析，得到的结果为由本发明方法分离纯化得到的TN纯品的纯度为96.5％。
3.等电点(PI)鉴定采用聚丙烯酰胺等电聚焦电泳法，选用水冷式平板电泳槽，主要步骤包括(1)玻璃板处理在凝胶制备玻璃板(厚度3mm)的一侧用纱布涂上一层薄薄的防水硅油，放置晾干；(2)预备灌胶槽将冷却糟调至水平，铺上泸纸，依次放置玻璃板、塑料间隔模具框、涂有硅油的玻璃板；然后用夹子夹紧，即制成9×9×0.05cm3的灌胶槽；(3)配制溶液a)30％单体储液29.1g丙烯酰胺(Acr)和0.9g亚甲基双丙烯酰胺(Bis)，用蒸馏水定容至100ml，用棕色瓶在4℃保存备用；b)电极液1M磷酸为酸性电极液，1M氧化钠为碱性电极液；c)两性电解质和标准蛋白液(已知PI的标准蛋白混合液，PI范围3.5～9.3)均购自Bio-Rad公司；d)固定液蒸馏水配制35％甲醇-10％三氯乙酸-3.5％磺基水杨酸；e)染色液蒸馏水配制0.1％考马斯亮蓝R250-35％乙醇-10％乙酸；f)脱色液；蒸馏水配制25％乙醇-10％乙酸；g)保存液蒸馏水配制2％甘油-35％乙醇-10％乙酸；(4)灌胶a)凝胶配制取30％单体储液2.0ml、两性电解质0.6ml、蒸馏水5.4ml，混合后脱气10分钟，再加入TEMED 8ul、10％过硫酸铵50ul，迅速混匀；b)灌胶即刻将混匀的凝胶溶液灌入灌胶槽，防止气泡产生，约1小时后凝胶聚合；(5)加样(包括已知PI值的蛋白标准品、待测TN纯品)a)小心取下玻璃板和塑料间隔模具框；b)取两条泸纸条(1×10cm)分别浸透酸性电极液和碱性电极液，并分别铺在凝胶的正、负两极；c)将浸渍过蛋白标准品的加样纸(5×5mm)放在凝胶的中间，将浸渍过待测TN纯品的加样纸(5×5mm)放在偏正极的位置；(6)电泳a)压好电极板，加满电极液，盖上安全罩，接通冷凝水，打开电源；b)恒压(60V)15分钟后改为恒流(8mA)，待电压升至550～580(V)时改为恒压(550V)30分钟；c)关电源，打开安全罩，取出加样纸，再盖上安全罩，将电压调至580V继续电泳约120分钟；d)待电流下降接近于零时，结束电泳；(7)凝胶的固定、染色和脱色a)将凝胶用固定液固定约4小时，b)用脱色液清洗1小时，c)用染色液染色30分钟，d)用脱色液脱色2小时，e)用保存液漂洗10分钟；(8)蛋白质PI的测定用已知PI值的蛋白为标准，根据它们经电泳后所处的位置，以PI值为纵坐标、相应距离为横坐标绘制PI梯度曲线；根据待测TN蛋白经电泳后所处的位置，从梯度曲线上查出它的等电点。由本发明方法分离纯化得到的TN纯品的等电点为5.8，与文献相符。
4.活性鉴定采用抗原-抗体反应法，主要步骤包括(1)配制溶液a)清洗液用0.2M PBS(PH7.4)配制0.05％吐温20溶液(20X)，使用时用蒸馏水稀释成1X清洗液；b)底物溶液磷磷-柠檬酸缓冲液(PH5.0)配制的3％过氧化氢溶液；c)显色液浓度为0.1mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)甲醇溶液d)反应终止液2M硫酸；(2)加抗体在微孔酶标板的各孔中加入TN抗体100ul，抗体浓度为2ug/孔；(3)加抗原加入不同浓度的待测TN蛋白纯品溶液各100ul，在37℃水浴保温60分钟；(4)酶联反应待抗原-抗体反应完成后，用清洗液洗板4次，每次3分钟；加入用辣根过氧化物酶(HRP)标记的TN抗体100ul进行酶联反应，在37℃水浴保温60分钟；用清洗液重复洗板4次，每次3分钟；(5)显色反应每孔依次加入底物溶液、显色液各50ul，在37℃水浴保温10分钟；再加入50ul反应终止液结束反应；(6)结果分析；根据不同浓度的待测TN蛋白纯品在450nm处测得的OD值即可得判断它们的活性。由本发明方法分离纯化得到的TN纯品的活性为浓度为2.4ng/ml的TN纯品即具有与2ug TN抗体发生明显抗原-抗体反应的活性。
5.特异性鉴定采用Western-Blot法，主要步骤包括(1)SDS-PAGE凝胶电泳的制备基本操作与步骤2基本相同，注意加样时在同一块凝胶上按加样顺序做一份重复加样；(2)配制溶液a)电转移缓冲液25mM Tris-192mM甘氨酸-20％(V/V)甲醇溶液，PH8.3；b)TBS缓冲液25mM Tris-HCl，0.5M氯化钠溶液，PH7.5；c)TBST缓冲液TBS缓冲液加0.05％吐温20；d)CBS缓冲液0.1M碳酸氢钠-1.0M氯化镁，PH9.8；e)底物溶液3mg氯化四唑硝基蓝(NBT)，1.5mg溴氯吲哚甲苯胺盐(BCIP)溶于170ul DMSO中，彻底溶解后，用CBS缓冲液稀释至10ml；(3)制作“凝胶三明治”将电泳凝胶与孔径为0.45um的硝酸纤维素膜(NC膜)、Whatman滤纸(规格3mm)一起制作成“凝胶三明治”，注意防止气泡产生；(4)电泳将“凝胶三明治”置入盛有电转移缓冲液的电泳槽内，NC膜面向阳极进行电泳，100mA恒流3小时；(5)染色电泳完毕将一半NC膜用0.1％氨基黑染色、7％乙酸脱色，即可显示蛋白区带；(6)抗原-抗体反应将另一半带有重复加样的NC膜经TBS缓冲液冲洗10分钟后置于3％BSA封闭液中，于37℃缓慢摇动60分钟；再经TBS缓冲液冲洗3次后(每次5分钟)，置于用TBST缓冲液1∶50稀释的TN抗体溶液中，于37℃缓慢摇动2小时；(7)酶联反应用TBST缓冲液冲洗3次后(每次5分钟)，加入用TBST缓冲液1∶150稀释的HRP酶标记的第二抗体，继续反应2小时；(8)显色反应用TBST缓冲液冲洗3次后(每次5分钟)，再经TBS缓冲液洗10分钟；加入底物溶液，反应5～10分钟，至抗原区带呈现明显的褐色条带；(9)终止反应用蒸馏水洗涤，终止反应；
(10)蛋白特异性分析将经过抗原-抗体反应并显色后的NC膜与直接染色的那一半NC膜进行对照，即可得知待测TN样品的特异性。由本发明方法分离纯化得到的TN纯品经Western-Blot法鉴定在17KD位置与TN抗体有明显的特异结合区带。
权利要求
1.一种卵巢癌早期诊断蛋白标志物四粘蛋白的分离纯化方法，其特征在于它由四粘蛋白的粗分离、中度纯化和精细纯化三个主要步骤组成，其中a.四粘蛋白的粗分离采用饱和硫酸铵沉淀法，包括饱和硫酸铵沉淀和pH值调整两个步骤；b.四粘蛋白的中度纯化工艺采用离子交换层析、亲和层析两个层析步骤；c.四粘蛋白的精细纯化工艺采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，包括蛋白质变性、电泳、目标蛋白回收三个步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤a中的饱和硫酸铵沉淀是在血浆中加入等量的生理盐水，再按比例加入固体硫酸铵至50％饱和度；pH值调整是待蛋白质析出后将溶液的pH值调至5.8。
3.根据权利要求2的方法，其中步骤b中的离子交换层析和亲和层析的顺序可以调换。
4.根据权利要求3的方法，其中离子交换层析选用弱碱性离子交换层析，亲和层析选用肝素亲和层析或赖氨酸亲和层析。
全文摘要
本发明提供了一种卵巢癌蛋白标志物四粘蛋白的纯化方法，它由四粘蛋白的粗分离、中度纯化和精细纯化三个主要步骤组成。TN粗品的分离步骤采用饱和硫酸铵沉淀法，中度纯化步骤采用离子交换层析和亲和层析法，精细纯化步骤采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法。采用本发明方法制备的四粘蛋白纯品具有高纯度、高活性、高特异性等特点。本发明方法设计的分离纯化工艺步骤组配合理，操作简便，具有良好的稳定性和重复性。
文档编号C07K14/435GK1552726SQ03136489
公开日2004年12月8日 申请日期2003年6月5日 优先权日2003年6月5日
发明者马旭, 吴尔若, 马 旭 申请人:马旭, 马 旭