专利名称：Sars冠状病毒核衣壳蛋白的抗原决定簇及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白)的抗原决定簇及其应用。具体地本发明使用人工合成的源自SARS病毒N蛋白的抗原多肽以及该多肽免疫动物后产生的抗体(单抗、多抗)，结合酶联免疫的方法检测人血清样品中的早期抗SARS抗体IgM或IgG，或直接检测血清样品中SARS病原体。该多肽可以直接作为治疗药物诱导保护性的CTL反应，保护病人免于急性病症的折磨，并且进一步促进病人产生保护性的抗体，加速康复的进程；还可以作为重要组成部分，构建亚单位疫苗用于SARS的预防和控制。
背景技术：
非典型肺炎即严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory SyndromeSARS)的病原体最近已经确认是一种冠状病毒该病毒是一种正链RNA病毒基因组为单链RNA含有Poly(A)总长接近30kb病毒表面有约20nm左右的棒状结构呈皇冠状该病原体具有很强的感染性和传染性病毒在患者体内经15过早期复制过程后在肺部引发大规模炎症反应最终导致肺部组织损伤由于临床缺少有效的治疗药物所以现阶段将感染病人迅速隔离治疗是最有效的防治手段。
发明人通过调研大量与冠状病毒有关的科研文献和参考新近涌现的非典型肺炎(SARS)病原体-SARS冠状病毒的临床及基础医学研究的成果，得出SARS冠状病毒的核衣壳蛋白(N蛋白)是其重要的致病因子的结论N蛋白可以引起被感染细胞的细胞分裂失常，与细胞内重要的信号分子接合并干扰正常的细胞信号传导和细胞的转录、翻译等代谢过程，并且参与病毒的复制、蛋白质合成和包装等。此外，N蛋白不但可以诱导宿主产生高效价的抗体，进一步促进宿主产生对S蛋白(冠状病毒的另一重要毒力因子)的中和抗体；而且能诱导产生保护性的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)，对消除宿主的急性感染具有决定性的作用。
截止2003年6月2日，全世界已经有8384人感染SARS冠状病毒，并且已经有700多人死亡(http//www.who.int/csr/sars/country/2003 06 02/en/)。SARS已经成为全人类共同面临的新的严重传染病，如何预防、治疗SARS病毒引起的急性传染病和控制其蔓延是人类能否赢得这场战争的核心。
目前已经发展并使用的诊断方法包括RT-PCR、通过临床症状综合评价诊断、血清免疫检查病毒抗体(荧光免疫法或ELISA)。这三种方法易产生较多的假阴性和假阳性而导致漏诊或误诊，或者不能简便快速准确的判断与区分患者与疑似病例，常常会延误对疾病进行有效的治疗。而抗原检测(ELISA)准确率高，操作简便，适合临床推广，但目前缺少病原体的特异性抗体。
因此本领域迫切需要开发新的更加有效的早期诊断的方法和试剂盒以及治疗、预防SARS的药物和疫苗。
发明内容
本发明目的就是提供一种快速简便准确率高的SARS检测方法和试剂盒以及治疗、预防SARS的药物和疫苗。
在本发明的第一方面提供一种源自SARS病毒的多肽，其氨基酸序列为SEQID NO1-SEQ ID NO54所示的一条氨基酸序列的多肽，这些SARS特异性多肽可特异性地与抗SARS病毒的抗体结合。较佳的，该多肽为SEQ ID NO39所示的氨基酸序列的多肽。
在本发明的第三方面提供了一种抗体，所述抗体特异性地与本发明的SARS特异性多肽结合。
在一优选例中所述的抗体是单克隆抗体。
在本发明的第四方面提供了一种检测试剂盒，它含有本发明的SARS特异性多肽、抗本发明多肽的抗体或其组合。
在本发明的第五方面提供了一种体外检测样品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗体的方法包括步骤(a)将样品与选自下组的物质接触本发明的SARS特异性多肽、抗本发明多肽的抗体或其组合；(b)检测是否形成抗原-抗体复合物其中形成复合物就表示样品中存在SARS病毒或抗SARS病毒抗体。
在一优选例中所述的样品为血清样品或痰液。
在另一优选例中所述的物质是氨基酸序列为SEQ ID NO1-SEQ ID NO54所示的一条氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中所述的物质是单克隆抗体。
在另一优选例中步骤(b)的检测方法是荧光检测法。
在本发明的第六方面提供了本发明多肽在制备治疗或预防非典型肺炎的药物中的应用。
图1MHC II型抗原表位(epitope)。
图2MHC I型(HLA型)抗原表位。
图3通过比较得出的SARS冠状病毒的N蛋白的主要CTL诱导抗原表位，其中，MHV是鼠肝炎病毒，SARS-CoV是人的SARS冠状病毒。
具体实施例方式
本发明通过对SARS病毒潜在抗原蛋白的序列分析找到了具有很强抗原性的氨基酸序列。通过合成多肽合成这些潜在抗原靶位，再由这些多肽免疫获得的抗体，研制出一种通过检测SARS病毒或抗SARS病毒抗体进行SARS临床早期诊断的酶联免疫方法和试剂盒。这些多肽可以用于构建SARS临床检验试剂盒，也可以作为候选药物直接使用或者经过改造而应用于临床，诱导感染早期的病人产生保护性的CTL，消除急性病征；另外，促进机体产生对SARS病毒的S蛋白的中和抗体也有利于病人的康复。同时，本发明可显著提高诊断效率并且简便准确率高。
已有的研究表明，采用抗体检测病原体可以在病人感染后最短时间内作出有效诊断。采用IgM检测可以在感染后一个星期左右作出诊断，而检测病人体内IgG则最不理想。为了获得检测SARS病毒所需的相关抗原与抗体，本发明人通过对SARS病毒基因组的分析与比对，结合最近与以往文献资料，对SARS的潜在抗原蛋白进行分析。
通过与冠状病毒的分析与比对，本发明人发现冠状病毒通过与细胞表面受体结合，随即与细胞膜发生融合，病毒粒子进入细胞。病毒的生活周期完全在细胞质中进行，不需细胞核参与。SARS病毒本身编码两大类蛋白质结构蛋白和非结构蛋白。与RNA结合构成螺旋状核衣壳样结构的N蛋白为SARS病毒的结构蛋白。
如本文所用，本发明多肽或SARS特异性多肽指氨基酸序列如图1、图2所示的抗原多肽。
本发明多肽可用常规方法人工合成也可用重组方法生产。
本发明多肽可以直接用于检测抗SARS的抗体。
本发明的多肽可用于免疫兔、鼠等动物，从而获得抗本发明多肽的抗体(本发明抗体)。本发明抗体包括特异性的多克隆抗体和单克隆抗体尤其是单克隆抗体。这里特异性是指抗体能结合于SARS病毒的基因产物或片段。较佳地，指那些能与非典型肺炎冠状病毒的基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段(如Fab’或(Fab)2片段)、 抗体重链、抗体轻链、嵌合抗体人源化抗体等。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的本发明多肽可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
本发明的多肽和抗体都可用于检测样品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗体，从而作为早期检测SARS的有效指标之一。
除了用于检测，本发明的SARS特异性多肽还可在体内与病毒竞争受体，阻止病毒与膜融合抑制病毒感染正常细胞。此外本发明的多肽或抗体还可用于制备治疗性的药物组合物或预防性的疫苗组合物。
因此，另一方面本发明还提供了一种组合物它含有(a)安全有效量的本发明多肽或其组合物以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水缓冲液、葡萄糖水、甘油乙醇佐剂及其组合。本发明的组合物可通过常规方法进行制备，以本发明多肽计其用量。例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
本发明的主要优点在于(a)因为本发明的SARS特异性多肽与抗SARS病毒抗体的亲和力高，本发明抗体与SARS病毒的亲和力高，因此本发明的检测方法灵敏简便，准确率高；(b)本发明的SARS特异性多肽还可在体内与病毒竞争受体，阻止病毒与膜融合，抑制病毒感染正常细胞，所以本发明具有很高的临床应用价值；(c)本发明的SARS特异性多肽也可以作为候选药物直接使用或者经过改造而应用于临床，CTL在2-3天内就可以产生，对于消除病人的急性病征具有关键作用。本发明中提供的MHCII型抗原表位多肽就可以直接作为药物使用，诱导产生保护性的CTL反应并且促进抗S蛋白的中和抗体的产生。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法。通常按照常规条件如Sambrook等人分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1多肽的人工合成按序列表SEQ ID NO3-SEQ ID NO54所示的氨基酸序列，在多肽合成仪上合成多肽，合成后经质谱法验证证明合成的多肽与设计相符。
实施例2抗原多肽免疫动物制备抗体取实施例1制备的各条多肽片断0.5毫克，分别溶解于1.5ml PBS中，加入等体积的CFA(完全弗氏佐剂)，充分混匀，将经过佐剂乳化处理的抗原免疫兔子和小鼠。
每只兔子注射抗原3ml左右，小鼠则注射0.8ml/只。分别皮下多点注射动物背部(每点0.2ml)，初次免疫三周后，取同样剂量多肽、PBS，混合2ml IFA(不完全弗氏佐剂)，乳化后对动物进行加强免疫注射，剂量不变。三周后对动物取血收集抗血清，使用BSA包被的层析柱清除针对BSA的抗体。挑选抗体滴度较高的抗原多肽制备单克隆抗体。
实施例3抗原多肽检测病人血清样品使用经过处理的实施例1制备的抗原多肽包被，与病人血清混合反应，结果本发明的抗原肽段可以识别病人血清中早期针对SARS的特异性抗体，并与之结合，洗涤后加入HRP酶连二抗反应；最后加入显色底物进行检测。
结果表明本发明的多肽可特异性地与抗SARS病毒的抗体结合。
实施例4抗体(单抗与多抗)检测病原体对于实施例2获得的抗体(多抗和单抗)，用ELISA法与病人血清反应，检测病人组织液血液中的病毒结合，对病原体进行检测。
结果表明本发明的多抗和单抗可特异性地与SARS病毒结合。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING<110>非典病毒(SARS virus)<120>中国科学院上海生命科学研究院<130>SARS冠状病毒核衣壳蛋白的抗原决定簇及其应用<160>54<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>420<212>PRT<213>非典病毒(SARS virus)MHC II型抗原表位<400>1Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile1 5 10 15Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly20 25 30Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn35 40 45Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu50 55 60Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly65 70 75 80Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg85 90 95Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr
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权利要求
1.一种多肽，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID NO3-SEQ ID NO54所示的一条氨基酸序列的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID NO39所示氨基酸序列的多肽。
3.一种抗体，其特征在于所述的抗体特异性地与权利要求1或2所述的多肽结合。
4.如权利要求3所述的抗体，其特征在于所述的抗体是单克隆抗体。
5.一种检测试剂盒，其特征在于它含有权利要求1或2所述的多肽，权利要求3所述的抗体或其组合。
6.一种体外检测样品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗体的方法，其特征在于包括步骤(a)将样品与选自下组的物质接触权利要求1或2所述的多肽、权利要求3所述的抗体或其组合；(b)检测是否形成抗原-抗体复合物其中形成复合物就表示样品中存在SARS病毒或抗SARS病毒抗体。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的物质是氨基酸序列为SEQNO1-SEQ NO54所示的一条氨基酸序列的多肽。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于步骤(b)的检测方法是荧光检测法。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的物质是权利要求3所述的抗体，且所述抗体是单克隆抗体。
10.如权利要求1或2所述的多肽在制备治疗或预防非典型肺炎的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白)的抗原决定簇及其应用。具体地本发明使用人工合成的源自SARS病毒N蛋白的抗原多肽以及该多肽免疫动物后产生的抗体(单抗或多抗)，结合酶联免疫的方法检测人血清样品中的早期抗SARS抗体IgM或IgG，或直接检测血清样品中SARS病原体。该多肽还可用于制备治疗SARS疾病的药物或预防SARS疾病的疫苗。
文档编号C07K16/08GK1566143SQ03145229
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月25日 优先权日2003年6月25日
发明者秦磊, 李亦学, 石铁流, 金由辛, 何伟忠 申请人:中国科学院上海生命科学研究院, 上海生物信息技术研究中心