专利名称：一种从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法
技术领域：
本发明涉及一种从冬凌草中提取冬凌草甲素的新的工艺方法。
背景技术：
药物研究表明，冬凌草有良好的消炎、抗菌、镇痛作用，可有效抑制甲型、乙型溶血型链球菌，金黄色葡球菌等。对体外培养的Hela细胞，人体食管癌109细胞及肝癌BEL-7402细胞有明显的细胞毒作用，对多种移植物性动物肿瘤如ECA，S180，P388，L1210肝癌及AKS有明显抗肿瘤作用，并且冬凌草甲素对食管上皮增生有轻度抑制作用。其中二萜类成分冬凌草甲素是抗肿瘤的有效成分，因而被誉为中药里的“盘尼西林”和“天然抗菌素”。并且美国也正在研究将冬凌草用于爱滋病的防治。冬凌草的开发将成为本世纪的“朝阳产业”和“黄金产业”。
冬凌草提取工艺主要通过提取——脱色——层析等工艺，提取其中的重要有效成分冬凌草甲素并除去其中的植物色素、糖类和鞣质类。各种文献报道的方法的区别体现在(1)提取溶剂的不同，如乙醚提取法，主要有中国的赵清治，王汉清等和日本的E.Fujita.T.Fujita，H，Katayama，M.Shibuya；乙醇提取法；(2)提取后对提取液处理方法不同，如有用过滤等方法去除水不溶物质，最常用的是沉降，然后活性炭脱色；还有是直接用活性炭脱色；(3)处理后的水提液一般采用有机溶剂萃取或层析或萃取+层析的工艺获得冬凌草甲素。
除在工艺路线上有上述差别外，不同方法的具体区别表现在所选萃取剂及柱层析方法上有所不同。
这些提取工艺通常是采用溶液提取法，然后采用活性炭脱色，浓缩后然后直接进行柱层析分离，此工艺不能很好的除去其中的鞣质和多糖，也不能很好除去与冬凌草甲素分子量只相差2的冬凌草乙素，很难得到冬凌草甲素的纯品。
冬凌草甲素的结构为 冬凌草甲素冬凌草乙素的结构为
冬凌草乙素为了得到纯度较高的冬凌草甲素，很好地除去其中的植物色素、多糖、树脂、鞣质类物质，因此有必要改进上述的传统生产工艺。
发明内容
本专利发明的目的是克服现有技术的缺陷，开发出一种简单、适于工业化生产，并且成本低的提取纯化冬凌草中有效成分冬凌草甲素的新工艺，并可用于开发新型抗肿瘤新药。
本发明的技术构思是这样的本发明综合运用几种提取纯化方法，将其进行有机组合，开发出了一套适合分离纯化冬凌草甲素的新工艺。采用醇溶液提取法，然后进行水浮回流处理，水浮液过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的大孔吸附树脂(如HZ-841大孔吸附树脂)柱除去其中的糖分、植物色素等，采用硅胶与氧化镁混合柱层析法分离洗脱，最后进行重结晶就可以得到纯度较高的冬凌草甲素。
本发明是通过如下技术方案实现的1、将冬凌草用4-10倍的95％醇溶液，最好是6倍量的醇溶液，醇提2-6小时，最好4小时；再用2-6倍的95％醇溶液，最好是4倍量的醇溶液，醇提1-4小时，最好2小时，提取温度为76摄氏度；2、合并两次提取液，减压浓缩，回收乙醇，得到绿褐色膏状物；加入1-6倍量的水进行水浮，最好是3倍；温度为60-90℃，最好是80℃；回流时间0.5-3h，最好1.5h；3、过滤，将滤液直接过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的大孔吸附树脂(如HZ-841大孔吸附树脂)柱，先用水洗去大部分植物色素，再用低浓度醇洗脱，一般为5％-30％，最好为10％，而后用50％-70％的醇洗脱，最好是60％的醇，效果较好；4、将过大孔吸附树脂柱液减压浓缩蒸干，硅胶与氧化镁混合柱层析法分离洗脱，洗脱剂可采用氯仿-甲醇、氯仿-丙酮、石油醚-丙酮等，最好是氯仿-丙酮，洗脱剂比例为6∶1-9∶1，最好是85∶15；原料与吸附剂的比例为1∶5～1∶10，最佳为1∶7，吸附剂为硅胶与氧化镁的混合吸附剂，一般为15∶1为宜；5、用甲醇-丙酮进行重结晶，过滤后用少量丙酮洗至白色，得到纯度为99％的冬凌草甲素。
以本发明的方法从冬凌草中提取有效成分冬凌草甲素，技术上具有以下显著优点和进步(1)本工艺增加在用乙醇溶液提取后，采用水浮回流技术除去一部分杂质，可初步提高产品的纯度。
(2)采用过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的大孔吸附树脂(如HZ-841大孔吸附树脂)柱技术，并采用硅胶+氧化镁的混合柱分离冬凌草甲素，可很大程度提高产品纯度。
(3)经过水浮与过大孔树脂柱处理，在过层析柱时因上样的样品纯度相对较高，因而同样量的吸附剂载样量就较大，这样就节省了吸附剂用量。
(4)仅用一套洗脱系统，大大节省了溶剂用量与洗脱时间。
(5)可以得到含量较高的冬凌草甲素(99.85％)
图1是柱层析洗脱不同馏分的薄层色谱图、图2冬凌草甲素对照品与样品薄层色谱图比较、图3是HPLC测试结果，图4冬凌草甲素样品与对照品HPLC图比较、图5是HENMR谱、图6是IR谱、图7是MS谱。
下面结合具体实施方式
和附图对本发明进行进一步说明。
实施例1提取原料1kg加6倍量95％乙醇提取4小时，倒出溶液，再加入4倍量95％乙醇回流2小时，减压浓缩，回收乙醇，得绿褐色膏状物，加入3倍量水回流1.5小时，过滤，将此滤液过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的大孔吸附树脂(如HZ-841大孔吸附树脂)柱，先用约6倍量水洗至近无色，然后用约4倍量60％的乙醇液洗脱，将此洗脱液减压浓缩，得到土黄色粉末约12g。
柱层析分离 将上步中所得土黄色粉末与适量硅胶拌匀，将相当于粉末5倍量的硅胶、氧化镁(15∶1)装柱，加样后上层覆盖少量硅胶，再加少量脱脂棉。用9∶1的氯仿-丙酮洗脱，以5ml/min的流速进行洗脱，按每份100ml进行收集，进行薄层板分析，证明第6份以后为纯的甲素(见附图1)。减压浓缩，用甲醇-丙酮进行重结晶，减压过滤后，用少量丙酮洗至白色，干燥后称重，共1.5g。薄层层析分析将冬凌草甲素对照品和样品用甲醇溶解后，在同一硅胶薄层板上点样，以9∶1的氯仿-甲醇展开，取出晾干，在紫外灯下照射，样品和对照品具有相同的Rf值(见附图2)，并呈现同样的亮黄绿色斑点，样品中无杂质斑。HPLC分析 将冬凌草甲素对照品和样品用甲醇溶解后，在同一条件下进样，得到相同的色谱图，保留时间相同，峰形也相同。冬凌草甲素HPLC图及对照图。见附图3、4。
NMR和IR的测定 经红外光谱与核磁共振光谱测定，表明所提样品与对照品结构相同，为同一化合物。见附图5、6。
MS检测经分析为冬凌草甲素。见附图7。
HPLC、HENMR、IR、MS分析IR、HENMR、MS检测分析为冬凌草甲素，与文献报道一致，将产物进行HPLC检测，结果见附图3。
权利要求
1.一种从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，包括如下步骤(1)将冬凌草用4-10倍的95％醇溶液，提取2-6小时；再用2-6倍的95％醇溶液，提取1-4小时，提取温度为76摄氏度；(2)合并两次提取液，减压浓缩，回收乙醇，得到绿褐色膏状物；加入1-6倍量的水进行水浮，温度60-90℃，回流0.5-3h，形成冬灵草甲素悬浮液；(3)将冬灵草甲素悬浮液过滤后，把滤液直接过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的大孔吸附树脂柱，如HZ-841大孔吸附树脂柱，先用水洗去大部分植物色素，再用5％-30％低浓度醇洗脱，而后用50％-70％的醇洗脱；(4)将过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的大孔吸附树脂(如HZ-841大孔吸附树脂)柱液减压浓缩蒸干，用硅胶与氧化镁混合柱层析法分离洗脱，洗脱剂可采用氯仿-甲醇、氯仿-丙酮、石油醚-丙酮，洗脱剂比例为6∶1-9∶1，原料与吸附剂的比例为1∶5-1∶10，吸附剂为硅胶与氧化镁的混合吸附剂，一般为15∶1(5)用甲醇-丙酮进行重结晶，过滤后用少量丙酮洗至白色，得到纯度为99％的冬凌草甲素。
2.如权利要求1所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，用95％醇溶液提取时，第一次用6倍量的醇溶液，第二次用4倍量的醇溶液。
3.如权利要求2所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，第一次醇提时间为4小时，第二次提取为2小时。
4.如权利要求3所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，提取温度为76摄氏度。
5.如权利要求1所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，进行水浮回流时，水浮量为3倍。
6.如权利要求5所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，回流温度为80℃。
7.如权利要求6所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，回流时间为1.5h。
8.如权利要求1所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的大孔吸附树脂柱，如HZ-841大孔吸附树脂柱时，先用10％的醇洗脱，再用60％的醇洗脱收集。
9.如权利要求8所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，过硅胶与氧化镁混合柱，洗脱液为氯仿-丙酮，比例为85∶15。
10.如权利要求9所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，过硅胶与氧化镁混合柱，硅胶与氧化镁的比例为15∶1。
11.如权利要求10所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，过硅胶与氧化镁混合柱，原料与吸附剂的比例为1∶7。
12.如权利要求1所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，重结晶时采用甲醇与丙酮混合液。
全文摘要
本发明提出了一套适合分离纯化冬凌草甲素的新工艺。即采用醇溶液提取法，然后进行水浮回流处理，水浮液直接过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的大孔吸附树脂(如HZ－841大孔吸附树脂)柱工艺除去其中的糖分、植物色素等，采用硅胶与氧化镁混合柱层析法分离洗脱，最后进行重结晶得到纯度较高冬凌草甲素。本发明的新工艺方法，安全，成本低廉，适于工业化生产，能够提取纯度较高的冬凌草甲素。
文档编号C07D311/00GK1528757SQ0315147
公开日2004年9月15日 申请日期2003年9月29日 优先权日2003年9月29日
发明者张立国, 倪力军, 谢国祥 申请人:华东理工大学