专利名称：人类肥大细胞表达的膜蛋白的制作方法
技术领域：
本发明大体涉及细胞膜蛋白及尤其是由肥大细胞表达的膜蛋白(“MCEMP(s)”)。
背景技术：
肥大细胞源自骨髓中的造血干细胞，但是仅在其迁移至不同的外围组织后才完成其发育。成熟的肥大细胞在其表面上表达一种被称为FcεRI的高亲和性IgE受体。FcεRI可以通过已经与特定过敏原交叉链接的受体结合IgE来激活。肥大细胞亦能被IgE独立机制激活。例如，已经显示补体蛋白C3a和C5a在体内激活肥大细胞，且已经显示钙离子载运体(诸如A23187)在体外激活肥大细胞。
肥大细胞含有多种预形成的分泌性炎性介体，例如组胺、类胰蛋白酶、蛋白酶、过氧化物酶及中性粒细胞趋化因子(neutrophil chemotactic factor)。在激活后，肥大细胞将此等预形成的介体及例如花生四烯酸代谢物(白细胞三烯)、前列腺素及细胞因子某些新合成的脂质介体，释放入周围组织。通常，该等细胞释放诱导免疫调节和刺激性炎性细胞因子两者，例如TNFα、IL-4、IL-13、IL-5、IL-10及趋化因子。
众所周知，人类的肥大细胞在多种炎症性和过敏性疾病例如哮喘和异位性皮炎的发病机理中起着关键作用。由肥大细胞所释放的预形成与新合成的介体是造成过敏反应中大多数早期事件的原因，通过细胞因子产生和其它机制，促进晚期反应与慢性过敏性炎症的表达。在多种肿瘤性、纤维性以及炎症性过程中亦已观察到肥大细胞，例如淋巴增生性疾病、间质性肺病和风湿性关节炎中的滑膜。此外，在其它炎性疾病，例如炎症性肠疾病中，肥大细胞的量显著升高。肥大细胞亦在心力衰竭的进程中起作用。在心力衰竭期间，发现人类心脏中肥大细胞的量增加，并且在缺血性心肌病中，其密度更高。美国专利第6140348号揭示一种用于通过抑制肥大细胞脱粒来预防和治疗心力衰竭的方法。肥大细胞亦在多发性硬化中起着重要作用。在多发性硬化的脑损伤中发现肥大细胞特异基因并发现一肥大细胞稳定剂改善实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)(一种多发性硬化的动物模型)的严重程度。
由于肥大细胞在过敏和其它炎症性疾病中起着如此重要作用，所以调节肥大细胞分化、增生、粘着、成熟、激活以及脱粒的药物或其它药剂适用于预防或治疗该等疾病。因此，有必要识别在由肥大细胞介导的疾病中起作用的新型肥大细胞蛋白并开发用于调节肥大细胞活性的药物和方法。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种在调节肥大细胞活性中涉及之新型的肥大细胞所表达的膜蛋白(“MCEMP(s)”)。
本发明的另一目的是提供一种结合到MCEMPs及其配体并调节其功能与活性的促效剂或拮抗剂。
本发明的另一目的是提供一种结合到MCEMPs的抗体及产生该等抗体的方法。
本发明的另一目的是提供一种编码新型MCEMPs的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供一种包含编码新型MCEMPs的核苷酸序列的载体及含有该等载体的宿主细胞。
本发明的另一目的是提供一种筛选方法，其用于识别MCEMPs促效剂与拮抗剂及确定药物在投予动物时是否有可能导致不良副作用。
本发明的另一目的是提供一种用于阻断或调节MCEMPs的表达的方法。
本发明的另一目的是提供一种用于诊断哺乳动物中感染由有害的MCEMP活性所引起的疾病的易患性的方法。
本发明的另一目的是提供一种用于预防或者治疗哺乳动物中MCEMP介导的疾病方法。
本发明的另一目的是提供一种用于检测由特定细胞、组织或体液表达的MCEMPs的诊断方法，。
本发明的另一目的是提供一种用于从重组细胞培养物、污染物以及天然环境中单离并纯化MCEMPs的方法。
本发明的另一目的是提供一种用于给哺乳动物接种以防止由MCEMP所介导的疾病的疫苗和方法。
通过提供一种具有SEQ ID NO2中所示的氨基序列的新型MCEMP，编码该蛋白的核苷酸序列，及载体和表达核苷酸序列并产生蛋白的宿主细胞来达成该等以及其它目的。将MCEMP用于产生适用于影响肥大细胞功能的促效剂和拮抗剂，例如肥大细胞载体的脱粒、粘着、迁移、凋亡以及释放。抗体适用于筛选MCEMP促效剂和拮抗剂以及用于筛选药物以确定为了医学目的投予动物中时其是否有可能导致不良的副作用。
本发明的其它以及另外的目的、特点和优点对于所属领域的技术人员是显而易见的。
具体实施例方式
定义术语“经纯化的多肽”意指从至少一种在天然环境中通常与经纯化的多肽相关联的污染物多肽中识别并单离出的多肽，尤其是从其细胞环境中单离的多肽。
术语“经单离的多核苷酸”意指从至少一种在天然环境中通常与经单离的多核苷酸相关联的污染物多核苷酸识别并单离出的多核苷酸，尤其是从其细胞环境中单离的一种多核苷酸。
当术语“天然的”用于描述多核苷酸、多肽序列或其它分子时，意指与天然发现相同的多肽、多核苷酸或其它分子，例如，存在于有机体，例如病毒或原核或真核细胞中的多肽或多核苷酸序列，其能够从一种天然来源中单离，并且未将其刻意改质以改变其结构、性质或功能。具有SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列的未经单离的细胞多核苷酸是一天然多核苷酸及具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的未经纯化的细胞多肽是天然多肽。
术语“百分比序列一致性”意指在两种或两种以上核苷酸或氨基酸序列的比较中发现的序列相似性的百分比。可以(例如)通过使用MEGALIGN程序(DNASTAR，Inc.，MadisonWisconsin.)来电子地测定百分比一致性。MEGALIGN程序根据不同的方法，例如clustal方法在两个或两个以上序列之间创建校准。(参见例如，Higgins，D.G.和P.M.Sharp(1988)Gene 73237-244)。Clustal算法通过检查所有配对之间的间距将序列分组成串。串成对校准及接着分组。通过将序列A的长度，减去序列A中间隔残基的数目，减去序列B中间隔残基的数目，除以序列A和序列B之间残基配对的总数，乘以一百，来计算两个氨基酸序列，例如序列A和序列B之间的百分比相似性。测定百分比相似性中不包括两个氨基酸序列之间低或无相似性的间隔。通过此项技术中已知的方法，例如Hein，J.(1990)Methods Enzymol.183626-645中给出的Jotun Hein方法来计数或计算核苷酸序列之间的百分比一致性。亦可通过此项技术中已知的其它方法，例如通过变更杂交条件来测定序列之间的一致性。
当术语“变体”用于描述一种多核苷酸序列时意指一与其天然对应物具有一个或多个核苷酸的差别及具有与其天然对应物相同或相似的生物功能或者不具有与其天然对应物相同或相似的生物功能的核苷酸序列，但是可以用作探针以识别或单离其天然对应物。优选的变体是当与其天然对应物相比时，具有至少85百分比序列一致性的核苷酸序列，更优选为至少90至95百分比序列一致性的核苷酸序列，及最优选为至少99百分比序列一致性的核苷酸序列，以及在严格条件下与天然序列或其补充序列结合的核苷酸序列。大多数优选变体是与其天然对应物一样为编码相同氨基酸但是仅根据遗传密码的衰退与天然核苷酸序列不同的核苷酸序列。
当术语“变体”用于描述一种多肽序列时意指一种氨基酸序列，该氨基酸序列与其天然对应物具有一个或多个氨基酸的差别，包括修改、取代、插入及删除，及具有与其天然对应物相同或相似的生物功能或者不具有与其天然对应物相同或相似的生物功能但是可以用作免疫原以产生与其天然对应物相结合的抗体或者用作其天然对应物的促效剂或者拮抗剂。优选的变体是当与其天然对应物相比时，具有至少70百分比序列一致性的多肽，优选为至少85百分比序列一致性，且最优选为至少95百分比序列一致性。大多数优选变体是具有保守氨基酸取代的多肽。
当术语“片段”用于描述多核苷酸时意指其天然对应物的核苷酸序列子集，其在严格的条件下结合到其天然对应物或其补体。优选的片段具有天然序列的至少25至50个连续核苷酸的核苷酸序列。最优选的片段具有天然序列的至少50至100个连续核苷酸的氨基酸序列。
当术语“片段”用于描述多肽时意指其天然对应物的氨基酸序列子集，其保持其天然对应物的任一生物活性或者作为能够产生结合到其天然对应物的抗体的免疫原。优选的片段具有天然序列的至少10至20个连续氨基酸的氨基酸序列。最优选的片段具有天然序列的至少20至30个连续氨基酸的氨基酸序列。
术语“促效剂”意指任何促进、提高或刺激MCEMPs的正常功能的分子。一种类型的促效剂是一种以模拟MCEMP配体包括抗体或抗体片段的方式与MCEMP相互作用分子。
术语“拮抗剂”意指任一阻断、防止、抑制或中和MCEMPs正常功能的分子。一种类型的促效剂是一种干扰MCEMPs与其配体，包括抗体或抗体片段之间的相互作用的分子。另一类型的拮抗剂是抑制天然MCEMPs的正确转录反义核苷酸。
术语“保守氨基酸取代”意指多肽中的一个氨基酸被具有相似侧链的氨基酸所取代。例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸以及异亮氨酸具有脂肪族侧链；丝氨酸和苏氨酸具有脂肪族-羟基侧链；天冬酰胺和谷氨酰胺具有含酰胺的侧链；苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸具有芳香族侧链；赖氨酸、精氨酸和组氨酸具有碱性侧链；及半胱氨酸和蛋氨酸具有含硫侧链。优选的保守氨基酸取代是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
术语“严格的条件”意指(1)在42摄氏度下在50％(体积/体积)甲酰胺与0.1％小牛血清白蛋白、0.1％菲科尔、0.1％聚乙烯吡咯烷酮以及PH值为6.5的50mM磷酸钠缓冲液与750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠中杂交，(2)42摄氏度下在50％甲酰胺、5×SSC(0.75M氯化钠、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH值6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt’s液、超声降解的鲑鱼精DNA(50微克/毫升)、0.1％SDS、以及10％硫酸葡聚糖中杂交；在42摄氏度下0.2×SSC和0.1％SDS中清洗或用0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠、0.1％硫酸钠在50摄氏度下清洗，或采用类似的低离子强度和高温清洗剂以及类似的变性剂进行类似程序。
如本文中使用的术语“反义”用于指含有与特定DNA或RNA序列互补的核苷酸序列的任一组合物。将术语“反义链”用于指代与“正义”链互补的核苷酸链。反义分子包括肽核酸及通过包括合成或转录的任一方法来产生。一旦被导入细胞，该互补核苷酸就与通过细胞所产生的天然序列结合以形成双联结构并阻断转录或翻译。名称“负的”有时用于指代反义链，及“正的”有时用于指代正义链。
术语“剔除”用于指部分或完全减少通过哺乳动物的单个细胞、经选择的细胞或所有细胞的内源性基因(例如用于编码MCEMPs的基因)的至少一部分多肽的表达。哺乳动物是具有破坏了的内源基因的一个等位基因的“杂合剔除”或是具有破坏了的内源基因的两个等位基因的“纯合剔除”。
术语“MCEMP(s)”意指取自任何物种，尤其是哺乳动物，包括小牛、绵羊、猪、鼠、马，及优选人类，来自任何来源，无论天然、合成、半合成或重组的经大体纯化的MCEMPs的氨基酸序列。
本发明不局限于本文中描述的特定方法学、方案、细胞系、载体以及试剂，因为它们可变化。此外，本文中使用的术语仅用于描述特定的实施例及其无意欲限制本发明的范围。如本文中和附加权利要求中使用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”和“该”包括复数涵义，例如参考“宿主细胞”包括该等宿主细胞的复数形式。
由于基因密码的退化，所以产生许多编码本发明的MCEMPs的核苷酸序列。某些此等序列将是高度同源性的，而某些与任一已知的和天然存在的核苷酸序列的核苷酸序列具有最小的同源性。本发明涵盖根据可能的密码子选择可通过选择组合产生的每一种和每种可能的核苷酸序列变体。此等组合根据应用于编码天然存在的MCEMPs编码的核苷酸序列的标准来产生三联体基因密码及认为所有该等变体为特定地揭示。
除非另有定义，本文中使用的所有技术性和科学性术语以及任何缩写都具有与本发明领域中的所属领域的技术人员的一般理解相同的含义。虽然在本发明的实践中可以使用与本文中描述的那些相似或等价的任一方法和材料，但是本文中描述了优选的方法、设备和材料。
本文中提及的所有申请案及公开案均以引用法律允许用于描述及揭示在下面范围报道说与本发明一起使用的蛋白、酶、载体、宿主细胞以及方法学目的的范围的方式并入本文中。然而，本文中不得解释为承认本发明无资格先于借助先前发明之揭示。本发明在根据先前发明的该种公开之前未经授权。
多肽一方面，本发明提供了一种包含氨基酸序列的经纯化的多肽，该氨基酸序列是选自由SEQ ID NO2；SEQ ID NO2的变体；SEQ ID NO2的片段组成的群组；通过包含核苷酸序列的经单离的多核苷酸编码的氨基酸序列，该核苷酸序列选自由SEQ ID NO1；SEQ ID NO1的变体；以及SEQ ID NO1的一种片段所组成的群组。
本发明的经纯化的多肽是肥大细胞所表达的膜蛋白(“MCEMP(s)”)，其在人类肥大细胞和肺中高度表达。该蛋白是调节肥大细胞和肺组织功能的过程中所涉及的跨膜蛋白。在优选实施例中，该蛋白是一种具有SEQ ID NO2(“MCEMP1”)中所示的序列187氨基酸蛋白。优选的蛋白具有一包含氨基酸1至82的细胞内域，一包含氨基酸83至105的跨膜域，以及一包含氨基酸106至187的细胞外域。
本发明的多肽用于创造结合到蛋白并影响肥大细胞和肺细胞的结构、性质或功能的抗体，包括生物学功能例如脱粒、粘着、迁移、凋亡以及肥大细胞内容物的释放。优选的，该抗体充当MCEMP促效剂以激活肥大细胞媒介的产生或充当MCEMP拮抗剂以抑制肥大细胞刺激性炎症性媒介的产生，例如组胺、TNFα以及白三烯。
促效剂和拮抗剂另一方面，本发明提供与MCEMP或其配体特异结合并抑制或激活其细胞功能的促效剂和拮抗剂。促效剂和拮抗剂的类型包括(但不限于)多肽、蛋白、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂类、多聚糖、寡聚糖、核苷酸、有机分子、生物有机分子、肽模拟剂、药理学药剂及其代谢物，以及转录和翻译控制控制序列。
在一个实施例中，拮抗剂是可溶形式的MCEMP和来自于MCEMPs细胞外域的可溶性多肽，其能够干扰MCEMP与其天然配位体相互作用的能力。优选的，拮抗剂是选自由SEQID NO2的氨基酸106至187组成的群组或其拮抗剂片段的肽。此等拮抗作用通过结合到配体并防止配体结合到其天然受体来为MCEMPs阻断天然配体的结合。
优选的，促效剂和拮抗剂是特异结合到MCEMP并影响其生物行为和功能的抗体，例如激活或抑制脱粒并控制肥大细胞媒介释放。抗体可以是多克隆或单克隆抗体，但优选单克隆抗体。
拮抗剂抗体用于预防或治疗以肥大细胞激活为特征的疾病，例如由于脱粒和肥大细胞内容物的释放所引起的疾病。促效剂抗体用于预防或治疗以肥大细胞媒介浓度相对低为特征的疾病。
促效剂和拮抗剂用于各种免疫性疾病的治疗，包括(但不限于)过敏性疾病，例如哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、食物超敏和风疹；与移植相关联的疾病，包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病；自身免疫和由免疫介导的皮肤疾病，包括大疱性皮肤疾病、多形性红斑和接触性皮炎、牛皮癣；风湿性关节炎、青少年慢性关节炎；炎症性肠病(例如，溃疡性结肠炎、克罗恩氏(Crohn’s)病)；系统性红斑狼疮；脊椎关节病；系统性硬化(硬皮病)；特发性炎症性肌病(皮肌炎、多发性肌炎)；干燥综合症；全身性血管炎；结节病；自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、间歇性夜间血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导性血小板减少症)；甲状腺炎(格雷夫氏(Grave’s)病、桥本氏(Hashimoto’s)甲状腺炎、青少年淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)；糖尿病；由免疫引起的肾疾病(血管球性肾炎，小管间质性肾炎)；中枢和外周神经系统的神经脱髓鞘疾病，例如多发性硬化、特发性脱髓鞘性多发性神经病或格林-巴利综合症，以及慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病；肝胆疾病例如感染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎以及其它非嗜肝性病毒)、自身免疫性慢性活性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎以及硬化性胆管炎；炎症性和纤维化肺病，例如囊性纤维化、谷蛋白敏感性肠病、以及惠普尔氏(Whipple’s)氏病肺的免疫性疾病例如嗜曙红性肺炎、特发性肺纤维化以及过敏性局部急性肺炎。
抗体和抗体产生另一方面，本发明提供一种结合到本发明的MCEMPs的抗体以及用于产生包括充当MCEMP促效剂或拮抗剂的抗体的该种抗体的方法。在一个实施例中，该方法包含使用经单离的MCEMPs或其抗原性片段作为用于产生抗体的抗原，该等抗体在用于使抗体产生到抗原的已知方案中结合到本发明的MCEMPs，包括多克隆及单克隆抗体。在另一实施例中，该方法包括使用表达重组MCEMPs的宿主细胞作为抗原。在另一实施例中，该方法包含使用含有MCEMP基因的DNA表达载体来将MCEMP表达为用于产生抗体的抗原。
熟练的技术人员熟知用于产生包括多克隆、单克隆、单价、人化、人类、双重特异性以及复共轭抗体的抗体的方法。
多克隆抗体通过单独或与佐剂组合注射免疫原可以在哺乳动物中产生多克隆抗体。通常，使用一次或多次皮下或腹腔内注射将免疫原注射于哺乳动物中。该免疫原包括所研究的多肽或融合蛋白，该融合蛋白含有多肽与已知在经免疫的哺乳动物中为免疫原性的另一多肽。该免疫原亦包括表达重组MCEMP的细胞或含有MCEMP基因的DNA表达载体。该等免疫原性蛋白的实例包括(但不限于)锁眼帽贝血蓝蛋白、血清白蛋白、小牛甲状腺球蛋白以及大豆胰蛋白酶抑制剂。佐剂的实例包括(但不限于)弗氏(Freund’s)完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酸脂A、合成海藻糖双棒状梅菌酸酯)。由所属领域的技术人员选择免疫草案而不会产生不当的实验。
单克隆抗体使用杂交瘤法，例如由Kohler和Milstein，Nature，256495(1975)描述的方法可以产生单克隆抗体。在杂交瘤法中，用免疫原免疫小鼠、仓鼠或其它适当的宿主哺乳动物以诱导产生或能够产生特异结合到该免疫原的抗体的淋巴细胞。或者，在体外免疫淋巴细胞。免疫原通常包括所研究的多肽或含有该多肽的融合蛋白。通常，如果需要人类来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBLs”)。如果需要非人类哺乳动物来源的细胞，则使用脾细胞或淋巴结细胞。接着使用合适的融合剂，例如聚乙烯二醇将淋巴细胞和不灭(immortal)的细胞系相融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice，第59-103页(Academic Press，1986))。不灭的细胞系通常是经转变的哺乳动物细胞，尤其是啮齿动物、小牛或人类骨髓瘤细胞。通常采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将杂交瘤细胞在合适的培养基中培养，该培养基优选含有一种或多种抑制未融合不灭细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基蝶呤以及胸腺嘧啶(HAT培养基)。HAT培养基防止HGPRT缺乏细胞的生长。
优选的不灭细胞系是有效的融合，通过所选的抗体产生细胞支持稳定的高含量表达抗体，并且对培养基(如HAT培养基)敏感的细胞系。更优选的不灭细胞系是鼠骨髓瘤细胞系例如那些来自购自Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA的MOPC-21和MPC-11鼠肿瘤，以及购自American Type Culture Collection，Rockville，Md.USA的SP2/0和X63-Ag8-653细胞的细胞系。人类骨髓瘤和鼠-人类杂骨髓瘤细胞系亦已经描述用于人类单克隆抗体的产生(Kozbor，J.Immunol.1333001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。亦可使用鼠骨髓瘤细胞系NSO(European Collection of Cell Cultures，Salisbury，Wiltshire UK)。亦可以使用此项技术中熟知的人类骨髓瘤和鼠-人杂骨髓瘤细胞系来产生人类单克隆抗体。
接着分析用于培养杂交瘤细胞的培养基确认对准所研究多肽的单克隆抗体的存在。优选的，通过免疫沉淀反应和体外结合分析，例如放射免疫分析(RIA)或酶链接免疫吸附分析(ELISA)来测定由杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性。该等技术及分析在此项技术中是已知的。单克隆抗体的结合亲和性可以，(例如)通过Munson和Pollard，Anal.Biochem.，107220(1980)的斯卡查德(Scatchard)分析进行测定。
在识别所需的杂交瘤细胞之后，通过限制性稀释程序对克隆体进行亚克隆并通过标准方法培育。用于此目的的合适培养基包括杜贝克氏(Dulbecco’s)改质伊格尔氏培养基和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞亦可以在体内例如在哺乳动物的腹水中培育。
通过传统免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和力色谱法从培养基或腹水液体中单离或纯化由亚克隆体分泌的单克隆抗体。
通过重组DNA法，例如美国专利第4,816,567号中描述的方法亦产生单克隆抗体。使用传统程序，例如通过使用能够特异结合到编码鼠抗体重链与轻链的基因的寡核苷酸探针可容易地单离及序列编码本发明的单克隆抗体的DNA(Innis M等人，在“PCRProtocols.A Guide to Methods and Applications”中，Academic，San Diego，CA(1990)，Sanger，F.S等人，Proc.Nat.Acad.Sci.745463-5467(1977))。本文中所描述的杂交瘤细胞担任该DNA的优选来源。一旦经单离，就将DNA放置于表达载体中。然后将载体转染于宿主细胞中，例如不另外产生免疫球蛋白的类人猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。将重组宿主细胞用于产生所需的单克隆抗体。还可以对DNA改质，例如，通过用人类重链和轻链恒定域的编码序列取代同源的鼠类序列或通过将免疫球蛋白编码序列共价连接至所有或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列。该非免疫球蛋白多肽可以经替代为抗体的恒定域或可以经替代为抗体的一个抗原组合位点的可变域以产生嵌合二价抗体。
使用免疫球蛋白的轻链与经改质的重链的重组表达可以产生单价抗体。通常在Fc区域的任何一个位点截短重链以防止重链交叉链接。或者，用另一氨基酸残基取代相关的半胱氨酸残基或将其删除以防止交叉链接。相似的，亦可将体外方法用于产生单价抗体。使用已知的方法，可将消化抗体用于产生抗体片段，优选Fab片段。
使用由McCafferty等人，Nature 348552-554(1990)中所描述的技术生成的抗体噬菌体库可以产生抗体与抗体片段。Clackson等人，Nature 352624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.222581-597(1991)描述使用噬菌体库各自分离鼠和人抗体。随后的公开案描述通过链移动(Marks等人，Bio/Technology 10779-783(1992))，以及组合式感染和作为用于构造非常大的噬菌体库的策略的体内重组(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.212265-2266(1993))来产生高亲和性的(纳米范围)人类抗体。因此，此等技术是用于单克隆抗体的单离的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代。同时，可以改质DNA，例如，通过通过用人类重链和轻链恒定域的编码序列取代同源的鼠类序列(美国专利第4,816,567号；Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 816851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列共价连接至全部或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列上。通常，将非免疫球蛋白多肽取代为抗体的恒定域，或将其取代为抗体的抗原结合位点的可变域以产生嵌合二价抗体，其包含一个用于抗原的特异性的抗原结合位点以及对不同抗原具有特异性的另一抗原结合位点。
使用电融合而不是化学融合来形成杂交瘤，以产生抗体。此技术经沿用已久。除了融合外，还可使用，例如Epstein Barr病毒或转变基因来转化B细胞使其不灭“Continuously Proferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody ofPredetermined Specificity，”Zurawaki，V.R.等人，在“Monoclonal Antibodies”中，由Kennett R.H.等人编辑，Plenum Press，N.Y.1980，第19-33页。
人化抗体使用由Winter在Jones等人，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332323-327(1988)；以及Verhoeyen等人，Science，2391534-1536(1988)描述的方法可以产生人化抗体。通过将鼠CDRs或CDR序列取代为人；类抗体的相应序列来完成人化。通常，人化的抗体具有一个或多个从非人类来源引入的氨基酸。该“人化”抗体是嵌合抗体，其中大体上小于完整的人类可变域经来自非人类物种的相应序列取代。在实践中，人化抗体通常是人类抗体，其中某些CDR残基以及可能的某些FR残基经来自鼠抗体中的类似位点的残基取代。非人类(例如，鼠或小牛)抗体的人化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链、或免疫球蛋白片段例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2，或含有来自非人类免疫球蛋白之最少序列的抗体的其它抗原结合序列。人化抗体包括人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的一个互补决定域(CDR)的残基经来自非人类物种(供体抗体)，例如具有所需特异性、亲和性以及能力的小鼠、大鼠或兔的CDR所取代。有时候，人类免疫球蛋白的Fv框架残基经相应的非人类残基取代。人化抗体亦包含在受体抗体中或在植入的CDR或框架序列中都找不到的残基。总体而言，人化抗体大体上包含至少一个，并且通常两个可变域的全部，其中全部或大体上全部CDR区域与非人类免疫球蛋白的CDR区域相对应且全部或大体上全部FR区域都是人类免疫球蛋白的一致序列(consensus sequence)的FR区域。人化抗体最优包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区域(Fc)，通常为人类免疫球蛋白的恒定区域。
人类抗体使用此项技术中已知的各种技术，例如在Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)以及Marks等人，J.Biol.，222581(1991)中描述的噬菌体展示库可以产生人类抗体。使用在Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，AlanR.Liss，第77页(1985)以及Boemer等人，J.Immunol.，147(1)86-95(1991)中描述的技术可以产生人类单克隆抗体。或者，可获得转基因动物，例如小鼠，其在免疫后，在不存在内源性免疫球蛋白产生的条件下可产生人类抗体的完整技能。该等转基因小鼠可以从Abgenix，Inc.，Fremont，California，以及Medarex，Inc.，Annandale，New Jersey购得。已描述嵌合与微生物系突变小鼠的抗体重链连接区域(JH)基因的纯合性删除导致内源性抗体产生的完全抑制。在该微生物系突变小鼠中的人类微生物系免疫球蛋白阵列的转化在抗体激发后导致人类抗体的产生。参见，例如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol.733(1993)；以及Duchosal等人，Nature 355258(1992)。人类抗体也可来自噬菌体展示库(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等人，J.Biol.，222581(1991)；Vaughan等人，Nature Biotech 14309(1996))。
双重特异性抗体通过两种免疫球蛋白重链/轻链对的重组共同表达可以产生双重特异性抗体，其中该等两种重链具有不同的特异性。双重特异性抗体是单克隆的，优选人类或人化具有对至少两种不同抗原的结合特异性的抗体。在本发明中，一种结合特异性是用于MCEMP而其它是用于任何其它抗原，优选为细胞表面受体或受体亚单位。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，该等杂交瘤产生十种不同抗体的潜在混合物。但是，该等抗体中仅一种具有正确的双重特异性结构。该正确分子的回收和纯化通常通过亲和力色谱法来完成。
可将具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原组合位点)融合至免疫球蛋白恒定域序列。该融合优选用含有至少一部分铰链、CH2和CH3区域的免疫球蛋白重链恒定域。优选的，含有用于轻链结合的所需位点的第一重链恒定区域(CH1)存在于至少一种融合物中。编码免疫球蛋白重链的DNA以及(若需要)将免疫球蛋白轻链插入于经单离的表达载体中并共同转染于合适的宿主有机体内。在Suresh等人，Methods inEnzymology，121210(1986)中描述展示用于产生双重特异性抗体的合适技术。
复共轭抗体采用已知的蛋白融合技术，例如，通过将一种抗体上的氨基偶合到另一种抗体或其它多肽上的硫醇基可以产生复共轭抗体。如果需要，使用已知的方法可引入硫醇基。例如，使用二硫化物交换反应或通过形成一个硫醚键可以产生包含抗体或抗体片段以及多肽毒素的免疫毒素。用于此目的的合适试剂的例子包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基丁酸酰亚胺。该等抗体可以用于使免疫系统细胞指向有害细胞或治疗人类HIV感染。
多核苷酸另一方面，本发明提供一种经单离的多核苷酸，其包含选自由SEQ ID NO1；SEQ IDNO1的变体；SEQ ID NO1的片段组成的群组的核苷酸序列，编码具有一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，具有该氨基酸序列选自由SEQ ID NO2；；SEQ ID NO2的变体；SEQ ID NO2的片段组成的群组。在一个实施例中，经单离的多核苷酸包含一编码具有氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，该氨基酸序列选自由SEQ ID NO2的氨基酸106至187或其拮抗剂片段组成的群组。
本发明的经单离的多核苷酸优选用于肥大细胞和肺功能的调节中所涉及的MCEMPs的编码序列。将多核苷酸用于产生MCEMPs，其在用于产生特异结合到MCEMPs的促效剂和拮抗剂抗体并抑制或激活肥大细胞脱粒的过程中充当抗原。
载体和宿主细胞另一方面，本发明提供了一种载体，其包含编码本发明之MCEMPs的核苷酸序列的载体以及包含该载体的宿主细胞。载体含有SEQ ID NO2或者，在一个实施例中，与表达MCEMPs所需的任何调节、表达或其它载体序列相组合的SEQ ID NO1的核苷酸455至1018。
通过实例的方式，宿主细胞是哺乳动物细胞(例如CHO细胞)、原核细胞(例如大肠杆菌)或酵母细胞(例如塞里维辛酵母)。进一步提供用于产生有脊椎动物融合多肽的方法及包含在合适用于表达脊椎动物融合多肽的条件下培养宿主细胞以及从该等细胞培养物中回收同样物。本发明包括具有或不具有相关联的天然样式糖基化的蛋白和多肽。当在酵母或哺乳动物表达系统(例如COS-7细胞)中表达时，重组蛋白与相应的天然蛋白在分子量和糖基化样式上类似或有显著不同。哺乳动物MCEMPs在细菌表达系统，例如大肠杆菌中的表达提供非糖基化分子。包含失活的N-糖基化位点的变体蛋白亦在本发明的范畴之内。这种该等变体以更加均质、减少的碳水化合物的方式表达。
MCEMP的重组表达根据本发明，通过将相应的核苷酸序列并入表达载体中并将核苷酸序列在合适的宿主细胞中表达以产生多肽来提供经单离和纯化的重组MCEMPs。
表达载体使用熟知的技术可以制备含有编码多肽的核苷酸序列的重组表达载体。表达载体包括一核苷酸序列，其操作性地链接到与合适的转录和翻译调节核苷酸序列上，例如来自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的核苷酸序列。调节序列的实例包括转录启动子、操纵子、增强子、mRNA核糖结合位点以及控制转录与翻译起始和终止的适当序列。当调节序列与适当多肽的核苷酸序列呈函数相关时，核苷酸序列被“操作性地链接”。因此，如果启动子核苷酸序列控制该适当核苷酸序列的转录，则启动子核苷酸序列被操作性地链接至MCEMP序列。
将通常通过一复制源和一通过识别转化株的选择基因来赋予的所需宿主细胞中复制的能力额外地并入表达载体中。
此外，编码与MCEMPs并非天然相关联的适当信号肽的序列并入于表达载体中。例如，将用于信号肽(分泌引导)的核苷酸序列框架内融合于多肽序列，以使该多肽初始翻译为包含信号肽的融合蛋白。在目标宿主细胞中有功能的信号肽增强适当多肽的细胞外分泌。在多肽从细胞分泌后从多肽上切下信号肽。
宿主细胞用于MCEMPs的表达的合适宿主细胞包括原核细胞、酵母、古生物以及其它真核细胞。在此项技术中熟知与细菌、真菌、酵母以及哺乳动物细胞宿主一起使用的适当克隆和表达载体，例如Pouwels等人，Cloning VectorsA Laboratory Manual，Elsevier，New York(1985)。载体是质粒载体、单或双链噬菌体载体或单或双链RNA或DNA病毒载体。通过熟知的用于使DNA和RNA引入细胞的技术，将该等载体以多核苷酸，优选DNA的形式引入细胞。通过熟知的感染和转换技术在为噬菌体和病毒载体的情况下，亦可及优选将该载体并且优选作为封包或封闭的病毒引入细胞。病毒载体具有复制能力或者是复制缺陷性的。在后者情况下，病毒繁殖通常仅在互补宿主细胞中进行。使用来自现有DNA结构的RNA，亦可以采用无细胞翻译系统来产生蛋白。
在本发明中用作宿主细胞的原核细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。在原核宿主细胞中，多肽包括N末端蛋氨酸残基，以促进原核宿主细胞中重组多肽的表达。从表达的重组MCEMPs上切下N末端蛋氨酸。通常用于重组原核宿主细胞表达载体的启动子序列包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统。
用于在原核宿主细胞中使用的表达载体通常包含一个或多个可选择表型的标记基因。可选择表型的标记基因是，例如，编码传递抗生素耐药性的基因或提供所需自养的基因。适用于原核宿主细胞的表达载体的实例包括来自商业可购得的质粒的载体，例如克隆载体pBR322(ATCC 37017)。pBR322含有用于氨卞青霉素和四环素耐药性的基因及因此提供用于识别经转化的细胞的简单方法。为了使用pBR322构造表达载体，将适当的启动子和DNA序列插入pBR322载体。商业上可购得的其它载体包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicais，Uppsala，Sweden)、pGEM1(Promega Biotec，Madison，Wisconsin.，USA)以及pET(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)和pRSET(InvitrogenCorporation，Carlsbad，California，USA)系列载体(Studier，F.W.，J.Mol.Biol.21937(1991)；Schoepfer，R.Gene 12483(1993))。
通常用于重组原核宿主细胞表达载体的启动子序列包括T7(Rosenburg，A.H.，Lade，B.N.，Chui，D-S.，Lin，S-W.，Dunn，J.J.，以及Studier，F.W.(1987)Gene(Amst.)56，125-135)、乳糖启动子系统(Chang等人，Nature275615，(1978)；以及Goeddel等人，Nature281544，(1979))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人，Nucl.AcidsRes.84057，(1980))以及tac启动子(Maniatis，Molecular CloningA LaboratoryManual，ColdSpring Harbor Laboratory，第412页(1982))。
在本发明中用作宿主细胞的酵母包括来自酵母属、毕赤酵母属、K.放射菌属和科普属的菌。酵母载体常常含有一来自2μ酵母质粒的复制序列源，一自主复制序列(ARS)，一启动子区域，用于多腺苷化的序列，用于转录终止的序列，以及一可选择的标记基因。合适的用于酵母载体的启动子序列包括，在其它的，用于金属硫因的启动子，3-磷酸甘油酸盐激酶(Hitzeman等人，J.Biol.Chem.2552073，(1980))或其它糖分解酶(Holland等人，Biochem.174900，(1978))例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶以及葡萄糖激酶。在Fleer等人，Gene，107285-195(1991)中进一步描述-用于酵母表达的其它合适载体和启动子。在此项技术中熟知其它用于酵母的启动子和载体以及酵母转化方案。
所属领域的技术人员已知酵母转化方案。Hinnen等人，Proceedings of the NationalAcademy of Science USA，751929(1978)中描述了一种此方案。Hinnen方案在选择性培养基上选择Trp.sup.+转化株，其中该选择性培养基由0.67％酵母氮基、0.5％酸水解酪素、2％葡萄糖、10μg/ml腺嘌呤以及20μg/ml尿嘧啶组成。
亦可采用此项技术中熟知的哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统来表达重组MCEMPs，例如，使用用于昆虫细胞中异种蛋白的产生的杆状病毒系统(Luckow和Summers，Bio/Technology 647(1988))或用于哺乳动物表达的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。从病毒基因组中切除用于哺乳动物宿主细胞表达载体的转录和翻译控制序列。常用的启动子序列和增强子序列来自多瘤病毒、腺病毒2、类人猿病毒40(SV40)以及人类巨细胞病毒。将来自SV40病毒基因组的DNA序列用于为哺乳动物宿主细胞中的结构基因序列，例如SV40源、早期和晚期启动子、增强子、接头以及多腺苷化位点的表达提供其它遗传元件。病毒早期和晚期启动子尤其有用，因为两者都易于从病毒基因组中以片段的形式获得，该片段亦含有一病毒复制源。此项技术中熟知用于哺乳动物宿主细胞中使用的示例性表达载体。
当有利时，将MCEMPs作为具有附着于融合片段上的MCEMP的融合蛋白来表达。融合片段常常有助于蛋白的纯化，例如通过允许该融合蛋白由亲和力色谱法单离和纯化。通过培养用融合核酸序列来转化的重组细胞可以产生融合蛋白，该序列编码一蛋白，该蛋白包括附着到蛋白的羧基和/或氨基末端的融合片段。优选的融合片段包括(但不限于)谷胱苷肽-S-转移酶、β-半乳糖苷酶、能够结合至二价金属离子的多组氨酸片段、以及麦芽糖结合蛋白。
由于MCEMPs缺乏一可辨别的引导肽，所以将异种信号肽有利的融合至可溶MCEMP的N末端以提高其分泌。在蛋白从宿主细胞中分泌后，信号肽可以从该蛋白切除。因此避免溶解细胞和回收来自细胞浆的重组可溶性蛋白的需要。在本发明的一个实施例中，可溶融合蛋白包含一融合到第二多肽的来自MCEMP1的细胞外域的第一多肽，为了例如促进纯化或实现二聚体构型而添加第二多肽。合适的第二多肽不抑制可溶融合蛋白的分泌。可溶多肽的实例包括包含整个细胞外域的多肽。本发明之可溶蛋白的代表性实例包括(但不限于)包含SEQ ID NO2的氨基酸的多肽，其中该多肽选自SEQ ID NO2的氨基酸1至82，SEQ ID NO2的氨基酸6至65，或其保留结合MCEMP1配体能力的任何片段。通过许多传统技术中的任一种制备本发明的蛋白，包括截短形式的可溶性多肽的。
表达和回收根据本发明，通过上述的重组表达系统产生经单离和纯化的MCEMPs。该方法包含在足以提高多肽表达的条件下培养经表达载体转化的宿主细胞，该表达载体包含一编码多肽的核苷酸序列。接着从培养基或细胞提取物中回收多肽，取决于采用的表达系统。正如熟练的技术人员所知，根据某些因素，例如所用宿主细胞的类型以及重组多肽是否分泌于培养基中，用于纯化重组多肽的程序变化。当采用分泌重组多肽的表达系统时，首先将培养基浓缩。在浓缩步骤后，可将浓缩液应用到纯化母质，例如凝胶过滤介质上。或者，亦可以采用阴离子交换树脂，例如具有附属二乙基氨基乙基(DEAE)基团的母质或基质。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、右旋糖苷、纤维素或蛋白纯化中常用的其它类型。同时，可以采用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括包含硫丙基或羧甲基的各种不溶母质。此外，可以采用一种或多种使用疏水性RP-HPLC媒介(例如具有附属甲基或其它脂肪族基团的硅胶)、离子交换-HPLC(例如具有附属DEAE或硫丙基(SP)基团的硅胶)或疏水性交互作用-HPLC(例如具有附属苯基、丁基或其它疏水性基团的硅胶)的逆相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤来进一步纯化该蛋白。以多种组合的某些或全部的前述纯化步骤在此项技术中是已知的并且可以用于提供经单离及纯化的重组多肽。
通常通过宿主细胞的初始破坏、离心、如果是不溶多肽则从细胞球提取，或如果是可溶多肽则从上清液提取、接着一次或多次浓缩、盐析、离子交换、亲和力纯化或大小排除式色谱步骤来单离细菌培养中产生的重组多肽。最后，可以采用RP-HPLC用于最终纯化步骤。通过任何传统方法，包括冷冻-解冻循环、超声波降解法、机械破坏或使用细胞溶解剂可破坏微生物细胞。
促效剂和拮抗剂的筛选另一方面，本发明提供一种筛选方法，其用于识别肥大细胞所表达膜蛋白的促效剂和拮抗剂。该筛选方法包含将一由肥大细胞表达的膜蛋白暴露于一潜在的肥大细胞所表达的膜蛋白促效剂/拮抗剂中并测定该潜在的促效剂/拮抗剂是否与蛋白相互作用。如果该潜在的促效剂/拮抗剂与蛋白相互作用，尤其是通过结合到蛋白，则存在强烈的推定该潜在的促效剂/拮抗剂在体内投予患者并暴露于天然的肥大细胞所表达的膜蛋白时真正充当促效剂或拮抗剂。通过将能够产生介体的肥大细胞暴露于促效剂/拮抗剂并测量肥大细胞脱粒，可以将使用本方法识别的促效剂或拮抗剂定性为促效剂或拮抗剂。促效剂增加脱粒；拮抗剂减少脱粒。另一种用于筛选的方法包含用一含有MCEMP DNA结合序列的指针基因构造转染细胞。优选的，该潜在的促效剂/拮抗剂是有机化合物或多肽，包括抗体。筛选方法适用于识别充当用于预防或治疗疾病的药物的化合物，尤其是和非疾病状态相比，特征为细胞因子的产生相对过低或过高的疾病。
不利副作用筛选另一方面，本发明提供了一种筛选方法，其用于测定药物在因为所需的指征而投予动物时是否有可能引起与减少或增加肥大细胞活性，尤其是脱颗粒相关联的不良副作用。该筛选方法包含将表达MCEMP的肥大细胞或经纯化的MCEMP暴露于药物并测定该药物是否与蛋白相互作用或模拟蛋白配体的生物学功能。如果药物与MCEMPs相互作用，就存在药物当用于所需指征而投予动物时引起不利副作用的可能。该不利副作用由肥大细胞功能或活性中的不良改变，尤其是有害的脱粒引起的。通过该方法可以筛选的药物包括(但不限于)多肽、蛋白、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核苷酸、有机分子、生物有机分子、模拟肽、药理学药剂及其代谢物、以及转录和翻译控制序列。在一个优选实施例中，用于特定指征投予的抗体进行筛选以观察其是否与MCEMPs交叉反应以及因此在投予用于预期的指征时是否有可能引起有害的副作用。
MCEMP表达的调节另一方面，本发明提供一种方法，其用于通过干扰编码蛋白的DNA或RNA多核苷酸的转录或翻译来阻断或调节MCEMPs的表达。该方法包含将一能够表达MCEMPs的细胞暴露于一干扰编码蛋白的DNA或RNA多核苷酸的正常转录或翻译的分子。该分子可以是有机分子、生物有机分子、反义核苷酸、RNAi核苷酸或核糖酶。
在一个优选实施例中，该方法包含通过编码细胞暴露于一与MCEMP的DNA或与调节MCEMP编码DNA的表达的DNA反义或形成三螺旋的多核苷酸来阻断或调节MCEMPs表达。将细胞以足够抑制或调节蛋白表达的量暴露于反义多核苷酸或形成三螺旋的多核苷酸中。同时，本发明提供一种方法，其通过将一种与编码MCEMP的DNA或与调节MCEMP编码DNA的表达的DNA反义或形成三螺旋的多核苷酸投予动物以阻断或调节动物中MCEMPs的表达。将反义多核苷酸或形成三螺旋的多核苷酸以足够抑制或调节动物体内MCEMPs的表达的量投予动物。优选的，该反义多核苷酸或形成三螺旋的多核苷酸是DNA或RNA多核苷酸。
在该技术中熟知用于将细胞暴露于反义多核苷酸以及用于将反义多核苷酸投予动物的方法。在一种优选方法中，使用已知的方法将多核苷酸被并入细胞基因组中并允许在细胞内表达。所表达的反义多核苷酸结合到用于编码MCEMPs的多聚核苷酸并干扰其转录或翻译。
当在各种类型的细胞上，例如肥大细胞或肺细胞进行研究时，该方法适用于抑制MCEMP的表达，以及用于预防或治疗与非疾病状态相比，特征为细胞活性，尤其是脱粒过度为的疾病。
疾病易患性的诊断另一方面，本发明提供了一种方法，其用于诊断患者发生由表达MCEMPs的细胞的不良活性而所致疾病的易患性。本发明的基础是一个发现，即MCEMPs在某些患者的细胞、组织或体液中的存在或增高量预示着该患者易患某些免疫性疾病。在一个实施例中，本方法包括从患者处收集细胞、组织或已知含有即使有也及少数的MCEMPs的体液标本，分析组织或体液以测定组织中是否存在MCEMPs，并根据组织或体液中MCEMPs的存在来预计患者对某些免疫性疾病的易患性。在另一个实施例中，该方法包括从患者处收集细胞、组织或已知含有规定含量MCEMPs的体液标本，分析组织或体液以测定组织中的MCEMPs量，并根据与为正常细胞、组织或体液所设定的规定或测试含量相比的该组织或体液中由肥大细胞表达的膜蛋白的量的变化，来预测该病人对于某些免疫性疾病的易患性。MCEMPs的规定含量可以是根据文献数值的已知量，或者通过测量正常细胞、组织或体液中的量来提前确定。特定言之，MCEMPs含量在某些组织或体液中的确定允许特效和早期的，较佳是在疾病发生之前的，对患者体内免疫性疾病的检测。使用本方法可以诊断的免疫性疾病包括但不局限于本文所描述的免疫性疾病。在较佳实施例中，组织或体液是肥大细胞和肺组织。
疾病的预防和治疗另一方面，本发明提供了一种方法，用于预防或治疗哺乳动物体内的肥大细胞介导性疾病。本方法包括将其量足以预防或治疗疾病的MCEMPs促效剂或拮抗剂投予哺乳动物。促效剂或拮抗剂与MCEMP或其配体结合并调节细胞的活性，尤其是肥大细胞的脱粒性，以产生无病状态下的肥大细胞介体含量特性。较佳地，该疾病是过敏症、哮喘、自身免疫作用或其它炎症疾病。最好该疾病是过敏症或哮喘。
MCEMPs促效剂或拮抗剂的剂量依据特定哺乳动物的年龄、体形大小和特性以及疾病的特性而变化。熟练的技术人员可以根据这些因素来确定剂量。可以按照疾病治疗方法来投予促效剂或拮抗剂，例如在几天内单次或数次给药以改善疾病状态，或在长期时间段内定期给药以预防过敏症或哮喘。
可以通过任何可接受的方法，包括注射、植入以及类似方法将促效剂和拮抗剂投予哺乳动物。较佳使用注射和植入，因为它们允许对给药所用的时间和剂量含量进行精确的控制。促效剂和拮抗剂较佳经胃肠外投予。如本文所使用的胃肠外给药意指静脉内、肌肉内或腹腔内注射，或者通过皮肤植入。
当通过注射给药时，促效剂和拮抗剂可以以含有任何生物相容性以及促效剂和拮抗剂的相容载体(例如各种媒介、佐剂、添加剂和稀释剂)的可注射配方形式投予哺乳动物。水性载体例如不含非挥发性热原的水、无菌水和抑菌水也合适制成可注射溶液。除了这些形式的水之外，还可以使用几种其它的水性载体。这些包括可被消毒的等张注射成分，例如氯化钠、林格氏液、葡萄糖、葡萄糖和氯化钠以及乳酸盐林格氏液。非水性载体，例如棉籽油、芝麻油或花生油和例如异丙基肉豆蔻酸盐的酯类，也能被用作该等成分的溶解系统。另外，还可以加入各种提高该成分稳定性、无菌性以及等张性的添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、鳌合剂以及缓冲剂。然而，依据本发明，所用的任何载体、稀释剂或添加剂都必须是生物相容性的，并且与促效剂和拮抗剂相容。
MCEMP多肽的诊断本发明的抗体还可以用于一种诊断方法，该诊断方法用于检测表达于特殊的细胞、组织或体液或其组分中的MCEMPs。本方法包括将细胞、组织或体液或其组分暴露于本发明的一种与MCEMP结合的抗体，并且确定是否细胞、组织或体液或其组分与抗体结合。与结合抗体的抗体细胞、组织或体液或其组分相结合的细胞、组织或体液或其组分被诊断为含有MCEMPs的细胞、组织或体液。这种方法可以用于确定是否一种特定细胞、组织或体液为先前已知含有MCEMPs的某一类型的细胞、组织、或体液之一。可以使用本技术领域中已知的各种诊断方法，例如在异相或同相中进行的竞争性结合化验、直接或间接多层化验以及免疫沉淀化验。
有可能通过使用其它与MCEMPs结合的成分来检测MCEMPs的存在，其中该等成分被标记并且能够被检测；而非使用诊断工具盒中的单克隆抗体。这些成分可以通过筛查化合物库和/或肽库来单离。通过使用一种如肽或其它共价化合共轭物的连接物来将化合物与标记物连接，可以借助一种荧光标记物或一种放射活性标记物来标记能够与MCEMPs相互作用的库成员。可以使用众所周知的方法，将所产生的已标记化合物用于一种诊断工具盒，以指示MCEMP阳性细胞的存在。
MCEMP多肽的纯化本发明的抗体还可以用于一种方法中，该方法用于单离并纯化来自重组细胞培养物、污染物以及天然环境的MCEMPs。本方法包括将一种含有MCEMPs的化合物和污染物暴露于一种能够与MCEMPs结合的抗体，使得MCEMPs与抗体结合，从污染物中分离抗体-MCEMP复合物，以及从复合物中回收MCEMPs。可以使用本技术领域中已知的各种纯化方法，例如从重组细胞培养物或天然来源中回收MCEMPs的亲和性纯化法。在这种方法中，使用本领域中众所周知的方法将选择MCEMPs的抗体固定于合适的支架上，例如交联葡聚糖树脂或滤纸上。然后将被固定的抗体与含有待纯化MCEMPs和污染物的样品化合物相接触。然后用合适的、能够充分去除样品中除与固定抗体相结合的MCEMPs外所有材料的溶剂清洗支架。最后，用另一种从抗体上去除MCEMPs的合适溶剂清洗支架。
剔除动物在另一方面，本发明提供了一种剔除动物，其包括一种其内生MCEMP基因中具有杂合性或纯合性破裂的基因组，该基因抑制或防止具有生物功能的MCEMPs的表达。较佳地，本发明的剔除动物在其内生MCEMP基因中存在纯合性中断。较佳地，本发明的剔除动物是一种小鼠。使用熟练的技术人员已知的技术可以容易地取得剔除动物。基因中断可以通过好几种方法实现，包括将一个终止密码子导入多肽编码序列的任何部分以产生一种无生物活性的多肽；将突变导入启动区或其它调节序列以抑制或防止多肽表达；将一种外生序列插入基因以减除基因活性；以及从基因删除序列。
有数种技术可以用于将特殊的DNA序列导入哺乳动物微生物系并使得这些序列被稳定传递给随后的每一代(转基因)。最常用的技术是将DNA直接微注射入受精卵母细胞的原核中。源自这些卵母细胞的小鼠或其它动物将以大约10％至20％的频率成为转基因奠基者，其将通过繁殖产生不同的转基因小鼠系。在本技术领域，例如美国专利号为4,736,866、4,870,009和4,873,191的美国专利中以及在Hogan，B.所著的Manipulating the Mouse Embryo(由位于Cold Spring Harbor，N.Y.的Cold SpringHarbor Laboratory出版社于1986年出版)中，通过对特别是例如小鼠的动物进行胚胎处理和微注射，，来产生转基因动物的方法已经成为惯用的。类似的方法也用于产生其它转基因动物。
借助特殊删除的基因，可以使用胚胎干细胞(“ES细胞”)技术来产生剔除小鼠(以及其它动物)。可以在体外培养全能胚胎干细胞并对其进行基因修改，将其与小鼠胚胎聚合或微注射入小鼠胚胎以产生一种嵌合(chemeric)小鼠，其可以将这种对基因所作的修改传递给其后代。通过定向繁殖，就可以获得一种缺乏这种基因的小鼠。还有其它几种方法可以用于产生基因经过修改的动物，例如可以使用卵母细胞单精子微注射技术(ICSI)来产生转基因小鼠。这需要将精子细胞的头部微注射入未受精卵母细胞的胞浆内，刺激卵母细胞受精，并随后激活预植入胚胎的适当的细胞分裂。由此获得的小鼠胚胎被转移给一只假孕的雌性受体。该雌性受体将生出一窝小鼠。在用于产生转基因小鼠的ICSI中，将一个精子或精母细胞头部的悬浊液与含有所需DNA分子(转基因)的溶液一起培育。这些物质与精子相互作用，精子一旦被微注射，就充当外来DNA的载体。一旦进入卵母细胞，该DNA就被整合入基因组，并产生一种转基因小鼠。这种方法提供比使用传统前核微注射方案至今为止所获得的更高的转基因鼠产量(高于80％)。
疫苗在另一方面，本发明提供了一种用于免疫哺乳动物以抵抗由肥大细胞或其它MCEMP引起的疾病的疫苗，其包含一种医药学上可接受的载体以及一种或多种MCEMPs或其免疫原性片段。将该疫苗投予患有或易患MCEMP介导的疾病的哺乳动物。疫苗在经免疫的哺乳动物中诱导抗体的构型，该抗体与MCEMPs相互作用并调节表达MCEMPs的细胞的活性和功能，包括调节肥大细胞或其它表达MCEMP的细胞的浓度。该疫苗可以含有一种或多种MCEMPs或免疫原性片段，单独或与合适的佐剂和/或其它抗原与治疗剂组合。
在另一方面，本发明提供一种用于免疫哺乳动物以抵抗由肥大细胞或其它MCEMP介导的疾病的方法，其包含将一种或多种MCEMPs或其免疫原性片段注射于哺乳动物中。该MCEMP或免疫原性片段可以单独或与合适的佐剂和/或其它抗原与治疗剂组合来注射。
总体而言，使用主要的组织相容性复合物(MHC)分子，即MHC I类分子和MHC II类分子，将抗原呈递给免疫系统。内源性或自身抗原，例如MCEMPs，通常结合到MHC I类分子并被呈递给细胞毒性T细胞(“CTL(s)”)。外源性抗原，例如病毒抗原，通常结合到MHCII类分子并被呈递给与B细胞相互作用的T细胞以产生抗体。
通过II类途径呈递称作MHCII类限制性抗原或II类抗原的抗原被T细胞识别并激活T细胞。此等经激活的T细胞对II类抗原引起一种完全性免疫响应。由于自身抗原正常情况下不会通过MHCII类途径呈递给免疫系统，所以免疫系统不会将此等自身抗原识别为外来性的并且不会对该抗原形成完全性免疫响应。
在一个实施例中，将一MCEMP抗原与其它设计为刺激或操纵免疫响应的抗原组合同时或同期注射。优选的，该MCEMP抗原作为一种构造的部分来注射，该构造包含MCEMP抗原与其它设计为诱导细胞免疫响应的抗原。将该等其它抗原设计为增强到T细胞的抗原呈递并对例如MCEMP的抗原诱导一种更有效的免疫响应，其通常引发一种不完全性免疫响应，因为其不能被免疫系统识别为外来抗原。
通常，将MCEMP与II类抗原组合来注射。使用其它抗原通过与被免疫系统识别为自身抗原的MCEMP抗原组合的MHC II类途径来刺激免疫系统，该自身抗原引发微弱或不完全性免疫响应、有助于确保MCEMP抗原由免疫系统作为外来抗原来处理，该外来抗原引发完全免疫系统响应。优选的，MCEMP抗原和II类抗原是一构造的部分，其中该抗原是单个分子的部分。另一方面，本发明提供一构造，其在单个分子中包含一MCEMP抗原和另一种抗原。优选的，其它抗原是II类抗原。
另一方面，本发明提供了一种用于免疫哺乳动物以抵抗肥大细胞或其它MCEMP介导的疾病的疫苗，其包含一医药学上可接受的载剂以及一含有编码MCEMP或其抗原性片段的核苷酸序列的载体。优选的，该疫苗包含一种核苷酸序列，其选自由SEQ ID NO1；SEQID NO1的一种变体；以及SEQ ID NO1的一个片段组成的群组。最优选的，该疫苗包含编码具有SEQ ID NO2(“MCEMP1”)所示的序列的MCEMP或其抗原性片段的核苷酸序列，尤其是一包含细胞外域(氨基酸106至187)或其抗原性片段的抗原性片段。
本发明的核苷酸疫苗适用于预防或治疗由于辨别自身与非自身造成免疫系统失常而引起的疾病。该疫苗使得免疫系统引发自身保护性免疫并因此将其自身的有害活性限制在需要该响应的时候。特别的，DNA疫苗提出一种在体内表达抗原用于产生体液和细胞免疫响应的新方法。在不仅为外来抗原和肿瘤，而且为自身抗原，例如T细胞受体基因或自体细胞因子获得免疫性中，此项技术已经被证明为成功的。由于DNA疫苗引发细胞和体液响应两者以抵抗给定构造的产物，该等疫苗在清除患病或有害的细胞中可以成为一种非常有效的工具。进入活着的宿主中的基因表达盒的直接注射把许多细胞转化于用于所引入基因产物的生产的工厂。此等传递基因的表达具有重要的免疫学结果并导致宿主的特异性免疫激活以抵抗新颖的经表达的抗原。此独特的免疫方法能够克服基于抗原的传统方法的缺陷并提供安全而有效的预防性与治疗性疫苗。宿主的正常细胞(非造血细胞)可以表达MCEMP抗原并将其呈递给免疫系统。经转染的细胞将其细胞表面上的抗原片段连同I类或II类主要组织相容性复合物(MHC I或MHC II)来展示。MHC I展示担当用于由细胞介导的免疫反应的紧急召唤，其派遣破坏经转染细胞的CTLs。通常，当细胞病的病毒感染宿主的正常细胞时，病毒蛋白经内源性地处理并呈递于细胞表面上，或者由MHC分子呈递于片段中。由正常细胞转染并表达的外来经定义的核苷酸可以模拟病毒感染。
在如本文中所述的一种载体上编码的免疫原性融合多肽包含一个T细胞抗原决定基部分以及一个B细胞抗原决定基部分。在该载体上编码的T细胞抗原决定基部分含有包含一个广范围或“通用”的辅助T辅助细胞抗原决定基，其结合表现多重(即2、3、4、5、6或更多)II类主要组织相容性(MHC)分子的抗原并与一T细胞抗原受体形成三元复合物，即MHC抗原T细胞抗原受体。“非内源性蛋白”为对于待治疗的哺乳动物非内源的蛋白。用做免疫原性融合多肽的T细胞抗原决定基部分的该等非内源性蛋白或其片段包括破伤风类毒素；白喉毒素；与恒定链有关的II类MHC；流感凝血T细胞抗原决定基；锁眼帽贝血蓝质(KLH)；一种来自已知疫苗包括百日咳嗽疫苗、BacileCalmette-Guerin(BCG)肺结核疫苗、脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、以及结核菌素的纯化蛋白提取物衍生物(PPD)的蛋白；以亦及能够与结合到多重II类组织相容性分子的抗原表达位点相结合上的合成肽，例如那些含有由Alexander等人(Immunity，1751-761(1994))所描述的天然氨基酸的合成肽。当被附着至MCEMP的抗原决定基部分时，T细胞抗原决定基部分使得免疫原性融合多肽能够打破耐受性并允许产生能够与内源性MCEMPs发生反应得的抗体。通过“打破耐受性”意指迫使生物体有机体着手免疫响应于对于在正常情况下生物体有机体找不到免疫原性的一种蛋白上，例如内源性MCEMPs产生免疫反应。
最近，DNA疫苗已显示为一种用于免疫抵抗各种感染性疾病的有用的方法。Michel，ML等人，Huygen，K等人，以及Wang，B等人，含有微生物抗原基因的裸DNAs的递送可诱导宿主中抗原特异性免疫响应。使用基于DNA的疫苗的抗原特异性免疫响应已经显示出一些有用的效果。Wolff，J.A.等人。最近的研究已经使用一种由DNA介导的用于CEA和MUC-1的疫苗阐述免疫的潜在可能性。Conry，R.M.等人，以及Graham，R.A.等人。
已显示基于DNA的疫苗比活的减毒病毒免疫具有更好的抗原表达、毒性以及致病性控制程度。在给Dow等人的题为“Gene Therapy for T Cell Regulation”的美国专利第5,705,151号中详细描述用于DNA疫苗的上述医药上可接受的载剂以及上述传递媒介的构造、操作和使用，其针对于抗肿瘤治疗，并藉此将其以引用方式并入，如同本文所完全阐明的。
在另一方面，本发明提供一种方法，其用于免疫哺乳动物以抵抗肥大细胞或其它MCEMP介导的疾病，其包含注射一种医药上可接受的载体以及一种含有编码MCEMP或其抗原性片段的核苷酸序列的载体。优选的，该方法包含注射一种包含核苷酸序列的疫苗，该核苷酸序列选自由SEQ ID NO1；SEQ ID NO1的一种变体；以及SEQ ID NO1的一个片段组成的群组。最优选的，该疫苗包含编码MCEMP核苷酸序列，该MCEMP具有SEQ IDNO2(“MCEMP1”)中所示的序列或其抗原性片段，尤其是一种包含细胞外域(106至187氨基酸)或其抗原性片段的抗原性片段。
MCEMP1的识别使用人类肥大细胞mRNA作为检测器以及来自人类THP-1(～45％)、乌迪(Daudi)(～35％)和TF-1(～20％)细胞系的mRNAs的组合作为驱动器，通过次代杂交识别MCEMP1。大约有45个次代克隆被单离、测序，并用于在公开可利用的核苷酸/蛋白数据库中寻找匹配物。通过次代杂交单离的一种包含369个碱基对(bp)插入物的cDNA克隆仅与一些含有部分cDNA序列的EST克隆相匹配，但是其在GenBank数据库中编码已知或预期蛋白的任何cDNA序列都未显示显著的同源性。
两种寡核苷酸引子5’CTCCCAGAAAGGTGATGAA 3’(SEQ ID NO3)和5’TAGACAGAAAACACGCCGCA 3’(SEQ ID NO4)根据369bp插入序列来合成并用于筛选人类外周血淋巴细胞cDNA文库(OriGeneTechnologies，Inc.，Rockville，MD.)。单离并序列若干cDNA克隆。通过将cDNA序列与GenBank数据库中的基因组序列相比较来识别三种替代裂解形式的mRNA。两种cDNA克隆代表异常的mRNA转录，因为在全部三种读取框架内的假定翻译产物由终止密码子中止。然而，多数cDNA克隆预测了一蛋白产物，其来自MCEMP1基因的七个外显子。一种该cDNA克隆(9E)含有编码区域的全长(564bp)，大约450bp的5’未翻译区域以及大约726bp的3’未翻译区域。
另外，使用一种覆盖起始蛋氨酸密码子5’GACCATGGAAGTGGAGGAAATCTAC 3’(SEQ IDNO5)的寡引子以及一种覆盖终止密码子5’GCAGGTGCAGCCCCATCTT 3’(SEQ ID NO6)的寡引子从HMC-1细胞系中获得了cDNA克隆。此等cDNAs编码187氨基酸的多肽。预计的起始蛋氨酸密码子与一理想的Kozak序列基序(ACCATGG)相联系，使其为翻译起始达到最佳。在cDNA克隆中的氨基酸残基167(Ile←→Val)处发现一种等位基因的变体，其由第一个密码子位置(ATT←→GTT)的单个核苷酸改变引起。
计算机辅助分析预计MCEMP1具有一位于氨基酸残基83至105处的跨膜序列。那里并未显示为可辨别的N末端疏水性引导序列。MCEMP1的预计分子量为21kDa。核苷酸及氨基酸序列两者与GenBank或欧洲分子生物学实验数据库的比较揭示其与BAB25183，由RIKEN Genome Exploration Research Group Phase II Team和FANTOM协会所识别的假定的小鼠序列共享37％的氨基酸一致性。使用一种基于线程的折叠识别法(Kelley等人，J.Mol.Biol.299499-520(2000))进行三维结构预测。简要说来，使用已知蛋白结构的文库，将MCEMP1序列“穿线”并对相容性计分。在计分系统中使用了四种组分1D和3D序列轮廓与二级结构以及求助潜在信息相配对。由于跨膜蛋白螺旋的预测显示MCEMP1含有一个跨膜片段(氨基酸83至105)，所以已将折叠识别方法(foldrecognition process)分别用于N末端部分(氨基酸1至82)和C末端部分(氨基酸106至187)以提高准确性。结果显示N末端区域(氨基酸6至65)可能采取了一种Ig样β三明治折叠，与小鼠T细胞受体α链的Ig域共享21％的一致性。
实例通过本发明之优选实施例的下列实例可进一步阐明本发明，但是，应了解所包括之该等实例仅用于说明的目的且除非特定指出，否则它们并不欲限制本发明的范畴。
实验方法细胞培养将人类脐血CD34+细胞(Bio-Whittaker，Walkersville，MD)在含有补充有20％FBS(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、2mM L-谷氨酰胺、50μM 2-ME、100单位/毫升盘尼西林、100微克/毫升链霉素、10微克/毫升庆大霉素、80纳克/毫升SCF、50纳克/毫升IL-6以及5纳克/毫升IL-10的RPMI 1640(Invitrogen)的培养基中培养多达9周。用抗类胰蛋白酶mAb对细胞进行染色以测定肥大细胞的百分比。将细胞悬液在5×105细胞/毫升的密度接种并将补充的细胞因子培养基每周替换一次。将重组人类IgE用于IgE交叉链接实验。按照ATCC的推荐培养其它细胞系。
表达构造和转染使用两种寡引子5’CACCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGGAAGTGGAGGAAATCTACAAGC3’(SEQ ID NO7)和5’TTGAGGTGAGGACTGTGGCATTT3’(SEQ ID NO8)来对Flag标记的MCEMP1 cDNA进行PCR扩增。将PCR产物克隆于pcDNA3.1D/V5-His载体(Invitrogen)内。此生产质粒MCEMP1-FV，其表达在N末端具有Flag标记及在C末端具有V5标记的MCEMP1融合蛋白。对于MCEMP1的N末端区域和Fcγ1融合构造(MCEMP1T-Fcγ1)而言，编码氨基酸1-83的区域PCR扩增，并通过PCR的额外循环连接至Fcγ1编码区域(SOEing，Ho，S.等人，1989，Gene 7751-59)。将该融合蛋白的编码区域克隆于pSecTag/FRT/V5-His-TOPO(Invitrogen)中。
使用Lipofectamine Plus系统(Invitrogen)来执行瞬间转染。在100毫米组织培养盘中将20毫克质粒DNA转染于293T细胞内；并在40个小时后，将细胞收获在基于PBS的无酶细胞解离缓冲液(Invitrogen)中用于蛋白分析。
蛋白提取和西方墨点分析(Weatern Blot Analysis)通过在100微升的双蒸馏水中重新悬浮3×105个细胞，并在添加等体积的2×样品装载缓冲液后在98摄氏度加热5分钟来制备整个细胞蛋白样品。为了从可溶部分中分离膜部分，通过均质作用或冰冻-解冻循环使5×105个细胞经受溶解程序。对于均质作用，先将细胞在150微升双蒸馏水中培养10分钟，接着多次通过一22#的洗涤器针。其后回添十分之一的10×溶解缓冲液(200mM Tris-HCl，PH7.6；700mM KCl；50mM EDTA)并培养5分钟。对于冰冻-解冻法，将细胞悬浮在1×溶解缓冲液中，并冰冻-解冻三次。通过在微离心机中以最大速度离心从可溶蛋白中分离不溶的膜部分。
在15％的SDS-PAGE中分离蛋白。通过使用抗-Flag(Sigma)或抗-V5单克隆抗体(Invitrogen)如前所述执行西方墨点。
免疫荧光染色在100微升含有1％BSA的无酶细胞解离缓冲液(Invitrogen)中于4℃下将经转染的293T细胞(1×106)洗涤并预培养20分钟。接着将细胞与FITC共轭的抗-Flag(20微克/毫升)(Sigma-Aldrich)或抗-V5 mAb(10微克/毫升)(Invitrogen)在相同的缓冲液中培养30分钟。洗涤3遍后，将细胞用100微升具有1％多聚甲醛的1×PBS重新悬浮。或者，将人类脐血来源的肥大细胞、HMC-1和THP-1细胞与抗-MCEMP1单克隆抗体一起培养，接着与第二抗体、FITC共轭的山羊抗小鼠IgG抗体一起培养。使用FACScan(Becton Dickinson，Franklin Lake，NJ)和/或显微镜分析全部样品。
抗-MCEMP1 mAbs的生成用含有N(氨基酸1-83)末端和C末端编码区域(氨基酸105-187)的抗原展示构造来使小鼠免疫。按照传统方法生成杂交瘤克隆及筛选。在ELISA筛选中，我们用MCEMP1-FV或MCEMP1融合蛋白来将96井板涂层，接着与杂交瘤克隆的上清液一起培养。将山羊抗小鼠IgG用做第二抗体来产生信号。
生物素化膜蛋白的免疫沉淀在10毫克/毫升D-生物素基-e-氨基山羊酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Boehringer)/10mM硼酸钠，pH8.8/150mM氯化钠中将细胞表面膜蛋白生物素化。泛泛地洗涤细胞，并用具有0.5％NP40的1×PBS和蛋白酶抑制剂混合物(Boehringer)溶解。使用抗-MCEMP1mAb和蛋白A-琼脂糖颗粒(Amersham)按照生产商的推荐执行免疫沉淀。在SDS-PAGE中分离经免疫沉淀的蛋白并通过链酶抗生物素蛋白-HRP和ECL侦测试剂(Amersham)来测定生物素化的蛋白。
实例1MCEMP1 mRNA表达的定量实时PCR分析使用Primer Express 2.0(Applied Biosystems，Inc.)从MCEMP1核苷酸序列中选择出两组寡核苷酸引子5’AAGGTGATGAATGAATAGGACTGA 3’(SEQ ID NO9)和5’CCACCGTGACATGCCGAGACT 3’(SEQ ID NO10)且加以合成并用于RT-PCR反应以监测MCEMP1的表达。
采用ABI Prism7900(Applied Biosystems，Inc.)序列测定系统，使用CYBR Green试剂，根据生产商的指导执行实时定量PCR。单离RNAs以测量MCEMP1在下列细胞中的表达含量Daudi(来自Burkitt’s淋巴瘤的B淋巴母细胞系，ATCC No.CCL-213)，THP-1(一单核细胞白血病细胞系，ATCC No.TIB202)，TF-1(一骨髓祖细胞系，ATCC No.CRL-2003)，HMC-1(一肥大细胞系)；初始单核细胞；初始B细胞；初始嗜碱性细胞；CD34+祖细胞；在5周或9周体外培养脐血来源的肥大细胞(CBMC)；巨噬细胞以及由LPS激活的巨噬细胞；HPB-ALL(一T细胞白血病细胞系)；初始淋巴细胞；嗜中性细胞；以及初始人类血管内皮细胞(HUVAC)。
将等量的来自上述细胞系的每一RNAs用作反应中的PCR模板以获得阈循环(Ct)。使用来自18S RNAs的已知Ct将Ct规格化以获得ΔCt。为了在不同细胞系中比较MCEMP1的基因表达的相对含量，通过使用最低表达含量作为基础来计算ΔΔCt，该基础接着转化为实际成倍表达的不同数值。发现MCEMP1 mRNA在体外培养的肥大细胞于5周和9周中表达。中等含量发现于单核细胞中。在所检查的五种人类组织中，MCEMP1在肥大细胞和肺细胞中高度表达，但是在心脏、肝脏、脑、气管和肾脏中所观察到的表达极少。
实例2MCEMP1蛋白的表达为了测定MCEMP1基因产物，通过使用两种寡引子5’CACCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGGAAGTGGAGGAAATCTACAAGC3’(SEQ ID NO11)和5’TTGAGGTGAGGACTGTGGCATTT 3’(SEQ ID NO12)来PCR扩增MCEMP1 cDNA并克隆于pcDNA3.1D/V5-His载体(Invitrogen)中，具有一Flag标记序列附着于MCEMP1的N末端上及一V5标记融合于C末端。将产物克隆、pMCEMP1-FV瞬间转染于293T细胞中。转染40个小时后，收获经转染的细胞并通过均质作用或冰冻-解冻法分为膜部分和细胞溶质部分。使用抗-Flag或抗-V5mAb以及抗-小鼠IgG共轭执行西方墨点分析。MCEMP1表达为主要35kDa蛋白。在MCEMP1转染的细胞中也存在次要形式的29和32kDa蛋白。事实上所有蛋白带都大于所计算的分子量，27kDa(21kDa加上标记的6kDa)，意味着MCEMP1发生了翻译后改质，例如通过293T细胞中的糖基化。细胞分馏导致MCEMP1在膜部分中的存在，但在细胞溶质中存在的极少。
实例3投予MCEMP1-结合分子本发明的拮抗剂性或促效剂性MCEMP1结合分子，例如抗体及其生物活性片段，可以适当的药理学构型通过多种途径投予患者，包括(但不限于)静脉内输液、静脉内快速浓注、以及腹腔内、皮内、肌肉内、皮下、鼻内、气管内、脊髓内、颅内和口服途径。该种投予使得其能够结合到内源性MCEMP1并抑制/刺激MCEMP1的活性。此等拮抗剂亦可阻断MCEMP1天然配体的结合。
该种抗体的估计剂量为介于10及500微克/毫升血清之间。实际的剂量可以在临床试验中按照用于测定最佳剂量的传统方法来测定，即，从体外和体内实验的范围推断剂量，及接着投予该范围内的各种剂量以测定哪一种是最有效的。
实例4亚细胞定位为了测定MCEMP1是否表达为II型跨膜蛋白，通过均质作用或冰冻-解冻法溶解经MCEMP1 FV转染的细胞并通过离心从可溶部分中分离膜部分(小球)。抗-Flag和抗-V5mAbs两者检测MCEMP1主要存在于膜部分中；在可溶部分中检测到极少。为了进一步测定Flag-和V5-标记的MCEMP1是否在细胞表面表达以及在膜中的方位，将MCEMP1 FV转染的细胞在活体状况下与FITC共轭的抗-Flag或抗-V5mAb一起培养。荧光显微镜和流式细胞仪分析显示尽管抗-V5mAb结合到膜上的MCEMP1-FV上，抗-Flag mAb不结合到膜上(表1)。此等结果显示MCEMP1是一种II型跨膜蛋白，其具有C末端暴露于细胞膜外及N末端暴露于细胞浆室中。
实例5小鼠抗MCEMP1的单克隆抗体的特征生成抗MCEMP1的鼠单克隆抗体(mAb)并通过ELISA、FACS和西方墨点分析来筛选。泛泛地表现三种mAb的特征。抗体克隆AZ1C11结合到MCEMP1-FV和MCEMP1T-Fcγ1两者上，而抗体克隆AZ1A8和AZ3H6仅正面地结合到MCEMP融合蛋白的全长。此显示AZ1A8和AZ3H6与MCEMP1的C末端区域特异性地相互作用及AZ1C11与MCEMP1的N末端区域相互作用。经MCEMP1-Fc融合蛋白转染的THP-1和293T细胞的免疫荧光染色确认了上述结果，即抗体克隆AZ1A8和AZ3H6结合到活体细胞中的MCEMP1的C末端而克隆AZ1C11不结合到活体细胞。然而，在西方墨点分析中，AZ1A8和AZ3H6不与MCEMP1结合但克隆AZ1C11确实与MCEMP1结合。
实例6天然MCEMP1在脐血来源的肥大细胞(CBMC)和HMC-1细胞中的表达与检测实时RT-PCR分析显示MCEMP1在肥大细胞以及在两种长期培养的细胞系，HMC-1和THP-1中有差别的表达。CBMC、HMC-1和THP-1细胞的免疫荧光染色确认这些结果。用抗体克隆AZ1A8和AZ3H6在那三种类型的细胞中检测到天然MCEMP1但在其它经测试的细胞中检测不到。抗体到CBMC和HMC-1细胞的结合以剂量依赖性的方式运转，即输入抗体越多导致由抗体染色的细胞的荧光强度改变越大。通过生物素化膜蛋白的免疫沉淀进一步评价MCEMP1在CBMC中的表达。通过抗-MCEMP1抗体检测到分子量为～21kD的蛋白但不能通过任何其它经测试的抗体所检测到。因为检测到的MCEMP1的分子量与基于氨基酸序列的预测出的相同，所以天然的MCEMP1未经糖基化。
表1
经MCEMP1-FV转染的293T细胞的免疫荧光染色
在本说明书中，已揭示本发明之典型的优选实施例，且尽管采用了特定的术语，但是其仅用于一般性及描述性意义而并无限制的目的，本发明的范畴已陈述在上文的权利要求中。显然，根据上文的教示，可对本发明作出许多修改和变化。因此，应当了解，在附属的权利要求范围内，本发明可以不同于本文的特定描述的方式来实行。
序列表<110>唐纳士公司(Tanox，Inc)<120>人类肥大细胞所表达的膜蛋白<130>TNX0201<150>USP 60/345,909<151>2002-01-03<160>12<170>PatentIn 3.1版<210>1<211>1750<212>DNA<213>人类肥大细胞<220>
<221>CDS<222>(455)..(1018)<223>编码序列，包括终止密码子<400>1ggggtggagc tgaggggtgg agctgaggct ggagggagga aggtgtgggg ggacccaggg60gtcctgtctc caagcctggt tgctcttacg cgaaaagttg ggacactgag gtgtcacagc120ttctcttttg aaatggagag gaggtaggag ggtgaggtcc atccaggtag acacagacac180acacagagac cacagcttcc tgtaacattt ccgagtgtcg aattccatct cccggtctag240aggtttttct tcttggtcct tcctgagacc tcttggctcc caagagcctc ttgatcgggg300caggaatgag ggtgccccag ggtgcgagag tcgtggatcc ctgaaaagag gaggctgctc360cccctctttc ttccccccac ctccagattt cctcatctgc ccacaccttc cggtgggcgg420ggacgtgtat ggacaaattt gcgggctggg gacc atg gaa gtg gag gaa atc tac475Met Glu Val Glu Glu Ile Tyr1 5aag cac cag gaa gtc aag atg caa gca cca gcc ttc agg gac aag aaa523Lys His Gln Glu Val Lys Met Gln Ala Pro Ala Phe Arg Asp Lys Lys10 15 20cag ggg gtc tca gcc aag aat caa ggt gcc cat gac cca gac tat gag571Gln Gly Val Ser Ala Lys Asn Gln Gly Ala His Asp Pro Asp Tyr Glu25 30 35aat atc acc ttg gcc ttc aaa aat cag gac cat gca aag ggt ggt cat619Asn Ile Thr Leu Ala Phe Lys Asn Gln Asp His Ala Lys Gly Gly His40 45 50 55tca cga ccc acg agc caa gtc cca gcc cag tgc agg ccg ccc tca gac667Ser Arg Pro Thr Ser Gln Val Pro Ala Gln Cys Arg Pro Pro Ser Asp
60 65 70tcc acc cag gtc ccc tgc tgg ttg tac aga gcc atc ctg agc ctg tac715Ser Thr Gln Val Pro Cys Trp Leu Tyr Arg Ala Ile Leu Ser Leu Tyr75 80 85atc ctc ctg gcc ctg gcc ttt gtc ctc tgc atc atc ctg tca gcc ttc763Ile Leu Leu Ala Leu Ala Phe Val Leu Cys Ile Ile Leu Ser Ala Phe90 95 100atc atg gtg aag aat gct gag atg tcc aag gag ctg ctg ggc ttt aaa811Ile Met Val Lys Asn Ala Glu Met Ser Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys105 110 115agg gag ctt tgg aat gtc tca aac tcc gta caa gca tgc gaa gag aga859Arg Glu Leu Trp Asn Val Ser Asn Ser Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg120 125130 135cag aag aga ggc tgg gat tcc gtt cag cag agc atc acc atg gtc agg907Gln Lys Arg Gly Trp Asp Ser Val Gln Gln Ser Ile Thr Met Val Arg140 145 150agc aag att gat aga tta gag acg aca tta gca ggc ata aaa aac gtt955Ser Lys Ile Asp Arg Leu Glu Thr Thr Leu Ala Gly Ile Lys Asn Val155 160 165gac aca aag gta cag aaa atc ttg gag gtg ctg cag aaa atg cca cag1003Asp Thr Lys Val Gln Lys Ile Leu Glu Val Leu Gln Lys Met Pro Gln170 175 180tcc tca cct caa taa atgagaggac attgtggcag ccaaagccac aacttggaag1058Ser Ser Pro Gln185atggggctgc acctgccaac gaagacggga aatgaccccc cccccagcct agtgtgaacc1118tgcccctcgt cccacgtata gaaaaacctc gagtcatggt gaatgagtgt ctcggagttg1178ctcgtgtgtg tgtacacctg cgtgcgtgtg tgtgcgtgtg tgcgcgtgtg ttcgtgtgtg1238tgcgtgtgtg cgtgcgcgtg tgtgtgcatt ttgcaaaggg tggacatttc agtgtatctc1298ccagaaaggt gatgaatgaa taggactgag agtcacagtg aatgtggcat gcatgcctgt1358gtcatgtgac atatgtgagt ctcggcatgt cacggtgggt ggctgtgtct gagcacctcc1418agcagatgtc actctgagtg tgggtgttgg tgacatgcat tgcacgggcc tgtctccctg1478tttgtgtaaa catactagag tatactgcgg cgtgttttct gtctacccat gtcatggtgg1538gggagattta tctccgtaca tgtgggtgtc gccatgtgtg ccctgtcact atctgtggct1598gggtgaacgg ctgtgtcatt atgagtgtgc cgagttatgc caccctgtgt gctcagggca1658catgcacaca gacatttatc tctgcactca cattttgtga cttatgaaga taaataaagt1718caagggaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1750<210>2<211>187<212>PRT
<213>人类肥大细胞<400>2Met Glu Val Glu Glu Ile Tyr Lys His Gln Glu Val Lys Met Gln Ala1 5 10 15Pro Ala Phe Arg Asp Lys Lys Gln Gly Val Ser Ala Lys Asn Gln Gly20 25 30Ala His Asp Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Ala Phe Lys Asn Gln35 40 45Asp His Ala Lys Gly Gly His Ser Arg Pro Thr Ser Gln Val Pro Ala50 55 60Gln Cys Arg Pro Pro Ser Asp Ser Thr Gln Val Pro Cys Trp Leu Tyr65 70 75 80Arg Ala Ile Leu Ser Leu Tyr Ile Leu Leu Ala Leu Ala Phe Val Leu85 90 95Cys Ile Ile Leu Ser Ala Phe Ile Met Val Lys Asn Ala Glu Met Ser100 105 110Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys Arg Glu Leu Trp Asn Val Ser Asn Ser115 120 125Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg Gln Lys Arg Gly Trp Asp Ser Val Gln130 135 140Gln Ser Ile Thr Met Val Arg Ser Lys Ile Asp Arg Leu Glu Thr Thr145 150 155 160Leu Ala Gly Ile Lys Asn Val Asp Thr Lys Val Gln Lys Ile Leu Glul65 170 175Val Leu Gln Lys Met Pro Gln Ser Ser Pro Gln180 185<210>3<211>19<212>DNA<213>人类<400>3ctcccagaaa ggtgatgaa19<210>4<211>23<212>DNA<213>人类<400>4tagacagaaa acacgccgca gta 23
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<210>11<211>53<212>DNA<213>人类<400>11caccatggac tacaaagacg atgacgacaa ggaagtggag gaaatctaca agc53<210>12<211>23<212>DNA<213>人类<400>12ttgaggtgag gactgtggca ttt 2权利要求
1.一种经纯化的多肽，其包含一选自由下列各序列组成的群组的氨基酸序列SEQ ID NO2；SEQ ID NO2的变体；SEQ ID NO2的片段；由经单离的多核苷酸编码的氨基酸序列，该多聚核苷酸包含一选自由下列各序列组成的群组的核苷酸序列SEQ ID NO1；SEQ ID NO1的变体；及SEQ ID NO1的片段。
2.根据权利要求1所述的经纯化的多肽，其中该多肽由包含核苷酸455至1018的SEQ IDNO1的片段来编码。
3.根据权利要求1所述的经纯化的多肽，其中该多肽是与肥大细胞表达的膜蛋白或其配位体特异性结合并抑制或激活该蛋白的细胞功能的促效剂或拮抗剂。
4.根据权利要求3所述的经纯化的多肽，其中该多肽是选自由下列各物组成的群组的拮抗剂由可溶形式的由肥大细胞表达的膜蛋白与衍生自肥大细胞表达的膜蛋白的细胞外域的可溶性多肽，其能干扰由肥大细胞表达的膜蛋白与其天然配位体相互作用的能力。
5.根据权利要求4所述的经纯化的多肽，其包含选自由下列各序列组成的群组的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸106至187或其拮抗剂片段。
6.根据权利要求3所述的经纯化的多肽，其中该促效剂或拮抗剂为抗体。
7.根据权利要求6所述的经纯化的多肽，其中该抗体是选自由多克隆、单克隆、人化、人类、双重特异性及复共轭抗体组成的群组。
8.根据权利要求6所述的经纯化的多肽，其中该抗体是单克隆抗体。
9.一种经单离的多核苷酸，其包含选自由下列各序列组成的群组的核苷酸序列SEQ ID NO1；SEQ ID NO1的变体；SEQ ID NO1的片段；编码多肽的核苷酸序列，该多肽具有选自由下列各序列组成的群组的氨基酸SEQ ID NO2；SEQ ID NO2的变体；SEQ ID NO2的片段。
10.根据权利要求9所述的经单离的多核苷酸，其包含编码具有选自由以下各序列组成的群组的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列SEQ ID NO2的氨基酸106至187或其片段。
11.一种包含根据权利要求9所述的核苷酸序列的表达载体。
12.一种经单离的宿主细胞，其是选自由以下各宿主细胞组成的群组包含根据权利要求11所述的表达载体的宿主细胞；包含根据权利要求9所述的核苷酸序列的宿主细胞；及包含根据权利要求10所述的核苷酸序列的宿主细胞。
13.一种用于识别由肥大细胞表达的膜蛋白促效剂和拮抗剂的筛选方法，其包含将由肥大细胞表达的膜蛋白暴露于潜在的肥大细胞表达的膜蛋白促效剂/拮抗剂；及测定该潜在的促效剂/拮抗剂是否与该蛋白相互作用。
14.一种用于测定药物在为了所要指示而投予哺乳动物时是否有可能导致与肥大细胞活性减少或增加相关联的不良副作用的筛选方法，其包含将表达由肥大细胞表达的膜蛋白的肥大细胞或经纯化的肥大细胞表达的膜蛋白暴露于药物；及测定该药物是否与该蛋白相互作用或模拟该蛋白配位体的生物学功能。
15.一种通过干扰编码由肥大细胞表达的膜蛋白的DNA或RNA多核苷酸的转录或翻译来阻断或调节细胞肥大细胞表达的膜蛋白的表达的方法，其包含将能够表达由肥大细胞表达的膜蛋白的细胞暴露于一分子，该分子干扰编码该由肥大细胞表达的膜蛋白的DNA或RNA多核苷酸的转录或翻译。
16.根据权利要求14所述的方法，其中该分子是选自由反义核苷酸、RNAi核苷酸及核酶所组成的群组，其干扰编码该由肥大细胞所表达的膜蛋白的DNA或RNA多核苷酸的正确转录或翻译。
17.根据权利要求14所述的方法，其中该分子是反义核苷酸，其干扰该由肥大细胞表达的膜蛋白的DNA或RNA多核苷酸的正确转录或翻译。
18.一种用于诊断病人感染由表达肥大细胞表达的膜蛋白的细胞的有害活性所引起的疾病的易患性的方法，其包括从病人收集已知含有即使有也极少数的由肥大细胞表达的膜蛋白的细胞、组织或体液样品；分析该组织或体液以确定该组织中由肥大细胞表达的膜蛋白的存在；及基于由肥大细胞表达的膜蛋白在该组织或体液中的存在来预测该病人对于某些免疫性疾病的易患性。
19.根据权利要求18所述的方法，其中该等表达由肥大细胞表达的膜蛋白的细胞是肥大细胞且该有害活性是肥大细胞脱粒。
20.一种用于诊断病人感染由表达肥大细胞所表达的膜蛋白的细胞的有害活性所引起的疾病的易患性的方法，其包含从病人收集已知含有即使有也极少数的由肥大细胞表达的膜蛋白的细胞、组织或体液样品；分析该组织或体液以确定该组织中由肥大细胞表达的膜蛋白的量；及根据与为正常细胞、组织或体液所设定的规定或测试含量相比的该组织或体液中由肥大细胞表达的膜蛋白的量的变化，来预测该病人对于某些免疫性疾病的易患性。
21.根据权利要求20所述的方法，其中该等表达由肥大细胞表达的膜蛋白的细胞是肥大细胞且该有害活性是肥大细胞脱粒。
22.一种用于在哺乳动物中预防或治疗由肥大细胞表达的膜蛋白介导的疾病的方法，其包括将预防或治疗疾病数量的一种肥大细胞表达的膜蛋白的激动剂或拮抗剂用于哺乳动物。
23.权利要求22的方法，其中肥大细胞表达的膜蛋白的激动剂或拮抗剂是一种抗体。
24.一种用于检测在特定细胞、组织或体液中表达的由肥大细胞表达的膜蛋白的诊断方法，其包含将细胞、组织或体液或其组份暴露于与由肥大细胞表达的膜蛋白结合的抗体；及测定该等细胞、组织或体液或其组份是否结合到该抗体。
25.一种用于产生与由肥大细胞表达的膜蛋白结合的抗体的方法，其包含一选自由下列各方法组成的群组的方法使用经单离的由肥大细胞表达的膜蛋白或其抗原性片段作为抗原；使用表达重组肥大细胞表达的膜蛋白的宿主细胞作为抗原；及使用含有该由肥大细胞表达的膜蛋白基因的DNA表达载体来表达由肥大细胞表达的膜蛋白作为用于产生抗体的抗原。
26.一种使用根据权利要求25所述的方法而产生的抗体。
27.根据权利要求25所述的抗体，其是选自由多克隆、单克隆、人化、人类、双重特异性以及复共轭抗体组成的群组。
28.一种用于单离及纯化来自重组细胞培养物、污染物和天然环境分离的由肥大细胞表达的膜蛋白的方法，其包含将含有由肥大细胞表达的膜蛋白和污染物的组合物暴露于能与该等由肥大细胞表达的膜蛋白结合的抗体；允许该等由肥大细胞表达的膜蛋白结合到该抗体；将该等抗体-由肥大细胞表达的膜蛋白的复合物从该等污染物中分离出来；及从该等复合物中回收该等由肥大细胞表达的膜蛋白。
29.根据权利要求28所述的方法，其中该抗体是根据权利要求25所述的抗体。
30.一种转基因剔除动物，其基因组在其内源性肥大细胞表达的膜蛋白基因中含有杂合性或纯合性破裂，能够抑制或防止生物学功能的由肥大细胞表达的膜蛋白的表达。
31.一种适用于使哺乳动物对由肥大细胞或其它肥大细胞表达的膜蛋白介导的疾病免疫的疫苗，其包含医药上可接受的载剂和一种或多种由肥大细胞表达的膜蛋白或其免疫原性片段。
32.一种用于使哺乳动物对肥大细胞或其它肥大细胞表达的膜蛋白介导的疾病免疫的方法，其包含将一种或多种由肥大细胞表达的膜蛋白或其免疫性片段注射入该哺乳动物体内。
33.一种适用于使哺乳动物对肥大细胞或其它肥大细胞表达的膜蛋白介导的疾病免疫的疫苗，其包含医药上可接受的载剂和含有编码由肥大细胞表达的膜蛋白或其抗原片段的核酸序列的载体。
34.根据权利要求33所述的疫苗，其中该核酸序列是选自由下列各序列组成的群组SEQ ID NO1；SEQ ID NO1的变体；及SEQ ID NO1的片段。
35.一种用于使哺乳动物对肥大细胞或其它肥大细胞表达的膜蛋白介导的疾病免疫的方法，其包含注射医药上可接受的载剂和含有编码由肥大细胞表达的膜蛋白或其抗原片段的核酸序列的载体。
36.根据权利要求35所述的方法，其中该核酸序列是选自由下列各序列组成的群组SEQ ID NO1；SEQ ID NO1的变体；及SEQ ID NO1的片段。
全文摘要
由肥大细胞表达的膜蛋白，与大脑、心脏、肾脏、肝脏、气管以及类似组织相比，其在人类肥大细胞与肺中高度表达。该等蛋白是涉及肥大细胞与肺组织功能的调节(包括肥大细胞脱颗粒)的跨膜蛋白。优选蛋白是187氨基酸的跨膜蛋白，其具有一包含1至82氨基酸的细胞间域，一包含83至105氨基酸的跨膜域，以及包含106至187氨基酸(SEQ ID NO2)的细胞外域。
文档编号C07K16/28GK1638799SQ03805212
公开日2005年7月13日 申请日期2003年1月3日 优先权日2002年1月3日
发明者李康, 李玉成, 王申戊, 胡广慧, 姚振斌 申请人:唐纳士公司