有效抗c型肝炎病毒的大环肽的制作方法

专利名称：有效抗c型肝炎病毒的大环肽的制作方法
技术领域：
本发明是关于一类化合物，其合成方法，组合物及治疗C型肝炎病毒(HCV)感染的方法。具体地，本发明提供新颖肽类似物，含此类似物的药物组合物及使用这些类似物治疗HCV感染的方法。
背景技术：
C型肝炎病毒(HCV)是全世界上输血后及社会上获得的非-A非-B肝炎的主要病原学剂。据估计，世界上有超过二亿人受这病毒的感染。有高百分比的带病毒者变成慢性感染，其中多数发展成慢性肝病，即所谓慢性C型肝炎。而这群人又成为严重肝疾病如肝硬化，肝细胞癌及导致死亡的肝病的高危险群。
HCV确立病毒持续性及导致慢性肝病高发生率的机理现在还不完全明了。现在还不知道HCV如何与宿主免疫系统相互作用及避开宿主免疫系统。此外，有关避免HCV感染及疾病的细胞及体液免疫反应的作用现在也还不确定。据报告，免疫球蛋白可预防输血引起的病毒性肝炎，但疾病控制中心(the Center for Disease Control)现在还没有推荐免疫球蛋白治疗用于此目的。有效的保护性免疫反应的缺乏妨碍了疫苗的发展或适宜曝露后的预防手段，所以近期内希望仍寄托于对抗病毒的干扰。
各种临床研究的目的在于确证能有效地治疗受慢性C型肝炎折磨的病人的HCV感染的药剂。这些研究包括使用α-干扰素，单独使用或与其他抗病毒剂组合使用。这类研究显示有相当数目的受试验者对这类治疗无反应，也有相当多受试者有不错的反应，发现大部分在治疗完了后有复发。
直到最近，干扰素(IFN)是临床上唯一证明对慢性C型肝炎患者有利的治疗。但其持续反应率低，而且干扰素治疗也会引起严重的副作用(即视网膜病变，甲状腺炎，急性胰脏炎，抑郁症)，这些副作用降低了受治疗病人的生活品质。最近已许可对单独使用IFN无反应的病人组合使用干扰素与病毒唑(ribavirin)。但由IFN所引起的副作用并未因使用这种组合治疗而减轻。聚乙二醇化(pegylated)的干扰素如PEG-Intron及Pegasys能明显地部分指出这些有害的副作用，抗病毒药物仍保留这种口服治疗HCV的选择方法。
所以，现在需要发展克服现有的药物治疗限制的用于治疗HCV的有效的抗病毒制剂。
HCV是一种B族虫媒病毒科中有包膜的正链RNA病毒。单链HCV RNA基因组的长度约9500个核苷酸，具有编码约3000个氨基酸的单个大的多蛋白的单个可读框(ORF)。在受感染的细胞内，这种多蛋白由细胞及病毒蛋白酶在多位点裂解以产生结构蛋白及非结构蛋白(NS)。在HCV的情形下，成熟的非结构蛋白(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A及NS5B)的增殖是由二种病毒蛋白酶实施。第一种，现在还没有完全了解其特性，在NS2-NS3连接处(前面称NS2/3蛋白酶)裂解；第二种为含于NS3(NS3蛋白酶)的N-端区内的丝氨酸蛋白酶，并引发NS3下游的所有其后的裂解，包括顺式，含在NS3-NS4A切割位点，和反式，剩余的NS4A-NS4B，NS4B-NS5A，NS5A-NS5B位点。NS4A蛋白质有多种功能，它起NS3蛋白酶的辅因子的作用，并可能有助于NS3膜及其他病毒复制酶成分的定位。NS3蛋白酶与NS4A的复合形成(complex formation)对所有位点的加工过程(processing events)，增进蛋白水解效率似乎是必需的。NS3蛋白也展现核苷三磷酸酶及RNA解旋酶活性。NS5B是一种涉及HCV复制的RNA-依赖性RNA聚合酶。
发展抗病毒制剂的一般策略是钝化(inactivate)主要用于病毒复制的病毒编码的酶。
下面是最近几年发布的揭示HCV NS3蛋白酶抑制剂肽类似物的专利申请案，这些HCV NS3蛋白酶抑制剂肽类似物结构上不同于本发明化合物GB 2,337,262；JP10298151；JP11126861；JP11292840；JP2001-103993；US 6,159,938；US 6,187,905；WO 97/43310；WO 98/17679；WO 98/22496；WO 98/46597；WO 98/4663O；WO 99/38888；WO 99/50230；WO 99/64442；WO 99/07733；WO 99/07734；WO 00/09543；WO 00/09558；WO 00/20400；WO 00/59929；WO 00/31129；WO 01/02424；WO 01/07407；WO 01/16357；WO 01/32691；WO 01/40262；WO 01/58929；WO 01/64678；WO 01/74768；WO 01/77113；WO 01/81325；WO 02/08187；WO 02/08198；WO 02/08244；WO 02/08251；WO 02/08256；WO 02/18369；WO 02/60926及WO 02/79234。
本发明化合物的不同处在于其具有不同的化学结构及其令人惊奇地发现其特异性地抑制HCV HS3蛋白酶，同时对其他丝氨酸蛋白酶表现不明显的抑制活性。此外，这些化合物在细胞培养中是有活性的，并在活体内具有极良好的药物动力学性质。
发明概述本发明范围内包括式I化合物 其中R1是羟基或NHS02R1A；其中R1A是(C1-8)烷基，(C3-7)环烷基或{(C1-6)烷基-(C3-7)环烷基}，其视需要以卤素，氰基，硝基，O-(C1-6)烷基、酰氨基，氨基或苯基进行1至3次的取代，或R1A是C6或C10芳基，其视需要以卤素，氰基，硝基，(C1-6)烷基，O-(C1-6)烷基，酰氨基，氨基或苯基进行1至3次的取代；R2是(C5-6)环烷基及R3是环戊基；或其药物上可接受的盐。
本发明范围内包括的药物组合物，包含抗C型肝炎病毒有效量的式I化合物或其治疗上可接受的盐，并混合有药物上可接受的载剂介质或助剂。
根据本发明一具体实施方案，本发明药物组合物还含有干扰素(聚乙二醇化或非聚乙二醇化的)或病毒唑，或一种或多种抗-HCV剂，或以上诸剂的任何组合物。
本发明另一重要方面包括通过给予哺乳动物一种抗C型肝炎病毒有效量的式I化合物，其治疗上可接受的盐，或上述组合物，单独给予或与一种或多种干扰素(聚乙二醇化或非聚乙二醇化)或病毒唑，或一种或多种其他抗-HCV制剂一起给予或分别给予以治疗C型肝炎病毒感染的方法，本发明另一重要方面包括通过给予哺乳动物一种抗C型肝炎病毒有效量的式I化合物，其治疗上可接受的盐，或上述组合物，单独给予或与一种或多种干扰素(聚乙二醇化或非聚乙二醇化)或病毒唑，或一种或多种其他抗-HCV制剂一起给予或分别给予以预防C型肝炎病毒感染的方法。
本发明范围还包括式I化合物，如本文所述，在制备用于治疗或预防C型肝炎病毒感染的药物中的用途。
优选实施方案的详述定义如本文所述，使用下述定义除非另有说明在述及各实例时，(R)或(S)用于指明不对称中心的绝对构形，这指明是用于整个化合物的说明而不是只用于取代基的说明。
本文所用的“P1，P2及P3”是指从肽类似物C-端开始并延伸至N-端的氨基酸残基的位置(即P1是指从C-端开始的1位，P2是指从C-端开始的2位，依此类推)(见Berger A.& Schechter I.，Transactions of the Royal SocietyLondon seriesB257，249-264(1970))。
本文所用的术语“(1R，2S)-乙烯基-ACCA”是指下式化合物 即，(1R，2S)1-氨基-2-乙烯基环丙基羧酸。
本文所用的“卤素”一词是指卤素取代基，选自溴，氯，氟或碘。
本文所用的“(C1-6)烷基”或“(低)烷基”一词，不管单独使用或与另一取代基组合使用，是指非环形的直链或支链烷基取代基，它含1至6个碳原子，包括，例如，甲基，乙基，丙基，丁基，己基，1-甲基乙基，1-甲基丙基，2-甲基丙基及1，1-二甲基乙基。
本文所用的“(C1-8)烷基”一词，不管单独使用或与另一取代基组合使用，是指非环形的直链或支链烷基取代基，它含1至8个碳原子，并包括，例如，甲基，乙基，2，2-二甲基丁基，己基，1-甲基己基，庚基及辛基。
本文所用的“(C3-7)环烷基”一词，不论单独使用或与其他取代基组合使用，是指环烷基取代基，其含3至7个碳原子，并包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基及环庚基。
本文所用的“{(C1-6)烷基-(C3-7)环烷基”一词，是指含3至7个碳原子的环烷基，直接键合到含1至6个碳原子的亚烷基上；例如环丙基甲基，环戊基乙基，环己基甲基，环己基乙基及环庚基丙基。在R3A是{(C1-6烷基)-(C3-7)环烷基}时，这基团是通过(C1-6)烷基(即亚烷基部分)连结到于SO2基上。
本文所用的“O-(C1-6)烷基”一词，不论单独使用或与其他基团组合使用，是指-O-(C1-6)烷基，其中烷基的定义如上述，含至多六个碳原子。O-(C1-6)烷基包括甲氧基，乙氧基，丙氧基，1-甲基乙氧基，丁氧基及1，1-二甲基乙氧基。后一取代基一般称作叔-丁氧基。
本文所用的“药物上可接受的盐”一词是指式I化合物的盐，其在正常的医学判断范围内，适用于与人及低等动物的组织接触而无毒性，刺激性，过敏反应等与合理的利益/风险比相匹配。一般是水溶性或油溶性，或是易分散的，并在其使用上是有效的。这词包括药物上可接受的酸加成盐及药物上可接受的碱加成盐。适宜的盐的表见于S.M.Birge等人J.Pharm.Sci.，1977，66，1-19页，今全文附上供参考。
“药物上可接受的酸加成盐”一词是指保持生物效果及游离态碱的性质，并且是非生物上或其他方面不需要的，其与无机酸如盐酸，氢溴酸，氢碘酸，硫酸，氨基磺酸，硝酸，磷酸等，及有机酸如醋酸，三氯醋酸，三氟醋酸，己二酸，藻酸，抗坏血酸，天冬氨酸，苯磺酸，苯甲酸，2-乙酰氧基苯甲酸，丁酸，樟脑酸，樟脑磺酸，肉桂酸，柠檬酸，二葡糖酸，乙烷磺酸，谷氨酸，乙醇酸，甘油基磷酸，半硫酸，庚酸，己酸，甲酸，富马酸，2-羟基乙烷磺酸(羟乙磺酸)，乳酸，马来酸，羟基马来酸，苹果酸，丙二酸，扁桃酸，三甲基苯磺酸，甲烷磺酸，萘磺酸，烟酸，2-萘磺酸，草酸，双羟萘酸(pamoic acid)，果胶酯酸，苯基醋酸，3-苯基丙酸，苦味酸，新戊酸，丙酸，丙酮酸，水杨酸，硬脂酸，丁二酸，对氨基苯磺酸，酒石酸，对-甲苯磺酸，十一碳烷酸等所形成的盐。
“药物上可接受的碱加成盐”一词是指保持生物效果及游离态酸的性质，并且是非生物上或其他方面不需要的，其是与无机碱如氨或，铵或金属阳离子如钠，钾，锂，钙，镁，铁，锌，铜，锰，铝等的氢氧化物碳酸盐或碳酸氢盐所形成的盐。特别优选的是铵，钾，钠，钙及镁盐。由药物上可接受的有机的非毒性的碱衍生的盐包括伯、仲及叔胺，季铵化合物，经取代的胺，包括天然的经取代的胺，环胺及碱离子交换树脂，如甲基胺，二甲基胺，三甲基胺，乙基胺，二乙基胺，三乙基胺，异丙基胺，三丙基胺，三丁基胺，乙醇胺，二乙醇胺，2-二甲基氨基乙醇，2-二乙基氨基乙醇，二环己基胺，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，咖啡因，海巴明(hydrabamine)，胆碱，甜菜碱，亚乙基二胺，葡糖胺，甲基葡糖胺，可可碱，嘌呤，哌嗪，哌啶，N-乙基哌啶，四甲基铵化合物，四乙基铵化合物，吡啶，N，N-二甲基苯胺，N-甲基哌啶，N-甲基吗啉，二环己基胺，二苄基胺，N，N-二苄基苯乙胺，1-二苯羟甲胺，N，N′-二苄基亚乙基二胺，聚胺树脂等所成的盐。特别优选的有机非毒性碱是异丙基胺，二乙基胺，乙醇胺，三甲基胺，二环己基胺，胆碱及咖啡因。
本文所用的“抗病毒剂”一词是指有效抑制哺乳动物中的病毒的形成和/或复制的制剂(化合物或生物制剂)。这包括干扰哺乳动物内的病毒形成及/或复制所必要的宿主或病毒机制的制剂。抗病毒剂包括，例如，病毒唑，金钢烷胺，VX-497(merimepodib，Vertex Pharmaceuticals)，VX-498(VertexPharmaceuticals)，Levovirin，Viramidine，Ceplene(maxamine)，XTL-001及XTL-002(XTL Biopharmaceuticals)。
本文所用的“其他抗-HCV剂”一词是指减少或预防有关C型肝炎疾病症状的进程的制剂。这类制剂可选自免疫调节剂，HCVNS3蛋白酶抑制剂或HCV聚合酶抑制剂或HCV生命周期中另一标的的抑制剂。
本文所用的“免疫调节剂”一词是指有效增强或提高哺乳动物免疫系统反应的制剂(化合物或生物制剂)。免疫调节剂包括，例如，I类干扰素(如α-，β-，δ-及ω干扰素，τ-干扰素，共有区干扰素及脱唾液酸干扰素(asialo-interferons))，II类干扰素(如γ-干扰素)及聚乙二醇化干扰素。
本文所用的“HCV NS3蛋白酶抑制剂”一词是指有效抑制哺乳动物HCVNS3蛋白酶的功能的制剂(化合物或生物制剂)。HCV NS3蛋白酶抑制剂包括例如，WO 99/07733，WO 99/07734，WO 00/09558，WO 00/09543或WO00/59929或WO 02/060926中所描述的化合物Boehringer Ingeheim临床侯补确认为BILN2061以及Vertex/Eli Lilly预发展候补确证为VX-950或LY-570310，特别是公开在WO 02/060926的224-226页的表中的化合物，#2，3，5，6，8，10，11，18，19，29，30，31，32，33，37，38，55，59，71，91，103，104，105，112，113，114，115，116，120，122，123，124，126和127。可与本发明的化合物组合使用。
本文所用的“HCV聚合酶抑制剂”是指有效抑制哺乳动物内HCV聚合酶功能的抑制剂(化合物或生物制剂)。这包括例如HCV NS5B聚合酶抑制剂。HCV聚合酶抑制剂包括非核苷，例如描述于以下的化合物-美国申请No 10/198680，相当于PCT/CA02/01127，二者申请于2002，7，l8，(Boehringer Ingelheim)-美国申请No 10/198384，相当于PCT/CA02/01128，二者申请于2002，7，18，(Boehringer Ingelheim)-美国申请No 10/198259，相当于PCT/CA02/01129，二者申请于2002，7，18，(Boehringer Ingelheim)-WO 02/100846 A1和WO 02/100851 A2(两者Shire)-WO 01/85172 A1和WO 02/098424 A1(两者Gsk)-WO 00/06529和WO 02/06246 A1(两者Merck)-WO 01/47883和WO 03/000254(两者日本Tobacco)和-EP 1256628 A2(Agouron)再者，其它HCV聚合酶抑制剂也包括核苷类似物，例如描述于下列的化合物-WO 01/90121 A2(Idenix)-WO 02/069903 A2(Biocryst Pharmaceuticals Inc)和-WO 02/057287 A2和WO 02/057425 A2(两者Merck/Isis)HCV聚合酶的抑制剂的特定实例，包括JTK-002，JTK-003和JTK-109(日本Tobacco)本文所用的“HCV生活周期中另一标的抑制剂”是指有效抑制哺乳动物内的HCV的形成及/或复制而非抑制HCV NS3蛋白酶功能的制剂(化合物或生物制剂)。这包括干扰在哺乳动物内形成及/或复制HCV所需的宿主或HCV病毒机制的制剂。HCV生活周期内另一标的抑制剂包括，例如，抑制选自解旋酶、HCV NS2/3蛋白酶和一种内部核糖体进入位点(IRES)的制剂。HCV生活周期内另一标的抑制剂的具体例包括ISIS-14803(ISIS Pharmaceuticals)。
本文所用的“HIV抑制剂”一词是指有效抑制哺乳动物内HIV的形成及/或复制的制剂(化合物或生物制剂)。这包括干扰在哺乳动物内HIV的形成及/或复制所需的宿主或病毒机制的制剂，HIV抑制剂包括，例如，核苷抑制剂，非核苷抑制剂，蛋白酶抑制剂，融合抑制剂及整合酶抑制剂。
本文所用的“HAV抑制剂”一词是指有效抑制哺乳动物内HAV的形成及/或复制的制剂(化合物或生物制剂)。这包括干扰在哺乳动物内HAV的形成及/或复制所需的宿主或病毒机制的制剂，HAV抑制剂包括A型肝炎疫苗，例如，Havrix(G1axoSmithKline)，VAQTA(Merck)及Avaxim(Aventis Pasteur)。
本文所用的“HBV抑制剂”一词是指有效抑制哺乳动物内HBV的形成及/或复制的制剂(化合物或生物制剂)。这包括干扰在哺乳动物内HBV的形成及/或复制所需的宿主或病毒机制的制剂。HBV抑制剂包括，例如，抑制HBV病毒，DNA聚合酶或HBV疫苗的制剂。HBV抑制剂的具体例包括拉米夫定(Lamivudine)(Epivir-HBV)，阿德福韦地匹福西(Adefovir Dipivoxil)，恩替卡韦(Entecavir)，FTC(Coviracil)，DAPD(DXG)，L-FMAU(Clevudine)，AM365(Amrad)，Ldt(Telbivudine)，monoval-LdC(Valtorcitabine)，ACH-126，443(L-Fd4C)(Achillion)，MCC478(Eli Lilly)，Racivir(RCV)，Fluoro-L及D核苷，Robustaflavone，ICN 2001-3(ICN)，Bam 205(Novelos)，XTL-001(XTL)，亚氨基-Sugars(Nonyl-DNJ)(Synergy)，HepBzyme；及免疫调节剂产物如干扰素α-2b，HE2000(Hollis-Eden)，Theradigm(Epimmune)，EHT899(Enzo Biochem)，胸腺素α-1(Zadaxin)，HBV DNA疫苗PowderJect)，HBV DNA疫苗(Jefferon Center)，HBV抗原(OraGen)，BayHep B(Bayer)，Nabi-HB(Nabi)及抗B型肝炎(Cangene)；及HBV疫苗产物如Engerix B，Recombivax HB，GenHevac B，Hepacare，Bio-Hep B，TwinRix，Comvax，Hexavac。
本文所用的“I类干扰素”是指选自全部结合到I型受体的干扰素。这包括天然的及合成所产生的I类干扰素。I类干扰素的实例包括α-，β-，ω干扰素，τ-干扰素，共有区干扰素及脱唾液酸干扰素。
本文所用的“II类干扰素”是指选自全部结合到II型受体的干扰素。II类干扰素的实例包括γ-干扰素。
本发明药物组合物可含一种或多种另外的活性剂，它选自，例如，抗病毒剂，免疫调节剂，其他HCV NS3蛋白酶抑制剂，HCV聚蛋白酶抑制剂、HCV生活周期中另一标的的抑制剂，HIV抑制剂，HAV抑制剂及HBV抑制剂。这类制剂的实例见以上定义段内所提供的。
这类制剂中优选的实例如下·抗病毒剂病毒唑及金钢烷胺；·免疫调节剂I类干扰素，II类干扰素及聚乙二醇化干扰素；·HCV生活周期中另一标的的抑制剂，其抑制标的选自NS3解旋酶，HCV NS2/3蛋白酶或内部核糖体进入位点(IRES)；·HIV抑制剂核苷抑制剂，非核苷抑制剂，蛋白酶抑制剂，融合抑制剂及整合酶抑制剂；或·HBV抑制剂抑制HBV病毒DNA聚合酶的制剂，或是HBV疫苗。
如上所述，可考虑组合治疗，其中是将式(1)化合物，或其药物上可接受的盐与至少一种另外的制剂一起给予，这另外的制剂是选自抗病毒剂，免疫调节剂，HCV NS3蛋白酶的另一抑制剂，HCV聚合酶的抑制剂，在HCV生活周期内另一标的的抑制剂，HIV抑制剂，HAV抑制剂及HBV抑制剂。这类制剂的实例见上述定义段所述。这些另外的制剂可与本发明化合物组合制成单一药物剂型。或者是，这些另外的制剂可作为多种剂型的一部分分开给予病人，例如，使用试剂盒。这些另外的制剂可在给予式(1)化合物，或药物上可接受的盐，之前、同时、或之后给予病人。
如本文所用的“治疗”一词是指给予本发明化合物或组合物以减轻或排除C型肝炎疾病症状及/或减少病人的病毒载量。
本文所用的“预防”一词是指在个体曝露于病毒后但在出现症状前，和/或在血中检查出病毒前，给予本发明化合物或组合物。
优选实施方案优选地，上述式I化合物，其中R1是羟基或NHSO2R1A，其中R1A是(C1-6)烷基，(C3-7)环烷基或{(C1-6)烷基-(C3-7)环烷基}，其都是视需要以卤素，硝基或O-(C1-6)烷基进行1-3次的取代，或苯基，其是视需要以卤素，硝基，(C1-6)烷基或O-(C1-6)烷基进行1至3次的取代。
更优选的是上述I化合物，其中R1是羟基或NHSO2R1A，其中R1A是甲基，乙基，环丙基，环丁基，环戊基，环丙基甲基，环己基乙基，CCl3，CF3，苯基，2-氟苯基或4-甲基苯基。
最佳的是上述限定的式I化合物，其中R1是羟基或NHSO2R1A；其中R1A是甲基，环丙基，CF3或苯基。尤佳的R1A为环丙基。
R1最佳是羟基。
R2最佳是环戊基。
在本发明优选实施方案内包括所有在表1所列的式I化合物。
根据另一实施方案，本发明的药物组合物可还含有另一抗-HCV剂。抗-HCV剂的实例包括α-，β-，δ-，γ-或ω-干扰素，病毒唑及金钢烷胺。
根据又一实施方案，本发明的药物组合物可另外含有另一HCV HS3蛋白酶抑制剂。
根据另一实施方案，本发明的药物组合物可另外包含一种HCV聚合酶抑制剂。
根据又一实施方案，本发明的药物组合物可还含有HCV生活周期中其他标的抑制剂，包括，但不限于，解旋酶，NS2/3蛋白酶或内部核糖体进入位点(IRES)。
本发明的药物组合物可经口，肠胃外的或经植入的储存器而给药。优选是口服或以注射给药。本发明药物组合物可含有任何习用的无毒性药物可接受的载剂，助剂或赋形剂。在某些情形下，制剂的pH可用医药上可接受的酸、碱或缓冲剂进行调整以增强已配制化合物或其输送形式的稳定性。本文所用的肠胃外的包括皮下，皮内，静脉内，肌肉内，关节内，滑液腔内，胸骨内，鞘膜内及病灶内注射或输液技术。
本发明的药物组合物可以是以灭菌注射制剂形式，例如灭菌的可注射的水性或油性悬浮液。这悬浮液可根据已知技术使用适宜的分散剂或湿润剂(如吐温80)及悬浮剂进行调配。
本发明药物组合物可以任何可接受的剂型口服，包括但不限于，胶囊，片剂及水性悬浮液与溶液。如用作口服片剂的情况下，一般使用的载剂包括乳糖及玉米淀粉。也可添加润滑剂如硬脂酸镁。以胶囊形式口服时，可用的稀释剂包括乳糖及干玉米淀粉。在以水性悬浮液作口服时，是将活性成分与乳化剂及悬浮剂组合。如有必要，可添加某些甘味剂及/或矫味剂及/或增色剂。
供上述调配剂及组合物用的其他适宜的赋形剂或载体见于标准医药文件，例如“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，The Science and Practice ofPharmacy，第19版，Mack出版公司，Easton，Penn.，(1995)。
剂量水平是每天每公斤体重约0.01至约100毫克之间，优选是每天每公斤体重约0.1至约50毫克的本文所述蛋白酶抑制剂化合物以单一治疗用于预防及治疗由HCV引起的疾病。一般是以本发明药物组合物给药，每天给予约1至约5次，或是以连续输液给药。这种给药可用作慢性和急性治疗。可与载剂物质组合以制成单一剂型的活性成分的量可视要治疗的宿主及具体给药方式而变化。典型制剂可含约5％至约95％活性化合物(重量/重量)。优选这种制剂含约20％至约80％活性化合物。
精于本领域者会理解，可能需要比上述剂量更低或更高的剂量。对具体病人所需的具体剂量及治疗方案可取决于各种因素，包括所用具体化合物的活性，年龄，体重，一般健康情况，性别，饮食，给药时间，排泄速度，组合药物，感染的严重性及感染过程，病人对感染的情况及医生的判断。一般而言，治疗是以较肽的适度剂量更小的剂量开始。所以，剂量是在环境下以小幅度增加直至达到适当效果。一般而言，化合物最需要是以产生抗病毒效果而不产生不良副作用的浓度给药。
当本发明组合物含式I化合物及一种或多种其他治疗剂或预防剂时，这化合物及另外制剂在一剂量内的含量约10至100％，优选是单一治疗方案中所给予的剂量约10至80％。
当这些化合物或其药物上可接受的盐与医药上可接受的载剂一起调配时，所得组合物可以体内给药哺乳动物，如人，以抑制HCV NS3蛋白酶或治疗或预防HCV病毒感染。这种治疗也可以使用本发明化合物与其他的制剂组合而达到，这些制剂包括，但不限于，α-，β-，δ-，ω-，τ-或γ-干扰素，病毒唑及金钢烷胺；其他HCV NS3蛋白酶抑制剂；HCV聚合酶抑制剂、HCV生活周期内的另一标的抑制剂，包括但不限于解旋酶，NS2/3蛋白酶，或内部核糖体进入位点(IRES)；或其组合物。这些另外的制剂可与本发明化合物组合制成单一剂形。或者是，这些另外的制剂可作为多剂型的一部分分别给药哺乳动物。
如果药物组合物只含本发明化合物作为活性成分，这种方法还包括给予所述哺乳动物选自免疫调节剂，抗病毒剂，HCV NS3蛋白酶抑制剂，HCV聚合酶抑制剂，或HCV生活周期另一标的抑制剂如解旋酶，NS2/3蛋白酶或IRES的制剂的步骤。这些另外的制剂可在给药本发明组合物之前、同时或之后给药哺乳动物。
本文所述式I化合物也可用作实验室试剂。本发明化合物也可用于治疗或预防物料的病毒污染，并因此减少接触这类物料(例如血液，组织，外科器材及衣物，实验室仪器及衣物，以及血液收集设备及物料)的实验室或医务人员或病人的病毒感染的危险性。
本文所述式I化合物也可用作研究试剂。式I化合物也可用作正面对照以有效代替细胞基的测试或体外或体内病毒复制的测试。
本发明其他详情以下述实施例说明，应了解到这些实施例并非限制所附权利要求范围。
方法论一般而言，式I化合物及其中间体是通过使用已知适于反应物的反应条件的已知方法进行制备。有数种方法公开于WO 00/09543及WO 00/09558中。
下列方案说明用非环形中间体以已知方法制备式6a的关键中间体的合适方法。

方案1步骤A，C，D简言之，P1，P2及P3部分可用公开于WO 00/09543及WO 00/09558的已知肽偶合技术键结。
步骤B这步骤包括4-羟基取代基构形的转换。有数种方法，其中这种转换为本领域人员所已知而进行。习用方法之一例是已知的Mitsunobu反应(Mitsunobu Synthesis 1981，January，1-28；Rano等人Tet.Lett.1994，36，3779-3792；Krchnak等人Tet.Lett.1995，36，6193-6196)。
步骤E大环的形成可通过使用Ru-基的催化剂的烯烃置换反应(metathesis)而进行，如Miller，S.J.；Blackwell，H.E.；Grubbs，R.H.J.Am.Chem.Soc.1996，118，9606-9614(a)；Kingsbury，J.S.；Harrity，J.P.A.；Bonitatebus，P.J.；Hoveyda，A.H.J.Am.Chem.Soc.1999，121，791-799(b)and Huang，J.；Stevens，E.D.；Nolan，S.P.；Petersen，J.L.；J.Am.Chem.Soc.1999，121，2674-2678(c)或如WO 00/59929中所述。也应认识到，含其他过度金属元素如Mo的催化剂也可用于本发明。
Grubbs’催化剂Horeyda’s催化剂 Nolan’s催化剂.
之后，式6a关键中间体的转化成本发明式I化合物于如下实施例中详述。
式I化合物，其中R1是上述NHSO2R1A，是通过对应的式I的酸(即R1是羟基)与适宜的式R1ASO2NH2的磺酰胺在有偶合剂存在下在标准条件下偶合制备。虽则可用一般习用的偶合剂，但发现TBTU及HATU是实用的。磺酰胺可由市场购得或可用已知方法制备。
实施例以非限制性实施例详细说明本发明。其他特定合成或解析方法见WO00/09543；WO 00/09558及WO 00/59929。
温度以摄氏度表示。除非另有说明，溶液百分比的表示是重量/容积关系，溶液比的表示是容积/容积关系。核磁共振(NMR)谱以Bruker 400MHz分光计记录；化学位移(δ)以每百万的份数报告，并参照内氘化的溶剂除非另有说明。所有最终化合物(抑制剂)的NMR谱以DMSO-d6记录。闪柱色层是在硅胶(SiO2)上根据Still氏闪色层技术进行(W.C.Still等人，J.Org.Chem.，1978，43，2923)。
实施例中所用缩写包括Boc叔-丁基氧基羰基[Me3COC(O)]；BSA小牛血清白蛋白；CHAPS3-[(3-胆酰氨基丙基)-二甲基铵基]-1-丙烷磺酸酯；CH2Cl2＝DCM二氯甲烷；DEAD二乙基偶氮二羧酸酯；DIAD二异丙基偶氮二羧酸酯；DIPEA二异丙基乙基胺；DMAP二甲基氨基吡啶；DMFN，N-二甲基甲酰胺；DMSO二甲基亚砜；(S，S)-Et-DUPHOS Rh(COD)OTf(+)-1，2-双(2S，5S)-2，5-二乙基膦羟基(lano)苯(细胞辛二烯)铑(1)三氟甲烷磺酸盐；EtOH乙醇；EtOAc醋酸乙酯；ESMS电喷质谱；HATUO-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓六氟磷酸盐；HPLC高效液体色层法；MS质谱；MALDI-TOF基质强制激光解吸电离-飞行时间(Matrix AssistedLaser Disorption Ionization-Time of Flight)；FAB快原子轰击(Fast AtomBombardment)；Me甲基；MeOH甲醇；R.T.室温(18°至22°)；TBTU2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓四氟硼酸盐；TFA三氟醋酸；THF四氢呋喃；TLC薄层色层法；Tris/HCl三(羟基甲基)氨基甲烷盐酸盐。
实施例1二肽1c的合成 将Boc-羟基脯氨酸1a(50.0克，216毫摩尔)，(1R，2S)-乙烯基-ACCA盐酸盐1b(42.25克，238毫摩尔)，TBTU(76.36克，238毫摩尔)及DIPEA(113毫升，649毫摩尔)于DMF(800毫升)中的混合物在氮气下于室温搅拌。3.5小时后，蒸发溶剂，残余物用EtOAc萃取。萃取物用盐酸(10％)，饱和碳酸氢钠及盐水洗涤。然后将有机相在硫酸镁上干燥，过滤，蒸发，得油体。于高真空干燥过夜(18小时)后，得黄色泡沫体的二肽1c(72.0克，94％，以HPLC测定纯度＞95％)。
实施例2二肽2a的合成 将二肽1c(72.0克，203毫摩尔)，三苯基膦(63.94克，243.8毫摩尔，1.2当量)及4-硝基苯甲酸(41.08克，245.8毫摩尔，1.2当量)溶于无水THF(1.4升)内。将搅拌的溶液在氮气下冷却至0℃。然后用45分钟滴加DEAD(38.4毫升，244毫摩尔，1.2当量)，使反应物升至室温。4小时后，蒸发溶剂，将残余物分成四份。每一份都在细二氧化硅胶(10-40微米筛目，柱直径12厘米，柱长16厘米)上用梯度2∶1的己烷/EtOAc至1∶1己烷/EtOAc至纯EtOAc作色层淋洗液纯化。得到酯2a，经蒸发溶剂并于70℃下高真空干燥1小时后呈无定形白色固体(108.1克，定量产额)。
实施例3醇二肽3a的合成 将硝基苯甲酰基酯2a(108.1克，203.1毫摩尔)溶于THF(1.0升)内，将所得溶液冷却至0℃。然后快速加入氢氧化锂单水合物(10.66克，253.9毫摩尔)于水(225毫升)中的溶液，并将反应物于0℃下搅拌30分钟，之后用盐酸(1N，50.8毫升)中和剩余的碱。再缓慢加酸至黄色消失(7毫升)。然后将所得混合物蒸发，残余物用EtOAc(3×150毫升)萃取。萃取物用饱和碳酸氢钠(150毫升)及盐水(150毫升)洗涤。有机相在硫酸镁上干燥，用硅藻土过滤，蒸发。残余物于高真空下干燥过夜，得无色泡沫体的醇3a(70.1克，98％，HPLC测定纯度＞99％)。
实施例4
(2S)-N-Boc-氨基-壬-8-烯酸(4g)的合成 步骤A.在市场上购得的二乙基2-乙酰氨基丙二酸酯4a(100克，0.46摩尔)在二噁烷(500毫升)中的溶液中在30至45分钟期间滴加氢氧化钠水溶液(1M，1当量，460毫升)。将所得混合物搅拌16.5小时，然后真空蒸发二噁烷。所得水溶液用三份300毫升的EtOAc萃取，用浓HCl酸化至pH1。将这溶液在冰水浴内结晶。在少许晶体出现后，混合物以超声波处理，出现大量沉淀。过滤，真空干燥，得到白色固体的化合物4b(62.52克，72％产出率)。
步骤B.将在1升圆底烧瓶中的以磁力搅拌的商业上购得的7-辛烯-1，2-二醇4c(25克，0.173摩尔)及H20(100毫升)的乳液中在20分钟期内加入过碘酸钠水溶液(40.7克，0.190摩尔，1.1当量，在475毫升H2O中)，(有少许放热)。生成的混合物再于室温搅拌1小时(以TLC证实反应已完全)。然后将混合物倾入分离漏斗内，由有机层分离出水层。水溶液用NaCl饱和，倾出，再一次从有机部分中分离。合并二次分离出的有机部分，在硫酸钠上干燥，在棉花塞上过滤(在巴斯德吸移管内)，得化合物4d(15.135克，无色油体，78％产出率)。水溶液用CH2Cl2过滤，用无水MgSO4干燥，真空浓缩(不加热，6-庚醛沸点153℃)以得另一部分化合物4d(1.957克，无色油体，10％产出率)。总产出率88％。
步骤C.在1分钟期间在固体2-乙酰氨基丙二酸乙酯4b(7.57克，40毫摩尔)中加入6-庚醛4d(4.48克，40毫摩尔)在吡啶(32毫升，10当量)中的溶液，所得溶液于10℃浴内冷却。在4分钟期间加入醋酸酐(12毫升，3.2当量)。将所得橙色溶液在室温下搅拌3小时，并加入另一部分2-乙酰氨基丙二酸乙酯4b(2.27克)。所得混合物再于室温下搅拌11小时。然后加入冰(60毫升)，将溶液搅拌1.5小时，该混合物再以250毫升水稀释，并用二分二乙醚萃取。这醚化溶液用1N HCl，饱和NaHCO3洗涤，干燥(Na2SO4)，浓缩，并以闪色层纯化(EtOAc 40％/己烷)，得到淡黄色油体的化合物4e(4.8克，50％产出率)。
步骤D.于去气(以氩气通入30分钟)的Z-2-乙酰氨基-2，8-壬烯酸乙酯4e(8.38克，35毫摩尔)在无水乙醇(70毫升)中的溶液中加入(S，S)-Et-DUPHOSRh(COD)Otf(51毫克，基质/催化剂＝496)。将该混合物置于30磅/英寸2氢下(在4-真空-H2循环后)于Parr摇动器上搅拌2小时。将所得混合物蒸发至干以得到粗制化合物4f，其用于下一步骤而不必纯化。
步骤E.于粗制(S)-2-乙酰氨基-8-壬烯酸乙酯4f(7.3克，30.3毫摩尔)于THF(100毫升)内的溶液中加Boc2O(13.2克，2当量)及DMAP(740毫克，0.2当量)。将反应混合物回流加热2.5小时。然后蒸发大部分THF溶剂，粗制混合物用CH2Cl2稀释，并用1N HCl洗涤以除去DMAP。有机层再以饱和NaHCO3水溶液萃取，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩。粗制产物以THF(50毫升)及水(30毫升)稀释，加入LiOH·H2O(2.54克，2当量)，将所得混合物于室温搅拌25小时(以TLC证实水解已完全)。将反应混合物真空浓缩以除去大部THF溶剂，用CH2Cl2稀释。所得溶液用1N HCl洗涤，用无水Na2SO4干燥，在真空下浓缩。为除去少量杂质及过量的Boc2O，将粗制产物以闪色层法纯化(用溶剂梯度100％己烷-100％EtOAc作洗脱剂)。得淡黄色油体的高纯度标题化合物4g(5.82克，71％产出率)。1H NMR(DMSO，400MHz)δ7.01(d，J＝8Hz，1H)，5.79(tdd，Jt＝6.7Hz，Jd＝17.0，10.2Hz，1H)，5.00(md，Jd＝17.0Hz，1H)，4.93(md，Jd＝10.2Hz，1H)，3.83(m，1H)，2.00(q，J＝6.9Hz，2H)，1.65-1.5(m，2H)，1.38(s，9H)，1.35-1.21(m，6H)。
实施例5三肽5b的合成
步骤1将氯化氢在二噁烷中的溶液(4N)加到BocP2-P1片段3a(5.32克，15.0毫摩尔)中成为无色溶液。在室温搅拌1小时后，蒸发溶剂，残余物置于高真空下3小时，制得无定形固体的化合物5a的盐酸盐，原样使用。
步骤2将DIPEA(2.6毫升，15毫摩尔)加到上面制备的P1-P2盐酸盐(15毫摩尔)在无水DCM(100毫升)中的混合物中，生成均质溶液。分别地将TBTU(5.30克，16.5毫摩尔，11当量)加到搅拌的C9-衔接物4g(4.07克，15.0毫摩尔)在无水DCM(130毫升)中的溶液中，导致试剂部分溶解。加入DIPEA(2.6毫升，15毫摩尔)，导致10分钟后成为基本均质的溶液。然后在这溶液内加入P1-P2溶液，并加入DIPEA直至反应物呈碱性(pH＞8，在湿石蕊上试验)。于氮气下搅拌5小时后，蒸发溶剂，残余物用EtOAc(2×250毫升)萃取，用稀盐酸(0.05N，400毫升)，水(400毫升)及饱和碳酸氢钠(400毫升)洗涤。然后将合并的有机相于硫酸镁上干燥，过滤，蒸发得到黄色浆体。粗制产物于硅胶上进行色层法处理，用6∶1 EtOAc/己烷至纯EtOAc作洗脱剂，得到所需三肽，二烯5b，呈白色泡沫体(5.88克，82％，HPLC测定纯度＞95％)。
实施例6大环中间体6a的合成
在二烯5b(4.0克，7.88毫摩尔)的无水DCM(800毫升)中的溶液通过鼓入Ar2小时而脱氧。然后加固体Hoveyda氏催化剂(262毫克，0.434毫摩尔，5.5摩尔％)，并将此反应物在Ar气的球形瓶中回流。28小时后，将红橙色溶液蒸发成无定形固体，于硅胶上进行闪柱色层法而纯化。开始的溶剂系统为10％EtOAc在CH2Cl2内。一但由柱洗去催化剂后，溶剂改为纯EtOAc。由柱上洗脱催化剂可由其颜色证明。分离大环产物6a，呈无色泡沫体，再将其溶于CH2Cl2/己烷(约1∶2)中。蒸发溶剂，得白色粉体(3.362克，89％产出率)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.20-1.50(m，6H)，1.43(s，9H)，1.53(dd，J＝9.5&5.4，1H)，1.61-1.70(m，1H)，1.76-1.90(m，2H)，2.05-2.26(m，4H)，2.45(d，J＝14.3，1H)，3.67(s，3H)，3.71(d，J＝11.1，1H)，3.90(dd，J＝11.1&4.3，1H)，4.43-4.53(m，2H)，4.76(d，J＝8.6，1H)，4.86(bd，J＝9.8，1H)，5.20-5.23(m，2H)5.57(dt，J＝7.0&9.8，1H)，7.32(bs，1H)。
实施例7硫脲7的制备硫脲7a的合成 在叔丁基异硫代氰酸酯(5.0毫升；39.4毫摩尔)于DCM(200毫升)中的溶液中加入环戊基胺(4.67毫升；47.3毫摩尔)，再加入DIEA，并将反应混合物于室温下搅拌2小时。混合物以EtOAc稀释，用10％柠檬酸水溶液(2x)，饱和NaHCO3(2x)，H2O(2x)及盐水(1x)洗涤。将有机层于无水MgSO4上干燥，过滤，并蒸发以得到N-叔-丁基-N′-环戊基硫脲，呈白色固体(3.70克；47％产出率)。将N-叔-丁基-N′-环戊基硫脲(3.70克)溶于浓HCl(46毫升)中。所得暗黄色溶液进行轻轻回流加热。40分钟后，将反应混合物冷却至室温，再于冰内冷却，并以固体及饱和NaHCO3水溶液碱化至pH9.5。将产物萃取入EtOAc(3x)内。合并的EtOAc萃取物用H2O(2x)及盐水(1x)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，过滤，浓缩至得到米色固体(2.46克粗制产物)。粗制产物在己烷/EtOAc 95/5中研磨，经过滤后得N-环戊基硫脲7a，呈白色固体(2.38；90％产出率)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.58(bs，1H)，7.19(bs，1H)，6.76(bs，1H)，4.34(bs，1H)，1.92-1.79(m，2H)，1.66-1.55(m，2H)，1.55-1.30(m，4H)。MS；es+144.9(M+H)+，es-142.8(M-H)-。
硫脲7b的制备用上述方法使用商业上可购得的环己基胺代替环戊基胺，制得硫脲7b 实施例8化合物101的合成
步骤A.于大环中间体6a(13.05克，27.2毫摩尔，1.0当量)，Ph3P(14.28克，54.4毫摩尔，2.0当量)及2-羧基甲氧基-4-羟基-7-甲氧基喹啉(WO 00/09543；WO 00/09558及W0 00/59929)(6.67克，28.6毫摩尔，1.05当量)在THF(450毫升)内的溶液中于0℃下在15分钟期间滴加DIAD(10.75毫升，54.6毫摩尔，2.0当量)。然后移去冰浴，将反应混合物于室温下搅拌3小时。待起始物完全转化成产物后，真空下蒸发溶剂，残余混合物用EtOAc稀释，用饱和NaHCO3(2x)及盐水(1x)洗涤，有机层于无水硫酸镁上干燥，过滤，蒸发至干。闪柱色层法后得纯的化合物7a；柱先用己烷/EtOAc(50∶50)淋洗，再用CHCl3/EtOAc(95∶5)淋洗以除去Ph3PO及DIAD副产物，以TLC监测杂质的洗脱。最后用CHCl3/EtOAc(70∶30)由柱上洗脱所需产物8a。通常色层步骤须重复2-3次后可得高纯度化合物8a，呈白色固体，总产出率68％(12.8克，99.5％纯度，以HPLC测定)。
步骤B.在Boc-保护的中间体8a(1.567克)在CH2Cl2(15毫升)内的溶液中加入4N HCl于二噁烷中的溶液(12毫升)。将反应混合物在室温搅拌1小时。[如在反应到半途有粘稠胶体生成时，再加10毫升CH2Cl2]。在去保护完成时，蒸发溶剂至干，以得到黄色固体及糊样物质。将此混合物再溶于约5％MeOH的CH2Cl2溶液中，并再于真空下蒸发至干，得到化合物8b，呈黄色固体，将其用于下一步骤而不必纯化。
步骤C.于环戊醇(614微升，6.76毫摩尔)于THF(15毫升)内的溶液中滴加光气在甲苯内的溶液(1.93M，5.96毫升，11.502毫摩尔)，并将混合物于室温下搅拌2小时以形成环戊基氯甲酸酯试剂(z)。然后真空下蒸发除去约一半量的溶剂。所剩余的浅黄色溶液通过加入CH2Cl2(5毫升)稀释，并浓缩至原容积的一半，以确保已除去全部过量的光气。将上述环戊基氯甲酸酯试剂溶液进一步以THF(15毫升)稀释，并加到胺-2HCl盐8b内。将混合物在冰浴内冷却至0℃，滴加Et3N调整pH至约8.5-9，将反应混合物再于0℃下搅拌1小时。然后用EtOAc稀释混合物，用水(1x)，饱和NaHCO3(2x)，H2O(2x)及盐水(1x)洗涤。有机层于无水MgSO4上干燥，过滤，真空蒸发，得黄琥珀色泡沫体。以闪柱色层法(用EtOAc内的30％己烷至20％己烷梯度溶剂作为洗脱剂)纯化，得二甲基酯8c，产出率80％(1.27克)，纯度＞93％。
步骤D.将二甲基酯8c(1.17克)溶于THF/MeOH/H2O(20毫升，2∶1∶1比)内，加入NaOH水溶液(1.8毫升，1N，1当量)。这反应混合物在室温搅拌1小时，然后蒸发至干，得钠盐8d，呈白色固体(约1.66毫摩尔)。化合物8d直接用于下一步骤而不必钝化。
步骤E.将粗制钠盐8d(1.66毫摩尔)溶于THF(17毫升)内，加入Et3N，混合物于冰浴内冷却至0℃。滴加异丁基氯甲酸酯(322微升，2.5毫摩尔)，于0℃下搅拌75分钟。然后加入重氮甲烷(15毫升)并于0℃下继续搅拌30分钟，再于室温搅拌1小时。真空下蒸发大部分溶剂至干，剩余混合物用EtOAc稀释，用饱和NaHCO3(2x)，H2O(2x)及盐水(1x)洗涤，于无水MgSO4上干燥，过滤，真空蒸发至干，得化合物8e，呈黄色泡沫体(1.2克，约1.66毫摩尔)。此重氮酮中间体8e直接用于下一步骤而不必纯化。
步骤F.将重氮酮8e(1.2克，1.66毫摩尔)溶于THF(17毫升)内的溶液在冰浴中冷却至0℃。滴加HBr水溶液(48％，1.24毫升)，并将反应混合物于0℃下搅拌1小时。然后混合物以EtOAc稀释，用饱和NaHCO3(2x)，H2O(2x)及盐水(1x)洗涤，于无水MgSO4上干燥，过滤，蒸发至干，得到α-溴酮中间体8f，为浅黄色泡沫体(约1.657毫摩尔)。
步骤G.于溴酮8f(2.51克，3.27毫摩尔)于异丙醇(105毫升)内的溶液中加入环戊基硫脲7a(565毫克，3.92毫摩尔)，将此反应混合物置于预热至70℃的油浴内并搅拌1.5小时。真空除去异丙醇，将产物溶于EtOAc内。溶液用饱和NaHCO3，水及盐水洗涤，有机层于无水MgSO4上干燥，过滤，蒸发至干，得到粗制产物8g(1.35克)，呈浅黄色固体。粗制产物以闪色层法于硅胶上纯化(1∶1己烷/EtOAc)，得2.12毫克灰白色固体(80％产出率)。
步骤H.将甲基酯8g(1.82克，2.2毫摩尔)溶于THF/MeOH/H2O(38/20/18毫升)的溶液内，用LiOH·H2O(935毫克，22.3毫摩尔)皂化。水解反应是在室温下进行18小时。然后将溶液蒸发至干，得灰白色糊料。此糊料用EtOAc及盐水稀释。用1N HCl将混合物pH调整至6。分离EtOAc层，并将水层用EtOAc萃取二次。合并的EtOAc层用去离子水(2x)及盐水(1x)洗涤，干燥(MgSO4)，蒸发，以得到环形三肽化合物101，呈黄色固体(1.76克，99％产出率)。
转化成Na盐将化合物8h(106毫克，0.132毫摩尔)溶于MeOH(20毫升)内，并加入0.01N NaOH溶液(13.2毫升)。此澄清黄色溶液用水稀释，冻干，以得化合物8h Na盐，呈黄白色不定形固体(106毫克，97％产出率)。
M.S.(电喷雾)799.3(M-H)-801.4(M+H)反相HPLC均匀性(0.06％TFA；CH3CN∶H2O)99％。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.02(d，J＝9.2Hz，1H)，7.90(d，J＝6.4Hz，1H)，7.76(s，1H)，7.44(bs，2H)，7.27(d，J＝1.9Hz，1H)，7.11(d，J＝7.0Hz，1H)，7.03(d，J＝9.2Hz，1H)，5.48(dd，J＝18.4，9.9Hz，1H)，5.43(bs，1H)，5.15(dt，J＝17.8，7.63Hz，1H)，4.70(bs，1H)，4.49-4.34(m，2H)，4.34-4.25(m，1H)，4.13-4.03(m，1H)，3.99-3.86(m，1H)，3.90(s，3H)，2.58-2.44(m，1H)，2.42-2.32(m，1H)，2.15-1.93(m，4H)，1.83-1.14(m，24H)，1,14-1.12(m，1H)。
实施例9用实施例8所述相同工序，但于步骤G中使用环己基硫脲7b，得化合物102钠盐。
化合物1021H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.02(d，J＝9.2Hz，1H)，7.86(bs，1H)，7.78(d，J＝7.3Hz，1H)，7.43(s，2H)，7.27(d，J＝2.2Hz，1Hz)，7.12(d，J＝6.9Hz，1H)，7.03(dd，J＝9.2，1.9Hz，1H)，5.57-5.40(m，1H)，5.40(s，1H)，5.26-5.17(m，1H)，4.70(bs，1H)，4.52-4.35(m，2H)，4.29-4.23(m，1H)，4.18-4.00(m，1H)，3.90(s，3H)，3.87-3.65(m，1H)，2.42-2.32(m，1H)，2.19-2.10(m，1H)，2.07-1.96(m，3H)，1.82-0.95(m，28H)。MS；es+815.4(M+H)+。es-813.4(M-H)-。
实施例10NS3-NS4A蛋白酶测定用于评估本发明化合物的酶催测定描述于WO 00/09543及WO 00/59929中。
实施例11细胞基的HCV RNA复制测定细胞培养以前述方法(Lohman等人，1990，科学285110-113)确立稳定地保留亚基因组HCV复制子的Huh7细胞，并定为S22.3细胞系(WO 02-052015)。将S22.3细胞保留在加有10％FBS及1毫克/1毫升新霉素的Dulbecco改性的Earle培养基(DMEM)内(标准培养基)。测定期间，使用加有10％的FBS的DMEM培养基，内含0.5％DMSO，但不含新霉素(测定培养基)。加入化合物前16小时，将S22.3细胞用胰蛋白酶消化，并用标准培养基稀释至50000细胞/毫升。取200微升(10000个细胞)分配在96孔盘的每一孔内。然后将盘在37℃在5％CO2下培养至第二天。
试剂及物料
试验化合物的制备将10微升试验化合物(在100％DMSO内)加到2毫升测定培养基内，使DMSO终浓度为0.5％，此溶液以超声波处理15分钟，并通过0.22微米Millipore Filter Unit过滤。将900微升移入聚丙烯深孔滴定盘的A排中。B至H排含400微升等分的测定培养基(含0.5％DMSO)，并通过将400微升由一排移至另一排(H排不含化合物)以用于制备系列稀释(1/2)。
试验化合物对细胞的应用由含S22.3细胞的96孔的盘吸出细胞培养物。将有适宜稀释的试验化合物的175微升测定培养基由含化合物的盘的每一孔转移至细胞培养物盘的每一对应孔(H排用作“无抑制对照”)。将细胞培养盘于37℃在5％CO2下培养72小时。
总细胞RNA的萃取培养72小时后，使用RNeasy 96试剂盒(Qiagen，RNeasy Handbook，1999)由96孔盘的S22.3细胞萃取总细胞RNA。简言之，由细胞完全取出测定培养基，加入100微升含143mMβ-巯基乙醇的RTL缓冲液(Qiagen)于96孔细胞培养盘的每一孔内。将此微量培养盘(microplate)轻轻摇动20秒。然后将100微升70％乙醇加到每一微量培养盘的孔中，并通过吸移管混合。取出溶胞产物，并加到RNeasy 96(Qiagen)盘的孔内，将盘置于QiagenSquare-WellBlock的顶部。用胶带将RNeasy 96盘密封，将有RNeasy 96孔盘的Square-WellBlock装入固定架内，并置于4K 15C离心机的转桶(rotor bucket)内。将样品于室温以6000转/分钟(约5600×g)离心4分钟。由盘上除去胶带。在RNeasy96孔盘的每一孔内加0.8毫升Buffer RWl(QiagenRNeasy 96试剂盒)。再用新胶带密封RNeasy 96孔盘，于室温以6000转/分钟离心4分钟。将RNeasy96孔盘置于另一清洁的Square-Well Block顶上，除去胶带，于RNeasy 96孔盘的每一孔内加0.8毫升Buffer RPE(QiagenRNeasy 96试剂盒)。再用新胶带密封RNeasy 96孔盘，于室温以6000转/分钟离心4分钟。除去胶带并在RNeasy 96孔盘中的每一孔中加入0.8毫升Buffer RPE(QiagenRNeasy 96套盒)。用新胶带密封RNeasy 96孔盘并在6000室温以6000rpm离心10分钟，除去胶带，将RNeasy 96孔盘置于有1.2毫升收集微管的支架顶端。通过加50微升无RNase的水于每一孔内而洗脱RNA，用新胶带密封盘，于室温培养1分钟。然后将盘于室温以6000转/分钟离心4分钟。再用第二容积50微升的无RNase的水重复洗脱步骤。将含总RNA的微管存储于-70℃。
总细胞RNA的定量用RiboGreenRNA定量试剂盒(Molecular Probes)在STORM系统(Molecular Dynamics)上定量RNA。简言之，将RiboGreen试剂于TE(10mMTris-HCl pH＝7.5，1mM EDTA)内稀释200倍。通常，将50微升试剂稀释在10毫升TE中。将核糖体的RNA的标准曲线在TE内稀释至2微克/毫升，再将预定量(100，50，40，20，10，5，2及0微升)的核糖体RNA溶液转移入新的96孔盘(COSTAR#3997)内，再用TE将容积加至100微升。通常，96孔盘的第一列用于标准曲线，其他的孔用于要定量的RNA样品。将要定量的10微升的每一RNA样品移至96孔盘的对应的孔中，并加入90微升TE。在96孔盘的每一孔内加100微升容积的稀释的RiboGreen试剂，于室温培养2至5分钟，避光(200微升终容积内的10微升RNA样品产生20X稀释)。每一孔的萤光强度用STORM系统(Molecular Dynamics)测定。基于已知量的核糖体RNA及生成的萤光强度制出标准曲线。由标准曲线及20X稀释校对测出实验样品中的RNA浓度。
试剂及物料
真实时间R.T.-PCR真实时间R.T.-PCR是用TaqMan EZ R.T.-PCR试剂盒(Perkin-ElmerApplied Biosystems)在ABI Prism 7700序列检测系统(Sequence DetectionSystem)完成。用类似上述技术(Martell等人，1999，J.Clin.Microbiol.37327-332)的Taqman技术(Roche Molecular Diagnostics System)使R.T.-PCR适合于HCV RNA的5’IRES定量。这系统使用AmpliTaq DNA聚合酶的5’-3’溶核(Nucleolytie)活性。简言之，这方法利用双重标记的萤光团杂交探针(PUTR Probe)，这探针特别使PCR引物(引物8125及7028)间的模板退火。探针的5’端含萤光报道分子(6-羧基萤光素[FAM])，其3’端含萤光熄灭剂(6-羧基四甲基罗丹明[TAMRA])。通过在完整杂交探针上的熄灭剂而抑制FAM报导分子的发射光谱。杂交探针的核酸酶降解释出报导分子，导致萤光发射的增加。ABI Prism 7700序列测量器是在PCR放大过程中测定萤光发射的增加，以致使放大的产物直接与信号成正比。在反应早期在代表产物累积的对数相的点上分析扩增区。代表一种有关用于序列测定器的PCR产物指数生长的萤光信号中增加的已确定的测定阈值的点定义为循环阈(Cτ)。Cτ值与输入的HCV RNA量成反比；这样，在相同PCR条件下，HCV RNA的起始浓度越高，Cτ越低。通过将Cτ对已知HCV RNA浓度的每一标准稀释度制成曲线图即可用ABI Prism 7700测定系统自动制成标准曲线。
将标准曲线的参考样品置于每一R.T.-PCR盘上。体外合成HCV复制子RNA(通过T7转录)，纯化，并以OD260定量。考虑到1微克RNA＝2.15×1011RNA拷贝，进行稀释以具有108，107，106，105，104，103或102基因组RNA拷贝/5微升。对每一稀释度中也加入总细胞Huh-7 RNA(50毫微克/5微升)。将5微升的每一参考标准(HCV复制子+Huh-7 RNA)与45微升ReagentMix合并，用于真实时间P.T.-PCR反应。
已于RNeasy 96-孔盘上纯化的实验样品的真实时间R.T.-PCR反应是通过5微升的每一总细胞RNA样品与45微升Reagent Mix组合而进行的。
试剂及物料
试剂混合物制备
正向引物序列(SEQ ID NO.1)5’-ACG CAG AAA GCG TCT AGC CATGGC GTT AGT-3’反向引物序列(SEQ ID NO.2)5’-TCC CGG GGC ACT CGC AAG CACCCT ATC AGG-3’注这些引物放大HCV的5’未翻译区内存在的256-nt的区。
PUTR探针序列(SEQ ID NO.3) -TGG TCT GCG GAA CCG GTGAGTACACC- 无模板对照(NTC)每一盘上使用4个孔作为“NTC”。这些对照在孔内加5微升水代替RNA。
热循环条件50℃ 2分钟60℃ 30分钟95℃ 5分钟 R.T.-PCR反应终了后，数据分析需设定PCR盘的阈值萤光信号，并通过将Cτ值对每一参考反应中所用的RNA拷贝数制图而构成标准曲线。供鉴定样品取得的Cτ值用于插入基于标准曲线的RNA拷贝数。
最后，将RNA拷贝数正常化(基于由细胞培养孔萃取的总RNA的RiboGreen RNA定量)并以基因组当量/微克总RNA[ge/μg]表示。
由细胞培养盘每一孔得到的RNA拷贝数[g.e./μg]是在有各种浓度抑制剂存在下复制HCV RNA量的量度。抑制％是以如下方程式计算100-[([g.e./μg inh]/(g.e./μg ctl)×100]将适合Hill模型的非线性曲线使用于抑制-浓度数据，用SAS软件(Statistical Software System；SAS Institute，Inc.Cary，N.C)计算50％有效浓度(EC50)。
实施例12特异性监测用于评估这化合物的选择性的特异性检测描述于WO 00/09543。
实施例13药物动力学性质本发明化合物也有良好药物动力学性质，如鼠在口服5毫克/公斤剂量后在1小时及2小时时的可测出的血浆含量。
更明显的是，下述检测，一种活体内口吸收筛选，用于测定鼠在口服后试验化合物的血浆含量物料及方法1.用于汇集化合物的方法(“盒式选择”)要汇集进“盒”的化合物的选择是基于其结构的相似性及物理化学性质。确立一种可用于所有选择的化合物的固相萃取方法。基于起始试验，将每一化合物送入鼠血浆，并以HPLC或/HPLC/MS在0.5μM浓度测定其停滞时间，离子质量，并使用通过HPLC及/或HPLC/MS测定出的各化合物间可能的分离作为汇集3-4个化合物入“盒”的基础。
2.口服载体及化合物制剂每一“盒”含3-4种化合物，每一化合物为5或4毫克/公斤。盒可制成在0.5％的水性甲基纤维素及0.3％聚氧乙烯(20)山梨糖酮单油酸酯(吐温80)中的悬浮液。经口管饲法给药容积为10毫升/公斤。
3.投药及血样抽样将Male Sprague Dawley鼠在各自笼内空腹过夜，但可喝10％葡萄糖水溶液。两只鼠给药每种“盒”。投药后1及2小时由2只鼠中采取血浆样品(约1毫升)，并汇集以进行萃取及分析。
4.化合物萃取及分析以固体相萃取方法萃取每一盒内的投药后1及2小时所取的血浆样品，空白血浆，含各以0.5μM的所有化合物的空白血浆。以HPLC及HPLC/MS分析样品以进行比较。基于0.5μM标准的单个浓度评估血浆浓度。
表1
在本发明化合物评估上述酶催及细胞基的鉴测时，发现这些化合物具有高活性。更具体地说，于NS3-NS4A蛋白酶检测中这些化合物的IC50低于0.01μM，于以细胞为基础的HCV RNA检测中其EC50低于0.01μM。
在这些化合物作特异性检测评估时，发现式I化合物的选择性在于其在人白血球弹性蛋白酶及组织蛋白酶B检测中无明显抑制性。
在这些化合物以鼠作药物动力学检测评估时，在Methocel∶Tween20(0.5％∶0.3％)内5毫克/公斤的剂量下即产生出乎意料的良好血浆浓度。化合物101及102的曲线下面积(AUC)分别为16及18--小时，而与其接近的类似物的AUC为0.8至4.5μM-小时。这种在鼠血浆内化合物吸收量的意外并显著增加使这些化合物作为口服的有效药物特别有兴趣。
序列表<110>贝林格尔.英格海姆加拿大有限公司(BOEHRINGER INGELHEIM CANADA LTD.)<120>有效抗C型肝炎病毒的大环肽<130>13/092<150>2,369,711<151>2002-01-30<160>3<170>FastSEQ for Windows Vervion 4.0<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>1acgcagaaag cgtctagcca tggcgttagt 30<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>2tcccggggca ctcgcaagca ccctatcagg 30<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PUTR探针<400>3tggtctgcgg aaccggtgag tacacc 2权利要求
1.一种式I化合物 其中R1是羟基或NHSO2R1A；其中R1A是(C1-8)烷基，(C3-7)环烷基或{(C1-6)烷基-(C3-7)环烷基}，其全部视需要以卤素，氰基，硝基，O(C1-6)烷基、酰氨基，氨基或苯基进行1至3次的取代，或R1A是C6或C10芳基，其视需要以卤素，氰基，硝基，(C1-6)烷基，O(C1-6)烷基，酰氨基，氨基或苯基进行1至3次的取代；R2是(C5-6)环烷基及R3是环戊基；或其药物上可接受的盐。
2.根据权利要求1的化合物，其中R1是羟基或NHSO2R1A，其中R1A是(C1-6)烷基，(C3-7)环烷基或{(C1-6)烷基-(C3-7)环烷基}，其全部视需要以卤素，硝基或O(C1-6)烷基进行1至3次的取代，或苯基其视需要以卤素，硝基，(C1-6)烷基或O(C1-6)烷基进行1至3次的取代。
3.根据权利要求2的化合物，其中R1是NHSO2R1A，其中R1A是甲基，乙基，环丙基，环丁基，环戊基，环丙基甲基，环己基乙基，CCl3，CF3，苯基，2-氟苯基或4-甲基苯基。
4.根据权利要求3的化合物，其中R1A是环丙基。
5.根据权利要求1或2的化合物，其中R1是羟基。
6.根据权利要求1至5中任一的化合物，其中R2是环戊基。
7.根据权利要求1的化合物，具有下式101
8.根据权利要求1的化合物，具有下式102
9.根据权利要求1的化合物，具有下式103
10.一种药物组合物，其包含一种抗C型肝炎病毒有效量的权利要求1至9中任一的式I化合物或其药物上可接受的盐，并混合有医药上可接受的载剂介质或助剂。
11.根据权利要求10的药物组合物，其还含有治疗有效量的一种或多种其他抗-HCV制剂。
12.根据权利要求11的药物组合物，其中所述其他抗-HCV剂是选自α-干扰素或聚乙二醇化的α-干扰素。
13.根据权利要求11或12的药物组合物，其中所述其他抗-HCV制剂是病毒唑。
14.根据权利要求11、12或13的药物组合物，其中所述其他抗-HCV制剂是选自解旋酶，NS2/3蛋白酶及内部核糖体进入位点(IRES)的抑制剂。
15.一种用于治疗或预防哺乳动物的C型肝炎病毒感染的方法，是通过对哺乳动物给药一种抗C型肝炎病毒有效量的权利要求1-9中任一式1化合物或其药物上可接受的盐。
16.一种用于治疗或预防哺乳动物的C型肝炎病毒感染的方法，是通过对哺乳动物给药一种抗C型肝炎病毒有效量的权利要求10-14中任一组合物。
17.一种用于治疗或预防哺乳动物的C型肝炎病毒感染的方法，是通过对其给药一种抗C型肝炎病毒有效量的权利要求1-9中任一式1化合物或其药物上可接受的盐，并组合一种或多种其它抗HCV的制剂。
18.根据权利要求17的方法，其中所述其他抗-HCV制剂是选自α-干扰素或聚乙二醇化的α-干扰素。
19.根据权利要求17或18的方法，其中所述其他抗-HCV制剂是病毒唑。
20.根据权利要求17、18或19的方法，其中所述其他抗-HCV制剂是选自解旋酶，NS2/3蛋白酶及内部核糖体进入位点(IRES)中的抑制剂。
21.根据权利要求1-9中任一的式1化合物的用途，它用于制造用于治疗或预防C型肝炎病毒传染的药物。
22.根据权利要求11、12或13的药物组合物，其中所述抗-HCV制剂是一种HCV聚合酶的抑制剂。
23.根据权利要求17、18或19的方法，其中所述其它抗-HCV制剂是一种HCV聚合酶的抑制剂。
全文摘要
式(I)化合物其中R
文档编号C07K5/087GK1639187SQ03805484
公开日2005年7月13日 申请日期2003年1月24日 优先权日2002年1月30日
发明者蒙特斯·利纳斯-布鲁尼特, 维达·J·戈里斯 申请人:贝林格尔·英格海姆加拿大有限公司