专利名称：ActRⅡB激酶活性的测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及激酶测定法，具体而言，本发明涉及用于测量ActR IIB激酶的活性和/或活性调节的新激酶测定方法。
背景技术：
活化素最初是作为可刺激促卵泡激素(FSH)在所培养垂体细胞中分泌的生殖腺多肽激素。有三种活化素(A型、B型和AB型)，它们是两种紧密相关的β亚基的同/异二聚体(βAβA、βBβB和βAβB)(Vale等，参见肽生长因子及其受体实验药学手册(Peptide Growth Factorsand Their ReceptorsHandbook of Experimental Pharmacology)，第95卷，第221页，Sporn和Roberts(编辑)，Springer-Verlag出版(纽约，纽约州，1990))。由于其具有诱发鼠Friend红白血病细胞的红细胞分化的能力，首先在经肉豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)处理的人单核白血病细胞(THP-1)的培养液中发现了红细胞分化因子(EDF)(Eto等，生物化学和生物物理研究交流(Biochem.Biophys.Res.Comm.)，1421095(1987))。后来发现与活化素A相同，因为它是由与活化素A的βA亚基相同的mRNA所编码的(Murata等，美国国家科学进展PNAS，852434(1988))。活化素A随后显示出能在人K562红白血病细胞中诱导血红蛋白的合成(Yu等，自然(Nature)，330765(1987))。此外，它还可增强正常的红细胞前体细胞在体外(Yu，同上；Broxmeyer，美国国家科学进展PNAS，859052(1988))和体内(Shiozaki等，生物化学和生物物理研究交流Biochem.Biophys.Res.Comm.，1651155(1989)；Schwall等，内分泌学Endocrinology，1251420(1989))的生长。活化素A及其mRNA表达于成年啮齿动物的骨髓和脾中(Meunier等，美国国家科学进展PNAS，85247(1988)；Shiozaki等，美国国家科学进展PNAS，891553(1992))。活化素A也可由培养中的鼠和人骨髓基质细胞所产生(Yamashita等，血液Blood，79304(1992)；Shao等，实验血液学Exp.Hematol.，201235(1992))。此外，最近的资料显示它可由人外周血单核细胞分泌得到(Shao，见上文；Eramaa等，实验医学杂志J.Exp.Med.，1761449(1992))。这些发现显示了活化素A充当了骨髓中红细胞发生的天然调节子作用。
预计活化素的生物效应通过I类和II类受体来介导(Massague，细胞(Cell)，691067(1992))。目前，已知的有两种I类受体ActR I和ActR I A，以及两种同源的II类活化素受体ActRII和ActR IIB，所有这些受体均已经cDNA克隆进行鉴定。ActRII和ActR IIB是跨膜蛋白质，具有结构上与许多已知丝氨酸/苏氨酸激酶相关的细胞内激酶结构域(Mathews等，细胞Cell，65973(1991)；Attisano等，细胞Cell，6897-108(1992))。
其它关于活化素受体的参考文献包括Mathews等，科学Science，2551702-05(1992)；Mathews等，生物学化学杂志J.Biol.Chem.，26819013-18(1993)；和Hilden等，血液Blood，832163-70(1994)。
ActR IIB是单跨膜受体激酶。Myostatin(TGF-β(转化生长因子)超家族的一员，也称生长和分化因子8或GDF-8)是骨骼肌中ActR IIB激酶的天然配体之一。Myostatin通过ActR IIB激酶的信号传导导致了对骨骼肌块的负调节作用。因而，ActR IIB激酶活性的抑制剂可预防或逆转造成身体虚弱的、与年龄相关的骨骼肌质量损失；因此本发明的一个目标是提供可用于筛选、尤其是高通量筛选潜在ActR IIB激酶配基的有效测定方法，因为这些配基的发现可导致发现治疗身体虚弱的合适药物。
蛋白激酶是通过将磷酸基团附着于蛋白质或肽的一个或多个位点上而共价修饰蛋白质和肽的酶。蛋白激酶代表了最大的酶组之一，它在许多细胞信号传导过程中起着关键的作用。由于基因组计划和近来分子生物学技术中的其它进展，越来越频繁地发现有具有未鉴定的生化特征和底物特异性的新激酶。传统的蛋白激酶测定法包括利用标记好的ATP作为磷酸供体，底物肽作为含相应激酶识别基元的磷酸受体。激酶反应后将底物肽捕捉于合适的滤器上。通过多种技术将未反应的标记ATP和代谢物从放射性肽底物中拆分出来，包括三氯乙酸沉淀法和大量的洗涤。添加各种带正电荷的残基，洗涤后被俘获在磷酸纤维素膜上。用闪烁计数检测掺入底物肽的放射活性。这种测定方法相对简单、相当灵敏，且可针对肽底物的序列和浓度进行调整以符合测定的要求。更多的关于代表性的激酶测定的内容参阅美国专利申请文件U.S.Patent5759787。
发明概述在第一个方面，本发明提供了用于测定ActR IIB的激酶活性的测定法，所述测定法包括如下步骤将ActR IIB、经标记的磷酸供体和靶肽在合适的介质中保温，以便所述ActR IIB可利用所述的已标记磷酸供体将所述靶肽磷酸化，从而产生被标记的靶肽，以及测量所述被标记靶肽中存在的标记量。
在第二个方面，本发明提供了用于发现ActR IIB激酶的调节物的测定法，所述测定法包括如下步骤在第一反应中将ActR IIB、已标记好的磷酸供体和靶肽在合适的介质中保温，以便所述ActR IIB可利用所述已标记磷酸供体将所述靶肽磷酸化，从而产生被标记的靶肽，然后在第二反应中将ActR IIB、已标记的磷酸供体、靶肽和待测化合物一起保温，测量来自所述第一和第二反应中的所述被标记靶肽中存在的标记量，并将所述第二反应中被标记靶肽的量与所述第一反应中被标记靶肽的量进行比较，其中被标记靶肽量的任何统计学显著性差异都表明了所述待测化合物是ActR IIB激酶的调节物。
在第三个方面，本发明提供了蛋白质catActR IIB激酶，其中所述蛋白质具有SEQ ID NO2所示的序列。
附图描述
图1提供了利用闪烁计数法进行几种激酶反应的结果的图解比较。
发明详述本领域熟练的技术人员完全能理解本文用于描述本发明的说明书和所附权利要求书中所使用的术语。尽管如此，除非本文另有说明，以下术语按下文所述来理解。
“ActR IIB”指蛋白质活化素受体IIB，或者有时指编码活化素受体IIB蛋白的基因。“ActR IIB激酶”相当于简写“ActR IIB”，尽管在需要强调ActR IIB的激酶活性和/或激酶催化部分时通常使用前者。除非特指，ActR IIB指蛋白质在人、小鼠或任何其它生物体中发现的(例如，对于人来源的ActR IIB，参阅Hilden等人，血液Blood，83(8)2163-70，1994；对于小鼠来源的ActR IIB，参阅Attisano等人，细胞Cell，6897-108，1992；对于爪蟾来源的ActR IIB，参阅Mathews等人，科学Science，2551702-05，1992)。此外，除非特指，ActR IIB指所有天然发生的该蛋白质等位基因及其人工(如通过遗传工程改造的)变体。
“catActR IIB”指为了用于本发明而设计的修饰形式的ActR IIB蛋白。通过保留催化部分并去除对于酶活性来说非必要的疏水部分来修饰ActR IIB，从而产生具有优良溶解特性的酶。虽然未修饰的ActR IIB也能用于本发明的方法中，但此修饰形式的ActR IIB是目前所优选的。catActR IIB优选由人ActR IIB(SEQ ID NO2)的第167-512位氨基酸组成。这些氨基酸对应于该蛋白质的催化(胞质)结构域，也对应于录入号#77533的核酸序列的第503-1543位核苷酸(参阅Hilden等人，Blood，83(8)2163-70，1994)。
“his-ActR IIB”、“his-catActR IIB”指由遗传工程化构建体表达的、包含便于后续纯化的组氨酸或his6标签的ActR IIB或catActR IIB蛋白质。
“磷酸供体”指参与ActR IIB所催化的酶促反应的化合物，其中的磷酸供体失去了磷酰基，而该基团被ActR IIB转移至底物。最常用的磷酸供体是核苷三磷酸和二磷酸。目前最优选用于本发明的磷酸供体是ATP。
“减少”指在统计学上显著的降低(即p＜0.1)。
“增加”指在统计学上显著的增加(即p＜0.1)。
“调节”指在统计学上显著的增加或降低(包括完全去除)。
最基本形式的激酶测定法只是激酶蛋白质、合适的底物、磷酸供体和用于测量所发生反应量的方法的组合。当然，在这简单化的策略中可能存在许多复杂的因素。在本发明的案例中，当试图建立用于测定ActR IIB的激酶活性，或更具体的说，测定修饰形式的ActR IIB(此处指catActR IIB，见下文)的激酶活性的方法时，就存在某些问题。通常使用的激酶检测法底物是髓鞘碱性蛋白质，或MBP。对于多数激酶来说它通常是一种好的靶蛋白，而且既容易获得又便宜。不过，当试图用MBP作为底物来测定catActR IIB的激酶活性时，这种尝试令人惊讶地失败了(见本文实施例1和2)。因此，必需使用另一种底物。
用于本发明激酶检测的底物被称为“靶肽”。此小肽对于本文所述的所有形式ActR IIB蛋白来说都是极好的底物。它包含了ActR IIB特异识别所必需的识别基元，以及被磷酸化所必需的氨基酸。在最优选的实施方案中，靶肽长为27个氨基酸，序列为H2N-Val-Tyr-Asp-Leu-Ser-Thr-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Leu-Pro-Leu-Phe-Val-Gln-Arg-Thr-Val-Ala-Arg-Thr-Ile-Val-Leu-COOH(SEQID NO1)。现认为ActR IIB识别适当间隔开的氨基酸序列STSGSGS和RTVART，在优选的靶肽中正是如此。不过，预期别的肽序列也能在本检测中发挥作用，只要它们与SEQ ID NO1足够类似从而能被ActR IIB有效识别就可。
为了使激酶检测有效，反应必须是能够检测的，即能测定在已知时间内激酶催化了多少磷酸化作用。目前已知的最简单的解决办法是提供一种磷酸化反应物，其中具有可在反应产物中测定到的标记(且此被标记产物可与被标记的反应物区别开来)。更通常的是提供放射性标记的ATP，在激酶反应中使用它将产生放射性标记的靶肽。既然从ATP转移至靶肽的磷酰基含有氧原子和磷原子，从理论上说就可以使用任何这些原子的放射性同位素作为标记。在实践中，磷(32P或33P)是较优选的。除了直接的放射性标记外，还有利用特异于磷酸化形式靶肽的抗体进行间接标记或捕捉的方法。此方法构成了放射免疫测定和非放射免疫测定的基础。在后一种测定法中，磷酸肽特异的抗体(或次级抗体)可携带整合酶活性，诸如辣根过氧化物酶，它可通过使用呈色底物进行检测，或者，抗体可以携带一些便于检测的荧光基团或磷光基团。如果底物肽包含不会干扰其作为底物的能力的荧光团，则此磷酸肽特异抗体就可用于荧光偏振检测方案中。由于与磷酸化肽/抗体复合物相比，非磷酸化肽将具有更快的偏振扩散，这两种形式的底物(未结合型和抗体结合型)就可利用偏振光分析加以区分。在目前优选的实施方案中，使用了含32P或33P的ATP，其中反应混合物中ATP的总浓度约在7.4μM-7.6μM之间，总ATP中大约有0.001％-0.004％被放射性标记。这样就产生了约0.2-0.5μci/ml反应体积的优选放射性水平。
正如本领域熟练技术人员所理解的，除了激酶本身和必需的反应物以外，为了检测的有效性和可重复性，还必须使反应在由恰当的溶剂、盐和促进反应的多种因子所组成的合适介质中进行。水是优选的介质，但也可完全使用其它溶剂或较优选的将其与水结合使用。这些溶剂包括DMSO、乙醇和本领域熟练技术人员已知可能与酶活性相容的其它溶剂。当然，优选在检测中使用缓冲液来维持恰当的pH范围。有用的缓冲液包括HEPES、Tris、MOPS，等等。pH优选约为6.3-8.3，更优选约为6.8-8.8。在最优选的实施方案中，pH约为7.3。重要的是在反应混合物中包含某些盐以达到最佳活性状态。特别是，优选包含适当浓度的MgCl2和MnCl2。最后，还优选包含某些表面活性剂、辅助因子等。其中有BSA或其它增强稳定性的蛋白质，以及EDTA或其它重金属清除化合物。
优选将本检测法中的激酶反应保温于50-100°F之间。更优选的是反应在65-80°F之间发生。由于优选且易于达到，反应最好保温于室温状态(通常约为72°F)。此保温时间可为几分钟到几小时，优选的时间范围是20分钟至90分钟。更优选的保温时间是在40-80分钟之间，目前最优选的是75分钟。
在进行激酶测定后，必须在一预先确定的时间点终止ActR IIB酶反应。如果反应未在一准确的已知时间点终止，那么就不可能比较一个反应与另一反应的结果。任何终止反应的合理方法都可使用，只要它不干扰激酶反应结果的准确测定就可以。例如，可将能使ActR IIB蛋白快速变性、降解或失活的某些化合物添加至反应混合物中。这样的化合物包括TCA、磷酸、SDS等等。或者，可以将反应混合物加热至使ActR IIB蛋白永久变性的某一温度。此方案将要求加热至至少约160°F。其它合适的方法均为本领域熟练技术人员所已知的。
在完成激酶反应且使ActR IIB蛋白失去活性后，通常需要分离被标记的靶底物。如果靶底物不被分离，一般说来无法将被标记底物所产生的信号与未使用完的标记反应物所产生的信号区分开来。不过，在某些情况下，不必分离被标记的靶底物，在这样的情况下可进行直接的测定。例如，在某些情况下可使用诸如闪烁近似测定法之类检测法，这种情况下就没有必要分离被标记底物。
本领域熟练的技术人员知道从未使用完的标记反应物中分离被标记好的靶底物的许多方法。常用的方法包括凝胶电泳、沉淀、过滤、层析、免疫沉淀，等等。目前，优选通过TCA沉淀靶肽来分离被标记的靶底物。
一种极好的分离方法是将被标记的靶底物特异结合至固相支持物上，随后洗去未被使用的标记反应物。有许多固相基质可用于此方法中。在选择合适基质时应考虑的因素包括固定化受体的粘附和功能保持力、可用于结合的表面区域、洗涤的便利性、成本、高通量适应性，等等。经常地，固相基质是反应池本身的壁。优选的基质能使信号强度和信噪比最大化。代表性的基质包括聚苯乙烯微量滴定板、细纤维、聚合体微珠或硅基微珠，等等，优选预先活化以提供最佳蛋白质结合。使用时，按尺寸、范围和结构来选择微珠，使其在测定保温期间表面面积、滤过保持力和珠子悬浮时间最大化。
一旦被标记的靶底物与未使用的标记反应物分离开，就必需测定被标记靶底物的量。进行此测定的方法取决于所使用标记的类型。对于放射性标记的靶底物来说，可用本领域熟练技术人员已知的各种技术中的任何方法来测定存在的放射性的量，包括闪烁计数法、定量放射自显影术、光密度测定法、磷酸成像术，等等。
如果靶底物是用荧光标记物所标记的，那么标记的量就可以用定量分光光度法、荧光/化学发光成像术等方法进行测定。
测定激酶活性的其它方法可基于因磷酸化和非磷酸化蛋白质及肽之间的电荷差异进行的分离。在这些方面，已使用了以凝胶电泳和HPLC为基础的方法。与这些技术相结合，还使用了分光光度测定法和荧光测定法。迄今用于测定蛋白激酶活性的许多方法的有关描述参阅国际专利申请文件WO 93/10461和美国专利5120644和5141852。还可参阅文献Toomik等，分析生物化学(Analytical Biochemistry)，209348-53(1993)。
除了激酶、底物、NTP和第一受体外，反应混合物还可以包含待测化合物，诸如预先选择的激酶抑制剂或调节子，或尤其是对于高通量药物筛选来说，还可包含来源于文库的待测化合物。很简单地，通过测定激酶反应，有可能很容易的确定在待测化合物存在的条件下激酶反应是增加还是降低了。如果反应速率提高了，那么待测化合物可能是激活剂。如果反应速率降低了，那么待测化合物可能是拮抗物。
文库来源的待测化合物包含许多化学类型，但它们通常为有机化合物；优选小的有机化合物。文库可包含合成的和/或天然来源的化合物。例如，有许多方法可用于随机和定向合成各种有机化合物和生物分子，包括随机化的寡核苷酸的表达。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库也是可以获得或容易产生的。此外，天然和合成产生的文库和化合物可很容易通过传统的化学、物理和生化方法进行修饰。另外，可对已知的药理学制剂进行直接或随机的化学修饰，诸如酰基化、烷化、酯化、脒化(amidification)等，从而产生其结构类似物。制剂以标准系列稀释度的形式提供，或按类似于已知调节子所确定的量来提供。此外，混合物常常包含另外的试剂，诸如盐、缓冲液等，以便促进激酶活性或使激酶活性最大化。
尽管不是严格的必需，作为实践来说包括激酶反应的一系列对照是非常有用的。如果在一反应混合物中添加某待测化合物，那么在对照激酶反应中添加同等量的类似组分(只缺少待测化合物)是非常重要的。这将解释由于含待测化合物的溶液中的溶剂、盐或其它成分所引起的激酶活性的任何变化。
还非常有必要的是包括正对照和负对照激酶反应，它们同样与待试验反应尽可能相似，不同的只是它们包含已知的激酶活性调节子。通过检测与未知待测化合物平行使用的已知激酶活性抑制剂和激活剂，可以更容易地控制在激酶反应性上不可预计的波动。
本发明的一个最重要的方面是它适用于对ActR IIB激酶调节子进行高通量的筛选(HTS)。因为该反应简便、可以小体积进行(如在微量滴定板上)，并且可重复，所以可能用于筛选巨型化合物文库并发现那些以有利方式调节ActR IIB激酶活性的化合物。这些新发现的调节子是可用于人和动物的潜在药物。
本发明的其它特征和优势在以下详述和权利要求中是显而易见的。尽管本发明以具体的实施方案进行描述，但应理解为可实行的其它改变或修饰也是本发明的一部分，并且也包括在附属权利要求的范围内。本申请意图覆盖总体说来遵从本发明原理的任何本发明的同等物、变种、用途或变化形式，包括来自本领域中已知或常规实践而脱离本文公布内容的任何本发明的同等物、变种、用途或变化形式。另外的指导参阅分子生物学、蛋白质科学、免疫学等标准教科书。所有本文件中所引用的文献均在此全文收编作为参考。
实施例实施例1-放射自显影测定法将在25mM HEPES(pH7.3)中包含2.5μg/ml his-catActR IIB激酶、1mg/ml靶肽或2.5μM髓鞘碱性蛋白质(MBP)、10μM ATP、10μCi[32P]γ-ATP(6000Ci/mmol)、1mg/ml牛血清清蛋白(BSA)、和5mM原钒酸钠的20μl反应混合液于室温运行30分钟。加入1/3体积的含β-巯基乙醇和示踪溴酚蓝的3x Laemmli缓冲液(188mM Tris pH6.8、3％SDS、24％甘油、25％v/vβ-巯基乙醇)终止反应。将终止后的反应液直接加到18％聚丙烯酰胺/tris/甘氨酸凝胶上而无需煮沸。将凝胶于大约100伏特进行电泳以完成适当分离，在水中清洗5分钟，并在半干印迹缓冲液(48mM Tris碱、39mM甘氨酸、20％甲醇、0.375％SDS)中平衡5分钟。然后在Bio-Rad半干印迹装置中于20伏特运行48分钟将反应产物转移到硝酸纤维素滤膜上，并通过放射自显影进行观察和/或定量。
在包含靶肽的反应混合液中，显现的条带位于3Kd和40Kd，分别对应于经标记的靶肽和自身磷酸化的his-catActR IIB激酶。在包含MBP的反应混合液中，显现的条带位于18Kd和40Kd，分别对应于经标记的MBP和自身磷酸化的his-catActR IIB激酶。最后，在不含靶肽和MBP的对照反应混合液中，唯一显现的条带是位于40Kd的自身磷酸化的his-catActR IIB激酶。因此，显然此反应条件有益于ActR IIB催化的磷酸化(激酶)活性。
实施例2-闪烁法将包含25mM HEPES(pH7.3)、3mM MgCl2、1mM MnCl2、0.1mMEDTA、1mM DTT、0.2mM原钒酸钠、100μg/ml BSA、10μM ATP、0.25μCi[33P]γ-ATP、和16.5μg/ml his-catActR IIB激酶的一系列反应混合液在总计100μl中直接在Durapore(Millipore)滤板中于室温运行80分钟。加入等体积的冰冷TCA(10％或25％v/v)终止反应。于4℃保温1小时后，在真空下收集沉淀。将沉淀用冷TCA清洗5次。干燥过夜后，向孔中加入闪烁体，并在Microbeta 1450 Trilux中以Paralux模式对板计数。不同的反应包含靶肽(176μM)、MBP(2μM)、或无底物。结果显示于图1。
正如在这些结果中看到的，尽管由放射自显影法得知his-catActR IIB可将MBP磷酸化，但是含MBP的反应出乎意料的产生阴性结果。正如在阴性对照(不含底物)中看到的，产生的唯一信号是his-catActR IIB蛋白质的自身磷酸化结果。然而，包含靶肽作为底物的反应运行得很好。
序列表<110>PFIZER PRODUCTS INC.
<120>ActRIIB激酶活性的测定法<130>PC11691A<140>60/360,607<141>2002-02-28<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工序列<400>1Val Tyr Asp Leu Ser Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro Leu Phe1 5 10 15Val Gln Arg Thr Val Ala Arg Thr Ile Val Leu20 25<210>2<211>346<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Asp Pro Gly Pro Pro Pro Pro Ser1 5 10 15Pro Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu Leu Glu Ile Lys Ala Arg20 25 30Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln Leu Met Asn Asp Phe Val35 40 45Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys Gln Ser Trp Gln Ser Glu50 55 60Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys His Glu Asn Leu Leu Gln65 70 75 80Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn Leu Glu Val Glu Leu Trp85 90 95Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser Leu Thr Asp Tyr Leu Lys100 105 110
Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys His Val Ala Glu Thr Met115 120 125Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp Val Pro Trp Cys Arg Gly130 135 140Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg Asp Phe Lys Ser Lys Asn145 150 155 160Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val Leu Ala Asp Phe Gly Leu165 170 175Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro Gly Asp Thr His Gly Gln180 185 190Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Gly Ala Ile195 200 205Asn Phe Gln Ar9 Asp Ala Phe Leu Arg Ile Asp Met Tyr Ala Met Gly210 215 220Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys Lys Ala Ala Asp Gly Pro225 230 235 240Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu Glu Ile Gly Gln His Pro245 250 255Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val His Lys Lys Met Arg Pro260 265 270Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro Gly Leu Ala Gln Leu Cys275 280 285Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp Ala Glu Ala Arg Leu Ser290 295 300Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu Ile Arg Arg Ser Val Asn305 310 315 320Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu Val Thr Ser Val Thr Asn325 330 335Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile340 34权利要求
1.用于测定ActRIIB的激酶活性的测定法，所述测定法包括如下步骤a)将ActRIIB、经标记的磷酸供体和靶肽在合适的介质中保温，以便所述ActRIIB可利用所述经标记磷酸供体将所述靶肽磷酸化，从而产生经标记的靶肽；并b)测量所述经标记的靶肽中存在的标记物的量。
2.权利要求1的测定法，其中所述靶肽具有SEQ ID NO1所示的序列。
3.权利要求1的测定法，其中所述ActRIIB是catActRIIB。
4.权利要求1的测定法，还包括如下步骤在所述测量步骤之前将所述经标记的靶肽与任何剩余的经标记磷酸供体分离开。
5.权利要求1的测定法，其中所述保温步骤还包括添加ActRIIB的潜在抑制剂。
6.用于发现ActRIIB激酶的调节物的测定法，所述测定法包括如下步骤a)在第一反应中将ActRIIB激酶、经标记的磷酸供体和靶肽在合适的介质中保温，以便所述ActRIIB激酶可利用所述经标记磷酸供体将所述靶肽磷酸化，从而产生经标记的靶肽，并在第二反应中将ActRIIB激酶、经标记的磷酸供体、靶肽和待测化合物一起保温；b)测量来自所述第一和第二反应的所述经标记靶肽中存在的标记物的量；和c)将所述第二反应中经标记的靶肽的量与所述第一反应中经标记的靶肽的量进行比较，其中经标记的靶肽的量的任何统计学显著性差异都指示所述待测化合物是ActRIIB激酶的调节物。
7.权利要求6的测定法，其中所述靶肽具有SEQ ID NO1所示的序列。
8.权利要求6的测定法，其中所述ActRIIB是catActRIIB。
9.权利要求6的测定法，还包括如下步骤在所述测量步骤之前将所述经标记的靶肽与所述第一和第二反应中的任何剩余的经标记磷酸供体分离开。
10.蛋白质catActRIIB激酶，其中所述蛋白质具有SEQ ID NO2所示的序列。
全文摘要
本发明涉及激酶测定法，更具体地涉及使用新靶肽测量ActR II B激酶蛋白的活性和/或活性调节的新激酶测定方法。
文档编号C07K14/72GK1643161SQ03806582
公开日2005年7月20日 申请日期2003年2月17日 优先权日2002年2月28日
发明者P·A·克拉斯尼, M·诺西亚, B·A·奥康纳, R·W·斯潘塞 申请人:辉瑞产品公司