专利名称：来自脂肪细胞的磷脂酰肌醇多糖(pig)结合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及源自于脂肪细胞质膜的蛋白质，所述蛋白质对磷脂酰肌醇多糖具有特异结合亲和性。
已肯定地确定了磷脂和磷脂酶在跨膜信号传导传导中的作用。同样充分地建立了通过共价键连接的糖基磷酯酰肌醇(GPI)锚定蛋白而使蛋白进入细胞膜的概念，并且对于几种GPI-锚定蛋白，例如源自于人红细胞的乙酰胆碱酯酶(AchE)、大鼠Thy-1、及几种寄生虫的外被蛋白如源自于布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的变体表面糖蛋白(VSG)，已得出GPI锚的精确化学结构。脂类锚定通过由二酰基甘油或烷酰基甘油型的磷脂组成的磷脂酰肌醇(PI)而发生。其中，由于后者出现于哺乳动物锚中，且不同于存在于膜中的大量PI，因而其可以提供由GPI产生第二信使时涉及的新分子种类。由GPI进行的信号传导是人们所特别关注的，因为这些脂类锚定分子不跨越膜，但是在大部分情况下，嵌合于脂双层的外层。对于在从激素到生长因子范围内的多种内分泌及旁分泌分子，已显示出它们由GPI的细胞膜产生的信号介导释放。至今，似乎已确定了GPI参与跨膜信号传导及其在胞内的效应，但关于导致观察到的代谢效应的信号传导途径知之甚少。
GPI锚定分子拥有信号传导特性这一概念，源自于早期实验，在实验中显示了胰岛素结合到其受体上从而刺激GPI水解。鉴定了模拟胰岛素对代谢酶产生某些作用的低分子量物质。所述物质具有肌醇多糖结构，且在质膜内引起胰岛素敏感的GPI水解。尽管最初认为作为肌醇多糖酶调节子的GPI前体在结构上类似于GPI膜蛋白锚，但是信号转导GPI和膜蛋白的GPI锚之间在糖部分有明显差异。GPI膜蛋白锚总是由连着磷酸乙醇胺的三甘露糖核心组成，其提供了与所结合蛋白C末端氨基酸的连接。
不仅胰岛素可调节GPI水解，也观察到许多其它激素调节GPI水解。
实际上在所有情况下，激素或生长因子刺激细胞都导致GPI锚定蛋白从细胞表面瞬时释放。这些激动剂的大部分受体是酪氨酸激酶受体或是与酪氨酸激酶偶联的受体。
已在分子水平上确定了涉及胰岛素作用的许多蛋白质。胰岛素受体是跨膜酪氨酸激酶，当其受胰岛素结合活化时，迅速进行自身磷酸化，同时使许多胞内底物磷酸化，在这些底物中，一个或多个是50-60kDa蛋白质，包括1 5kDa脂肪酸结合蛋白Shc和胰岛素受体的几种底物蛋白质IRS-1/2/3/4。酪氨酸磷酸化后，IRS多肽作为几种Src同源性2结构域的停靠蛋白，其包括衔接分子和酶，这些酶包括磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-K)、Grb2、SHP2、Nck和Fyn。通过酶的p85调节亚单位产生IRS蛋白和PI 3-K间的相互作用，进而导致p110亚单位的催化活性增强。对于许多胰岛素敏感的代谢过程，包括葡萄糖转运和糖原合成的刺激，PI 3-K是必不可少的。在IRS蛋白的酪氨酸磷酸化刺激的所有情况下，这些蛋白质同时停靠至PI3-K的p85亚单位，并且，除了胰岛素与血管紧张素信号传导系统间的通讯外，这种停靠与PI 3-K活性的刺激有关。
除了鉴定直接引导从胰岛素受体到下游目标的信号转导途径外，在通过胰岛素和其它激素/生长因子或不同的外源刺激物间进行的信号传导，已描绘了几种通讯，其中所述刺激物在多种细胞系统内，要么模拟(到某种程度)要么以正的或负的方式调节胰岛素代谢的和/或促有丝分裂作用。由于这些配基中无一直接活化胰岛素受体激酶，因而，它们的信号传导途径可能与胰岛素的信号传导途径在较远的信号传导阶段处汇合。这种特性由不同类型的磷脂酰肌醇多糖-肽(PIG-P)分子共有，例如对于从酵母Gce1p的糖基磷酯酰肌醇锚制备的PIG-P，其模拟胰岛素的代谢作用达到显著程度而不同时诱导胰岛素受体激酶活性。
在胰岛素反应性目标细胞中，磷脂酰肌醇多糖(PIG)和PIG-肽(PIG-P)对胰岛素信号转导级联的正向作用，涉及到糖基磷酯酰肌醇(GPI)-锚定的质膜蛋白(GPI蛋白)和双酰化的非受体酪氨酸激酶从去污剂抗性的富含糖脂的高胆固醇含量的质膜筏域(rafe domain)(hcDIGs)重新分配到较低胆固醇含量的筏域(lcDIGs)。
在分离的大鼠脂肪细胞中，PIG-P的主要目标定位于hcDIGs。放射性标记的PIG-P、Tyr-Cys-Asn-NH-(CH2)2-O-PO(OH)O-6Manα1-2)-2Manα1-6Manα1-4Glu N1-6Ino-1，2-(环)-磷酸(YCN-PIG)和放射性标记的用于衍生YCN-PIG的来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的经脂解GPI蛋白(lcGce1p)都以可饱和方式结合hcDIGs，但不结合lcDIGs、微粒体或全部质膜。YCN-PIG与lcGce1这两者的结合是特异的，因为过量的化学合成的未标记YCN-PIG或脂肪细胞用胰蛋白酶然后用NaCl或N-乙基马来酰亚胺(NEM)进行预处理完全破坏了其结合，这表明一种细胞表面受体识别YCN-PIG。在源自于用GPI特异的磷脂酶C预处理的脂肪细胞的hcDIGs内，PIG-P的结合显著增加，其中所述酶相当于通过脂解去除内源性配体例如GPI蛋白质/脂类。YCN-PIG结合亲和力是最高的，然后是Tyr-Cys-Asn-NH-(CH2)2-OH(YCN)和HO-PO(H)O-6Manα1(Manα1-2)-2-Manα1-6Manα1-4GluN1-6Ino-1，2-(环)-磷酸(PIG37)成分的组合，而肽变体YMN-PIG、PIG37和YCN单独表现出中亲和力和低亲和力。对于YCN-PIG与脂肪细胞的培养，依次用胰蛋白酶/NaCl处理从细胞表面释放出来的115kDa多肽使得通过[14C]NEM进行的后续标记减少。这些数据表明，在大鼠脂肪细胞中，作为GPI蛋白受体的hcDIGs的胰蛋白酶/NaCl/NEM敏感的115kDa蛋白识别模拟胰岛素的PIG(-P)。
几种类型的DIGs似乎存在于相同细胞内。由标志物和结构蛋白(小窝蛋白1-3)丰富表达引起的瓶形内陷，细胞膜穴样内陷代表末期分化细胞特异的DIGs。
占脂肪细胞质膜表面积20％的细胞膜穴样内陷参与受体介导的细胞摄液作用、细胞内吞作用、胞吞转运作用和信号转导。在分离的大鼠脂肪细胞中，可以辨别出表现高浮力密度(根据蔗糖密度梯度离心)的低胆固醇/小窝蛋白含量的lcDIGs和以低浮力密度为特征的高胆固醇/小窝蛋白含量的典型hcDIGs。GPI蛋白的主要级分，例如Gce1和Nuc，以及双酰化蛋白的主要级分，例如NRTK非受体酪氨酸激酶、pp59Lyn，都定位于hcDIGs。响应模拟胰岛素的刺激物例如合成的PIG或磺酰脲、格列美脲(glimepiride)，GPI蛋白和NRTKs都从hcDIGs转移位置到lcDIGs。这种重新分配不是由于缺失其脂类修饰引起的。
无(PIG)或有(PIG-P)相邻的源自于GPI蛋白多肽部分的羧基末端氨基酸的极性核心多糖首基，提供处于基础状态的GPI蛋白在hcDIGs和lcDIGs之间分配的分子基础，且它们的重新分配响应于胰岛素模拟物的刺激。
GPI蛋白是细胞表面抗原、胞外酶、受体或细胞粘附分子，其在从酵母菌到人的真核细胞内表达，并通过共价结合的糖基磷酯酰肌醇(GPI)脂类部分锚定于质膜外层。尽管缺少跨膜结构域，但在穿越质膜的信号转导中还是涉及到了它们。
GPI蛋白与特定脂类筏域的相关性，其中所述筏域即所谓的不溶于去污剂的富含糖脂的筏DIGs，而不与明显的跨膜结合/连接蛋白具相关性，这一发现表明，对于通过GPI蛋白介导的信号转导来说，可能脂类-脂类的相互作用为主要的偶联机制。
DIGs的基本结构元件是(糖)鞘脂类和胆固醇的边侧组装，其在膜脂双层内，呈现不同于相邻的液相无序(ld)区的液相有序(lo)组织。哺乳动物细胞的质膜包含胆固醇(30-50mol％)及偏爱ld结构域的脂类(如带有不饱和尾的卵磷脂)和偏爱lo结构域的具有饱和酰基链的脂类(如[糖]鞘脂类和GPI脂类)的混合物。人们认为，胆固醇通过在脂类分子间填充细胞间隙而在lo域内，对脂类的紧密包装有贡献，并且仅在胆固醇浓度的特定范围内才能看到lo域的构成。
胰岛素是非常重要的激素，其对生物体代谢起显著影响。通常，它促进合成代谢过程并抑制分解代谢过程。特别是它增强糖原、脂肪酸和蛋白质的合成速率，并抑制蛋白质和糖原的分解。激素的至关重要的作用是刺激来自于肝脏、肌肉和脂肪的细胞，以从血液内移除葡萄糖、一些其它糖和氨基酸。
牛胰岛素由两条多肽链组成，多肽A包含21个AA，且多肽B包含30个AA，它们通过两个-s-s(二硫桥)连接。这种相同结构模式出现在包括人的许多哺乳动物的胰岛素内。结构为被压缩的圆筒状，只有B链的羧基端从蛋白质的其它部分伸出。有许多疏水残基，其相互作用形成中央疏水核心，且在每一边上的内部散布的极性残基进一步使蛋白质稳定。三个二硫桥，即两个链间和一个链内二硫桥，将结构钳夹在一起。许多蛋白质(特别对于从细胞输出的蛋白质)生物合成的共同特性是蛋白质以前体形式产生，然后经修饰以产生在贮存期间与释放前的最终形式。胰岛素通过一群在所谓胰岛的胰腺内的细胞合成，以颗粒贮存，然后在需要的时候释放到血液中。
在胰岛素最初合成时，其由100个AA的单多肽链组成，该链由16个AA的信号序列、B链、33个AA的称作连接链的C链和A链组成。该结构叫前胰岛素原(PPI)。人们认为，在细胞内信号区负责引导PPI从合成位点到ER(内质网)，其收集并包裹胰岛素，以形成贮存颗粒。当定位于ER时，信号肽通过蛋白酶移除。
糖尿病是需要长期药物维护的慢性病，这种维护，既要限制其破坏性并发症的出现，又要在其真正出现时进行控制。糖尿病与急性和慢性并发症有关，如低血糖症、糖尿病酮酸中毒和高渗透非酮性综合征。
1型糖尿病通常在瘦弱的年轻患者中发生，并且其特点是由于β细胞自体免疫的损坏而导致分泌胰岛素的胰腺的功能明显不足。患1型糖尿病患者的辨别特征是若撤出胰岛素，就会出现酮病，并最终出现酮酸中毒。因此，这些患者依赖外来胰岛素以维持其生命。
2型糖尿病一般在40岁以上的人群发生，这些人有糖尿病家族史。2型糖尿病的特点是具有不同严重程度的胰岛素分泌缺陷的周缘胰岛素抗性(peripheral insulin resistance)。这些缺陷导致肝糖原异生增强，其产生禁食高血糖。患有2型糖尿病的大部分患者(90％)肥胖，且肥胖本身与胰岛素抗性有关，其进一步恶化糖尿病的状态。
多种其它型糖尿病，以前称为“继发性糖尿病”，由其它疾病或药物引起。根据所涉及的原发过程(即胰腺β细胞的破坏或周缘胰岛素抗性的产生)，这些型糖尿病同样地表现为1型或2型糖尿病。最常见的是破坏胰腺β细胞的胰腺疾病(例如血色病、胰腺炎、囊性纤维化、胰腺癌)、干扰胰岛素分泌的激素综合征(例如嗜铬细胞瘤)或导致周缘胰岛素抗性的疾病(例如肢端肥大症、库兴氏综合征、嗜铬细胞瘤)，以及药物(例如二苯基乙内酰脲钠、糖皮质激素、雌激素)诱导的糖尿病。
糖尿病的特点是血清葡萄糖水平的不适当调节。在1型糖尿病中，对内分泌胰腺的自体免疫攻击导致胰岛素分泌的β细胞受到进行性且不可逆损伤。胰岛素缺乏影响胰岛素敏感的目标细胞进行葡萄糖摄入与新陈代谢作用。2型糖尿病有几种病因，大部分通常在细胞对胰岛素作用抗性中得到反映，在血清葡萄糖水平调节方面也具有随后的转变。胰岛素通过二硫键链接的异四聚体细胞表面受体起作用，该受体包含经二硫键与跨膜细胞内β亚单位相偶联的细胞外α亚单位。在1型糖尿病中，与正常细胞受体在结构与功能上相结合的配基的缺失通常是随后的代谢缺陷的起因。以日常胰岛素注射形式的激素替代疗法提供用于受体作用的配基，尽管在正常生理情况下这不是必要的。在2型糖尿病中，对胰岛素作用的抗性常常成为一些由于受体作用的缺陷而导致抗性的疾病的基础。
已知在胰岛素抗性的情况下，胰岛素受体需要大量胰岛素以使胰岛素信号传导级联开始。本发明涉及能通过避开诱发信号传导途径的胰岛素受体而刺激葡萄糖摄入的脂肪细胞的细胞膜蛋白。对于手头没有用来识别能担当胰岛素替代物的化合物筛选工具的问题，本发明提供了强有力的解决办法。
因而，本发明涉及源自于脂肪细胞质膜的蛋白，其可由质膜和/或脂囊泡和/或具有高胆固醇和/或脂囊泡的筏域的同时存在而稳定，并且其对磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽具有特异的结合亲和性，其特征在于a]在磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽特异结合该蛋白质后，能引发脂肪细胞内胰岛素受体底物1或2的tyr磷酸化，以及b]在磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽特异结合该蛋白质后，能刺激脂肪细胞内葡萄糖的摄入。
相对于其它蛋白和/或稳定化成分和/或其它化合物(例如盐、离子、puffer)，该蛋白质量的湿重范围在0.01％到10％之间。
该蛋白质量的优选湿重范围为0.1％至5％，且最优选湿重范围为0.1％至1％。
在天然条件下，在质膜中，所述蛋白质的湿重低于10-6％。
在本发明的优选方案中，磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽至少由以下一种化合物组成YCN-PIG，YMN-PIG，PIG37，YCN或lcGce1。
磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽结合蛋白质优选地发生在结合常数(KD)为0.001至10μM时。
结合常数是用于定量描述蛋白质和磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽复合体解离以及不解离状态之间平衡的热力学常量。
结合常数等于前进反应与后退反应速率常数之比。结合常数的高值(例如大于10mM)定义为弱的非特异结合，而低值(例如不高于100μM)定义为强的特异结合。
结合常数可通过不同方法测定，例如通过平衡透析、分光光度法、绘图法(斯卡查德图(Scatchard-Plot))。
所涉及的脂肪细胞质膜优选地来自于大鼠、小鼠或人。
蛋白质分子量介于100至120kDa之间，优选地介于110至120kDa之间，且最优选的是115kDa。必须提及一下，通过任一方法，特别是通过SDS-PAGE测定蛋白质分子量时，其误差在±5至10％之间。
本发明进一步涉及本发明如前所述蛋白与YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1中至少一种化合物形成的复合体。
复合体形成的先决条件是配基特异地结合蛋白质。在配基与蛋白质间形成离子键或共价键而使复合体稳定。
本发明也涉及了本发明蛋白质的产生，其中a]脂肪细胞可由大鼠、小鼠或人组织提供，b]分离来自a]的脂肪细胞的质膜，
c]从来自于b]的质膜制备具有高胆固醇的筏域(hcDIGs)，d]用胰蛋白酶/NaCl溶液处理来自于c]的hcDIGs，e]离心来自于d]的培养混合物，并通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离上清液中的蛋白，f]将100至120kDa大小的蛋白质级分从凝胶洗脱，且用含有去污剂或生物膜的溶液或悬液可能使之溶解。
此外，本发明涉及鉴定特异结合本发明蛋白质的化合物的方法，其中a]提供细胞的级分，其含有本发明的蛋白质，b]提供化合物，c]将来自于a]的细胞的级分与b]的化合物接触，d]测定化合物与来自于a]的细胞的级分的结合，e]通过将d]的结果与下面实验结果的对比推出结合的特异性在该实验中，将同样来自于b]的化合物与这样的细胞级分进行接触，其中所述细胞具有与来自于a]的细胞相同的物种和/或组织特异性但所述细胞级分不含有本发明的蛋白质，一旦来自于b]的化合物与含有本发明蛋白质的细胞级分之间结合的量高于来自于b]的化合物与不含有本发明蛋白质的细胞级分之间结合的量，就显示出较高的结合特异性。
细胞级分优选地采于脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞或肝细胞。这些细胞中的任意一种可以优选地源自于小鼠、大鼠或人。细胞级分优选地由细胞的细胞膜组成，或更优选地由高胆固醇含量的筏域(hcDIGs)组成。可应用于以下方法的化合物可通过放射性核素(例如14C、3H、32P、121J及其它)或荧光标记物进行标记，其中所述方法是可用于鉴定与本发明蛋白质具有特异结合的化合物的方法。
本发明进一步涉及用于鉴定与本发明的蛋白质具有特异结合的化合物的方法，其中a]提供包含本发明蛋白质的葡萄糖转运细胞，b]提供化合物，c]将源自于a]的细胞与b]的化合物接触，
d]检测化合物与葡萄糖转运细胞间的结合，e]通过将d]的结果与下面实验结果的对比推出结合的特异性在该实验中，将同样来自于b]的化合物与这样的葡萄糖转运细胞进行接触，其为具有与来自于a]的细胞相同的物种和/或组织特异性但不含有本发明蛋白质的葡萄糖转运细胞，一旦结合含有本发明蛋白质的葡萄糖转运细胞的化合物的量高于结合不含本发明蛋白质的细胞的化合物的量，则表明较高的结合特异性。
通过用胰蛋白酶/NaCl溶液和/或糖苷酶处理包含本发明蛋白质的细胞，就可从含有本发明蛋白质的葡萄糖转运细胞产生不含本发明蛋白质的葡萄糖转运细胞。
优选的葡萄糖转运细胞是脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞或肝细胞。这些细胞优选地来自于人、小鼠或人源的组织或细胞培养物。
所用的化合物优选地用放射核素或荧光标记物进行标记。
此外，本发明涉及用于鉴定对于本发明的蛋白质是激动剂或拮抗剂的化合物的方法，其中a]提供葡萄糖转运细胞，其中存在本发明的蛋白质，b]提供本发明蛋白质的天然配基，c]提供化学化合物，d]将a]的葡萄糖转运细胞与来自b]的配基及来自c]的化学化合物进行接触，e]检测来自于d]的葡萄糖转运细胞的葡萄糖摄入，f]检测来自于d]的葡萄糖转运细胞的葡萄糖摄入，其中葡萄糖摄入刺激是指源自于c]的化合物具有激动剂活性，且葡萄糖摄入抑制是指源自于c]的化合物具有拮抗剂活性。
前述用于鉴定本发明蛋白质的激动剂或拮抗剂的方法中的优选配基是YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1。用于鉴定本发明蛋白质的激动剂或拮抗剂的方法中的优选葡萄糖转运细胞是优选地来自于人、小鼠或大鼠的脂肪细胞、骨骼肌细胞、心脏细胞或肝细胞。
本发明也涉及包含所述化合物以及辅助成分的药物，所述化合物已通过鉴定为结合本发明的蛋白质或是本发明蛋白质的激动剂或拮抗剂，所述辅助成分用于药物制剂。在优选实施方案中，药物包含至少以下一种化合物 YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1。药物也可包含至少一种以下化合物的部分或衍生物，所述化合物为YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1。
此外，本发明涉及所述化合物的用途，用于产生治疗胰岛素抗性或糖尿病的药物，所述化合物已鉴定出是可结合本发明的蛋白质或是本发明蛋白质的激动剂或拮抗剂。
这类化合物优选地是YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN、lcGce1或这些化合物之一的一部分或衍生物。
实施例PIG(-P)的化学合成YCN-PIG的合成(对于常规方案，见
图1、2、3)对于产物2的合成(图4；i、ii)，源自于Bachem(德国海德尔堡)的产物1(8.0g，20.6mmol)溶于200ml吡啶，然后加入5g(81.8mmol)乙醇胺和5ml N-乙基吗啉。静置(16小时，室温)后，在5℃下逐滴添加50ml乙酸酐，并搅拌。搅拌反应混合物(2小时，室温)，然后在高真空下浓缩。残余物溶于150ml的热甲醇，然后浓缩溶液。添加100ml二氯甲烷/甲醇(15/1)和200ml正庚烷/乙酸乙酯(2/1)后，产物结晶。产物2的产量6.1g(84％)白色晶体，熔点175℃。TLC(薄层色谱法)二氯甲烷/甲醇(9/1)，Rf＝0.7。MS(M+Li)+＝358.2，计算得出C16H21N3O6，M＝351.36。
对于产物3的合成(图4；iii)，将2.0g钯碳(10％Pd)加入到产物2(12.0g，34.0mmol)的200ml甲醇/乙酸(1/1)溶液中，之后氢化混合物(2小时，室温)。在硅胶上过滤并浓缩溶液，并通过快速色谱法(二氯甲烷/甲醇/浓缩氨30/5/1)纯化残余物。产物3的产量7.3g(98％)浅黄色油。TLC二氯甲烷/甲醇/浓缩氨(30/5/1)，Rf＝0.5。MS(M+Li)+＝224.2，计算得出C8H15N3O4，M＝217.23。
对于产物4的合成(图4；iv)，在0℃搅拌条件下，将1.5g(4.5mmol)的1(O-(氰基(乙氧基羰基)-亚甲基)氨基-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(TOTU)、0.64g(4.5mmol)乙基-(肟基)-氰基乙酸酯(肟)及1.7ml(13.5mmol)N-乙基吗啉加入到0.8g(3.7mmol)3和2.8g(4.5mmol)TrtCys(Trt)OH在二甲基甲酰胺中的溶液，然后搅拌混合物(0℃，2小时)。加入200ml乙酸乙酯后，用饱和NaHCO3溶液洗混合物3次，经MgSO4干燥浓缩。残余物用正庚烷/乙酸乙酯(6/1)研成粉，然后产物结晶。产物4的产量2.2g(74％)白色晶体，熔点185℃。TLC二氯甲烷/甲醇(15/1)，Rf＝0.4。MS(M+Li)+＝811.7，计算得出C49H48N4O5S，M＝805.0。
对于产物6的合成(图4；v，vi)，将4.0g(5.0mmol)产物4溶于200ml二氯甲烷。添加4ml水和3ml三氟乙酸。15分钟后，用饱和NaHCO3溶液洗混合物3次，经MgSO4干燥浓缩，产生99％的粗产物5。将该粗产物溶于50ml甲醇，然后逐滴添加0.5ml的1M的甲醇钠溶液。15分钟后，添加50ml二氯甲烷，然后在硅胶上过滤混合物。溶液浓缩后，用快速色谱法(二氯甲烷/甲醇(9/1))纯化残余物。产物6的产量2.2g(85％)的白色无定形固体。TLC二氯甲烷/甲醇(5/1)，Rf＝0.7。MS(M+Li)+＝527.3，计算得出C28H32N4O4S，M＝520.6。
对于产物7的合成(图4；vii)，2.7g(5.2mmol)产物6、4.2g(10.4mmol)的Ztyr(Bn)OH、3.4g(10.4mmol)的TOTU、1.5g(10.4mmol)的肟和2ml的N-乙基吗啉在50ml二甲基甲酰胺中反应，类似于产物4的制备。产物7的产量4.2g(89％)的白色晶体。TLC二氯甲烷/甲醇(15/1)，Rf＝0.25。MS(M+Li)+＝914.8，计算得出C25H53N5O8S，M＝908.1。
对于产物8的合成(图5；viii)，用吡啶浓缩6.0g(73mmol)的亚磷酸4次，然后在180ml无水吡啶中进行处理。在10℃逐滴滴加13ml新戊酰氯。使该反应溶液静置(45分钟，室温)。如前所述，将16.4g(18.1mmol)的产物7加入到反应液中。5小时后，用200ml甲苯和150ml二氯甲烷/甲醇/33％NH3(30/10/3)稀释。浓缩后，残余吡啶用200ml甲苯再蒸馏3次。残余物悬浮于200ml二氯甲烷/甲醇(20/1)中。过滤不溶成份，并用50ml二氯甲烷/甲醇(20/1)洗2次。浓缩滤液，并用快速色谱法纯化。产物8的产量11.6g(66％)白色晶体。TLC二氯甲烷/甲醇/33％NH3(30/5/1)，Rf＝0.25。MS(M+Li)+＝978.4，计算得出C52H54N5O10SP，M＝972.08。
对于产物10的合成(图6；ix，x)，将4.5g产物8(4.6mmol)和6.0g产物9(2.3mmol；按以前文献47中所述进行合成)溶于80ml无水吡啶中。室温，30分钟后，冷却反应混合物至0℃，并加入5ml水和1.3g碘。搅拌反应混合物(30分钟，10℃)，然后用500ml二氯甲烷、150ml饱和NaCl溶液和30ml饱和硫代硫酸盐溶液稀释，搅拌5分钟。有机相用MgSO4干燥浓缩。通过用二氯甲烷/甲醇/浓NH3(30/5/1至30/10/3)的快速色谱法纯化残余物。产物10的产量8.0g无定形固体。TLC二氯甲烷/甲醇(20/1)，Rf＝0.5。MS(M+Li)+＝3583.6，计算得出C207H214N8O42SP2，M＝3580.0。
对于产物11的合成(图6；xi)，在-78℃下浓缩300ml氨水。将2.1g(91mmol)钠溶于其中。该溶液用150ml无水四氢呋喃稀释，然后将溶于50ml无水四氢呋喃中的最终保护形式的8.0g产物10(2.2mmol)在反应温度-78℃下缓慢地逐滴滴加。反应15分钟后(蓝色不能消失)，小心地用5g氯化铵处理混合物。当蓝色消失时，用50ml水和150ml甲醇小心地稀释混合物。可以将其解冻，然后浓缩到约100ml。用500ml二氯甲烷/甲醇/33％NH3(3/3/1)稀释所述溶液，然后添加到快速硅胶柱中(500ml硅胶)。用1升二氯甲烷/甲醇/33％NH3(3/3/2)和1升二氯甲烷/甲醇/33％NH3(3/3.5/3)依次洗脱。洗脱物用正丁醇/乙醇/水/33％NH3(2/2/2/1)层析。产物11的产量2.4g(67％来自产物9)白色固体。TLC正丁醇/乙醇/水33％NH3(2/2/2/1)，Rf＝0.5。MS(M+NH3)+＝1572.6；计算得出C54H88N6O40P2S，M＝1555.31。对于环磷酸脂，31P-NMR(D2O)＝15.3ppm，且对于磷酸二酯，31P-NMR(D2O)＝0.3ppm。表1列出了来自1H-NMR和13C-NMR的数据。
对于产物YCN的合成(图7；xii)，与制备产物11相类似地对11.0g(11.3mmol)产物7去保护。YCN的产量4.5g(90％)白色晶体。TLC二氯甲烷/甲醇/浓缩氨(30/15/5)，Rf＝0.25。MS(M+Li)+＝448.3，计算得出C18H27N5O6S，M＝441.51。
对于产物YMN-PIG的合成，用图2显示的相同反应顺序合成YMN-PIG。用BocMetOH替代TrtCys(Trt)OH产生相似产量的YMN-PIG，为白色固体。TLC正丁醇/乙醇/水/33％NH3(2/2/2/1)，Rf＝0.5。MS(M+NH3)+＝1600.6；计算得出C56H92N6O40P2S，M＝1583.38。对于环磷酸脂，31P-NMR(D2O)＝15.3ppm，且对于磷酸二酯，31P-NMR(D2O)＝0.3ppm。
制备放射性标记的脂解切割的Gce1p(lcGce1p)从乳酸生长酵母细胞中纯化带有完整GPI锚的Gce1p，所述细胞已用[14C]肌醇进行代谢标记，且该标记细胞已通过酶促转变为原生质球。制备质膜、通过菲可(Ficoll)梯度离心进行纯化、用0.35％的β-酰胺基牛磺胆酸溶解并用TX-114进行分配。在富含去污剂相中包含的Gce1p通过交联葡聚糖凝胶S-300的凝胶过滤色谱法、N6-(2-氨乙基)-cAMP琼脂糖的亲和色谱法和苯基琼脂糖色谱法纯化。对通过色谱柱的洗脱液，在线监测3H的放射活性。沉淀部分纯化的Gce1p(12％聚乙二醇6000)，然后以0.2mg蛋白质/ml重悬于缓冲液G(25mM Tris/乙酸，pH7.4、144mM NaCl、0.1％β-酰胺基牛磺胆酸、0.5mM DTT、0.2mM EDTA、5％甘油、0.1mM PMSF、5μM亮抑酶肽、1mM碘乙酰胺、10μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂)中，接着在6U/ml PI特异的PLC(蜡状芽孢杆菌(B.cereus))存在下培养(3小时，25℃)。添加10倍体积冰冷的2％TritonX-114、10mM Tris/HCI(pH7.4)、144mM NaCl的溶液并进行相分离(37℃下培养2分钟，然后在25℃、12,000×g下离心1分钟)之后，从上层不含去污剂的相中回收lcGce1p。通过添加等体积的10mM Tris/HCl、144mM NaCl，对下层富含去污剂的相进行两次再抽提，接着在冰上再次溶解，然后进行相分离，最后沉淀经合并且不含去污剂的相(12％聚乙二醇6000)。
放射性标记的lcGce1p悬于缺乏β-酰胺基牛磺胆酸(200-1000dpm/μl)的缓冲液中。
放射性标记的YCN-PIG的制备用V8蛋白酶(金黄色葡萄球菌(S.aureus))和PI-PLC(蜡状芽孢杆菌)依次消化，从Gce1p获得放射性标记的YCN-PIG。用TX-114抽提分层后，从不含去污剂相中回收YCN-PIG，然后进行依次纯化，步骤为通过阳离子交换层析(Dowex 50W-X8)、BioGel-P4上凝胶过滤、SAX HPLC柱上阴离子交换层析、Si-60 HPTLC板上使用不同溶剂体系进行二次薄层层析，最后在BioGel-P4上进行凝胶过滤。在每步层析分离期间，原料洗脱液都通过3H放射活性、UV吸收(A220)及根据在分离的大鼠脂肪细胞内对葡萄糖转运的刺激进行模拟胰岛素活性的检测。对于放射化学纯度的检测，最终制备的YCN-PIG在pH13经过Dionex CarboPac PA-1阴离子交换HPLC(单位Dionex)，所述柱以包括葡萄糖低聚物的标准校正。用脉冲安培检测仪检测内部标准混合物。14C标记的级分通过RaytestRamona进行在线放射活性监测。对于浓度的确定，其为水解YCN-PIG(6MHCl，16小时，110℃)，然后测定无机磷酸(2mol/分子)和酪氨酸(1mol/分子)的量。干燥过的YCN-PIG在使用之前于-80℃贮存，使用时，将其悬于包含2mM DTT的水中，终浓度为100μM。
大鼠脂肪细胞的制备及与PIG(-P)/YCN的孵育从雄性Sprague Dawley大鼠(140-160g，随意喂食)的附睾脂垫中用胶原酶消化分离脂肪细胞，分离后在含有1％(w/v)BSA、100μg/ml庆大霉素、100mM 1-甲基-2-苯乙基腺苷、0.5U/ml腺苷脱氨酶、0.5mM丙酮酸钠和5mM D-葡萄糖的KRH缓冲液(0.14mM NaCl、4.7mM KCI、2.5mMCaCl2、1.2mM MgSO4、1.2mM KH2PO4、20mM N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸钠盐(Hepes)/KOH，pH 7.4)中培养，培养条件为存在PIG(-P)/YCN(溶于20mM Hepes/KOH，pH7.4，2mM DTT)，37℃，摇动水浴，并在指定期间，连续通入5％CO2/95％O2。
用胰蛋白酶/NaCl或NEM处理大鼠脂肪细胞对于胰蛋白酶/NaCl处理，在100μg/ml胰蛋白酶存在下，培养在含有5mM葡萄糖的KRH中的2ml脂肪细胞悬液(3.5×106细胞/ml)(20分钟，30℃)。添加大豆胰蛋白酶抑制剂(终浓度100μg/ml)和2ml含有1M NaCl和0.5％BSA的KRH，并继续培养(10分钟，22℃)。对于NEM处理，用NEM(终浓度1.5mM)培养在含有5mM葡萄糖的KRH中的1ml脂肪细胞悬液(3.5×106细胞/ml)(30分钟，25℃)，然后用DTT(终浓度15mM，5分钟)培养。处理后，离心细胞(1500×g，5分钟，外开式转子)，通过抽吸移除下层。用10ml含有0.5％BSA的KRH补充至剩余的细胞悬液(约0.5ml)，然后再次离心(500×g，1分钟，外开式转子)。再洗涤两次后，将终细胞悬液移到25ml含有0.5％BSA、50μM葡萄糖和1mM丙酮酸钠的KRH中。对于lipigenesis，分析0.2ml部分以监测对PIG41反应性的丧失。对照细胞经历与处理细胞相同的离心和洗涤过程，仅仅是用水替代了胰蛋白酶/NaCl。对于使用[14C]NEM放射性标记的脂肪细胞，细胞悬液经离心(500×g，1分钟)，然后移出下层。在总体积为60μl时，用2.5μCi[14C]NEM培养50-μl部分(7×106细胞/ml)(10分钟，30℃)。添加5μl 10mM DTT和55μl含有10mM葡萄糖的KRH之后，如前所述，在总体积为200μl时进行胰蛋白酶/NaCl处理。在0.4-ml离心管内将50-μl部分小心地置于200-μl由邻苯二甲酸二壬酯组成的油层上层。离心(5,000×g，15秒)之后，在离心管中穿过油层。使在离心管下部含有的培养基中的蛋白沉淀(10％TCA，两次丙酮洗涤)，将沉淀物悬浮于Laemmli样本缓冲液，然后通过SDS-PAGE分析。
质膜、全细胞裂解物和微粒体的制备如前所述，从分离的大鼠脂肪细胞制备后核下层。对于质膜的制备，将1ml样品置于38％(w/v)蔗糖、25mM Tris/HCI(pH7.4)、1mM EDTA的5ml垫层上进行分层，然后离心(110,000×g，1小时)。在两层间分界面处的膜(0.5ml)用吸管吸出，用4体积均质化黄油稀释，然后使其在28％珀可、0.25M蔗糖、1mM EDTA、25mM Tris/HCI(pH7.0)的8ml垫层的上部。离心(45,000×g，30分钟)之后，质膜用巴氏滴管从下面第三个梯度处移出(0.5ml)，用10体积均质化缓冲液稀释，然后离心(200,000×g，90分钟)。对于结合研究，洗涤过的沉淀以浓度为1-2mg蛋白/ml悬浮于结合缓冲液中。对于全细胞裂解物的制备将脱氧胆酸和NP-40(终浓度分别为0.3％和0.2％)补充到后核下层中，培养(1小时，4℃)，最后离心(100,000×g，1小时，4℃)。上清液用于免疫沉淀反应。对于微粒体的制备，离心(100,000×g，1小时，4℃)后核上层。沉淀以1-2mg蛋白/ml的浓度悬于结合缓冲液中。
hcDIGs/lcDIGs的制备纯化的经沉淀质膜(0.5-1mg)悬浮于1.5ml冰冷的含有50mM NaF、5mM焦磷酸钠、10μM冈田酸(Okadaic acid)、1mM原钒酸钠、20μM亮抑酶肽、5μM抑肽素、1μM抑肽酶、5mM碘醋酸盐、200μMPMSF、1mMEDTA的0.5M Na2CO3(pH11)中，并进行培养(1小时，4℃，在用吸液管反复搅拌抽吸条件下)。然后用等体积的85％蔗糖在15mMMES/KOH(pH6.5)、75mM NaCl中的溶液与悬液混合，接着，依次用在相同介质中的42.5、35、28、22、15、5％蔗糖覆盖，之后进行离心(230,000×g，Beckman SW41转子，18小时)。使用19-号针和注射器收集在15-22％(级分4和5)和28-35％(级分8和9)蔗糖界面的絮状物质以及42.5％垫层的物质(级分12-15)，为散射光的乳白色带(0.75ml/级分)，其分别为hcDIGs、lcDIGs和溶解的质膜蛋白质。用测量级分的折射率方法测定浓度。hc/lcDIGs的特点是富含/匮乏如前所述的相应标记物。对于结合研究，将hc/lcDIGs悬浮于结合缓冲液(15mM Mes/KOH，pH6.5、0.25M蔗糖、75mMNaCl、2mM MgCl2、0.5mM EDTA、0.5mM DTT、蛋白酶抑制剂)中。
放射性标记的YCN-PIG或lcGce1p与亚细胞级分的结合将10μl放射性标记的YCN-PIG或lcGce1p(60,000-80,000dpm/nmol，终浓度5μM)加入到40μl存在或不存在未标记竞争物的(如图的说明所示)悬浮质膜、微粒体或hc/lcDIGs(40-80μg蛋白)在结合缓冲液中的溶液，终体积为100μl，然后培养(30分钟，4℃)。对于来自于培养介质的膜的分离，在质膜/微粒体的情况下，45μl试样小心置于0.4ml预冷(4℃)离心管(microtubes no.72.700，Sarstedt，Germany)内的200μl由邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二辛酯组成(1/1体积比，终浓度1.012)的油层上小心地分层，或在hc/lcDIGs的情况下，油层由邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二壬酯组成(1/9体积比，终密度9.863)。离心(48,000×g，2分钟)后，盖帽的离心管通过油层刺穿，离心管(开帽)上部和下部分别包含经沉淀质膜/微粒体和飘浮的hc/lcDIGs，它们渗透或没有渗透到油层，然后转移入含有1ml 10％SDS的10ml闪烁小瓶。经过剧烈摇动(16小时，25℃)之后，在9ml ACSII闪烁剂(Beckman)中计数放射活性。在这些条件下，粘在离心管壁上及分配在油层中的放射性标记的YCN-PIG和lcGce1p占50-120dpm(即小于每次培养所用的总放射活性的0.5％放射活性)，且因此没被计入到结合数据中。根据蛋白质测定，质膜和微粒体的一般回收量分别为78-85％和65-80％，且hcDIGs和lcDIGs的分别为83-92％和70-78％。
PIG(-P)的化学合成通过下面两个实验方法可以从天然物质中产生亲水GPI结构(i)通过GPI特异的PLC/D从游离GPI脂类释放出PIG，因为其为极性核心聚糖首基而没有任何氨基酸，和(ii)通过结合分解脂肪的和分解蛋白质的切割从GPI蛋白产生PIG-P，其具有极性核心聚糖首基和源自于残留GPI蛋白羧基端的一个至数个氨基酸。GPI脂类和GPI蛋白质都存在于真核细胞质膜的外层，其具有在从酵母菌到人类中都存在的保守核心聚糖首基。对于分析GPI核心聚糖首基的结合，用到了如“Müller等，内分泌学138，3459-3475，1997”里描述的合成放射性标记的可信PIG(-P)的结构；从源自于酿酒酵母质膜的放射化学纯GPI蛋白质Gce1p制备YCN-PIG，在体外通过依次使用分解蛋白质的和分解脂肪的切割制备，其中所述菌已经以[14C]肌醇进行了代谢标记。对于评定结合的结构活性关系，用到了化学合成的YCN-PIG及其衍生物。(图1YCN-PIG；图2YMN-PIG；图3PIG37；图4YCN)根据本领域内肽合成的描述合成YCN-PIG的三肽。使用如“Frick等，生物化学37，13421-13436；1998”中描述的三氯乙酰亚胺法合成多聚己糖。合成PIG-P的关键步骤是磷酸二酯键的形成。在试验的多种方法中，H-膦酸法产量最多。
在钠存在于液氨的条件下，通过半胱氨酸(没有与钯水合的可能)和酸不稳定的环磷酸脂使最终化合物去保护。全部化合物通过质谱、1H-NMR、13C-NMR和31P-NMR法表征。
PIG(-P)特异地结合hcDIGs用差速离心从未受刺激脂肪细胞制备的全部质膜(与全细胞裂解物相对比)富集质膜的特异标志酶。富集毒毛花甙G(Quabain)敏感的对硝基苯磷酸酶(对应于Na+/K+-ATP酶的催化亚单位)9.5倍和Nuc 10.9倍(根据酶活性)，β1-整合蛋白13.9倍和突触融合蛋白-116.4倍(根据免疫印迹)，以及Gce1 7.8倍(根据光亲和标记)。同时，从质膜制备物去除(与全细胞裂解物相对比)肌质网标志(EGTA敏感的Ca2+-腺苷三磷酸酶5.7倍)和内体标志(SCAMP(分泌的载体膜蛋白)37/39 8.5倍，和GLUT4(葡萄糖转运蛋白4)16.9倍(根据免疫印迹)。与全细胞裂解物相对比，对未受刺激脂肪细胞的微粒体富集GLUT4 14.4倍、SCAMP 37/39 8.5倍、转铁蛋白受体为6.9倍和IGFII受体为9.7倍，且与全细胞裂解物相对比，根据免疫印迹，去除对硝基苯磷酸酶为24.6倍、Gce1为12.5倍、Nuc为15.8倍、β1-整合蛋白为39.5倍和突触融合蛋白-1为48.5倍以及Ca2+-敏感的腺苷三磷酸酶活性为19.9倍。这表明，该级分主要是内质网和内体结构，且实质上缺乏质膜和肌质网碎片。基于hcDIGs和lcDIGs在0.5M Na2CO3(pH 11)中的不溶性和在蔗糖密度梯度离心中的低浮力密度，从未受刺激脂肪细胞制备hcDIGs和lcDIGs。它们的特点是丧失了(与全质膜对比)GLUT4和胰岛素受体β亚单位。hcDIGs不同于lcDIGs，在hcDIGs中比在lcDIGs中有显著高含量的小窝蛋白、pp59Lyn和Gce1。分离的亚细胞膜级分与数量渐增的放射性标记的YCN-PIG进行培养，然后用离心机通过适当密度的油层从培养介质中快速分离，从而使培养停止。
以浓度依赖的和可饱和的方式回收主要含有hcDIGs且含有少量lcDIGs的膜相关YCN-PIG，但是质膜和微粒体本质上不含放射性标记(图5)。在线性范围内，当存在超出500倍的未经标记的合成YCN-PIG或其它竞争物(图5)进行评测时，对hcDIGs非特异结合的YCN-PIG小于20％。用YCN-PIG浓缩物进行以下实验，这些实验与结合的线性范围的结果一致。
用于检测受体-配基间相互作用的其它方法，例如快速过滤与基于沉降而非密度的离心，未能检测到YCN-PIG特异结合任一脂肪细胞膜亚级分(未列出数据)，可能原因是介质结合亲和性和/或高解离速率。斯卡查德图用于分析YCN-PIG，得出Kd范围为50nM-500nM和Bmax为50-200pmol/mg hcDIGs蛋白。以下述现象证明YCN-PIG结合hcDIGs的特异性肽变体即缺失肽乙醇胺部分的YMN-PIG和PIG37的功效显著降低，以及在竞争试验中(图6)肽乙醇胺部分YCN单独具有非常低的活性。
未标记的YCN与PIG37(等摩尔比率)的组合取代了放射性标记的YCN-PIG与hcDIGs的结合，其在功效上仅轻微地小于未标记的YCN-PIG，但却比单独的PIG或肽乙醇胺部分及YMN-PIG高。该发现说明了PIG和肽乙醇胺部分同时的且增效的识别。与共价连接的YCN-PIG(图6)相比，竞争性IC50仅仅比YCN+PIG37高3至4倍。还进一步研究了对于PIG(-P)所鉴定的结合位点是否是蛋白质属性的位点。hcDIGs用胰蛋白酶/NaCl或NEM进行预处理，然后在有或无过量的未标记的合成YCN-PIG条件下(用于非特异结合的评定)，用浓度渐增的放射性标记的YCN-PIG进行培养。依次用胰蛋白酶和0.5M NaCl处理或用NEM处理，完全消除了放射性标记的YCN-PIG与hcDIGs的特异结合，但是仅单独使用胰蛋白酶或NaCl或在DTT存在下使用NEM时，则没有显著效果(图7)。同一失活模式也在YCN-PIG与lcDIGs间的低亲和作用中观察到。这些数据显示对于在脂肪细胞细胞表面的DIGs处的结合，对PIG(-P)存在胰蛋白酶/NaCl和NEM敏感的结合蛋白。对比lcDIGs，YCN-PIG优先结合到hcDIGs上，这一优先性通过在脂肪细胞质膜使用m-βCD使hcDIGs脱除胆固醇这一过程中的转化，以及通过hc/lcDIGs对于放射性标记的YCN-PIG的特异结合的后续分析得到证实。在对照脂肪细胞内，回收了带有hcDIGs的大部分YCN-PIG，而剩余20％与lcDIGs结合(图8)。然而，用m-βCD(1-10mM)处理的完整大鼠脂肪细胞显示出，随着lcDIGs相应的增加，YCN-PIG结合hcDIGs的量呈现浓度依赖性下降。脂肪细胞在胆固醇脱除之后但在制备DIGs之前，用胰蛋白酶/NaCl或NEM处理，该处理显著地削弱了YCN-PIG与hcDIGs和lcDIGs的特异结合(未列示数据)。这些发现证实了PIG(-P)受体主要定位在大鼠脂肪细胞的hcDIGs，其形成主要依赖胆固醇。
脂解切割的GPI蛋白质特异地结合hcDIGsYCN-PIG，YMN-PIG和PIG37(图1、2和3)的PIG部分，即-NH-(CH2)2-O-PO(OH)O-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1-6Manα1-4GluN1-6Ino-1，2-(环)-磷酸，与所有真核GPI蛋白的极性核心聚糖首基相同。因此，对于PIG-P研究了其蛋白质结合位点是否与lcGPI蛋白相互作用，即如果将其与GPI蛋白完整的多肽部分接触，其是否识别PIG(-P)部分。为获得放射性标记的lcGPI蛋白，源自于代谢标记的酿酒酵母细胞的Gce1p用PI-特异的PLC(蜡状芽孢杆菌)处理，并将亲水裂解产物纯化成放射化学均匀性。正如PIG(-P)，使用相同的油离心法，发现lcGce1p以浓度依赖的和可饱和的方式与分离的大鼠脂肪细胞的DIGs结合，且hcDIGs为lcDIGs功效的11-至15倍。在200倍摩尔的过量未标记lcGce1p存在下，非特异结合占在非饱和浓度的lcGce1p时所回收DIGs中总lcGce1p的15％以下。根据斯卡查德图分析，lcGce1p结合hcDIGs的Kd范围为0.1-1μm，Bmax为70-200pmol/mg hcDIGs蛋白质。全部质膜和微粒体不表现出lcGce1p的特异结合。因此，对于来自酵母的lcGce1p，脂肪细胞质膜的hcDIGs明显具有特异的结合位点。为了进一步分析对于PIG(-P)和lcGPI蛋白质的结合位点的特性，其中所述特征以类似的Kd和Bmax值显示，在竞争研究中，比对了合成的PIG(-P)化合物对于lcGce1p结合位点在hcDIGs上的相对亲和性(图9)。
放射性标记的lcGce1p与hcDIGs的结合被过量(大于500倍)的经标记合成的YCN-PIG，YMN-PIG和YCN+PIG37置换，置换量大于总结合的lcGce1p的75％，这证实了lcGce1p与hcDIGs间相互作用的特异性。lcGce1p与PIG37和YCN结合的竞争极少有效。如在其表观IC50中所反映的，对于从hcDIGs置换出lcGce1p，不同PIG(-P)的相对等级为YCN-PIG＞YCN+PIG37＞YMN-PIG＞PIG37＞YCN，且因此，与用YCN-PIG结合的干扰相同(图6)。此外，对于lcGce1p和YCN-PIG结合的竞争，表观IC50值是非常相像的，说明在这两种情况下识别相同的决定簇，且GPI蛋白质的剩余蛋白质部分(除了羧基末端三肽乙醇胺残基)并不参与结合。其次，在几乎完全破坏了放射性标记的YCN-PIG结合的(图7)条件下，研究了对用胰蛋白酶/NaCl处理的和NEM处理的完整大鼠脂肪细胞lcGce1p与hcDIGs相互作用的敏感性。源自于胰蛋白酶/NaCl处理的和NEM处理的脂肪细胞的hcDIGs显示出放射性标记的lcGce1p的结合没有超过在500倍过量的未标记YCN-PIG(占使用hcDIGs从未处理的对照细胞中回收的总Gce1p的约30％)存在下的非特异结合(图10)。相反，在过量DTT(图10)存在下用NEM，或单独使用胰蛋白酶或NaCl(未列出数据)培养脂肪细胞，没有削弱放射性标记的lcGce1p的结合，且对比未处理的细胞，其竞争为3μM YCN+PIG37、5μM PIG37和10μM YCN。总之，对于YCN-PIG与lcGce1p的特异结合位点，在脂肪细胞质膜hcDIGs处的定位、绝对和相对亲和性(对结构衍生物)、表达水平和对胰蛋白酶/NaCl及NEM处理敏感性方面显示出非常相似的特性。
PIG(-P)和lcGPI蛋白的受体的内源性配基对于PIG(-P)和lcGPI来说，具有明显相同结合位点的生理学配基候选物是未切割的GPI结构，即GPI脂类和/或GPI蛋白质锚。为检测这种可能性，分离的大鼠脂肪细胞用多种GPI特异的PL处理，然后在制备hcDIGs之前用盐洗(0.5M NaCl)，以特异地移出推定的内源性GPI分子，其与受体相互作用并因而掩盖YCN-PIG/lcGce1p的结合位点。
浓度渐增的源自于蜡状芽孢杆菌PI特异性PLC或的源自于人血清的GPI特异PLD培养大鼠脂肪细胞，导致浓度依赖的放射性标记的YCN-PIG和Gce1p数量上的增加，所述标记物特异地结合到hcDIGs上(图11)。从hcDIGs缺失Gce1p和Nuc，平行地显示出脂解消化的功效。
它们分别缺失达75％和65％，这与YCN-PIG或lcGce1p到hcDIGs的结合增加了200％和260％有关。PC特异的PLC(蜡状芽孢杆菌)和源自于卷心菜的PLD(其不攻击GPI结构)完全不能显著地代替Gce1或源自于hcDIGs的Nuc以及不能刺激YCN-PIG(lcGce1p)结合到hcDIGs上显示出GPI裂解的特异性(图11，12)。
特异结合到源自于PI-特异的PLC预处理的脂肪细胞(不显著地改变非特异结合)的hcDIGs的斯卡查德图分析显示出放射性标记的YCN-PIG/lcGce1p的结合增强主要归因于Bmax高出2至3倍和几乎未改变的Kd。这些发现表明，在基本状态下，可由(G)PI特异的PLC/D裂解的内源性GPI结构占据了约50％的对于PIG(-P)或lcGPI蛋白在分离大鼠脂肪细胞内hcDIGs上的结合位点。引人注意的是，生理浓度的胰岛素在大鼠脂肪细胞内模拟GPI特异的PLC/D处理的功效达到特定的程度，即引起Gce1p和hcDIGs内的Nuc在数量上是中等的但显著的下降。胰岛素诱导的源自于hcDIGs的GPI蛋白的缺失导致YCN-PIG或lcGce1p的结合能力显著增加(图11，12)。
此外，其可由以下得到显示PIG(-P)和lcGPI蛋白质的受体与对胰蛋白酶/NaCl和NEM敏感的115kDa的称为CIR的蛋白质相同。
PIG-P与受体的结合将影响其发生下面现象的机会后续的通过NEM的共价修饰和/或通过胰蛋白酶/NaCl处理从脂肪细胞的细胞表面裂解和释放。
大鼠脂肪细胞用PIG(-P)培养，然后用[14C]NEM标记，之后用胰蛋白酶/NaCl处理。通过SDS-PAGE和磷成像对释放的放射性标记的多肽进行分析显示出(图13)，PIG(-P)降低了通过[14C]NEM标记的115kDa多肽的交联和/或经过胰蛋白酶/NaCl处理后从脂肪细胞的下层对其的回收。YCN-PIG或PIG37为3μM，YCN为30μM时，与对照细胞相比，减少量分别为83、65和28％。该蛋白代表了唯一主要的NEM标记的通过胰蛋白酶/NaCl处理从质膜释放的，但单独处理不能释放的成分(图13)，其与CIR相同。与存在内源性配基(例如GPI蛋白)及通过脂解切割使它们从相应结合位点脱离(见图11，12)的实验数据一致，使用外源性PI特异的PLC(蜡状芽孢杆菌)或胰岛素轻微但重复地处理脂肪细胞，刺激了胰蛋白酶/NaCl依赖的[14C]NEM标记的CIR的释放，分别达30％和20％(图13)。由于通过胰蛋白酶/NaCl处理比对胰蛋白酶处理比对NaCl处理CIR从脂肪细胞细胞表面的释放的相对比率(100/20/10)可粗略地与对照组相比，即与PIG(-P)刺激的和PLC/胰岛素处理的细胞相比，PIG(-P)和内源性GPI配基与hcDIGs的结合明显削弱使用NEM而不是胰蛋白酶裂解对CIR的标记。这是由于配基与PIG(-P)受体在脂肪细胞质膜的hcDIGs处的交互作用引起了CIR构象的改变。
表1对于YCN-PIG在D2O中1H和13C的化学位移[ppm]，pD＝8.1(未校正)
附图简述图1PIG的1部分合成的一般性方案图2PIG的2部分合成的一般性方案图3PIG的3部分合成的一般性方案图4YCN-PIG的1部分的合成，图5YCN-PIG的2部分的合成，图6YCN-PIG的3部分的合成，图7YCN的合成图8YCN-PIG的化学式图9YMN-PIG的化学式图10PIG37的化学式图11YCN的化学式图12PIG(-P)与hcDIGs的特异结合用源自于分离的大鼠脂肪细胞的hcDIGs(6.5μg蛋白质)、lcDIGs(6.5μg)、质膜(47.5μg)和微粒体(68μg)与从酿酒酵母分离的数量渐增的经放射性标记的YCN-PIG孵育(1小时，4℃)。将膜级分/DIGs通过油层离心，回收沉淀/油层顶部，溶解并计数放射性。计算的特异结合为不存在和存在10μM未标记的YCN-PIG时测定的放射性的差异。每个点代表至少使用4种不同膜制备物进行一式三份孵育的均值±标准差。
图13PIG-P与hcDIGs的特异结合在缺乏或存在数量渐增的未标记YCN-PIG、YCN+PIG37、YMN-PIG、PIG37和YCN(竞争)下，将hcDIGs(6.5μg蛋白质)与放射性标记的YCN-PIG(18,000-22,000dpm)孵育(1小时，4℃)。将膜级分/DIGs通过油层离心，回收沉淀/油层顶部，溶解并计数放射性。
图14PIG-P在hcDIGs上结合位点的特征用源自于分离的大鼠脂肪细胞的hcDIGs(6.5μg蛋白质)与数量渐增的放射性标记的从酿酒酵母分离的YCN-PIG孵育(1小时，4℃)，所述hcDIGs已用胰蛋白酶/NaCl、胰蛋白酶、NEM+DTT、NaCl或NEM预处理，或不进行处理(对照)。将DIGs通过油层离心，从油层顶部回收，溶解并计数放射性。计算的特异结合为不存在和存在10μM未标记的YCN-PIG时测定的放射性差异。每个点代表至少使用3种不同脂肪细胞预处理的一式三份的培养物的均值±标准差。
图15PIG-P在hcDIGs上结合位点的特征从分离的大鼠脂肪细胞制备的(成比例)量的hcDIGs和lcDIGs培养放射性标记的YCN-PIG(12,000-18,000dpm)(1小时，4℃)，所述细胞用浓度渐增的m-βCD进行预处理(50分钟，30℃)或不进行处理。将DIGs通过油层离心，从油层顶部回收，溶解并计数不存在和存在10μM未标记的YCN-PIG时测定的放射性。每个点代表至少使用3种不同脂肪细胞预处理的一式三份的培养物的均值±标准差。
图16lcGce1p与hcDIGs的特异结合在不存在或存在未标记的PIG-P条件下，使用从未处理的大鼠脂肪细胞中分离的hcDIGs(6.5μg蛋白质)培养从酿酒酵母制备的并经PI-特异的PLC(蜡状芽孢杆菌)处理的放射性标记的Gce1p(1小时，4℃)。hcDIGs通过油层离心，溶解并计数放射性。每个点代表至少分别地使用3种不同的hcDIG制备物和脂肪细胞预处理物进行一式四份培养的均值±标准差。
图17lcGce p与hcDIGs的特异结合。
在不存在或存在未标记的YCN-PIG(终浓度3μM)、YCN+PIG37(3μM)、PIG37(5μM)和YCN(10μM)条件下，使用从脂肪细胞分离的hcDIGs(6.5μg蛋白质)培养从酿酒酵母制备的并经PI-特异的PLC(蜡状芽孢杆菌)处理的放射性标记的Gce1p(1小时，4℃)，所述脂肪细胞已用胰蛋白酶/NaCl、NEM、NEM+DTT进行预处理或不进行处理(对照)。hcDIGs通过油层离心，溶解并计数放射性。每个点代表至少分别地使用3种不同的hcDIG制备物和脂肪细胞预处理物进行一式四份培养的均值±标准差。
图18PL和胰岛素处理脂肪细胞对YCN-PIG和lcGce1p与hcDIGs结合的影响在温和摇动及5％CO2/95％O2条件下，用一定量PI特异性PLC(蜡状芽孢杆菌)、PC特异性PLC(蜡状芽孢杆菌)、GPI特异性PLD(人血清)或PLD(卷心菜)或人胰岛素培养总体积为2ml的经分离大鼠脂肪细胞(7×107细胞/ml)(30分钟，30℃)。添加2ml 1M NaCl后，通过浮选法洗脂肪细胞。分离hcDIGs，然后，在不存在或存在未标记的YCN-PIG(终浓度10μM)条件下，用从酿酒酵母中制备的放射性标记的lcGce1p和YCN-PIG(15,000-25,000dpm)培养6.5μg hcDIGs(1小时，4℃)，通过油层离心，从油层顶部回收，溶解并计数放射性。计算的特异结合为不存在和存在YCN-PIG时的差异。每个点代表至少使用2种不同的hcDIG制备物进行一式三份培养的均值±标准差。
图19PL和胰岛素处理脂肪细胞对YCN-PIG和lcGce1p与hcDIGs结合的影响在温和摇动及5％CO2/95％O2条件下，用一定量的PI特异性PLC(蜡状芽孢杆菌)、PC特异性PLC(蜡状芽孢杆菌)、GPI特异性PLD(人血清)或PLD(卷心菜)或人胰岛素培养总体积为2ml的经分离大鼠脂肪细胞(7×107细胞/ml)(30分钟，30℃)。添加2ml 1M NaCl后，通过浮选法洗脂肪细胞。分离hcDIGs，然后，在不存在或存在未标记的YCN-PIG(终浓度10μM)条件下，用从酿酒酵母中制备的放射性标记的lcGce1p和YCN-PIG(15,000-25,000dpm)培养hcDIGs的6.5μg试样(1小时，4℃)，通过油层离心，从油层顶部回收，溶解并计数放射性。
图20PIG(-P)、PI特异性PLC和胰岛素对CIR进行NEM-标记的影响在特定浓度下，在不存在(对照)或存在PIG37、YCN-PIG、YCN、PI-PLC(蜡状芽孢杆菌)或胰岛素条件下，培养分离的大鼠脂肪细胞(30分钟，37℃)，然后用[14C]NEM标记。如前所述，用胰蛋白酶/NaCl处理后，通过油层用离心法从培养介质中分离脂肪细胞。从培养介质(油层之下)回收蛋白，然后通过SDS-PAGE分辨。
磷成像从重复三次的具有相似结果的典型试验得到显示。定量评估对四种不同的脂肪细胞培养物以任意单位给出的三个测量值(均值±标准差)，其中将胰蛋白酶/NaCl处理的对照细胞释放的CIR量的设定为100。
权利要求
1.源自脂肪细胞质膜的蛋白质，其与磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽具有特异结合亲和性，其特点是a]在磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽与所述蛋白质特异结合后，能引发脂肪细胞内胰岛素受体底物1或2的tyr磷酸化，和b]在磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽与所述蛋白质特异结合后，能刺激脂肪细胞摄入葡萄糖。
2.权利要求1的蛋白质，其中磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽由YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1中的至少一种化合物组成。
3.权利要求1或2的蛋白质，其中磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽以0.001至10μM的结合常数结合所述蛋白质。
4.权利要求3的蛋白质，其中磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽以结合常数为0.001至1μM进行结合。
5.权利要求1至4的蛋白质，其中脂肪细胞是大鼠、小鼠或人源的脂肪细胞。
6.权利要求1至5的蛋白质，其中所述蛋白质分子量为115kDa。
7.复合体，其由权利要求1至6的蛋白质和YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1中的至少一种化合物构成。
8.权利要求1至7的蛋白质的产生，其中a]脂肪细胞由大鼠、小鼠或人组织提供，b]从a]分离脂肪细胞的质膜，c]从b]的质膜制备具有高胆固醇的筏域(hcDIGs)，d]用胰蛋白酶/NaCl溶液处理源自c]的hcDIGs，e]离心来自于d]的培养混合物并用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离上清液中的蛋白，f]从凝胶上洗脱大小为115kDa的蛋白质级分并可能用含有去污剂或生物膜的溶液或悬液溶解，g]且可能加入了下述化合物之一YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1。
9.用于鉴定特异结合至权利要求1至6的蛋白的化合物的方法，其中a]提供细胞的级分，其含有权利要求1至6的蛋白，b]提供化合物，c]将来自于a]的细胞级分与b]的化合物接触，d]检测所述化合物与a]的细胞级分的结合，e]通过将d]的结果与下面实验结果进行比较推出结合的特异性在该实验中，将来自于b]的同一化合物与这样的细胞级分进行接触，其中所述细胞具有与来自于a]的细胞相同的物种和/或组织特异性但所述细胞级分不含有权利要求1至6的蛋白质，一旦来自于b]的化合物结合到含有权利要求1至6的蛋白质的细胞级分上的量高于来自于b]的化合物结合到不含有权利要求1至6的蛋白质的细胞级分上的量，则表明所述化合物具有较高的结合特异性。
10.权利要求9的方法，其中由其获得细胞级分的细胞是脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞或肝细胞。
11.权利要求9或10的方法，其中细胞是人、小鼠或大鼠物种来源的细胞。
12.权利要求9至11的方法，其中细胞级分由细胞的细胞膜组成。
13.权利要求9至12的方法，其中细胞级分由高胆固醇含量的筏域(hcDIGs)组成。
14.权利要求9至13的方法，其中化合物用放射性核素或荧光标记物进行标记。
15.鉴定特异结合权利要求1至6的蛋白质的化合物的方法，其中a]提供葡萄糖转运细胞，其包含权利要求1至6的蛋白质，b]提供化合物，c]将源自于a]的细胞与b]的化合物接触，d]确定化合物结合至葡萄糖转运细胞，e]通过将d]的结果与下面实验结果进行比较推出结合的特异性在该实验中，将来自b]的同一化合物与这样的葡萄糖转运细胞进行接触，其为具有与来自于a]的细胞相同的物种和/或组织特异性但不含有权利要求1至6的蛋白质的葡萄糖转运细胞，一旦所述化合物结合至含有权利要求1至6所述蛋白质的葡萄糖转运细胞上的量高于结合到不含有本发明蛋白质的葡萄糖转运细胞上的量，则表明所述化合物具有较高的结合特异性。
16.权利要求15的方法，其中细胞是脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞或肝细胞。
17.权利要求15或16的方法，其中细胞是人、小鼠或大鼠物种来源的细胞。
18.权利要求15至17的方法，其中化合物用放射性核素或荧光标记物进行标记。
19.鉴定化合物为权利要求1至6的蛋白的激动剂或拮抗剂的方法，其中a]提供葡萄糖转运细胞，其中存在权利要求1至6的蛋白质，b]提供权利要求1至6的蛋白质的天然配基，c]提供化学化合物，d]将a]的葡萄糖转运细胞与b]的配基和c]的化学化合物接触，e]检测d]的葡萄糖转运细胞的葡萄糖摄入，由此认为刺激葡萄糖摄入的源自于c]的化合物具有激动剂活性，且认为抑制葡萄糖摄入的源自于c]的化合物具有拮抗剂活性。
20.权利要求19的方法，其中天然配基选自YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1。
21.权利要求19或20的方法，其中葡萄糖转运细胞是脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞或肝细胞。
22.权利要求19至21的方法，其中细胞是人、小鼠或大鼠物种来源的细胞。
23.药物，其包含通过权利要求9至22的方法鉴定的化合物以及用于药物制剂的辅助化合物。
24.权利要求23的药物，其中至少一种化合物选自YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1。
25.权利要求23的药物，其中化合物由YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1中至少一种中的一部分或衍生物组成。
26.通过权利要求9至22的方法鉴定的化合物的用途，用于产生治疗胰岛素抗性或糖尿病的药物。
27.权利要求26的用途，其中所述化合物选自YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1。
28.权利要求26的用途，其中所述化合物由YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1中至少一种中的一部分或衍生物组成。
全文摘要
本发明涉及来自脂肪细胞质膜的蛋白质，所述蛋白质与磷脂酰肌醇多糖具有特异的结合亲和性。其通过避开胰岛素信号传导级联而调控葡萄糖的摄入。
文档编号C07K14/705GK1665836SQ03815992
公开日2005年9月7日 申请日期2003年6月26日 优先权日2002年7月5日
发明者G·米勒, W·弗里克, S·佩特里, R·施奈德, M·乌尔曼 申请人:安万特医药德国有限公司