具有抗癌特性的植物来源蛋白质:海特卡品的制作方法

专利名称：具有抗癌特性的植物来源蛋白质:海特卡品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抗癌特性的植物来源的人GHRH(人生长激素释放激素)结合蛋白。
生长激素(“GH”)是具有191个氨基酸的蛋白质，其刺激许多生长因子如胰岛素样生长因子I(IGF-1)的产生并引发许多组织(骨骼、结缔组织、肌肉和内脏)的生长。GH还具有生理学活性，增加核酸、蛋白质的合成和脂解作用减少尿的分泌(Frohman L.A.&Kineman，R.D.，生理学手册，生长的激素控制，Kostyo，J.L & Goodman，H.M.编著(牛津大学出版社，纽约，1999)，189-221页)。
GH的合成受到下丘脑分泌的正作用因子或负作用因子的调节。控制GH产生的主要因子是“生长激素释放激素”(GHRH)，它是人体中一种具有44个氨基酸的肽。
GH和GHRH与许多疾病有关。其中，尤其应该提及下面的疾病癌症(尤其是前列腺癌和肺癌)、肢端肥大症、糖尿病性视网膜病和肾病；对于这些病理，适应用GHRH拮抗剂治疗。由于潜在有关的许多疾病，工业上继续在研究GHRH拮抗剂。
因此本申请人刚好已经分离了一种植物来源的新蛋白质，其具有结合人GHRH的特性。
因此本发明的一个主题是通过从植物异叶毛果芸香(pilocarpusheterophyllus)提取可以得到的经分离蛋白质，其特征是其分子量约为90.9kDa并且含有肽序列SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3的片段，所述蛋白质能够以糖基化或非糖基化形式存在。为了简化下面的公开，该蛋白质此后称为“海特卡品(heterocarpine)”。
所述SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3序列如下
SEQ.ID.NO.1KLIGARYFDKSEQ.ID.NO.2YGEDIIVGVIDSGVSEQ.ID.NO.3 PESESY上面用于定义该肽的命名法(如本申请剩下部分中的)为“生物化学命名IUPAC-IUB委员会”(IUPAC-IUB Commissioner on BiochemicalNomenclature)规定，其中，根据标准表示，N-末端氨基酸(氨基基团)出现在左边，C-末端氨基酸(羧基基团)出现在右边。术语“天然氨基酸”表示天然蛋白质中发现的天然L-氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Lys、Arg、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys、Met、Phe、Tyr、Pro、Trp和His的一种。
如果蛋白质被从其最初的环境中移出，那么称该蛋白质“被分离”。具体地，如果天然蛋白质从天然系统中与该蛋白质共存的生物材料分开，那么该天然蛋白质被“分离”。
本发明优选地涉及非糖基化形式的海特卡品。
根据本发明的优选可变方案，从体外培养的植物异叶毛果芸香的细胞提取物得到海特卡品。
而且，本发明的一个主题也为特异性结合海特卡品的单克隆抗体或单克隆抗体的抗原结合片段。
海特卡品具有结合人GHRH的特性。体外，海特卡品结合人GHRH并从而抑制人GHRH结合到其受体上时诱导的环AMP的合成。体内，在大鼠中，在血室中形成海特卡品/人GHRH复合体，并且其以依赖剂量的方式以摩尔对摩尔比例抑制10μg人GHRH诱导的GH合成。海特卡品具有结合人GHRH的特性。
这些特性使得本发明的化合物适于药用。因此，本发明的另一个主题是糖基化或非糖基化的海特卡品用作药物。本发明还涉及含有作为活性成分的糖基化或非糖基化的海特卡品的药物组合物，所述组合物还含有一种或多种可药用赋形剂。另一个主题是糖基化或非糖基化形式海特卡品的用途，用于制备拮抗GHRH作用的药物，以治疗增殖性疾病(尤其是癌症)，治疗肢端肥大症或治疗糖尿病性视网膜病或肾病。关于癌症，海特卡品尤其适于制备治疗良性肿瘤和胰腺肿瘤、下丘脑-垂体神经节细胞瘤、支气管的、肠的和肝的肿瘤、交感肾上腺素能肿瘤、嗜铬细胞瘤、垂体腺瘤和甲状腺肿瘤的药物。海特卡品尤其适于制备治疗依赖于生长因子GHRH生长的癌的药物，尤其用于制备治疗选自小细胞肺癌和乳腺癌(尤其是小细胞肺癌)的药物。
本发明的一个主题是作为药物的特异结合海特卡品的单克隆抗体或者其抗原结合片段。还涉及含有作为活性成分的特异结合海特卡品的单克隆抗体或者其抗原结合片段的药物组合物，所述组合物还含有一种或多种可药用赋形剂。还涉及特异结合海特卡品的单克隆抗体或者其抗原结合片段的用途，用于制备拮抗GHRH作用的药物，以治疗增殖性疾病(尤其是癌症)、治疗肢端肥大症或治疗糖尿病性视网膜病以及肾病。对于癌症，所述单克隆抗体或者其抗原结合片段尤其适于制备治疗良性肿瘤和胰腺肿瘤、下丘脑-垂体神经节细胞瘤、支气管的、肠的和肝的肿瘤、交感肾上腺素能肿瘤、嗜铬细胞瘤、垂体腺瘤和甲状腺肿瘤的药物。
本发明还涉及海特卡品作为用于GHRH缓释的药物组合物中赋形剂的用途。还涉及含有GHRH、海特卡品和一种或多种可药用赋形剂的药物组合物。
最后，本发明的其他主题是使得可能从植物异叶毛果芸香的细胞提取和分离海特卡品的方法，所述细胞优选地来自体外培养物。这些方法基本包括用温度为0到50℃，优选4到25℃的水提取来自植物异叶毛果芸香的细胞的步骤，所述提取步骤后跟随过滤步骤以从异叶毛果芸香细胞分离富含海特卡品的滤液，和从植物异叶毛果芸香提取的其他组分分离海特卡品的一个或多个步骤。
根据第一个可变方案，这些提取和分离方法基本上包括下面的连续步骤a)用温度为0到50℃，优选4到25℃的水提取来自植物异叶毛果芸香的细胞的步骤，所述提取步骤后跟随着从异叶毛果芸香细胞分离富含海特卡品的滤液的过滤步骤；b)沉淀所提取的蛋白质的步骤，例如通过加入硫酸铵沉淀，然后是分离沉淀物的步骤(通过过滤或者，优选地通过离心)；c)将步骤b)中回收的沉淀物溶于水中；和d)凝胶过滤层析的步骤，目的是从溶液的其他组分分离出海特卡品。
根据另一可变方案，这些提取和分离方法基本上包括下面的连续步骤a)用温度为0到50℃，优选4到25℃的水提取来自植物异叶毛果芸香的细胞的步骤，所述提取步骤后跟随着从异叶毛果芸香细胞分离富含海特卡品的滤液的过滤步骤；b)对a)中所得溶液脱脂(delipidation)的步骤，通过加入pH优选为2到4的非氧化酸(例如，盐酸、硫酸或磷酸)酸化，使用液-液提取(优选通过有机溶剂如二氯甲烷、庚烷、己烷或环己烷)；c)通过将b)中所得的脱脂溶液与聚乙烯吡咯烷酮(或者尼龙66)接触然后在大孔树脂(优选基于聚苯乙烯的树脂如树脂DiaionHP-20)上过滤除去鞣酸的步骤；d)通过加入碱如氢氧化铵、氢氧化钠或氢氧化钾将步骤c)后所得滤液调节到碱性pH(优选9到11之间的pH)；e)在阴离子-交换树脂上过滤的一个或多个步骤，该一个或多个过滤步骤的洗脱液优选为pH9到11的缓冲液并且任选含有盐(例如，氯化钠或硫酸铵)浓度梯度，该一个或多个步骤的目的是将海特卡品与溶液的其他组分分离；f)脱盐步骤，包括将步骤e)中所得溶液通过基于它们的分子量分离混合物成分的树脂(如树脂SephadexG25或Superdex200HR)和用水从所述树脂洗脱该混合物。
含有本发明化合物的药物组合物可以是固体形式如，例如，粉剂、丸剂、粒剂、片剂、脂质体、明胶胶囊或栓剂。丸剂、片剂或明胶胶囊可以用某种物质包衣，该物质可以保护组合物在足够的时间不受受试者胃中的胃酸或酶的作用以允许该组合物穿过受试者小肠而不被消化。该化合物哈可以局部施用，例如，施用于肿瘤的实际部位。还可以根据缓释方法使用该化合物(例如，通过使用缓释组合物或灌注泵)。适宜的固体载体可以是例如磷酸钙、硬脂酸镁、碳酸镁、滑石粉、糖、乳糖、右旋糖、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮和蜡。
含有本发明化合物的药物组合物也可以以液体形式如溶液剂、乳剂、悬浮剂或缓释制剂给出。适宜的液体载体可以是例如水、有机溶剂(如甘油)或乙二醇(如聚乙二醇)，以及它们以各种比例在水中的混合物。
本发明药物的施用可以通过局部、经口、肠胃外途径、通过肌内注射等进行。
为治疗上面提到的疾病或失调所提供的本发明化合物的剂量根据施用方法、所要治疗的对象的年龄和体重及状态而变，并且将最终由主治医生或兽医决定。由主治医生或兽医确定的这种量在这里被称为“治疗有效量”。
根据本发明，可通过此后描述的方法制备海特卡品。
海特卡品的制备根据本发明的优选可变方案，进行了来源于该植物不同器官的愈伤组织或细胞悬浮物的体外培养。培养于半固体或液体培养基中的这些组织能够生物合成具有生物学特性的化合物。
本申请中“愈伤组织”指半固体营养培养基上培养的未分化细胞的宏观群。本申请中术语“未分化的细胞”表示在一定条件下能够以愈伤组织或细胞悬浮物的形式增殖而无任何形态发生现象的细胞。最后，“细胞悬浮物”指在液体营养培养基的培养物中可形成微观群的未分化细胞。
营养培养基、激素、培养条件的选择以及这些体外培养物的提取和提取物的分析形成了本发明的一个整体部分。
例如根据此后的步骤可以在悬浮液中培养来自异叶毛果芸香种子的细胞。
根据常规方法在培养前将这些器官消毒。体外胚芽器官也作为愈伤形成(callogenesis)起始材料而不需要事先消毒。优选的基础营养培养基是通常用于体外培养的培养基中的一种它是Gamborg培养基(在Gamborg等，大豆根细胞悬浮培养物的营养需求，Exp.Cell Res.(1968)，50(1)，151-158)。碳源为蔗糖但是也可以使用浓度为1到120g/l，优选约30g/l的葡萄糖。宏观成分含量也可以减半。向培养基中加入生长素或加入生长素和细胞分裂素，优选组合这两种激素，通常为2，4-二氯苯氧基乙酸和激动素，但是α-萘乙酸(NAA)、β-吲哚乙酸(IAA)、β-吲哚丁酸(IBA)或毒莠定也可以与激动素或苯甲基氨基嘌呤(BAP)组合。生长素的浓度可以为0.1到10mg/l(例如可以选择1mg/ml)，细胞分裂素的浓度可以是0.01到2mg/l(例如可以选择0.06mg/ml)。维生素为那些与不同基础培养基相关的维生素。在光或黑暗中进行培养。温度为10℃到33℃，但是优选约23℃。培养基的pH为4到6.5并且优选在灭菌前调节到5.8。此外，培养基中可以加入或不加入琼脂。
原代愈伤组织在几天的培养后出现并且可以从最初的植入物分离，约1个月后取出并传代培养，然后在琼脂半固体培养基(试管或培养皿中)上培养，间隔4到8周，优选6周，从而通过在新培养基上连续传代培养可以将愈伤组织保存数年。愈伤组织也可以在搅拌的液体培养基中(锥形瓶或生物反应器中)传代培养，在2到6周，优选3周进行传代培养。
株系通过它们的遗传起源、培养条件、外观和形态发生的缺乏进行区分。
用温度为0到50℃，优选4到25℃的水提取冷冻干燥的异叶毛果芸香细胞。将所得提取物冷冻干燥，以后以适宜的浓度再溶解(例如，约30％的干物质)。通过加入浓缩的硫酸铵溶液(例如在代表70到90％饱和浓度的浓度)沉淀的蛋白质溶于最少量的水中并通过离心分离出不溶物质。然后通过柱层析(洗脱液优选为水)分离蛋白质并可以回收海特卡品(可通过其约90.9kDa的分子量进行鉴定)。
特异结合海特卡品的抗体的制备本发明提供了特异结合海特卡品的结合剂，如抗体。如果这种结合剂在可检测的水平(例如通过ELISA试验)与所述蛋白质反应并且不与其他蛋白质可检测地反应，那么这种结合剂被称为“特异结合”。“结合”指两种不同分子间的非共价结合从而形成复合体。结合能力可以例如通过确定复合体形成的结合常数来评价。结合常数是复合体浓度值除以非复合组分的浓度值的乘积所得的值。当结合常数达到103l/mol时称两种产物是“结合的”。可以使用本领域技术人员熟知的方法确定结合常数。
可以满足上面标准的任何试剂都可认作结合剂。
本发明中，结合剂优选为抗体或其片段。可通过本领域技术人员可得到的任何技术制备抗体(参考Harlow和Lane，抗体实验室手册，冷泉港实验室，1988)。通常，可通过细胞培养技术包括产生单克隆抗体的技术产生抗体，或者通过将抗体基因转染入来自细菌或哺乳动物的宿主细胞以产生重组抗体。
其他技术中，优选此后描述的那些技术。将含有海特卡品的免疫原注射到一组哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、绵羊或山羊)中。在该步骤，海特卡品可作为未修饰的免疫原。备选地，如果海特卡品与转运蛋白如牛血清白蛋白或者形血蓝蛋白组合，那么可以诱导更强的免疫应答。优选根据预定方案将免疫原注射到宿主动物中，并对动物定期取血。可以从这些抗血清纯化对海特卡品特异的多克隆抗体，例如，使用与适宜固体载体偶联的海特卡品通过亲和层析纯化。
用于释放GHRH的药物组合物可以具体地根据刊物De Wolf和Brett，PharmacologicalReviews(2000)，52，207-236和其中引用的参考文献中描述的方法之一从海特卡品和GHRH制备组合物。
除非另外说明，此处所用的所有技术和科学术语具有和本发明所属领域中普通技术人员所通常理解的相同的意思。类似地，此处提到的所有出版物、专利申请、所有专利和所有其他参考文献被并入作为参考。
下面给出的实施例用于阐明上面的方法并且绝不应该被认为是对本发明范围的限制。
获得海特卡品实施例1细胞的体外培养使异叶毛果芸香种子发芽并移走发芽产生的茎。所述茎培养于Gamborg培养基(Gamborg等，大豆根细胞悬浮培养的营养需求，Exp.CellRes.(1968)，50(1)，151-158)，该培养基中已经被加入30g/l蔗糖、1mg/l2，4-二氯苯氧基乙酸和0.06mg/l激动素。在23℃的温度下黑暗中在试管中进行培养。每6周在常规条件下进行传代培养。这些株系外观上具颗粒，具有浅褐色色素。
进行株系的生长动力学研究，为期8周，该动力学基于来自生物量的鲜物质和干物质质量的增加。将来自两管的愈伤组织组合并组成每周两次的收获物，第一次收获在时间0进行。然后收获愈伤组织和半乳聚糖并冷冻干燥。观察到出现稳定的生长期前生长为指数的，长达6周。
细胞培养物的提取将25g冷冻干燥的异叶毛果芸香细胞提取两次，该提取为将这些细胞浸于375ml 4℃水中，在4℃放置过夜，然后在250ml 4℃水中4小时，最后用125ml 4℃水洗涤。这样所得每种水性溶液在真空中通过装有硅藻土(celite)的玻璃过滤器过滤以将细胞残渣从水性溶液分离。合并所得水性溶液并冻干得到9.4g干物质。然后将冻干的干燥提取物溶于31ml 20℃水中以得到含有30％干提取物的溶液。在稳定的磁力搅拌下以小份加入17.4g硫酸铵以沉淀蛋白质级分。然后通过3000转/分钟离心20分钟将蛋白质沉淀物从硫酸铵溶液分离。倒出硫酸铵溶液并将沉淀的蛋白质溶于22ml水中，再次离心并过滤以除去不溶微粒。
然后对所得滤液进行凝胶过滤层析。将其注射到根据生产商的推荐制备的装有SuperdexTM20(Amersham Pharmacia Biotech，参考号17-1043-01；微粒平均直径13μm)的柱子(Buchi N°19678，L＝230mm；内径＝26mm)，使用超纯水(Water’s Milli-Q)作为洗脱液，流速为5ml/分钟。收集多个40ml级分并在第3和第4级分中发现活性蛋白质。将这些部分冷冻干燥以得到约14.2mg活性产物。
所得产物的纯度通过在含有十二烷基硫酸钠的电泳凝胶(SDS PAGE)上出现的单带证明。对应于该带的产物此后指定为海特卡品。
实施例2根据与实施例1中描述的方法相同的方法体外培养细胞，根据此后描述的方法提取所培养细胞。
将100g冻干的异叶毛果芸香细胞用2升20℃去离子水提取，混合物在搅拌下保持过夜。通过覆盖硅藻土床(事先用酸洗涤；1到2cm厚)的过滤板(孔隙3，直径20cm)上抽气过滤细胞和提取物。回收的细胞用400ml去离子水洗涤然后将它们除去。然后将水性滤液通过加入约10ml 18％盐酸酸化。使用400ml二氯甲烷通过液-液提取对酸性溶液脱脂。将二氯甲烷相倒出并清除。将经脱脂的溶液进行旋转蒸发以除去残留的二氯甲烷。然后将约30g聚乙烯吡咯烷酮加入经脱脂溶液(pH约3.0)并搅拌混合物约30分钟以除去鞣酸。通过被含有25g硅藻土(事先用酸洗涤)和25g聚乙烯吡咯烷酮的混合物床覆盖的过滤板(孔隙率3，直径10cm)上抽气穿过床过滤混合物。然后滤液穿过根据生产商的使用说明预活化的400ml DiaionHP-20(Mitsubishi Chemical Company)的床。通过加入约60ml 20％氢氧化铵溶液使所得滤液为碱性(pH10)。放置30分钟后出现少许沉淀。将1g硅藻土(事先用酸洗涤)加入该碱性溶液，然后将该溶液通过抽气穿过膜过滤器(0.22μm)过滤。然后约2升滤液穿过安装在Akta纯化器上的HiPrepQ XL 16/10柱子，该柱子已经用pH 10.2的哌嗪/HCl 0.1M缓冲液预平衡，流速为每分钟0.5ml(HiPrep柱和Akta纯化器都是AmershamBiosciences公司的产品)。将柱子用6柱体积的pH 10.2的起始缓冲液、5柱体积的含有0.2M NaCl的相同缓冲液、和10柱体积的含有1M NaCl的相同缓冲液连续洗涤。在含有1M NaCl的缓冲液的头3个柱体积中回收大部分海特卡品。活性级分通过穿过SephadexG25柱(床体积260ml)脱盐，使用去离子水作为洗脱液。在相应于滞留体积的第一个柱体积中发现活性级分，将该活性部分冷冻干燥得到170mg海特卡品。所得海特卡品在SDSPAGE凝胶上基本上是一条带。
海特卡品的表征分析和微测序将样品上样至10％聚丙烯酰胺凝胶。迁移后，将凝胶固定并用考马斯亮蓝染色。
相应于泳道1、2、3、4和5的在图3中描绘的凝胶泳道分别是分子量标记(Amarsham)、如在实施例1中所得最终海特卡品级分的0.5、1和2μg含量和分子量标记(Amersham)。通过标准分子量图使用本领域技术人员熟知的标准计算工具(例如，Viber Lourmat’s Bio-Profil BiolD软件)确定分子量使得可表明海特卡品的分子量为90.9千道尔顿(±1.6千道尔顿)。
对于蛋白质的微测序分析，切下含有该蛋白质的聚丙烯酰胺带并将其在存在0.4μg endolysine-C(Sigma)下在含有50mM Tris(pH 8.6)、0.03％十二烷基硫酸钠的300μl消化缓冲液中35℃消化18小时。所得肽通过HPLC在直径1mm的DEAE-C18内嵌柱上分离。分离梯度基于乙腈(从2到70％)和0.1％三氟乙酸(TFA)的混合物。然后在Procise测序仪(AppliedBiosystem)上进行测序。通过该方法已经测序了三个峰，使得可能以唯一方式表征海特卡品。相应序列在本发明中确定为SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3。
通过检测SDS-PAGE凝胶分离的糖蛋白的糖化结构进行糖蛋白的分析。该检测系统是对“Periodic Acid-Schiff”方法的改良并导致品红色带的出现，证明是糖蛋白(Sigma)。对于如在实施例1中得到的海特卡品，得到在图4中再现的结果。
海特卡品的药理学性质人GHRH受体(hGHRH-R)的稳定转染从Kelly Mayo博士(Northwestern University，芝加哥，IL)得到以稳定方式表达人GHRH受体的人胚胎肾细胞HEK-293(Stuart Sealfon(MountSinai Medical School，纽约)博士开发的细胞系)。
细胞培养和膜制备上述用人GHRH受体稳定转染的HEK-293细胞培养于补加0.4mg/mlG418(Life technologies)且存在10％胎牛血清和4mM L-谷氨酰胺(Lifetechnologies)的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基，高葡萄糖含量，Life technologies提供)中。将细胞在含有50mM HEPES(pH 7.4)、5mM氯化镁(MgCl2)、2mM乙二醇-二(2-氨基-乙基)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)和50μg/ml杆菌肽的缓冲液A中匀浆并在相同缓冲液A中超声处理。将匀浆的细胞在4℃以39,000g离心10分钟，悬于缓冲液A中并4℃以40,000g再离心10分钟。通过Bradford’s技术定量总膜蛋白。然后将沉淀的膜保存在-80℃备用。
hGHRH-R的竞争结合试验将用人GHRH受体稳定转染的HEK-293细胞的膜用含有50mMHEPES(pH 7.4)、5mM MgCl2、2mM EGTA、50μg/ml杆菌肽和0.5％牛血清白蛋白(BSA)的反应缓冲液稀释到浓度100μg/ml。在浓度不断增加的海特卡品存在下将膜与0.05nM[125I]GHRH(1-44酰胺)以终体积200μl在23℃下孵育2小时。通过在预装0.1％聚氮丙啶的96孔GF/C过滤器上快速过滤中止反应。然后使用Packard 96孔过滤站(filtration station)用含有50mM Tris(pH 7.4)的洗涤缓冲液在4℃下洗涤过滤器3次。将如此干燥的过滤器浸入20μl闪烁混合物(Microscint O，Packard)中并进行Topcout计数(Packard)。存在100nM hGHRH时确定非特异性活性。所产生的hGHRH(0.001nM到100nM)剂量-应答曲线及所得结果包括在

图1中。
环AMP的竞争性形成将用人GHRH受体稳定转染的HEK-293细胞分布于48孔培养板中并培养3天。除去培养基并用含有250μl DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基，高葡萄糖含量；Life technologies提供)并存在0.5％BSA、0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)的培养基B代替并在37℃下预孵育5分钟。在预孵育期间末，额外检测海特卡品20分钟。观察到的浓度在图2中报告。通过加入100μl 0.1M HCl中止孵育并使用FlashPlate试剂盒(NewEngland Nuclear)分析等分试样的环AMP含量。
大鼠中GH的分析通过Spi-Bio(Spi-Bio，法国)开发的酶-免疫学试验在血样中测量大鼠(雄性Sprague Dawley)中GH的水平。通过递增剂量海特卡品的静脉内注射(只用载体、用1.3和10nmol海特卡品)，然后10分钟后，通过10μg(3nmol)的hGHRH的静脉内注射处理大鼠。注射hGHRH后10分钟，如上描述地测量血样中生长激素水平。所得结果在图5中表示。
抗肿瘤活性的测量在无胸腺小鼠的皮下注射人肿瘤细胞，具体地为H-69小细胞肺癌细胞以便第一次移植后约10天产生约80mm3的人肿瘤异种移植物。每两天通过增量(仅有载体、2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg)海特卡品的静脉内注射处理小鼠。在处理的全过程中每4天测量肿瘤体积。
附图简述图1是代表随着海特卡品的浓度增加，对人GHRH与人GHRH受体结合的抑制的图。
图2是代表随着海特卡品的浓度增加，存在10nM人GHRH下用人GHRH受体稳定转染的细胞中抑制环AMP的产生的图。
图3是SDS-PAGE蛋白质凝胶板的再现，其显示存在分子量为90.9kDa的海特卡品。
图4是SDS-PAGE蛋白质凝胶板的再现，其显示海特卡品是糖蛋白(图4B)。
图4以柱状图代表随着海特卡品的浓度增加，存在10μg人GHRH时大鼠中GH合成的抑制。
序列表<110>科学研究和应用咨询公司<120>具有抗癌特性的植物来源蛋白质海特卡品<130>RS 329 FR<140>FR 02/15560<141>2002-08-26<160>3<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>10<212>PRT<213>异叶毛果芸香(Pilocarpus Heterophyllus)<400>1Lys Leu Ile Gly Ala Arg Tyr Phe Asp Lys1 5 10<210>2<211>14<212>PRT<213>异叶毛果芸香<400>2Tyr Gly Glu Asp Ile Ile Val Gly Val Ile Asp Ser Gly Val1 5 10<210>3<211>6<212>PRT<213>异叶毛果芸香<400>3Pro Glu Ser Glu Ser Tyr1 权利要求
1.通过从植物异叶毛果芸香(pilocarpus heterophyllus)提取可以获得的一种经分离蛋白质的用途，用于制备治疗依赖生长因子GHRH而生长的癌症的药物，其中所述蛋白质的特征在于其分子量约为90.9kDa并且包含肽序列为SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3的片段；而且所述蛋白质能够以糖基化或非糖基化形式存在。
2.根据权利要求1的用途，其特征在于所述蛋白质已经从体外培养的植物异叶毛果芸香细胞的提取物得到。
3.根据权利要求1或2的用途，其特征在于依赖生长因子GHRH而生长的癌选自小细胞肺癌和乳腺癌。
4.根据权利要求3的用途，其特征在于依赖生长因子GHRH而生长的癌是小细胞肺癌。
5.根据权利要求3的用途，其特征在于依赖生长因子GHRH而生长的癌是乳腺癌。
全文摘要
本发明涉及结合人生长激素释放激素(hGHRH)的具有抗癌特性的植物来源蛋白质。所述蛋白质从异叶毛果芸香(pilocarpus heterophyllus)植物得到，尤其适于制备旨在治疗依赖GHRH生长因子而生长的癌症的药物，尤其用于制备旨在治疗包括小细胞肺癌和乳腺癌在内的癌症的药物。
文档编号C07K14/415GK1787828SQ03819974
公开日2006年6月14日 申请日期2003年8月25日 优先权日2002年8月26日
发明者E·费兰迪斯, 邓朋本, C·索耶, C·蒂里奥 申请人:科学研究和应用咨询公司