专利名称：制备酰化肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于酰化肽和蛋白质的方法。更具体的，本发明涉及一种用于将一个或多个酰基导入肽或蛋白质的方法。
背景技术：
业已有大量肽被证实用于医疗实践，所述肽可通过重组DNA技术在适当的宿主细胞中产生，或其可通过现有的肽合成技术合成性制备。但是，天然肽及其类似物倾向于显示高清除率，这对许多临床需要长期高血浆浓度的肽之症状是不可接受的。呈天然形式的具有高清除率的肽的例子有ACTH、促(肾上腺)皮质(激素)释放因子、加压素、降钙素、胰岛素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子-2、抑胃肽、生长激素释放因子、垂体腺苷酸环化酶激活肽、分泌素、肠抑胃素(enterogastrin)，生长抑素、促生长素、生长介素、甲状旁腺激素、血小板生成素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳素、甲状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽、后叶加压素、催产素、 阿片及其类似物、超氧化物歧化酶、干扰素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶和核糖核酸酶。
已发现肽和肽类似物的多种衍生化用于以有利的方向影响肽的清除速率。一种这样的衍生化是亲脂性酰基向治疗性肽的导入，引起相对于非酰化肽而言所期望之延长的作用曲线。因此，治疗性蛋白质不甚频繁的施用改善了患者对规定治疗的顺应性，且降低了待施用的肽的量。在WO98/08871(其中，尤其是公开了GLP-1及其类似物的酰化)、WO98/08872(其中，尤其是公开了GLP-2及其类似物的酰化)和WO99/43708(其中，尤其是公开了exendin及其类似物的酰化)中业已描述和证实。在肽和酰基之间的单或二肽间隔基，如天冬氨酸和谷氨酸被证实是期望的。
包括自由羧酸基的间隔基必须在酰化前被保护，随后去保护。EP1227107公开了人胰岛素ε-氨基的酰化。WO00/55119公开了用于酰化肽(如GLP-1)的方法和新的酰化剂。
为了使治疗性肽经济上有益，制备肽的成本以及肽的治疗性剂量非常重要。治疗性肽的制备的主要成本是需要将目标蛋白质与和目标蛋白质紧密相关的杂质(例如异构体，脱氨形式)等分离的纯化步骤。这些纯化步骤通常通过层析进行，提示需要昂贵的层析基质和溶剂以及总产率较低。
本发明的目的在于提供一种有效、经济的方法，用于通过α-氨基-α，ω-二羧酸间隔基向肽导入亲脂性基团。所述方法更具有特异性，因此有较高的产率且形成较少的密切相关杂质。实现了酰化肽生产成本的明显降低。对于最大化可接受治疗病人的数目以及对于利用通过比皮下注射具有较低生物利用度的其他递送方案(例如经皮和肺递送)的有利性而言，非常希望不甚昂贵的酰化肽。
发明概述本发明提供了一种酰化肽或蛋白质的一个或多个氨基的方法，所述方法包括步骤a)在碱性条件下水性混合物中将具有至少一个自由氨基的肽与通式I的酰化剂反应 其中n是0-8；R1是COOR4；
R2是亲脂性部分；R3与R3所连接的羧基一起称为活性酯或活性N-羟基酰亚胺酯；且R4选自氢、C1-12-烷基和苄基；b)如果R4不是氢，在碱性条件下皂化酰化肽的酯基(COOR4)；c)分离N-酰化肽，其特征在于，所述步骤a)中的水性混合物中含有低于10％w/w的非质子极性溶剂。
在所述方法的一个实施方案中，所述步骤a)中的反应在含有低于8％w/w，优选低于5％w/w，甚至更优选低于3％w/w的非质子极性溶剂的水性混合物中进行。
在所述方法的另一实施方案中，酰化剂作为固体加入反应混合物中。
在所述方法的另一实施方案中，酰化剂作为通过加入酸稳定化的非质子性极性溶剂中的溶液加入反应混合物中。
发明详述肽和蛋白质本发明用于向任一肽(或蛋白质)导入亲脂性酰基以降低体内清除率。所述肽和蛋白质的实例有ACTH、促(肾上腺)皮质(激素)释放因子、加压素、降钙素、exendin及其类似物、胰岛素及其类似物、胰高血糖素及其类似物、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其类似物、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)及其类似物、胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子-2、抑胃肽、生长激素释放因子、垂体腺苷酸环化酶激活肽、分泌素、肠抑胃素，生长抑素、促生长素、生长介素、甲状旁腺激素、血小板生成素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳素、甲状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽、后叶加压素、催产素、阿片及其类似物、超氧化物歧化酶、干扰素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶和核糖核酸酶。
应当理解肽(或蛋白质)应当带有至少一个自由的氨基，所述氨基是N-末端氨基或侧链氨基。肽或蛋白质可含有不是由遗传密码编码的氨基酸，如D-氨基酸、3-羟基脯氨酸、鸟氨酸和戊基甘氨酸。特别感兴趣的是赖氨酸和鸟氨酸氨基酸残基的氨基。本发明的方法特别与赖氨酸残基ε-氨基的N-酰化相关。也应当理解目标肽或蛋白质可含有两个或多个侧基氨基，其均可根据本发明被N-酰化。
本发明特别适于GLP-1及其类似物的酰化。可被根据本发明N-酰化的GLP-1及其类似物的实例是GLP-1和截短的类似物，如Arg26-GLP-1(7-37)；Arg34-GLP-1(7-37)；Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)；Arg34Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26Lys39-GLP-1(7-39)；Arg34Lys40-GLP-1(7-40)；Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26-GLP-1(7-37)；Gly8Arg34-GLP-1(7-37)；Gly8Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37)；Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys40-GLP-1(7-37)；Arg26Lys36-GLP-1(7-37)；Arg34Lys36-GLP-1(7-37)；Val8Arg22-GLP-1(7-37)；Met8Arg22-GLP-1(7-37)；Gly8His22-GLP-1(7-37)；Val8His22-GLP-1(7-37)；Met8His22-GLP-1(7-37)；His37-GLP-1(7-37)；Gly8-GLP-1(7-37)；Val8-GLP-1(7-37)；Met8-GLP-1(7-37)；Gly8Asp22-GLP-1(7-37)；Val8Asp22-GLP-1(7-37)；Met8Asp22-GLP-1(7-37)；Gly8Glu22-GLP-1(7-37)；Val8Glu22-GLP-1(7-37)；Met8Glu22-GLp-1(7-37)；Gly8Lys22-GLP-1(7-37)；Val8Lys22-GLP-1(7-37)；Met8Lys22-GLP-1(7-37)；Gly8Arg22-GLP-1(7-37)；Val8Lys22His37-GLP-1(7-37)；Gly8Glu22His37-GLP-1(7-37)；Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)；Met8Glu22His37-GLP-1(7-37)；Gly8Lys22His37-GLP-1(7-37)；Met8Lys22His37-GLP-1(7-37)；Gly8Arg22His37-GLP-1(7-37)；Val8Arg22His37-GLP-1(7-37)；Met8Arg22His37-GLP-1(7-37)；Gly8His22His37-GLP-1(7-37)；Val8His22His37-GLP-1(7-37)；Met8His22His37-GLP-1(7-37)；Gly8His37-GLP-1(7-37)；Val8His37-GLP-1(7-37)；Met8His37-GLP-1(7-37)；Gly8Asp22His37-GLP-1(7-37)；Val8Asp22His37-GLP-1(7-37)；Met8Asp22His37-GLP-1(7-37)；Arg26-GLP-1(7-36)-酰胺；Arg34-GLP-1(7-36)-酰胺；Lys36-GLP-1(7-36)-酰胺；Arg26，34Lys36-GLP-1(7-36)-酰胺；Arg26，34-GLP-1(7-36)-酰胺；Arg26，34Lys40-GLP-1(7-36)-酰胺；Arg26Lys36-GLP-1(7-36)-酰胺；Arg34Lys36-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8Glu22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8His22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8His22-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8His22-GLP-1(7-36)-酰胺；His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8Arg22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8Arg22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8Asp22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8Asp22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8Asp22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8Glu22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8Glu22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8Lys22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8Lys22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8Lys22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Gly8Arg22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Val8His22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；Met8His22His37-GLP-1(7-36)-酰胺；及其衍生物。
所述GLP-1类似物及其截短的类似物中的每一种均构成本发明的另外的实施方案。
本发明也特别适于GLP-2及其类似物的酰化。可被根据本发明N-酰化的GLP-2及其类似物的实例是GLP-2和截短的类似物，如Lys20GLP-2(1-33)；Lys20Arg30GLP-2(1-33)；Arg30Lys34GLP-2(1-34)；Arg30Lys35GLP-2(1-35)；Arg30，35Lys20GLP-2(1-35)；和Arg35GLP-2(1-35)。所述GLP-2类似物及其截短的类似物中的每一种均构成本发明的另外的实施方案。
本发明也适于exendin-3和exendin-4及其类似物的酰化。根据本发明可被N-酰化的exendin类似物的实例公开于例如WO99/43708。所述exendin类似物及其截短的类似物中的每一种均构成本发明的另外的实施方案。
本发明也特别适于胰岛素及其类似物的酰化。根据本发明可被N-酰化的胰岛素及其类似物的实例是人胰岛素和des(B30)-人胰岛素。
在本发明的又一实施方案中，N-酰化发生在赖氨酸残基的ε-氨基。
酰化剂根据本发明的方法，具有至少一个自由氨基的肽(或蛋白质)与通式I的酰化剂反应
式I中的整数n优选为0-8，相应于例如天冬氨酸、谷氨酸等特别是0-6。优选的，n是0-4，如0-2，例如0(天冬氨酸)或1(谷氨酸)。上述整数的每一个及其范围构成本发明的其他实施方案。
式I中的R1代表自由酸基(COOH)或酯基(COOR4)。当R1为酯基时，R4选自在碱性条件下通过水解可被移除的基团(作为相应的醇)。所述基团的实例为C1-12-烷基，例如甲基、乙基、丙-1-基、丙-2-基、丁-1-基、丁-2-基、2-甲基-丙-1-基、2-甲基-丙-2-基(叔丁基)、己-1-基等和苄基。所述基团的每一个均构成本发明的其他实施方案。
式I中的R2代表待掺入肽或蛋白质的亲脂性部分。所述亲脂性部分通常选自C3-39-烷基、C3-39-链烯基、C3-39-链二烯基和甾族残基。C3-39-烷基的具体实例为庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基和十九烷基。所述亲脂性部分的每一个均构成本发明的其他实施方案。
所述亲脂性取代基(或部分)的特征在于在20℃下具有水中的溶解度范围从约0.1mg/100ml水-约250mg/100ml水，优选的范围从约0.3mg/100ml水-约75mg/100ml水。例如，辛酸(C8)在20℃具有水中溶解度68mg/100ml，癸酸(C10)在20℃具有水中溶解度15mg/100ml，十八酸(C18)在20℃具有水中溶解度0.3mg/100ml。所述亲脂性取代基范围中的每一个均构成本发明的其他实施方案。
术语″C3-39-烷基″，″C3-39-链烯基″和″C3-39-链二烯基″意在包括直链和分支的，优选直链，分别为饱和的、单不饱和的和双不饱和的3-39个碳原子的烃基。C3-39-烷基的具体实例为为庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基和十九烷基。
如此处所用，术语″甾族残基″是指一种亲脂基，其与和R2连接的羰基一起衍生自甾族(steroide)羧酸，即三、四和五环、完全饱和或部分未饱和的C16-36-烃。所述基团R2-C(＝O)-的实例为石胆酰基(lithocholoyl)、脱氧胆酰基(deoxycholoyl)和胆酰基(choloyl)。
在上述亲脂性基团中，C7-25-烷基、C7-25-链烯基、C7-25-链二烯基和甾族残基尤其相关。特别感兴趣的实例是庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、石胆酰基、脱氧胆酰基和胆酰基。所述亲脂性基团中的每一个均构成本发明的其他实施方案。
式I中的R3与R3所连接的羧基一起称为活性酯，或活性N-羟基酰亚胺酯。所述酯中的每一个均构成本发明的其他实施方案。活性酯和活性N-羟基酰亚胺酯均为有机化学领域(特别是肽化学)公知，作为用于氨基、巯基和羟基的酰化中的官能团。在本发明中，术语″活性酯或活性N-羟基酰亚胺酯″是指适于酰化胺(优选是伯胺)的羧基基团的酯官能化形式。因此，应当理解对伯胺酰化的选择性比对羟基和巯基的酰化选择性更优选。活性N-羟基酰亚胺酯尤其优选。
活性酯的实例是1-羟基苯并三唑酯和衍生物。已知许多用于形成这类羧酸的活性酯的高效试剂，例如2-(1H-苯并三唑-1基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓四氟硼酸。所述活性酯通常在碱，例如有机碱(如三烷胺)存在下原位形成。
活性N-羟基酰亚胺酯的酰亚胺部分的实例在EP 0511600 A2，第3-7页有具体描述。其中特别感兴趣的酰亚胺部分的实例是琥珀酰亚胺、邻苯二甲酰亚胺等。所述酰亚胺部分的每一个均构成本发明的其他实施方案。
式I的活性N-羟基酰亚胺酯可如WO00/55119和WO98/02460所述制备。
在其中式I的酰化剂被用作自由α-羧酸(R4＝氢)时，其中R4是一个可被选择性除去的基团之式I化合物被转化成相应的其中R4是氢的化合物。羧酸保护基团可以是能够被催化氢化移除的苄基或能够被选择性除去的烯丙基。苄基保护基团可以通过催化氢化在非质子极性溶剂(例如丙酮)中室温下利用披钯木炭和氢被去除。反应可以在氢气氛(通常0.1-10atm)的密闭容器中剧烈搅拌条件下进行。根据钯催化剂的质量，反应一般在0.5-12小时内完成。可采用常规技术。
反应条件式I的酰化剂与肽或蛋白质之间的反应在碱性条件下在含有低于10％w/w非质子极性溶剂的水性溶液中进行。
在本发明的一个实施方案中，步骤a)中的反应在含有0％w/w-10％w/w非质子极性溶剂的水性溶液中进行。
在本发明的一个实施方案中，步骤a)中的反应在含有1％w/w-10％w/w非质子极性溶剂的水性溶液中进行。
在本发明的一个实施方案中，步骤a)中的反应在含有1％w/w-8％w/w非质子极性溶剂的水性溶液中进行。
式I的酰化剂一般以相对于待酰化的肽之氨基数目略微过量的量使用。根据肽中的氨基数目，一般是1∶1-1∶20，优选地1∶1.2-1∶5过量的酰化剂比例。酰化剂可以作为固体加入反应混合物，或其可以作为溶液加入反应混合物。当作为溶液加入酰化剂时，其溶解在非质子极性溶剂中，且优选地通过加入酸稳定化。通常，用于稳定化的酸是无机酸，例如硫酸。
应当知晓，根据所用酰化剂的量和反应条件，肽可以被完全N-酰化或仅仅部分N-酰化。优选的，N-酰化反应基本上是化学计量式的。
非质子极性溶剂是具有适当的高介电常数的溶剂，其不含有酸性氢(见，例如Morrison和Boyd，Organic Chemistry，5thed.p 229)。通常非质子极性溶剂选自无水四氢呋喃(THF)、无水二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、二氯甲烷、二甲亚砜(DMSO)，二噁烷、二甲基乙酰胺和N-甲基-2-吡咯烷酮及其混合物，其中二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺和N-甲基-2-吡咯烷酮是优选的，N-甲基-2-吡咯烷酮是特别优选的。
温度一般保持在-10-50℃的范围。
重要的是溶剂混合物的pH值在范围7-14，例如9-13，优选的在范围10-12，以顺利进行反应。当溶剂混合物的pH值在范围10-12时，就产率和纯度的结果而言一般是最优的。通过加入碱金属氢氧化物，例如氢氧化钠和氢氧化钾，和/或有机碱例如三烷基胺(如三乙胺，N，N-二异丙基乙基胺等)获得期望的pH值。也可以有利地加入适于在反应起始前保持pH在起始值附近的缓冲液。可用于所述目的的缓冲液的实例是磷酸缓冲液、硼酸缓冲液等。
作为一个典型的实例，利用摩尔比为1∶1-1∶5的蛋白质和式I酰化剂进行步骤(a)中的反应。一般，在-10-30℃(如0-25℃)的水中预先溶解所述肽，使用碱金属氢氧化物(例如，氢氧化钠或氢氧化钾)调节pH至适当的水平。pH值可利用酸(如乙酸)和碱(如三烷基胺)进一步调节，但是温度优选的在上述范围内。或者，将肽直接预先溶解在适当量的相关酸或碱的水性溶液中。随后作为固体或作为在非质子极性溶剂中的溶液加入酰化剂。反应一般允许进行完全(可用HPLC监测)，一般在0.2-4小时，如0.2-1小时实现，然后加入水和酸(如乙酸)至pH 6.5-9.0。产物一般通过HPLC分离和纯化，或通过等电点pH沉淀，或在纯化前水解(步骤(b))。
当使用其中R4是氢的式I酰化剂时，直接获得带有亲脂性部分和自由羧基的N-酰化肽或蛋白质。因此，其中R4是氢的变化代表本发明所述方法的优选实施方案。
或者，即当基团R4是C1-12-烷基或苄基，N-酰化肽酯(或蛋白质酯)在碱性条件下被皂化，以获得N-酰化肽或N-酰化蛋白质。皂化一般地在0.01-4.0M碱金属氢氧化物溶液(例如氢氧化钠或氢氧化钾)中实施。溶液的pH一般为10-14。一般允许反应在0-40℃(例如室温左右)的温度下进行0.1-12小时，优选0.5-4小时。反应后，通过在等电点pH沉淀和/或制备性HPLC纯化产物。因此，其中R4是C1-12-烷基或苄基的变化代表本发明所述方法的其他优选的实施方案。
在本方法的另一实施方案中，酰化剂作为固体加入反应混合物中。
在本方法的另一实施方案中，步骤a)中的所述反应在含有0％w/w-8％w/w非质子极性溶剂，优选0％w/w-5％w/w非质子极性溶剂，甚至更优选0％w/w-3％w/w非质子极性溶剂的水性混合物中进行。
在本方法的另一实施方案中，步骤a)中的所述反应在存在非质子极性溶剂的条件下进行，所述非质子极性溶剂选自N-甲基-2-吡咯烷酮、四氢呋喃和二甲基亚砜。
在本方法的另一实施方案中，所有的非质子有机溶剂作为酰化剂的溶剂加入反应混合物中。
在本方法的另一实施方案中，酰化剂作为通过加入酸稳定化的溶液加入反应混合物中。
在本方法的另一实施方案中，所述酸以0.01％w/w-1％w/w的浓度，优选以0.05％w/w-0.5％w/w的浓度加入非质子极性溶剂。
在本方法的另一实施方案中，所述酸选自硫酸、甲磺酸和三氟乙酸。
在本方法的另一实施方案中，步骤a)中的反应在不存在非质子极性溶剂的条件下发生。
在本方法的另一实施方案中，式I中的R4是氢。
在本方法的另一实施方案中，R4选自C1-8-烷基和苄基。
在本方法的另一实施方案中，R3与R3所连接的羧基一起称为活性N-羟基酰亚胺酯。
在本方法的另一实施方案中，酰化肽酯在pH值范围10-14，优选在pH范围9-13下被皂化。
在本方法的另一实施方案中，酰化肽酯在pH值范围9-14，例如pH范围10-13下被皂化。
在本方法的另一实施方案中，步骤a)中反应混合物的pH从pH9-pH13，优选从pH10-pH12，或更优选的从pH11.0-pH11.5。
在本方法的另一实施方案中，步骤a)中的反应混合物包含适于在反应过程中维持基本上恒定的pH的缓冲液。在本方法的一个实施方案中，所述缓冲液是磷酸缓冲液、硼酸缓冲液或其混合物。
在本方法的另一实施方案中，步骤a)中的反应混合物的温度范围为0-50℃，优选为5-40℃，更优选为10-30℃。
在本方法的另一实施方案中，R2选自C3-39-烷基，C3-39-链烯基、C3-39-链二烯基和甾族残基。
在本方法的另一实施方案中，R2-C(＝O)-选自石胆酰基和十六烷酰基。
在本方法的另一实施方案中，所述肽用作步骤a)的起始材料，具有如RP-HPLC确定的至少80％，至少90％，至少93％，至少95％或至少97％的肽纯度。
在本方法的另一实施方案中，所述肽选自GLP-1、exendin-4、GLP-2，胰高血糖素、胰岛素和任一前述的类似物和衍生物。
在本方法的另一实施方案中，所述肽是GLP-1激动剂。
在本方法的另一实施方案中，所述肽选自exendin-3，exendin-4，Arg34-GLP-1(7-37)，Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8-GLP-1(7-37)，Val8-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8-GLP-1(7-37)，Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Asp22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺，Val8Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Lys22-GLP-1(7-37)，Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Arg22-GLP-1(7-37)，Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8His22-GLP-1(7-37)，des(B30)人胰岛素及其衍生物。
在本方法的另一实施方案中，所述肽选自Val8Trp19Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37)，Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37)，Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)，Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)及其类似物。
在本方法的另一实施方案中，所述肽选自HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2(ZP-10)及其类似物。
在本方法的另一实施方案中，所述肽不是胰岛素肽，即其不是胰岛素或其类似物。在本方法的另一实施方案中，所述肽仅包含一条多肽链。在所述方法的另一实施方案中，所述肽包含两条多肽链，其通过至少一个二硫键共价连接。
本发明的另一方面是用于制备如下肽衍生物的酰化方法的用途，所述肽衍生物选自Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)和LysB29(Nε-十四烷酰基)des(B30)人胰岛素和LysB29(Nε[Nα-石胆酰基-Glu-OH])des(B30)人胰岛素。
实施例如WO 00/55119所述进行酰化剂的制备。
在实施例中通过柱层析获得产物的最终纯化。
实施例1在酵母(酿酒酵母(S.cerevisiae))中通过常规重组DNA技术，例如WO 98/08871所述表达Arg34GLP-1(7-37)。发酵液中的Arg34GLP-1(7-37)再通过常规反相层析和随后在肽的等电点pH(即在pH 5.4)沉淀进行纯化。通过离心和冷冻分离沉淀。
将Arg34GLP-17-37(1.47g冷冻等电沉淀肽材料，约0.10mmol)在10-15℃溶于0.1mol/kg三乙基胺(23ml)。溶液的pH调整为11.6。加入N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羟基琥珀酰亚胺酯(63.7mg，0.13mmol)。室温下20分钟后加入水(42ml)，通过加入1.0M乙酸调整pH至8.0。
产率根据分析型RP-HPLC，反应混合物显示含有84％(面积)的Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37和0.5％(面积)的Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。
实施例2Arg34GLP-1(7-37)在酵母(酿酒酵母)中通过常规重组DNA技术表达，例如WO 98/08871中所述。发酵液中的Arg34GLP-1(7-37)然后通过常规反相层析和随后在肽的等电pH，即在pH5.4下沉淀而纯化。通过离心和冷冻分离沉淀。
将Arg34GLP-17-37(1.57g冷冻等电沉淀肽材料，约0.14mmol)在10-15℃溶于0.1mol/kg三乙基胺(23ml)。通过加入三乙胺将溶液的pH调整为11.5。加入溶于N-甲基-2-吡咯烷酮(含有0.105％w/w 1MH2SO4)的1.7ml N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羟基琥珀酰亚胺酯(92.1mg，0.19mmol)。室温下20分钟后加入水(42ml)，通过加入1.0M乙酸调整pH至8.0。
产率根据分析型RP-HPLC，反应混合物显示含有83％(面积)的Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37和0.4％(面积)的Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。
实施例3Arg34GLP-1(7-37)在酵母(酿酒酵母)中通过常规重组DNA技术表达，例如WO 98/08871中所述。发酵液中的Arg34GLP-1(7-37)然后通过常规反相层析和随后在肽的等电pH，即在pH5.4下沉淀而纯化。通过离心和冷冻分离沉淀。
将Arg34GLP-17-37(1.53g冷冻等电沉淀肽材料，约0.13mmol)在室温下溶于0.05mol/kg三乙胺(25ml)。溶液的pH为10.9。加入溶于N-甲基-2-吡咯烷酮(不含有H2SO4)的1.8ml N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羟基琥珀酰亚胺酯(94.2mg，0.19mmol)。室温下30分钟后加入水(48ml)，通过加入1.0M乙酸调整pH至8.0。
产率根据分析型RP-HPLC，反应混合物显示含有75％(面积)的Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37和4.0％(面积)的Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。
实施例4-对比实施例，非质子极性溶剂含量＞10％w/wArg34GLP-1(7-37)在酵母(酿酒酵母)中通过常规重组DNA技术表达，例如WO 98/08871中所述。发酵液中的Arg34GLP-1(7-37)然后通过常规反相层析和随后在肽的等电pH，即在pH5.4下沉淀而纯化。通过离心和冷冻分离沉淀。
将Arg34GLP-17-37(1.57g冷冻等电沉淀肽材料，约0.14mmol)在10-15℃溶于0.1mol/kg三乙基胺(23ml)。加入N-甲基-2-吡咯烷酮(6.8ml)并通过加入三乙胺将溶液的pH调整为11.5。然后加入溶于1.7ml N-甲基-2-吡咯烷酮(含有0.105％w/w 1M H2SO4)的N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羟基琥珀酰亚胺酯(92.1mg，0.19mmol)。室温下20分钟后加入水(54ml)，通过加入1.0M乙酸调整pH至8.0。
产率根据分析型RP-HPLC，反应混合物显示含有87％(面积)的Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37和0.5％(面积)的Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。
实施例5-对比实施例，非质子极性溶剂含量＞10％w/wArg34GLP-1(7-37)在酵母(酿酒酵母)中通过常规重组DNA技术表达，例如WO 98/08871中所述。发酵液中的Arg34GLP-1(7-37)然后通过常规反相层析和随后在肽的等电pH，即在pH5.4下沉淀而纯化。通过离心和冷冻分离沉淀。
将Arg34GLP-17-37(1.51g冷冻等电沉淀肽材料，约0.13mmol)在10-15℃溶于0.1mol/kg三乙基胺(20ml)和N-甲基-2-吡咯烷酮(100ml)。加入溶于1.4ml N-甲基-2-吡咯烷酮(含有0.105％w/w 1M H2SO4)的N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羟基琥珀酰亚胺酯(74mg，0.15mmol)。室温下45分钟后加入水(206ml)，通过加入1.0M乙酸调整pH至8.0。
产率根据分析型RP-HPLC，反应混合物显示含有57％(面积)的Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37和14％(面积)的Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。
实施例6表1中概述了实施例1-5的实验中用于酰化Arg34-GLP-17-37的实验条件，以及列出了所得杂质Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37(简称为α-glu)的含量。不加入H2SO4作为稳定剂时，显然较低浓度的非质子极性溶剂在降低α-glu杂质的量上有效。当加入稳定剂时，在明显较高浓度的非质子极性溶剂，即高于28％w/w开始形成明显量的α-glu杂质。
表1.当酰化GLP-1肽时非质子极性溶剂在反应混合物中的含量和所得杂质Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37(α-glu)的级分。(数据来自实施例1-5)
实施例7钠结晶的des(B30)-人胰岛素(通过等电点沉淀分离的1.74g冷冻肽材料，约0.088mmol)室温下溶于0.1mol/kg三乙胺(10.85ml)。溶液的pH为10.9。然后，加入溶于N-甲基-2-吡咯烷酮(1.25ml)的甲基(2S)-5-[(2，5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-2-{[(3a，5b)-3-羟基-9-甲基-24-氧代胆-24-基]氨基}-5-氧代戊酸酯(55.1mg，0.089mmol)。室温下30分钟后加入水(5℃，85ml)。
产率根据分析型RP-HPLC，反应混合物显示含有34％(面积)的Nε-(石胆酰基-γ-谷氨酰基)-LysB29-des(B30)-人胰岛素。
实施例8.
Arg34GLP-1(7-37)在酵母(酿酒酵母)中通过常规重组DNA技术表达，例如WO 98/08871中所述。发酵液中的Arg34GLP-1(7-37)然后通过常规反相层析和随后在肽的等电pH，即在pH5.4下沉淀而纯化。通过离心和冷冻分离沉淀。
将含有Arg34GLP-1(7-37)(5.70g冷冻沉淀肽材料，约0.38mmol)的等电沉淀在15℃溶于0.1M二水合磷酸氢二钠溶液(170mL，用1MNaOH将pH调至11.35)。通过加入1M NaOH将溶液pH再调至11.4。在8分钟内逐滴加入3mL溶于N-甲基-吡咯烷酮(含有0.105％w/w 1M H2SO4)的N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羟基琥珀酰亚胺酯(248.1mg，0.51mmol)。
在15℃下21.5小时的反应过程中取出(drawn out)样本，加入含有1mg/mL甘氨酸的0.1M二水合磷酸氢二钠溶液，pH 7.5。用水(300ml)稀释终反应混合物，通过加入冰醋酸调整pH至8.0。
产率根据分析型RP-HPLC，反应混合物显示含有78-80％(面积)的Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37和0.24-1.67％(面积)的Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。
表2.Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37(γ-Glu)和Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37(α-Glu)的量对反应时间(数据来自实施例8)
权利要求
1.一种制备N-酰化肽的方法，所述方法包括下列步骤a)在碱性条件下于水性混合物中将具有至少一个自由氨基的肽与通式I的酰化剂反应 其中n是0-8；R1是COOR4；R2是亲脂性部分；R3与R3所连接的羧基一起被称为活性酯或活性N-羟基酰亚胺酯；且R4选自氢、C1-12-烷基和苄基；b)如果R4不是氢，在碱性条件下皂化酰化肽的酯基(COOR4)；c)分离N-酰化肽，其特征在于，所述步骤a)中的水性混合物中含有低于10％w/w的非质子极性溶剂。
2.权利要求1的方法，其中所述步骤a)中的反应在含有低于8％w/w非质子极性溶剂，优选低于5％w/w非质子极性溶剂，甚至更优选低于3％w/w非质子极性溶剂的水性混合物中进行。
3.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述酰化剂作为固体加入反应混合物。
4.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述步骤a)中的反应在存在非质子极性溶剂的条件下发生，且所述非质子极性溶剂选自N-甲基-2-吡咯烷酮、四氢呋喃和二甲基亚砜.
5.权利要求4的方法，其中所有的非质子有机溶剂作为酰化剂的溶剂加入反应混合物。
6.权利要求4-5中任一项的方法，其中酰化剂作为通过加入酸被稳定化的溶液形式的加入反应混合物。
7.权利要求6的方法，其中所述酸以浓度0.01％w/w-1％w/w，优选以浓度0.05％w/w-0.5％w/w加入非质子极性溶剂。
8.权利要求6-7中任一项的方法，其中所述酸选自硫酸、甲磺酸和三氟乙酸。
9.权利要求1-3中任一项的方法，其中步骤a)中的反应在不存在非质子极性溶剂的条件下进行。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中R4是氢。
11.权利要求1-9中任一项的方法，其中R4选自C1-8-烷基和苄基。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中R3与R3所连接的羧基一起被称为活性N-羟基酰亚胺酯。
13.权利要求1-9中任一项的方法，其中酰化肽酯在pH值范围10-14，优选pH范围9-13中被皂化。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中步骤a)中的反应混合物的pH为pH9-pH13，优选pH10-pH12，或更优选pH11.0-pH11.5。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中步骤a)中的反应混合物的温度范围为0-50℃，优选5-40℃，且更优选10-30℃。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中R2选自C3-39-烷基、C3-39-链烯基、C3-39-链二烯基和甾族残基。
17.权利要求16的方法，其中R2-C(＝O)-选自石胆酰基和十六烷酰基。
18.前述权利要求中任一项的方法，其中用作步骤a)的起始物的所述肽具有以RP-HPLC测定的至少80％、至少90％、至少93％、至少95％或至少97％的肽纯度。
19.前述权利要求中任一项的方法，其中所述肽选自GLP-1、exendin-4、GLP-2、胰高血糖素、胰岛素，前述任一项的类似物和衍生物。
20.前述权利要求中任一项的方法，其中所述肽是GLP-1激动剂。
21.前述权利要求中任一项的方法，其中所述肽选自exendin-3exendin-4、Arg34-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8-GLP-1(7-37)、Val8-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8-GLP-1(7-37)、Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Asp22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Lys22-GLP-1(7-37)、Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Arg22-GLP-1(7-37)、Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8His22-GLP-1(7-37)、des(B30)人胰岛素及其类似物。
22.权利要求19的方法，其中所述肽选自HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2(ZP-10)及其类似物。
23.权利要求1-14任一项的方法，其中步骤a)中的反应混合物含有适于在反应过程中维持基本上恒定pH的缓冲液。
24.前述权利要求中任一项的方法，其中所述肽不是胰岛素肽，即其不是胰岛素或其类似物。
全文摘要
本发明提供了一种用于酰化肽的一个或多个氨基的方法，其中所述酰化反应在含有低于10％w/w非质子极性溶剂的水性混合物中进行。
文档编号C07K1/107GK1684941SQ03823008
公开日2005年10月19日 申请日期2003年9月25日 优先权日2002年9月25日
发明者D·L·丁韦伯, I·H·延森, L·B·汉森 申请人:诺沃娜第克公司