专利名称：新mhcⅱ相关肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及结合人MHC II类HLA-DR分子的新肿瘤抗原肽的鉴别。本发明涉及树突细胞对这样的肿瘤抗原肽在与肿瘤细胞结合后的呈递。而且，本发明还涉及这样的肿瘤抗原肽用于疫苗接种抵抗肿瘤和用于诊断对肿瘤的免疫应答的应用。
通过表达肿瘤特异性蛋白可将肿瘤细胞与健康细胞区别开。这些在肿瘤中新表达的、突变的或异常表达的蛋白可以用作诊断标记或用于疗法。
一类有效地用作诊断和治疗工具的标记是结合主要组织相容性复合体(MHC)分子的蛋白片段或肽。在人类中，MHC分子被定义为人白细胞抗原(HLA)。HLA相关肽较短，包含9-25个氨基酸(Kropshofer，H. & Vogt，A.B.，Immunol Today 18(1997)77-82)。它们对于起动适应性免疫反应是必不可少的，因为它们激活特异化的免疫细胞，即T淋巴细胞(简称T细胞)。如果T细胞不能识别出来自肿瘤特异性抗原的肽，则会造成免疫逃避和肿瘤的渐进性生长(Boon，T.等，Ann Rev Immunol.12(1994)337-265)。
关于它们的功能，可以区别开两类MHC-肽复合体(Germain，R.，Cell76(1994)287-299)(i)MHC I类-肽复合体可以由几乎所有的有核细胞表达，以吸引CD8+细胞毒性T细胞，它会溶解肿瘤细胞和受感染细胞，(ii)MHC II类-肽复合体仅在所谓的抗原呈递细胞(APC)上组成型表达，例如B淋巴细胞、巨嗜细胞或树突细胞(DC)。具体地，DC具有准备CD4+T辅助细胞的能力(Banchereau，J.和Steinman，R.M.，Nature 392(1998)245-254)。而且，DC会被允许最佳地激活细胞毒性CD8+T细胞这是通过它们的MHC II类-肽复合体与CD4+T辅助细胞的预先相互作用来完成的(Ridge，T.等，Nature 393(1998)474-478)。这样，MHC II类分子呈递到DC上的肽在涉及T细胞驱动的免疫反应的疾病的发病机理中、从而也在诱导抗肿瘤的免疫中起主导作用。
DC在启动免疫反应中的明显作用已经促使人们尝试将DC开发作为疫苗，特别是抗癌症的疫苗(Dallal，R.M.和Lotze，M.T.，Curr OpinionImmunol 12(2000)583-588)。一项重要的进展是发明了用于体外分化不同来源(包括外周血，例如粘附的单核细胞或来自骨髓的CD34+干细胞前体)的DC的技术。体外分化和活化的DC在与来自肿瘤细胞的抗原共培养或者采用类似技术以后，可以用于癌症患者的疫苗接种。实验性的树突细胞疫苗接种研究已经成功地诱导了特异性的抗癌反应，包括临床反应(Timmermann，J.M.和Levy，R.，Ann Rev Medicine 50(1999)507-529；Nestle，F.O.，等，Nature Medicine 7(2001)761-765)。
基于鉴别肿瘤抗原的疫苗包括用裸DNA准备的DC、重组的腺病毒或痘苗病毒、从各肿瘤细胞纯化出的天然或重组蛋白或合成的肿瘤肽类似物。用抗原性肿瘤肽而不是遗传的或蛋白前体来刺激DC的优点是，肽可以直接装载在DC的MHC分子上，而无需其它加工。
在过去的十年中，已经鉴别出了许多源自肿瘤标记蛋白且被MHC I类分子限制的肽。它们被分成4类睾丸癌抗原，黑素瘤-黑素细胞分化抗原，在肿瘤上过表达的突变的抗原和未突变的共有抗原。在几个临床实验性的疫苗接种研究中，用黑素瘤肽的混合物刺激来自黑素瘤患者的DC，该肽至今仍然受到HLA I类的排他性的限制(Nestle，F.O.等，NatureMedicine 4(1998)328-332；Thurner，B.等，J Exp Med 190(1999)1669-1678)。但是，越来越多的证据表明，通过补充MHC II类限制的协助T细胞可以增加抗肿瘤的细胞毒性T细胞反应的功效和寿命。因此，预计一种改良的疫苗接种方法是组合使用除MHC I类抗原之外的MHC II类相关的肿瘤肽。
对CD4+T辅助细胞识别的MHC II类-限制的癌症抗原的知识落后于对I类-限制的抗原的鉴别(Wang，R.-F.，Trends in Immunol 22(2001)269-276)。一个原因是，将来自肿瘤细胞的cDNA库转染进靶细胞后使用抗肿瘤T细胞鉴别合适的转染子和抗原性的表位(一种成功地应用于MHCI类分子的方法)是无效的，因为编码的蛋白不能运送到APC中的MHC II类途径。
一种创新的替代方案是使用肿瘤细胞刺激的自体DC或特别的肿瘤标记蛋白，并对DC上的与MHC相关的肽进行测序。但是，该方案仅仅已经用于抗自体肿瘤的疫苗接种，迄今为止仍然没有用于鉴别候选的肿瘤抗原，因为DC是在体外不分裂的细胞，且仅仅能从外周血或骨髓得到非常小的量。而且，肽的纯化和测序技术到目前为止仍不太敏感，通过该方法或任何其它的将注意力放在人体产生的肽的方法都不能直接地鉴别出与疾病相关的肽。
因此，通过提供新的天然加工的与MHC II类相关的候选肿瘤抗原肽能够解决因为缺乏MHC II类限制的肿瘤抗原肽所导致的问题。
本发明提供了新的天然加工的抗原性肽，它们是黑素瘤和其它肿瘤中的候选的肿瘤抗原。这些抗原性肽由人MHC II类HLA-DR分子呈递。它们源自翻译因子eIF-4A、IFN-γ-可诱导的蛋白p78、细胞骨架蛋白波形蛋白和结合铁的表面蛋白黑转铁蛋白(melanotransferrin)。本发明的抗原性肽可以用作各肿瘤诊断中的标记和治疗中的抗肿瘤疫苗。
图1是说明使用的技术的简图在抗原摄入和抗原加工的最佳条件下，使最特异化抗原呈递细胞(APC)的树突细胞(DC)与抗原源(例如坏死的黑素瘤细胞)接触。作为对照，在没有黑素瘤细胞抗原的情况下，在相同的条件下培养DC。在成熟后，纯化加载有DC抗原的MHC II类分子，分离并鉴别各MHC II类相关抗原性肽。
图2A含有从成熟的树突细胞分离出的HLA-DR结合肽的所有组成成分的代表性的MALDI-质谱分析，所述的树突细胞已经用坏死的黑素瘤细胞系UKRV-Mel-15a模拟处理(上区)或刺激(下区)。标记的是肽峰(M+H+)＝1820.6，它在与黑素瘤细胞接触的图谱中很明显。
图2B显示了具有实验谱(M+H+)＝1820.6的肽的对应的MALDI-PSD断裂谱。该肽由坏死的黑素瘤细胞诱导(图2A)。经数据库检索鉴别出了波形蛋白表位波形蛋白(202-217)(参见表1)。
图2C显示了具有实验谱(M+H+)＝1820.6的肽的离子阱MS-MS图谱。该肽由坏死的黑素瘤细胞诱导(图2A)。经数据库检索鉴别出了波形蛋白表位波形蛋白(202-217)(参见表1)。
图3A-C显示了在各种HLA-DR等位产物的情况下来自波形蛋白和黑转铁蛋白的候选肿瘤抗原的不同结合力。体外的肽结合实验分析指示的肽，其中纯化的HLA-DR分子和生物素化的HA(307-319)肽作为报道物。作为亲和力测量，检测了通过竞争使生物素化的流感病毒血凝素HA(307-319)肽结合减少50％所需的肽浓度(IC50)。得到的倒数1/IC50直接与肽亲和力相关。为了进行对比，已经包括了来自流感病毒血凝素的HA(307-319)、已知能混杂地结合几种HLA-DR等位基因的肿瘤抗原NY-ESO(115-132)(Zarour HM等，Cancer Research 2002；62，213-218)和CDC-27(768-782)(参见表2)。在HLA-DR1(图3A)、HLA-DR4(图3B)和HLA-DR5(图3C)的情况下，检测了IC50值。
图4显示了产生的T细胞系对鉴别出的源自黑转铁蛋白的表位的特异性反应。用LPS(1μg/ml)活化并用20uM源自不变链(LPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPM；SEQ ID NO17)的对照肽或黑转铁蛋白肽(MTF；SEQ ID NO13)刺激自体树突细胞24小时，或者不进行刺激。通过夹心免疫测定法检测对INF-γ(TH1反应)或IL-4(TH2反应)的T-细胞反应。
图5显示了黑转铁蛋白在一组黑素瘤细胞(UKRV-Mel-15a，Ma-Mel-18a，UKRV-Mel-17(Eichmuller，Usener D，Jochim A，Schadendorf D.，Exp Dermatol.2002 Aug；11(4)292-301))以及未成熟的(IM DC)和成熟的树突细胞(Mat DC)(用1μg/ml LPS活化的)的细胞表面的表达。用黑转铁蛋白mAb L235(5μg/ml)对细胞染色。细胞表面表达的强度指定为特异性的荧光指数(SFI)i.d.特异信号的geo mean/同种型的geo mean。
图6显示了黑转铁蛋白在不同癌症和正常组织中的单一靶表达模型(STEP)。表达水平以任意单位给出，其基于黑转铁蛋白mRNA相对于一组8个持家基因的相对表达。点划线显示了黑转铁蛋白在所有测试的正常组织中的平均表达。
迄今为止只记载了少数由MHC II类分子呈递的人肿瘤抗原，它们几乎全部与恶性黑素瘤相关。发现的第一个黑素瘤抗原性肽源自黑素细胞-特异性的酶酪氨酸酶，且受到HLA-DR4的限制(Topalian SL等，PNAS 1994；91，9461-9465)。还发现了其它3种黑素瘤表位源自MAGE家族蛋白，且由HLA-DR11和HLA-DR13呈递(Manici S等，J Exp Med 1999；189，871-876)。已知另一组黑素瘤抗原还含有MHC I类肿瘤抗原，它们包含Melan-A/MART-1(Zarour HM等，PNAS 2000；97，400-405)、gp100和膜联蛋白II(Li K等Cancer Immunol Immunother 1998；47，32-38)。已经证实它们都能以HLA-DR4-限制的方式激活源自黑素瘤患者的CD4+T细胞。
只有3种MHC II类相关黑素瘤抗原依赖突变来自糖酵解酶磷酸丙糖异构酶的HLA-DR1-限制的肽(Pieper R等，J Exp Med 1999；189，757-765)、来自细胞周期调节剂CDC-27的HLA-DR4-限制的表位(WangR-F等J Exp Med 1999；183，1131-1140)和依赖于染色体地重排的融合蛋白(由LDL受体和fucosal转移酶组成)的黑素瘤表位(Wang R-F等，J Exp Med 1999；189，1659-1667)。
术语黑素瘤包括但不限于黑素瘤，转移性的黑素瘤，来自黑素细胞或与黑素细胞有关的色素痣细胞的黑素瘤，黑素癌，黑素上皮癌，黑素肉瘤，原位黑素瘤，表面散布的黑素瘤，结节性黑素瘤，恶性痣性黑素瘤，肢端着色斑性黑素瘤，入侵性黑素瘤或家族性的非典型胎块和黑素瘤(FAM-M)综合征。哺乳动物中的这种黑素瘤可能是由染色体异常、退化性生长和进行性疾病、促有丝分裂剂、紫外线辐射(UV)、病毒感染、不合适的基因的组织表达、基因表达的改变、和在细胞上的呈递或致癌剂造成的。
本发明的抗原性肽是与MHC分子相关且由其呈递的肽，因此具有激活或耐受(tolerize)T细胞的潜力。因此，由MHC II类分子呈递的抗原性肽是与MHC II类相关或MHC II类抗原性肽，而由MHC I类分子呈递的抗原性肽是与MHC I类相关或MHC I类抗原性肽。
将源自由机体基因组编码的蛋白或APC的肽指定为“自身肽”。认为外周淋巴器官中的DC所呈递的自身肽的主要功能是诱导T细胞对自身蛋白的耐受。
源自细菌、病毒或其它外来入侵者的基因组编码的蛋白的肽且与自身蛋白不同的肽被称作“外源抗原性的”或“外源性的”肽。它们能引起T细胞对抗它们所来源的外源蛋白的反应。
肿瘤抗原是由肿瘤细胞表达的蛋白，该肿瘤细胞会导致T细胞的抗肿瘤反应性。肿瘤抗原肽源自这样的肿瘤抗原，并因此具有激活肿瘤反应性T细胞的潜力。
本发明提供了分离的与MHC II类相关的抗原性肽，其包含选自由SEQID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21组成的组的氨基酸序列。优选地，抗原性肽具有小于26个氨基酸的长度，更优选地是11-25个氨基酸的长度。更优选地是，本发明的抗原性肽具有14-18个氨基酸的长度。最优选地是，本发明的抗原性肽具有15-17个氨基酸的长度。
本发明的与MHC II类相关的新型抗原性肽源自细胞骨架蛋白波形蛋白(SEQ ID NO.1-6)、翻译因子eIF-4A1(SEQ ID NO.7-9)、IFN-γ可诱导的蛋白p78(SEQ ID NO.10和11)和结合铁的表面蛋白黑转铁蛋白(SEQ IDNO.12和13)和由T-细胞1识别的黑素瘤抗原(MART-1，Melan-A蛋白；SEQID NO21)。
MHC II类分子的单肽结合沟是约25长，但是与MHC I类分子不同的是，其两侧都是开放的(Stern LJ等，Nature 1994；368，215-221)。因此，从人MHC II类分子洗脱的天然加工的抗原性肽具有约11个残基的最小长度，且达到约25个残基的最大长度(Chicz RM等，J Exp Med 1993；178，27-47)。
MHC-肽的相互作用的稳定性由多余一打的氢键决定，该氢键涉及肽主链和结合沟的特异性袋与合适地定位的肽氨基酸侧链之间的互补性。与各袋配合的肽氨基酸称作“锚”残基。关于大多数HLA-DR等位基因，这些锚位于相对位置P1、P4、P6和P9。在这4个锚位置的氨基酸的组合赋予了结合到各HLA-DR等位基因产物的高稳定性，并且随各等位基因而异。在本文中将肽结合基序定义为包含4个锚氨基酸的9个氨基酸的序列。本发明的MHC II类抗原性肽的肽结合基序在SEQ ID NO.18中表示，它是SEQ ID NO.1至4的抗原性肽的序列，或如SEQ ID NO.19所示，它是SEQID NO.5和6的源自波形蛋白的抗原性肽的序列，和如SEQ ID NO.20所示，它是SEQ ID NO.12和13的源自黑转铁蛋白的抗原性肽的序列。
其它的结合能由氢键提供，所述的氢键涉及P1锚前面和P9锚后面的残基。与此相符合，在大多数天然加工的肽中，九聚物核心区(P1-P9)在N-和C-末端连接有3-4个残基。因此，大多数肽是15-17聚体。更长的肽会从沟中伸出，因此允许外肽酶(它们会修饰两端)的接近。
在本发明的另一个实施方案中，抗原性肽包含选自由SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21组成的组的氨基酸序列，其可以在氨基或羧基端具有氨基酸缺失并且维持它们的结合力。通过检测将标记的报道肽的结合减少50％所需的浓度来测量肽的相对结合力。该值称作IC50。以合理亲和力与相关的HLA II类分子相结合的肽所得到的IC50值不超过用参考肽建立起来的IC50的10倍。最优选的是，本发明的抗原性肽由包含4个锚氨基酸的肽结合基序组成。
波形蛋白已知波形蛋白是多种良性和恶性肿瘤的标记蛋白。与melanA/MART-1、酪氨酸酶和S100一起，常规地用波形蛋白来跟踪来自黑素瘤患者的临床标本中的黑素瘤细胞。有趣地，有较低入侵潜力的黑素瘤克隆具有较高的波形蛋白表达，而波形蛋白在较高入侵性的黑素瘤细胞克隆则受到下调(Gutgemann A等，Arch Dermatol Research 2001；293，283-290)。相反地，在分化较差的和转移性的前列腺癌中观察到表达增加的波形蛋白(Lang SH等，Prostate 2002；52，253-263)。而且，与正常肾组织相比，波形蛋白在人肾细胞癌中过量表达(Stassar MJ等Br.J.Cancer2001；85，1372-1382)。同样地，典型何杰金淋巴瘤中有超过95％的肿瘤细胞是波形蛋白阳性的，而富含T-细胞的B-细胞淋巴瘤则是波形蛋白阴性的(Rudiger T等，Am J Surg Path 1998，22，1184-91)。
eIF-4A1近年来，许多研究中已经报道了翻译起始因子与恶性细胞转化之间的密切联系，包括乳腺癌、成神经细胞瘤和黑素瘤(Kerekatte V等，Int.J.Cancer 1995；64，27-31)。这些发现导致了对一组新的翻译癌基因的定义。与正常的人黑素细胞相比，翻译起始因子eIF-4A1持续在黑素瘤细胞系中过量表达。eIF-4A1的过量表达似乎是黑素瘤细胞的一个重要特征，并且为它们的恶性转化负责(Eberle J等，Int.J.Cancer 1997；71，396-401)。
IFN-可诱导的p78
前列腺癌从激素依赖性状态向非激素依赖性状态的演变包括了一系列遗传改变，该遗传改变由癌基因的活化和/或肿瘤抑制基因的失活导致。鉴别出了几种在不依赖于雄激素的癌细胞系中高度过量表达的基因。在其它基因中，鉴别出了干扰素可诱导的编码p78的基因(Markku H等，LabInyest.2000；80，1259-1268.)。
黑转铁蛋白(p97)黑转铁蛋白是与人黑素瘤相关的首选表面标记之一(Hellstrm等，Int.J Cancer 1983；31，553-555)。与上述的肿瘤标记蛋白波形蛋白、eIF-4A1或IFN-可诱导的p78不同，黑转铁蛋白只在少数的细胞类型中表达至显著程度肝和脑中的内皮细胞，汗腺导管和赘生性细胞(RichardsonDR，Eur J Biochem 2000；267，1290-1298)。除了酪氨酸酶、MUC 18和Melan A/MART-1以外，常规地将黑转铁蛋白用作RT-PCR实验中的基因标记，并且发现其在大多数人黑素瘤中表达(Slingluff等，Curr OpinImmunol 1994；6，733-740)。此外，证实了黑转铁蛋白在成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤和少突胶质瘤中受到上调(Chi DD，等，Am.J.Pathol.1997；150，2143-2152)。经常在黑素瘤患者的肝、肺和肾转移中发现它。重要的是，黑转铁蛋白是GPI-锚定的表面蛋白，因此可以被抗体接近。
T-细胞识别的黑素瘤抗原T-细胞识别的黑素瘤抗原(Melan A；MART-1)是已知的肿瘤抗原(Kawakami Y.，Eliyahu S.，Delgado C.H.，Robbins P.F.，RiVoltiniL.，Topalian S.L.，Miki T.，Rosenberg S.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.913515-3519(1994)；Coulie P.G.，Brichard V.，van PelA.，Woelfel T.，Schneider J.，Traversari C.，Mattei S.，de Plaen E.，Lurquin C.，Szikora J.-P.，Renauld J.-C.，BoonT.，J.Exp.Med.18035-42(1994))。
本发明的“分离的”肽是不具有天然产生的对应物(例如突变的肽抗原)、或已经被从其天然伴随组分中分离出或纯化出的肽，例如在组织(例如胰腺、肝、脾、卵巢、睾丸、肌肉、关节组织、神经组织、胃肠组织)或体液如血液、血清或尿。典型地，当它是至少70干重％且不含有蛋白和天然生成的与其天然有关的有机分子时，认为肽是“分离的”。优选地，本发明的肽制品由至少80干重％、更优选地至少90干重％、最优选地至少99干重％的本发明的肽组成。由于化学合成的肽被根据其性质从天然伴随它的组分中分离出来，合成的肽是“分离的”。免疫原性的肽包括但不限于能造成或刺激细胞免疫反应或体液免疫反应的抗原性肽。这样的肽还可以是抗体反应性的。
本发明还提供了本发明的抗原性肽的类似物。术语“类似物”包括显示出这些抗原性肽的功能特征的任何肽。术语“类似物”还包括肽的保守取代物或化学衍生物。
术语“类似物”包括具有与这里所述的序列实质上相同的氨基酸残基序列的任何多肽，其中一个或多个残基已经被功能类似的残基保守地取代，且其能表现出这里所述的肽的功能特征。保守取代的实例包括将一个非极性(疏水性)残基例如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸取代为另一个；将一个极性(亲水性)残基取代为另一个，例如在精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、苏氨酸和丝氨酸之间；将一个碱性残基例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代为另一个；或将一个酸性残基例如天冬氨酸或谷氨酸取代为另一个。
短语“保守取代”也包括使用化学衍生的氨基酸替代非衍生的氨基酸。“化学衍生物”是指通过侧官能团的反应化学衍生出的具有一个或多个氨基酸的主题多肽。这样衍生的分子的实例包括，例如其中的游离氨基已经被衍生形成胺氢氯化物、对甲苯磺酰基、苄酯基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基、乙酰基或甲酰基的那些分子。游离的羧基可以衍生形成盐、甲酯和乙酯或其它类型的酯或酰肼。游离的羟基可以衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以衍生形成N-im-苄基组氨酸。化学衍生物还包括含有20个标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的那些蛋白或肽。例如，4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸，5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸，3-甲基组氨酸可以取代组氨酸，高丝氨酸可以取代丝氨酸，和鸟氨酸或瓜氨酸可以取代赖氨酸。
因此，在本发明的一个优选的实施方案中，分离的与MHC II类相关的抗原性肽具有小于26个氨基酸的长度，其包含选自由SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21组成的组的氨基酸序列，以及在氨基或羧基端有缺失且能维持它们的结合力的这些肽，在它们的序列中含有至少一个氨基酸修饰来增强该肽与MHC II类分子的结合。该氨基酸修饰可以是如上所述的保守氨基酸取代。可以将结合检测为与参考抗原性肽相比的结合力。本发明的MHC II类抗原性肽的肽结合基序还可以包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸序列修饰，同时仍然维持未修饰的肽结合基序的结合力。优选地，修饰的肽结合基序包含未修饰的肽结合基序的四个锚氨基酸中的至少3个。氨基酸修饰可以是如上所述的保守的氨基酸取代。
本发明的分离的肽可以如下得到例如通过从天然源(例如从MHC II分子洗脱)中提取；通过表达编码该肽的重组核酸；或通过化学合成。在与其天然起源不同的细胞系统中生成的肽是“分离的”，因为它将从天然伴随它的组分中分离出。由宿主生物表达的重组肽可以作为粗裂解物得到，或者可以通过本领域已知的标准蛋白纯化方法纯化，这样的方法可以包括示差沉淀、大小排阻色谱、离子交换层析、等电聚焦、凝胶电泳、亲合层析和免疫亲合层析等。分离或纯化的程度可以通过任何合适的方法检测，例如质谱或HPLC分析。通过Merrifield，(1986)Science 232341-347，Barany和Merrifield，The Peptides，Gross和Meienhofer，编(N.Y.，Academic Press)，第1-284页(1979)所述的方法，可以合成地制备出该肽。合成可以在溶液中、或在固相中或用自动合成仪进行(Stewart和Young，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，RockfordIll.，PierceChemical Co.(1984))。
在另一个实施方案中，提供的本发明的抗原性肽包含选自由SEQ IDNO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21组成的组的氨基酸序列，这些肽在氨基或羧基端有缺失且维持它们的结合力，其与MHC II类分子相连。
如果连有可检测的标记(例如荧光基团、放射性核素或能催化反应产生能吸收或发射特定波长的光的酶)，则含有共价地或非共价地结合的本发明的方法定义的肽的II类MHC分子的多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、或寡聚体)可以用于对来自对象(例如人患者)的T细胞进行定量，所述的T细胞具有对这样的复合体特异性的并且因此能与之结合的细胞表面受体。相对较多的这样的T细胞很可能是相关疾病的诊断，或者表明该T细胞参与了对疾病的免疫。另外，连续监视结合多聚体的T细胞的相对数量可有助于确立疾病的进程或治疗功效。已经使用I类MHC分子的四聚体(含有来自HIV-1或来自流感病毒-15的肽)开发了这样的实验(Altman等(1996)，Science 27494-96；Ogg等(1998)，Science 2792103-21061)，预期相应的II类MHC多聚体也具有相似用途。这样的复合体可以通过纯化的II类MHC分子(在存在目标肽的情况下装配好)的化学交联生成，或者通过改进已经建立的生成含有单一定义肽的II类MHC分子的重组技术来生成(Kazono等(1994)，Nature 369151-154；Gauthier等(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9511828-118331)。这样多聚体的II类MHC分子单体可以是天然分子，其由全长的α和β链组成。或者，它们可以是含有α和β链的胞外域或形成肽结合裂缝的“壁”和“墙”的α和β链域的分子。
因此，本发明还涉及指向上述肽且能与其反应的抗体、片段或其衍生物。生产抗体的一般方法学是熟知的，并且作为实施例公开在Kohler和Milstein，1975，Nature 256，494或在J.G.R.Hurrel，MonoclonalHybridoma AntibodiesTechnique and Application，CRC Press Inc.，Boco Raron，FL(1982)中。抗体可以是多克隆的，或优选地单克隆的，或抗体片段，例如是F(ab’)2、Fab、Fv或scFv。本发明的抗体还可以是人源化的(Merluzzi S.等，(2000)，Adv.Clin.Path.，4(2)77-85)或人抗体(Aujame L.等，Hum.Antibodies，(1997)，8(4)155-168)。
本发明还提供了分离的编码MHC II类抗原性肽的核酸分子，所述的肽包含选自由SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21组成的组的序列，以及编码在氨基或羧基端有缺失且维持其结合力的抗原性肽的核酸分子，和编码这样的抗原性肽的核酸分子，其中的氨基酸序列含有至少一个氨基酸修饰来增强肽与MHC II类分子的结合。优选地，分离的核酸分子是DNA分子。
而且，提供的分离的核酸分子编码与MHC II类分子相连的本发明的抗原性肽，其中抗原性肽包含选自由SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21组成的组的氨基酸序列。
本发明还提供了重组核酸构建体，其包含全部或部分的编码抗原性肽的核酸序列，所述的肽包含选自由SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21组成的组的序列，或者包含编码在氨基或羧基端有缺失且维持其结合力的抗原性肽的核酸分子，或者包含编码这样的抗原性肽的核酸分子，其中的氨基酸序列含有至少一个氨基酸修饰来增强该肽与MHC II类分子的结合，所述的核酸可操作地连接到表达载体上。适合于在本发明中使用的表达载体包含至少一个表达调控元件，它可操作地连接到编码该抗原性肽的核酸序列上。重组表达构建体可以是DNA构建体。
表达调控元件插入在载体中，以控制和调节编码本发明的抗原性肽的核酸序列的表达。表达调控元件的实例包括但不限于lac系统，噬菌体λ的操纵子和启动子区域，酵母启动子和源自多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒或SV40的启动子。其它优选的或需要的操纵元件包括但不限于前导序列、终止密码子、多腺苷酸化信号和在宿主系统中合适地转录并随后翻译核酸序列所必须或优选的任何其它序列。本领域的技术人员能够明白，表达调控元件所需要或优选的正确组合取决于选择的宿主系统。还能明白，表达载体应当含有在宿主系统中转移并随后复制含有核酸序列的表达载体所必需的其它元件。这样的元件的实例包括但不限于复制起始点和选择性标记。本领域的技术人员还能够明白，这样的载体能使用常规方法容易地构建(www.cellbio.com/protocols.html)或可以商业获得。
本发明的另一方面涉及宿主生物或宿主细胞，已经插入在其中的重组核酸构建体包含全部或部分的编码抗原性肽的核酸序列，所述的肽选自由SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21组成的组，或者包含编码在氨基或羧基端有缺失且维持其结合力的抗原性肽的核酸分子，或者包含编码这样的抗原性肽的核酸分子，其中的氨基酸序列含有至少一个氨基酸修饰来增强该肽与MHC II类分子的结合，所述的核酸可操作地连接到表达载体上。用本发明的核酸构建体转化的宿主细胞包括真核细胞(例如动物、植物、昆虫和酵母细胞)和原核细胞(例如大肠杆菌)。可以将携带核酸序列的核酸构建体导入细胞中的方法包括但不限于显微注射、电穿孔、转导或使用DEAE-葡聚糖、脂转染、磷酸钙转染或本领域技术人员已知的其它方法(Sambrook等(1989)in″MolecularCloning.A Laboratory Manual″，Cold Spring Harbor Pres，Plainview，New York)。
在一个优选的实施方案中，使用了能在真核细胞中起作用的真核表达载体。这样的载体的实例包括但不限于反转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、禽痘病毒载体、质粒或杆状病毒转移载体。优选的真核细胞系包括但不限于COS细胞、CHO细胞、HeLa细胞、NIH/3T3细胞、293细胞(ATCC# CRL15731)、T2细胞、树突细胞、单核细胞或Epstein-15 Barr病毒转染的B细胞。
本发明还提供了生产MHC II类抗原性肽的方法，所述的抗原性肽包含选自由SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21组成的组的氨基酸序列，或者所述的抗原性肽在氨基或羧基端有缺失且维持其结合力，或者所述的抗原性肽的氨基酸序列中含有至少一个氨基酸修饰来增强该肽与MHC II类分子的结合，该方法包括下述步骤在能表达所述肽的条件下培养含有上述的重组核酸构建体的宿主细胞，并从细胞或培养基中回收该肽。
分离和鉴别出的本发明的抗原性肽的序列可以通过MHC结合基序、MHC结合力和T细胞识别来验证。
MHC结合基序与特定MHC分子(等位变体)相关的肽具有常见的结构特征，定义为结合基序，这是与MHC分子形成稳定复合体所必须的。从MHC I类分子洗脱下来的肽配体相对较短，有8-11个氨基酸。而且，该肽的2或3个侧链与结合有关。各氨基酸侧链的位置随HLA等位基因而变化，这些所谓的“锚”残基中的两个在大多数情况下是位于位点2和9。关于特殊的锚位置，仅有1或2个氨基酸正常起锚氨基酸的作用，例如在HLA-A2中位点2处的亮氨酸或缬氨酸V。
关于MHC II类分子，其肽长度从11至25个氨基酸，更长的肽也可以结合，因为肽结合沟的两端是开放的。大多数HLA II类分子具有至多4个锚残基，位于九聚物核心区的相对位点P1、P4、P6和P9中。但是，该核心区到肽N-端的距离是可变的。在大多数情况下，有2-4个N-端残基在核心区前面。因此，在大多数HLA II类相关肽中P1锚残基位于位点3、4或5处。从HLA-DR II类分子洗脱的肽具有较大的疏水P1锚，代表性的是酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。
锚残基的位点和准确类型构成了肽结合基序，它对于大多数常见的HLA II类等位基因产物是已知的。能够在肽序列中进行基序验证的计算机算法是“Tepitope”，可以从vaccinome获得(www.vaccinome.com)。
MHC结合力通过本领域已知的方法，例如使用分离的MHC II类分子和合成的肽(其氨基酸序列与通过本发明的方法鉴别出的那些相同)，可以测试通过本发明的方法鉴别出的肽结合到合适的MHC II类分子的能力(KropshoferH等，J.Exp.Med.1992；175，1799-1803；Vogt AB等，J.Immunol.1994；153，1665-1673；Sloan VS等，Nature 1995；375，802-806)。或者，可以使用细胞结合实验(使用MHC II类表达细胞系和生物素化的肽)来检验鉴别出的表位(Arndt SO等，EMBO J.，2000；19，1241-1251)。
在两种实验中，通过检测将标记的报道肽的结合减少50％所需的浓度来测量肽的相对结合力。该值称作IC50。以合理亲和力与相关的HLA II类分子相结合的肽所得到的IC50值不超过用参考肽建立起来的IC50的10倍。
同样的结合实验还可以用于测试肽结合备选的II类MHC分子(即，使用本发明的方法它们被洗脱的那些之外的II类MHC分子)的能力。可以将本发明的诊断方法(使用这样的肽)和本发明的治疗方法(使用这样的肽或源自它们的肽)应用到能表达这样的备选的II类MHC分子的受试者。
T细胞识别表位的检验方法可以涉及检测通过本发明的方法鉴别出的肽激活CD4+T细胞群的能力。合成了其氨基酸序列与在本发明中鉴别出的那些相同的或与核心序列(源自在本发明中鉴别出的嵌套组肽)相对应的肽。然后测试了合成肽激活CD4+T细胞的能力，所述CD4+T细胞来自(a)测试受试者，能表达目标MHC II类分子，且具有至少一种疾病症状；和(b)对照受试者，能表达目标MHC II类分子，且没有疾病症状。其它的对照受试者可以是具有疾病症状且不表达目标MHC II类分子的那些。
在有些疾病(例如具有自身免疫组分的那些)中，测试受试者的CD4+T细胞中有反应性，而(b)所述的对照受试者的CD4+T细胞中则没有，这提供了确实的证据证明相关肽是能激活CD4+T细胞的表位，所述细胞能启动、促进或加剧相关疾病。在其它疾病(例如没有自身免疫组分的癌症或感染性疾病)中，与前述类似的反应性和无反应性模式表明，相关肽是能激活CD4+T细胞的表位，所述细胞介导对疾病的免疫，或者至少减轻疾病的症状。
可以通过多种本领域已知的方法体外地检测CD4+T细胞反应。例如，可以将全外周血单核细胞(PBMC)在有或没有备选的合成肽的情况下培养，并通过例如将[3H]-胸腺嘧啶整合它们的DNA来检测它们的增殖反应。增殖的T细胞是CD4+T细胞，这可以通过在实验前从PBMC中排除CD4+T细胞来检测，或者通过添加能结合到T细胞上的CD4+分子的抑制性抗体、从而抑制后者增殖来检测。在两种情况下，只有当CD4+T细胞是增殖细胞时，增殖反应才会被抑制。或者，可以从PBMC中纯化CD4+T细胞，并在存在能表达合适的MHC II类分子的APC的情况下测试对肽的增殖反应。这样的APC可以是B-淋巴细胞、单核细胞、巨嗜细胞或树突细胞或全PBMC。APC还可以是源自B-淋巴细胞、单核细胞、巨嗜细胞或树突细胞的无限增殖化细胞系。APC可以内源地表达目标MHC II类分子，或者它们可以表达转染的编码这样的分子的多核苷酸。在所有情况下，在试验之前，可以通过例如电离辐射或丝裂霉素-C处理来使APC无增殖性。
作为检测细胞增殖的备选方案，可以通过本领域技术人员已知的方法检测CD4+T细胞生成的细胞因子。细胞因子包括但不限于白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、TNF-α、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)或TGF-β。测试它们的实验包括但不限于ELISA和其中在存在测试样品的情况下测试细胞对相关细胞因子的反应性(例如增殖)的生物测定。
备选地，通过细胞内的免疫荧光染色和流式细胞计数可以直接看见CD4+淋巴细胞生成的细胞因子。
而且，前述的分离的抗原性肽可以用于诊断、预防和治疗疾病，优选癌症。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了用于诊断、预防和治疗疾病(优选癌症)的本发明的抗原性肽。
本发明的一个方面是治疗目的，其中一种或多种鉴别出的黑素瘤肽用于给患者疫苗接种以抵抗癌症，优选黑素瘤。为此目的，可以将相关肽以足以使肽结合到MHC分子的量直接地给患者施用，激活T细胞，随后T细胞介导受感染的细胞或癌细胞的裂解。
备选地，黑素瘤肽可以用于生成基于DC的疫苗。在该情况下，可以用相关肽或含有相关肽序列的重组蛋白刺激源自患者的单核细胞的自体DC。更具体地，在疫苗接种抵抗黑素瘤时，与或不与本领域已知的MHC I类相关的肿瘤抗原肽组合的本发明的MHC II类相关肽可以用于刺激黑素瘤患者的自体的或异源的DC。类似地，可以将能编码相关肽的核酸分子整合进载体中，以转染肿瘤细胞。这些转染的肿瘤细胞可以与DC融合。在任何这些情况下，都会给肿瘤患者施用在合适的MHC分子情况下呈递相关肽的DC，以触发抗肿瘤的细胞介导的和/或抗体介导的免疫反应。
本发明的II类限制的黑素瘤抗原或其类似物可以预防性地或治疗性地用作疫苗。当预防性地使用时，该疫苗在出现任何黑素瘤之前就使用。II类限制的黑素瘤抗原疫苗的预防性施用应当用于防止或减少哺乳动物的黑素瘤。在一个优选的实施方案中，用本发明的疫苗预防性地处理对黑素瘤高危的哺乳动物(优选人)。这样的哺乳动物的实例包括但不限于具有黑素瘤家族史的人、具有非典型痣史的人、具有FAM-M综合征史的人或患过黑素瘤(已经切除)并因此具有再次发作的危险的人。当治疗性地使用时，该疫苗用于增强患者自身对黑素瘤或转移性的黑素瘤呈递的肿瘤抗原的免疫反应。当用作免疫原时，该疫苗可以是细胞、用重组表达载体转染的细胞的细胞裂解物、用编码II类限制的黑素瘤抗原的重组表达载体转染的细胞的细胞裂解物、或含有表达的蛋白的培养上清液。备选地，免疫原是部分地或基本上纯的为II类限制的黑素瘤抗原编码的重组蛋白、肽或其类似物。使用常规方法，可以将蛋白或肽与脂蛋白连接，或者以脂质体形式或与佐剂一起施用。
因此，本发明提供了一种含有有效量的抗原性肽的药物组合物，所述抗原性肽包含在SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和21中描述的序列，以及这些肽在氨基或羧基端具有缺失并且维持它们的结合力，和可接受的赋形剂、稀释剂或载体。“有效量”在这里是指足以激活特异性的淋巴细胞并诱导抗肿瘤的有效反应的量。该量取决于使用的肽、给药方式、要治疗的疾病的严重程度和患者的总体状况，通常为1-50mg/ml，例如在肽加载到树突细胞上的情况下。
可接受的赋形剂、稀释剂或载体可以是用于体外研究的磷酸盐缓冲盐水和体内使用的生理盐溶液。
在一个实施方案中，这样的组合物是用于给容易长瘤的患者进行预防性的疫苗接种，或用于给长瘤患者进行治疗性的疫苗接种。“疫苗接种”在这里是指主动免疫法，即，作为常规的疫苗接种方法，体内地施用该肽来直接地在患者中引起体内免疫反应，例如抗病原体，和被动免疫法，即，使用该肽来体外地激活抗肿瘤的CD4+细胞或自身的或异源的树突细胞，随后将它们重新接种到患者体内。
制备和使用疫苗的技术是本领域技术人员已知的，记载在(作为实例)Paul，Fundamental Immunology，Raven Press，New York(1989)或Cryz，S.J.，Immunotherapy and Vaccine，VCH Verlagsgesellschaft(1991)中。疫苗常规地制成注射剂、混悬液或溶液形式，但是它们也可以以固体制剂或脂质体的形式使用。免疫原成分可以与药用赋形剂混合，例如乳化剂、缓冲剂和能提高疫苗功效的佐剂。后者可以根据单或多剂量方案施用。多次给药包括1-10次分开的给药，每一次含有一定量的抗原，从1Hg至1000joug，随后在后续的时间间隔(必须能维持或加强免疫反应)再次给药，如果受试者需要，还可以在几个月后再次给药。在任何情况下，治疗方案都取决于在治疗的患者中引起的反应、总体状况和肿瘤的发展。
本发明的兽用和人用的药物组合物或制剂包括如上所述的抗原性肽、一种或多种药用载体和任选的其它治疗性成分。载体必须是“可接受的”，其含义是与制剂的其它成分相容且对其受体无害。制剂可以常规地制成单位剂量形式，且可以通过制药领域熟知的任何方法制备。
所有方法包括将活性成分与载体(其包括一种或多种辅助成分)相组合的步骤。通常，通过使活性成分与液体载体或细碎的固体载体或者两者均匀地和紧密地组合来制备制剂，然后如果需要将产品制成需要的制剂。
适合于静脉内地、肌肉内地、皮下地或腹膜内地施用的制剂常规地包含活性成分的无菌水溶液和优选地与受体血液等渗的溶液。这样的制剂可以方便地如下制备将固体活性成分溶解到水中形成水溶液，所述的水含有生理上可相容的物质，例如氯化钠(例如0.1-2.0M)、甘氨酸等，且具有缓冲的可与生理条件相容的pH，并对所述的溶液灭菌。它们可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如，密封的安瓿或小瓶。
本发明的制剂可以包含稳定剂。示例性的稳定剂是聚乙二醇、蛋白、糖、氨基酸、无机酸和有机酸，它们可以单独使用或者混合使用。这些稳定剂的优选用量是约0.11～约10,000重量份/重量份免疫原。如果使用两种或多种稳定剂，它们的总量优选地在上述范围内。这些稳定剂以合适的浓度和pH用在水溶液中。这样的水溶液的特定渗透压通常为约0.1至约3.0渗透压摩尔，优选地为约0.8至约1.2。水溶液的pH调至约5.0至约9.0，优选地为6-8。在制备本发明的免疫原时，可以使用抗吸附剂。
本发明还提供了包含在SEQ ID NO.1-13和21中描述的序列的抗原性肽和在其氨基或羧基端具有缺失并且保留它们的结合力的那些肽在生产药物中的应用，所述的药物用于刺激哺乳动物中的保护性抗体或具有抗肿瘤反应性的免疫细胞(例如细胞毒性T细胞或自然杀伤细胞)的生成。
在另一个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO.1-13和21中描述的序列的抗原性肽和在其氨基或羧基端具有缺失并且保留它们的结合力的那些肽在生产药物中的应用，所述的药物用于通过刺激保护性抗体或免疫阳性的CD4+T细胞的生成来预防或治疗黑素瘤。
在另一个实施方案中，提供了包含选自由SEQ ID NO.12和13组成的组的氨基酸序列的MHC II类抗原性肽在生产药物中的应用，所述的药物用于通过刺激保护性抗体或免疫阳性的CD4+T细胞的生成来预防或治疗肺癌。
此外，本发明的方法可以用作诊断目的。在一个实施方案中，本发明的抗原性肽可以用作跟踪治疗方案功效的反应标记。实质上，可以测定抗原性肽的基准值，然后施用特定的治疗剂，随后监视抗原性肽的水平，抗原性肽水平的变化指示着治疗性处理的功效。
而且，仅仅在疾病(优选癌症)的特定阶段或时期发现的抗原性肽可以用作阶段特异性的标记。实质上，例行地监视已经与特定疾病阶段关联的抗原性肽的水平，由此提供关于疾病的阶段和其进程的信息。
因此，提供了作为癌症诊断标记的包含选自由SEQ ID NO.1-13和21组成的组的氨基酸序列的MHC II类抗原性肽。优选地，提供了本发明的MHC II类抗原性肽作为黑素瘤的诊断标记的应用。实质上优选地是，包含选自由SEQ ID NO.12和13组成的组的氨基酸序列的MHC II类抗原性肽作为黑素瘤诊断标记的应用。
另外，提供了包含选自由SEQ ID NO.12和13组成的组的氨基酸序列的MHC II类抗原性肽的作为肺癌诊断标记的应用。
本发明还包括源自黑转铁蛋白多肽的抗原性肽的作为肺癌诊断和监视标记的应用。各蛋白的应用原理是，CD存在于大多数组织中，它们在那里通过特异性受体和通过特异化的内吞机制(例如巨胞饮作用)捕获外源性抗原，随后在MHC II类分子上将加工后的抗原作为肽呈递。以前的研究已经证实了在MHC II类分子的情况下发现的肽表位的频率，这在多数情况下反应了蛋白(特定肽源自它们)的丰富。因此，不仅仅抗原性肽，其相应的蛋白也可以用作肺癌标记。
因此，本发明另一个实施方案提供了黑转铁蛋白(SEQ ID NO22)用作肺癌标记的应用。
通过多种方法，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白印迹、免疫沉淀和免疫荧光，通过检测疾病(优选癌症)的多肽或肽标记的表达和/或组成，可以诊断疾病(优选癌症)。对来自个体的测试样品检测是否存在本发明的多肽或肽的表达变化和/或组成变化。多肽或肽表达的变化可以是例如定量多肽表达(即生成的多肽的量)的变化；多肽组成的变化可以是例如定性多肽表达(如多肽突变体或不同的拼接变体的表达)的变化。
这两种变化(定量的和定性的)还可以都存在。如这里所使用的，多肽表达或组成的“变化”是指测试样品中的表达或组成与对照样品中的肽或多肽的表达或组成相比时的变化。对照样品是与测试样品相对应的(例如来自相同种类的细胞)且来自不患有疾病(优选癌症)的个体。测试样品中的肽或多肽的表达或组成与对照样品相比时的变化指示着疾病(优选癌症)，或者对疾病(优选癌症)的易感性。可以使用多种方法检查本发明的肽或多肽的表达或组成，包括光谱法、比色法、电泳、等电聚焦和免疫试验(例如，David等，美国专利号4,376,110)，例如免疫印迹(还参见Current Protocols in Molecular Biology，具体地第10章)。例如，在一个实施方案中，可以使用能结合到多肽(例如如上所述)上的抗体，优选具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆的，或更优选地是单克隆的。可以使用完整的抗体或其片段(例如，Fab或F(ab’)2)。与探针或抗体相关的术语“标记的”意在包括通过将可检测的物质偶联(即物理连接)到该探针或抗体上来直接标记该探针或抗体，和通过与直接标记的另一种试剂反应来间接标记该探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的次级抗体和末端用生物素标记的DNA探针(这样可以用荧光标记的链霉抗生物素检测它)检测初级抗体。
蛋白印迹分析使用如上所述的能特异性地结合到本发明的肽或多肽上的抗体，它可以用来检测测试样品的肽或多肽的水平或量，并将其与对照样品的肽或多肽的水平或量进行对比。优选地，测试样品的肽或多肽是在同源的或异源的免疫测定中检测。测试样品的多肽的水平或量高于或低于对照样品的多肽的水平或量，该差异是统计学上显著的，指示着多肽表达的变化，诊断疾病(优选癌症)或对疾病(优选癌症)的易感性。
因此，本发明还涉及包含抗体的诊断性组合物，所述抗体能与本发明的MHC II类抗原性肽反应。
现在已经总体上描述了本发明，参考具体实施例并结合附图能更好地理解本发明，除非另有说明，这些实施例在这里仅仅是用作解释目的而无意进行限制。
实施例下面的实施例与上面所述的附图有关，并且是基于图1所示的和下面详细描述的技术。除非另有说明，在实施例中提到的商业获得的试剂是根据生产商的说明书使用。
发明方法细胞系和培养本研究用人树突细胞进行，其从单核细胞分化出，如下所述。单核细胞是从人外周血纯化出。另外，使用了黑素瘤细胞系UKRV-Mel-15a、UKRV-Mel-20c和Ma-Mel-18a(Eichmueller S等，Exp Dermatol 2002；11，292-31)。
所有细胞都在补充有1mM Pyruvat、2mM谷氨酰胺和10％热灭活的胎牛血清(Gibco BRL，Rockville，MD)的RPMI 1640培养基(简称RPMI)中培养。
外周血单核细胞(PBMC)的分离外周血从当地血库获取，其是从健康供体得到的标准白细胞层(buffycoat)制品。用肝素(200国际单位/毫升血，Liquemine，Roche)防止凝结。在LSM(1.077-1.080g/ml；ICN，Aurora，OH)中以800g(室温)离心30分钟，分离外周血单核细胞(PBMC)。从中间相收集PBMC，用含有20mMHepes的RPMI洗涤2次(在500g进行15分钟，在300g进行5分钟)。为了除去红细胞，在37℃用ALT缓冲液(140mM氯化铵，20mM Tris，pH 7.2)处理PBMC 3分钟。用含有20mM Hepes的RPMI洗涤PBMC 2次(在200g进行5分钟)。
从外周血单核细胞生成树突细胞根据生产商的说明，使用抗-CD14磁珠(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)进行阳性筛选，从PBMC分离出单核细胞。将单核细胞在RPMI中培养，所述的RPMI中添加了1％非必需氨基酸(Gibco，BRL，Rockville，MD)、50ng/ml重组人粒细胞巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF；S.A.1.1×107U/mg)(Leucomax；Novarti，Basel Switzerland)和3ng/ml重组人IL-4(S.A.2.9×104U/μg)(R&D Systems，Minneapoli，MN)。以0.3×106/ml，将单核细胞接种到6孔平板(Costar)中，培养5天，得到未成熟的树突细胞。
通过流式细胞仪分析确认下述表型来例行监视来自单核细胞的未成熟的树突细胞的质量CDla(高)，CD3(负的)，CD14(低)，CD19(负的)，CD56(负的)，CD80(低)，CD83(负的)，CD86(低)和HLA-DR(高)。相反，成熟的树突细胞(参见下面)表现出下述表型CDla(低)，CD80(高)，CD83(高)，CD86(高)和HLA-DR(高)。抗CDla、CD3、CD14、CD19、CD56、CD80、CD83、CD86以及各同种型对照的单克隆抗体购自Pharmingen(SanDiego，CA)。
树突细胞暴露于坏死的黑素瘤细胞通过在液氮中冷冻并随后在室温解冻，循环4次使黑素瘤细胞系坏死。通过光学显微镜监视死亡细胞的百分比。为了给树突细胞饲喂来自黑素瘤细胞的抗原，将6×106未成熟的树突细胞暴露于1.8×107死亡细胞(3∶1比例)。同时，通过加入10ng/ml重组人肿瘤坏死因子(TNFα；S.A.1.1×105U/μg)来诱导树突细胞的成熟。作为对照，单独用TNFα孵育6×106树突细胞。
共培养24-48小时后，通过在300g离心10分钟收获成熟的树突细胞。用含有10％FCS的RPMI洗涤细胞，并转移到eppendorf管中。在400g离心3分钟后，完全除去上清液，在-70℃冷冻细胞。
抗-HLA II类珠的生成通过培养各小鼠杂交瘤细胞系，生成抗-HLA-DR单克隆抗体(mAb)L243(ATCC，Manassa，VA)。根据生产商的说明，使用Protein A琼脂糖凝胶(Pharmacia，Uppsala，Sweden)纯化mAb L243，并以2.5mg/ml的终浓度固定化到CNBr-活化的琼脂糖凝胶珠(Pharmacia)上。将L243珠保藏在含有0.1％ Zwittergent 3-12(Calbiochem，La Jolla，CA)的PBS中。
HLA-DR-肽复合体的纳米级纯化将冷冻的树突细胞团重新悬浮到10倍体积的冰冷却的裂解缓冲液(1％Triton-X-100，20mM Tris，pH 7.8，5mM MgCl2，含有蛋白酶抑制剂胰凝乳蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂、PMSF和亮抑蛋白酶肽(Roche，Mannheim，Germany))中，并于1000rpm、4℃在水平摇床中裂解1小时。通过在2000g、4℃离心10分钟，将细胞裂解物从细胞碎片和核中分离出。将裂解物与L243珠(5-10μl L243珠/100μl细胞裂解物)于1000rpm、4℃在水平摇床中共孵育2小时。通过在2000g、4℃离心5分钟，使结合到L243珠上的免疫沉淀的HLA-DR-肽复合体沉积下来，并用300μl0.1％Zwittergent 3-12(Calbiochem)的PBS洗涤3次。
通过分析免疫沉淀前后的各细胞裂解物，监视耗尽HLA-DR-肽复合体的功效。平行地，通过使用抗-HLA-DRα-特异性的mAb 1B5(Adams，T.E.等，Immunology 50(1983)613-624)的蛋白印迹分析等分试样的珠。
HLA-DR相关肽的洗脱将结合到L243珠上的HLA-DR-肽复合体重新悬浮到400μl H2O(HPLC-级；Merck，Darmstadt，Germany)中，转入超滤管，Ultrafree MC，30kD截留(Millipore，Bedford，MA)，通过在14000rpm、4℃离心2-4分钟，用400μl H2O(HPLC-级)洗涤10次。为了洗脱结合的肽，加入50μl在H2O(HPLC-级)中的0.1％三氟醋酸(Fluka，Buch，Switzerland)，在37℃孵育30分钟。通过在14000rpm、室温Ultrafree unit离心3分钟，将洗脱的肽收集到一个新的eppendorf管中，并立即在Speed-VacTM真空离心机中冻干。
通过纳米-HPLC对肽分级将冻干的从HLA-DR分子洗脱的肽再溶解到在H2O(HPLC-级)中的0.05％三氟醋酸、5％乙腈(Merck，Darmstadt，Germany)中，在连接到FAMOSTM自动取样器和ULTIMATETM纳米流HPLC(Dionex，Olten，Switzerland)上的75μm×15cm C18 PepMap毛细管(C18；3μm；100)(LC-Packings，Amsterdam，Netherland)上分离。使用恒定流速为200nl/分钟的下述非线性梯度0-40分钟，5-50％，系统B；40-50分钟，50-90％，系统B。系统A是0.05％三氟醋酸，5％乙腈/H2O，系统B是0.04％三氟醋酸，80％乙腈/H2O。通过在214nm和280nm的双紫外吸收监视分离。使用级分收集器PROBOTTM(BAI，Weiterstadt，Germany)收集级分(400nl)，并且点样到AnchorChip 600/384MALDI-MS靶(Bruker，Bremen，Germany)上。
通过质谱分析肽序列MALDI-TOF质谱将点样到AnchorChip板上的肽与基质(10mg/ml；α-氰-4-羟基-肉桂酸(Merck，Darmstadt，Germany)，50％乙腈，0.1％三氟醋酸)共结晶。为了定性分析整体的肽所有组成成分，根据生产商的说明在UltraflexTMMALDI-TOF质谱仪(Bruker，Bremen，Germany)上分析样品。
离子阱MS/MS质谱为了对复合体肽混合物进行高通量测序，使用了基于液体色谱级分的MudPIT(多维蛋白鉴别技术)(Washburn MP等，Nat Biotechnol 19(2001)，242-247)，随后进行质谱测序。
为此目的，将冻于的从HLA分子洗脱的肽重新悬浮到含有下述试剂的缓冲液中5％(v/v)乙腈，0.5％(v/v)醋酸，0.012％(v/v)七氟丁酸(HFBA)和5％(v/v)甲酸。在通过Model P-2000激光拉出器(Sutter InstrumentCo.，Novato，CA)生成的熔融石英(fused-silica)微毛细管柱(100μm内径×365μm)上分离样品。微柱装填有3μm/C18反相物质(C18-ACE 3μm[ProntoSIL 120-3-C18ACE-EPS，Leonberg，Germany])，随后装入3cm长的5μm阳离子交换物质(Partisphere SCX；Whatman，Clifton，NJ)。
在Agilent 1100系列的HPLC(Agilent Technologie，Waldbronn，Germany)上进行全自动的8步梯度分离，使用下述缓冲液5％ACN/0.02％HFBA/0.5％醋酸(缓冲液A)，80％ACN/0.02％HFBA/0.5％醋酸(缓冲液B)，250mM醋酸铵/5％ACN/0.02％HFBA/0.5％醋酸(缓冲液C)，和1.5M醋酸铵/5％ACN/0.02％HFBA/0.5％醋酸(缓冲液D)。第一步106分钟包括，从0至80％梯度缓冲液B 100分钟，在80％缓冲液B保持6分钟。接下来的6步(每步106分钟)的特征在于下述特征在100％缓冲液A5分钟，在x％缓冲液C2分钟，在100％缓冲液A5分钟，从0至10％梯度缓冲液B 3分钟，从10至35％梯度缓冲液B 55分钟，从35至50％梯度缓冲液B 20分钟，从50至80％梯度缓冲液B 16分钟。步骤2-7中的2分钟缓冲液C百分比(x)如下10、20、30、40、70、90和100％。步骤8有下述特征组成用100％缓冲液A洗涤5分钟，用100％缓冲液D盐洗20分钟和0-80％梯度缓冲液B 100分钟。
HPLC柱直接连接到装配有纳米-LC电喷射离子化源的Finnigan LCQ离子阱质谱仪(Finnigan，Bremen，Germany)。根据生产商的说明进行MS-MS模式的质谱。通过对swiss.fasta数据库的sequest算法鉴别肽。
MALDI-PSD质谱作为如上所述通过离子阱MS/MS进行序列分析的备选方案，使用软件FLEXControl 1.1α在Bruker Ultraflex TOF/TOF质谱仪(Bruker，Bremen，Germany)上进行MALDI-PSD分析，获得数据。使用胰蛋白酶消化的人血清白蛋白(Merck，Darmstadt，Germany)进行校正。首先在reflectron模式扫描肽混合物。然后对于lift模式(MALDI-PSD分析)选择目标肽。使用Xmas 5.1.2和Biotools 2.1软件(Bruker)自动验证得到的肽断裂谱，并使用MASCOT算法(http//www.matrixxcience.com)用于不丰富蛋白数据库的序列鉴别。
肽结合试验肽合成使用F-moc化学合成肽，并通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化。一些肽通过在F-moc合成的过程中在N-端偶联生物素基-氨基-己酸来生物素化。通过MALDI-MS例行地检查肽的纯度。
HLA-DR分子的纯化如(Kropshofer H.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1995；92，8313-8317)所述，通过使用抗-DR mAb L243的亲合层析，从1010EBV-转化的B细胞系或T2-转染子纯化HLA-DR分子。
体外肽结合试验HA(307-319)(PKYVKQNTLKLAT)是来自流感病毒血凝素的免疫显性的表位，它能良好地结合HLA-DR1、DR4和DR5，并且用作报道肽。
将纯化的洗涤剂增溶的HLA-DR1、HLA-DR4或HLA-DR5分子(200nM)与生物素化的HA(307-319)肽(200nM)和分级量的竞争肽(100nM-10uM)于37℃在总体积为50μl的结合缓冲液(50mM磷酸钠，50mM柠檬酸钠，pH5.0，0.1％ Zwittergent 3-12)中共同孵育24小时。
将3×10μl在含有0.05％ Tween-20和1％BSA的PBS中稀释10倍，在微量滴定板(Nunc)中孵育3小时，所述滴定板包被有抗-DR mAb L243。根据生产商的说明，用0.1μg/ml链霉抗生物素-铕(Wallay Oy)孵育45分钟，使平板显影。使用时间分辨的铕荧光和VICTOR多标记计数器(Wallac Oy)对生物素化的HA(307-319)肽向HLA-DR分子的结合进行定量(Arndt SO等，EMBO J.2000；19，1241-1251)。
T细胞识别T细胞的分离使用由半抗原抗体混合物和连接到磁珠上的抗-半抗原抗体组成的CD4+T细胞分离试剂盒(Milteny Biotech)，通过负选择从PBMC中分离出CD4+T细胞。在添加有下述试剂的RPMI培养基中培养T细胞1％自体人血清、1％非必需氨基酸(Gibco，BRL)、1％丙酮酸钠(Gibco，BRL)、1％卡那霉素(Gibco，BRL)和1％谷氨酸(Gibco，BRL)。通过流式细胞分析对分离的CD4+T细胞进行定性控制，显示出下述表型CD3(高)，TcR(高)，CD4(高)，CD8(负的)，CD19(负的)，CD45RO/RA(高)。
肿瘤抗原特异性的T细胞系的生成最初用2×105自体树突细胞刺激1×106T细胞，所述的树突细胞已经用脂多糖(LPS来自Salmonella abortus equi，Sigma)和20μM黑转铁蛋白肽刺激。5天后，加入IL-2(1250U/ml)。每10-14天，用20μM黑转铁蛋白肽(SEQ ID NO13)刺激的自体树突细胞再次刺激响应的T细胞，并且在含有IL-2的培养基中生长。每个再刺激循环后，通过夹心免疫测定检测生长的T细胞对IFN-γ和IL-4的特异性。
STEP分析在含有不同来源(睾丸、脑、脾、肌肉、淋巴(lymph)、脂肪、肺、肺癌、黑素瘤、结肠、结肠癌、转移性结肠癌、前列腺、前列腺癌)的癌和正常组织平板上进行单靶表达谱(Single target expressionprofiling，STEP)用Ultraspec RNA分离试剂盒(Biotecx，BL10100)从快速冷冻的人组织中提取总RNA，并使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)进一步纯化。使用T7-T24引物(5’-GGC CAG TGA ATT GTA ATA CGA CTC ACTATA GGG AGG CGG(dT24))，通过反转录(GIBCO BRL Life Technologies，Grand Island，NY)将15μg总RNA转化成双链cDNA，使用锁相凝胶(phaselock gel)(5Prime-3Prime Inc.)通过苯酚/氯仿/异戊基萃取提纯。使用已知的方法，生成含有5ng/μl的源自总RNA的双链cDNA的主384-孔平板。手工地或通过机器人技术生成子板(最终cDNA浓度40pg/μl(200pg/孔))。使用TaqMan技术，在384-孔光学板上进行双重实时PCR(靶基因和GAPDH作为参考基因)，并在ABI PrismPE7900序列检测系统(Perkin-Elmer Applied Biosystems(PE)，Lincoln，CA)上分析，该系统使用TaqDNA聚合酶的5’核酸酶活性产生实时定量DNA分析试验。每孔中的PCR混合物(25μl)有下述物质组成商业获得的预先混合的GAPDH TaqMan引物/探针(PE)，来自每个靶基因的5’和3’引物各900nM和200nM TaqMan探针，200pg cDNA和TaqMan通用PCR主混合物(PE)。使用下述的PCR条件在50℃进行2分钟，然后在95℃进行10分钟，随后在95℃ 15秒，和在62℃1分钟进行40个的循环。
生成了下述引物对，来特异性地从黑转铁蛋白基因的外显子9中挑出序列，因此受到黑转铁蛋白的长转录产物(抗原性表位源自它)的限制5’-MtfCAGTGCGTGTCAGCCAAGTC(SEQ ID NO14)；3’-MtfTTCCCCGCCGTGTAAATGT(SEQ ID NO15)用下面的带有荧光报道染料和荧光猝灭染料的位点特异性的探针序列进行检测
P-MtfAGCGTCGACCTGCTCAGCCTGG(SEQ ID NO16)用式2ΔcT计算目标基因的相对表达。ΔcT是当荧光信号超过阈值时的GAPDH基因相对目标基因的热循环差异。将GAPDH在每种组织中的表达调整到8个持家基因块的表达水平。
抗体小鼠单克隆抗体L235是黑转铁蛋白特异性的IgG1同种型的抗体。能生成该抗体的杂交瘤细胞系购自ATCC(HB-8446)。
结果鉴别出的黑转铁蛋白的表位能被T-细胞识别(图4)。用自体树突细胞(其已经用鉴别出的黑转铁蛋白表位和LPS刺激)重复地再刺激来自HLA-DR4阳性供体的T细胞，会产生特异性地识别该表位的T-细胞系。诱导的T-细胞系能排它地分泌IFN-γ，而不是IL-4。根据抗原的剂量，T-细胞反应是可滴定的。从而鉴别出的黑转铁蛋白表位是免疫原性的，且因此是肽疫苗的备选品。
而且，还可以从黑素瘤细胞系UKRV-Mel-17(它强烈表达黑转铁蛋白且是HLA-DR4阳性的)的HLA-DR分子洗脱鉴别出的表位。而且，已经从该细胞系的HLA-DR分子洗脱并鉴别出新的MART-1抗原性肽(SEQ ID NO21)(表4)。已经知道MART-1是肿瘤抗原(Kawakami Y.，Eliyahu S.，Delgado C.H.，Robbins P.F.，Rivoltini L.，Topalian S.L.，MikiT.，Rosenberg S.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.913515-3519(1994)；Coulie P.G.，Brichard V.，van Pel A.，Woelfel T.，Schneider J.，Traversari C.，Mattei S.，de Plaen E.，Lurquin C.，Szikora J.-P.，Renauld J.-C.，Boon T.，J.Exp.Med.18035-42(1994))。
黑转铁蛋白在大多数黑素瘤细胞系上表达，其中的一些表现出非常强烈的表达(图5)。用于鉴别取自死亡的Ma-Mel 18a细胞的新型抗原的树突细胞自身不能表达黑转铁蛋白。
使用一组正常的对癌症的组织的mRNA表达方案表明，黑转铁蛋白在所有观察的正常组织中都非常缺乏，但是在几种肺癌中强烈表达，还在结肠癌细胞中较少程度地表达(图6)。
关于黑转铁蛋白在某些肿瘤组织中的特异性表达、其在黑素瘤细胞中的广泛表达和鉴别出的表位特异性地激活T-细胞的能力，新鉴别出的黑转铁蛋白表位能满足可以用于肽疫苗接种的新型肿瘤抗原的要求。
实施例1用上述的方法学(图1)鉴别源自黑素瘤细胞系UKRV-Mel-15a(或从其诱导的)新的与HLA-DR-相关的肿瘤肽。该黑素瘤细胞系UKRV-Mel-15a自身不能表达HLA-DR分子。
将3×106树突细胞与9×106黑素瘤系UKRV-Mel-15a的死亡细胞共孵育，在存在TNFα(10ng/ml)的情况下培养24小时。作为对照，在只存在TNFα(10ng/ml)的情况下培养3×106树突细胞。
在洗涤剂TX-100中裂解两组树突细胞，并使用抗-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。用0.1％TFA洗脱与HLA-DR相关的肽，通过MALDI-MS分析(图2A)在该实施例中，通过MALDI-MS光谱测定法对比来自两种DC培养物的HLA-DR相关肽，通过连续测序只用包含在用黑素瘤细胞刺激的DC的图谱中的肽信号来鉴别新的表位。
MALDI-MS分析揭示了一个在与未刺激的DC相比的刺激过的DC谱中的观察到的质谱为m/z＝1820.6的显著信号(图2A)。
通过MALDI-PSD片段测序产生了源自肿瘤抗原波形蛋白(登记号P08670；swissprot)——具有氨基酸序列TLQSFRQDVDNASLAR(图2B；表1，SEQ ID NO.1)的波形蛋白(202-217)的新型表位。离子阱MS-MS序列分析确认了该序列(图2C)。
分析全肽所有组成成分的高通量离子阱MS/MS测序的结果，揭示了该波形蛋白表位的3种其它长度的变体(表1)15-mer波形蛋白(203-217)(SEQ ID NO.2)、14-mer波形蛋白(203-216)(SEQ ID NO.3)和14-mer波形蛋白(202-215)(SEQ ID NO.4)。波形蛋白表位的4种长度的变体与黑素瘤抗原Melan A(51-65)、CDC27(768-782)、酪氨酸酶(448-462)和gp100(44-59)具有适合于结合到HLA-DR4的共同的序列基序(DRB1*0401)(表2)。可以通过涉及合成的波形蛋白(202-217)肽和纯化的HLA-DR4分子的体外结合试验证实向HLA-DR4的结合(图3)根据其对报道肽HA(307-319)的IC50值，波形蛋白(202-217)能高亲和力地结合到HLA-DR4(图3B)，这类似于CDC-27(768-782)，但是较差地结合到DR1(图3A)或DR5(图3C)。
通过本发明的方法鉴别出的波形蛋白(202-217)肽是迄今为止记载的第一种源自HLA II类限制的表位的波形蛋白。
实施例2该方法学还用于鉴别结合到用TNFα-诱导成熟且暴露于坏死的黑素瘤细胞系UKRV-Mel-20c后的树突细胞(DC)的HLA-DR分子的肽。黑素瘤细胞系UKRV-Mel-20c自身不能表达HLA-DR分子。通过高通量离子阱MS/MS技术进行测序。
这样，将5×106树突细胞与1.5×107黑素瘤系UKRV-Mel-20c的死亡细胞共孵育，在存在TNFα(10ng/ml)的情况下培养24小时。作为对照，在只存在TNFα(10ng/ml)的情况下培养5×106树突细胞。
在洗涤剂TX-100中裂解两组树突细胞，并使用抗-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。用0.1％TFA洗脱与HLA-DR相关的肽，通过LC-高通量离子阱MS/MS技术分析。
对比从未刺激的DC(对照)鉴别出的肽序列和从用坏死的黑素瘤细胞刺激的DC鉴别出的肽序列在不存在黑素瘤细胞的情况下鉴别出了35种来自DC的HLA-DR分子的肽序列，在存在UKRV-Mel20c黑素瘤细胞的情况下鉴别出了40种肽序列。对比肽序列发现，21种肽是相同的，14种序列(11种表位)对未刺激的DC是特异性的，17种序列(9种表位)仅仅在黑素瘤细胞刺激后呈递。
重要的是，9种黑素瘤细胞诱导的表位中的3种是源自已知的肿瘤标记蛋白，即翻译因子eIF-4A1(登记号P04765；swissprot)，干扰素-γ(IFNγ)-可诱导的P78(登记号AAD43063；基因座AF135187)和细胞骨架蛋白波形蛋白(登记号P08670；swissprot)(表1)。
从下述事实强调波形蛋白关于作为黑素瘤抗原的重要性使用黑素瘤细胞系UKRV-Mel20c可以鉴别出第二种波形蛋白表位。在该情况下，发现了两种长度的变体波形蛋白(166-183)(SEQ ID NO.5)和波形蛋白(167-183)(SEQ ID NO.6)。与前述波形蛋白表位不同，波形蛋白(167-183)不仅携带HLA-DR4的结合基序(参见表2)，而且似乎是混杂的HLA-DR结合剂，因为它能中等至较好程度地结合到HLA-DR1(图3A)、HLA-DR4(图3B)和HLA-DR5(图3C)。
死亡的UKRV-Mel-20c黑素瘤细胞还产生了源自翻译起始因子eIF-4A1(表1)的3种肽由2种长度的变体eIF4A1(172-187)(SEQ ID NO.7)和eIF4A1(172-186)(SEQ ID NO.8)所代表的一种表位，同时发现其它的是肽eIF4A1(321-338)(SEQ ID NO.9)。
而且，还鉴别出了两种源自干扰素-可诱导的蛋白p78的肽(表1)，为相同表位的长度变体p78(503-516)(SEQ ID NO.10)和p78(503-515)(SEQ ID NO.11)。迄今，p78蛋白仍然指示着前列腺癌。
因而，通过本发明的方法鉴别出的源自翻译因子eIF-4A1、IFNγ-可诱导的p78和波形蛋白的肽是可以用作治疗方案中的诊断标记或疫苗的新的候选肿瘤抗原。
实施例3用第三种黑素瘤细胞系Ma-Mel-18a来鉴别新的与HLA-DR相关的肿瘤肽。黑素瘤细胞系Ma-Mel-18a自身不能表达HLA-DR分子。
这样，将4×106树突细胞与1.2×107黑素瘤系Ma-Mel-18a的死亡细胞共孵育，在存在TNFα(10ng/ml)的情况下培养24小时。作为对照，在只存在TNFα(10ng/ml)的情况下培养4×106树突细胞。
在洗涤剂TX-100中裂解两组树突细胞，并使用抗-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。用0.1％TFA洗脱与HLA-DR相关的肽，通过LC-高通量离子阱MS/MS技术分析。
对比从对照组(未刺激的DC)鉴别出的肽序列和从用死亡的Ma-Mel-18a刺激的DC鉴别出的肽序列(表3)在不存在Ma-Mel-18a细胞的情况下，发现了155种源自75种自身蛋白的自身肽序列。这些自身肽中的22种在遇到死亡的Ma-Mel-18a细胞后消失；但是在对照组中没有发现165种自身肽中的26种。这26种自身肽显然是由Ma-Mel-18a黑素瘤细胞诱导的，它们源自19种蛋白。19种蛋白中的18种是仅由DC表达或者由黑素瘤细胞和DC二者表达。尚未有关于18种蛋白在黑素瘤或其它肿瘤中的记载。
DC不能表达但是Ma-Mel-18a细胞能表达的唯一蛋白是黑转铁蛋白(登记号P08582；swissprot)鉴别出了相同p97表位的两个长度的变体(表1)p97(688-684)(SEQ ID NO.12)和p97(688-683)(SEQ ID NO.13)。
p97是熟知的黑素瘤标记蛋白，但是至今仍没有定义出源自p97的肿瘤抗原肽。
与上述的两种波形蛋白表位(表1，2)类似，p97表位含有HLA-DR4的肽结合基序，所述的HLA-DR4带有分别作为P1、P4、P6和P9的锚的L-672、D-675、T-677和A-680(表2)。与此相一致地，p97(668-683)能高亲和力地结合到HLA-DR4上(图3B)。而且，它以中等亲和力地结合到HLA-DR1(图3A)和HLA-DR5(图3C)。
再根据这些结果，能产生p97鉴别结果的DC和能产生p97肽的鉴别的DC会表达HLA-DR4和HLA-DR1。因此，这里所述的p97表位可以用于多种HLA-DR等位基因。
关于黑转铁蛋白黑素瘤组织中的广泛表达(Palmieri G等，J.Clin.Oncol.1999；17，304-311)，黑转铁蛋白表位可以用作候选的肿瘤抗原。
这样，以能导致MHC II类-和CD4+T细胞介导的免疫反应的黑转铁蛋白为基础的肽疫苗将最适合于对表达黑转铁蛋白的肿瘤的治疗。
表1黑素瘤细胞诱导的与HLA-DR相关的肽抗原
a用于刺激树突细胞的坏死后的黑素瘤细胞的名字b源自黑素瘤细胞的肽的单字母序列c表位在蛋白序列中的位置表2共有HLA-DR4的结合基序(DRB1*0401)的源自黑素瘤细胞的肽抗原
a以单字母表示的肽序列，并且根据HLA-DR4(DRB1*0401)的肽结合基序对比P1锚W，Y，F，I，L，V；P4锚D，E；P6锚T，S，A；P9锚A，S，G；包含P1-P9的核心表位区域标有下划线
bR.-F.Wang，Trends in Immunol 22，269-276(2001)cN.Renkvist等，Cancer Immunol.Immunother.50，3-15(2001).
表3.在缺乏和存在坏死的Ma-Mel-18a情况下DC的与HLA-DR相关的肽所有组成成分(DRB1*0101/DRB1*0401)
a产生鉴别出的肽的蛋白的数目b在缺乏或单独存在Ma-Mel-18a细胞的情况下唯一发现的肽或蛋白的数目表4从HLA-DR4阳性的黑素瘤细胞系UKRV-Mel-17的MHC II类分子洗脱的与黑素瘤的MHC II类限制的表位相关的蛋白
序列表序列表<110> 霍夫曼-拉罗奇有限公司<120> 新MHC II类相关候选肿瘤抗原的鉴定<130> Case 21412<160> 22<170> PatentIn vetsion 3.2<210> 1<211> 16<212> PRT<213> 人<400> 1Thr Leu Gln Ser Phe Arg Gln Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu Ala Arg1 5 10 15<210> 2<211> 15<212> PRT<213> 人<400> 2Leu Gln Ser Phe Arg Gln Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu Ala Arg1 5 10 15<210> 3<211> 14<212> PRT<213> 人<400> 3Leu Gln Ser Phe Arg Gln Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu Ala1 5 10<210> 4<211> 14<212> PRT<213> 人<400> 4Thr Leu Gln Ser Phe Arg Gln Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu1 5 10<210> 5<211> 18<212> PRT<213> 人<400> 5Asn Asp Lys Ala Arg Val Glu Val Glu Arg Asp Asn Leu Ala Glu Asp1 5 10 15Ile Met<210> 6<211> 17<212> PRT<213> 人
<400> 6Asp Lys Ala Arg Val Glu Val Glu Arg Asp Asn Leu Ala Glu Asp Ile1 5 10 15Met<210> 7<211> 16<212> PRT<213> 人<400> 7Ser Pro Lys Tyr Ile Lys Met Phe Val Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met1 5 10 15<210> 8<211> 15<212> PRT<213> 人<400> 8Ser Pro Lys Tyr Ile Lys Met Phe Val Leu Asp Glu Ala Asp Glu1 5 10 15<210> 9<211> 18<212> PRT<213> 人<400> 9Gly Ser Ser Arg Val Leu Ile Thr Thr Asp Leu Leu Ala Arg Gly Ile1 5 10 15Asp Val<210> 10<211> 14<212> PRT<213> 人<400> 10Lys Ser Lys Ile Glu Asp Ile Arg Ala Glu Gln Glu Arg Glu1 5 10<210> 11<211> 13<212> PRT<213> 人<400> 11Lys Ser Lys Ile Glu Asp Ile Arg Ala Glu Gln Glu Arg1 5 10<210> 12<211> 17<212> PRT<213> 人<400> 12Gly Gln Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg Ala Val Pro Val
1 5 10 15Gly<2l0> 13<211> 16<212> PRT<213> 人<400> 13Gly Gln Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg Ala Val Pro Val1 5 10 15<210> 14<211> 20<212> PRT<213> 人<400> 14Cys Ala Gly Thr Gly Cys Gly Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Cys Ala1 5 10 15Ala Gly Thr Cys20<210> 15<211> 19<212> PRT<213> 人<400> 15Thr Thr Cys Cys Cys Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Ala Ala1 510 15Thr Gly Thr<210> 16<211> 22<212> PRT<213> 人<400> 16Ala Gly Cys Gly Thr Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala1 5 10 15Gly Cys Cys Thr Gly Gly20<210> 17<211> 24<212> PRT<213> 人<400> 17Leu Pro Lys Pro Pro Lys Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro1 5 10 15Leu Leu Met Gln Ala Leu Pro Met20
<210> 18<211> 9<212> PRT<213> 人<400> 18Phe Arg Gln Asp Val Asp Asn Ala Ser1 5<210> 19<211> 9<212> PRT<213> 人<400> 19Val Glu Val Glu Arg Asp Asn Leu Ala1 5<210> 20<211> 9<212> PRT<213> 人<400> 20Leu Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg Ala1 5<210> 21<211> 17<212> PRT<213> 人<400> 21Ala Pro Pro Ala Tyr Glu Lys Leu Ser Ala Glu Gln Ser Pro Pro Pro1 5 10 15Tyr<210> 22<211> 738<212> PRT<213> 人<300>
<308> swissprot/P08582<309> 2001-10-16<313> (1)..(738)<400> 22Met Arg Gly Pro Ser Gly Ala Leu Trp Leu Leu Leu Ala Leu Arg Thr1 5 10 15Val Leu Gly Gly Met Glu Val Arg Trp Cys Ala Thr Ser Asp Pro Glu20 25 30Gln His Lys Cys Gly Asn Met Ser Glu Ala Phe Arg Glu Ala Gly Ile35 40 45Gln Pro Ser Leu Leu Cys Val Arg Gly Thr Ser Ala Asp His Cys Val50 55 60
Gln Leu Ile Ala Ala Gln Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly Gly65 70 75 80Ala Ile Tyr Glu Ala Gly Lys Glu His Gly Leu Lys Pro Val Val Gly85 90 95Glu Val Tyr Asp Gln Glu Val Gly Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala Val100 105 110Val Arg Arg Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys Gly Val Lys115 120 125Ser Cys His Thr Gly Ile Asn Arg Thr Val Gly Trp Asn Val Pro Val130 135 140Gly Tyr Leu Val Glu Ser Gly Arg Leu Ser Val Met Gly Cys Asp Val145 150 155 160Leu Lys Ala Val Ser Asp Tyr Phe Gly Gly Ser Cys Val Pro Gly Ala165 170 175Gly Glu Thr Ser Tyr Ser Glu Ser Leu Cys Arg Leu Cys Arg Gly Asp180 185 190Ser Ser Gly Glu Gly Val Cys Asp Lys Ser Pro Leu Glu Arg Tyr Tyr195 200 205Asp Tyr Ser Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Gly Ala Gly Asp Val210 215 220Ala Phe Val Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Thr Asp Gly Lys Thr225 230 235 240Leu Pro Ser Trp Gly Gln Ala Leu Leu Ser Gln Asp Phe Glu Leu Leu245 250 255Cys Arg Asp Gly Ser Arg Ala Asp Val Thr Glu Trp Arg Gln Cys His260 265 270Leu Ala Arg Val Pro Ala His Ala Val Val Val Arg Ala Asp Thr Asp275 280 285Gly Gly Leu Ile Phe Arg Leu Leu Asn Glu Gly Gln Arg Leu Phe Ser290 295 300His Glu Gly Ser Ser Phe Gln Met Phe Ser Ser Glu Ala Tyr Gly Gln305 310 315 320Lys Asp Leu Leu Phe Lyg Asp Ser Thr Ser Glu Leu Val Pro Ile Ala325 330 335Thr Gln Thr Tyr Glu Ala Trp Leu Gly His Glu Tyr Leu His Ala Met340 345 350Lys Gly Leu Leu Cys Asp Pro Asn Arg Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Trp355 360 365Cys Val Leu Ser Thr Pro Glu Ile Gln Lys Cys Gly Asp Met Ala Val
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Tyr Arg Gly Trp Leu Gly Leu Asp Tyr Val Ala Ala Leu Glu Gly Met690 695 700Ser Ser Gln Gln Cys Ser Gly Ala Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ala Pro705 710 715 720Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Ala Leu Ala Ala Arg Leu Leu Pro Pro725 730 735Ala Leu
权利要求
1.一种分离的MHC II类抗原性肽，其包含选自由SEQ ID NO.1-13和21组成的组氨基酸序列。
2.根据权利要求1的抗原性肽，其中所述的肽在羧基或氨基端有氨基酸缺失且保持结合能力。
3.根据权利要求1和2的抗原性肽，其中所述的肽序列含有至少一个氨基酸修饰以增强所述肽与MHC II类分子的结合。
4.根据权利要求1-3中任一项的抗原性肽，其与MHC II类分子相连。
5.抗体，其与权利要求1-3的抗原性肽反应。
6.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求1-4中任一项的肽或多肽。
7.一种重组核酸构建体，其包含可操作地连接表达载体的权利要求6的核酸分子。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求7的核酸构建体。
9.一种生产根据权利要求1-3中任一项的MHC II类抗原性肽的方法，其包括下述步骤在允许表达所述肽的条件下培养权利要求8的宿主细胞，并从所述细胞或培养基中回收该肽。
10.一种药物组合物，其含有权利要求1-4中任一项的抗原性肽和可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
11.权利要求1-4中任一项的分离的抗原性肽，用于诊断、预防和治疗疾病，优选癌症。
12.根据权利要求1-3中任一项的MHC II类抗原性肽作为癌症诊断标记的应用。
13.根据权利要求12的应用，其中所述的MHC II类抗原性肽是黑素瘤的诊断标记。
14.包含选自由SEQ ID NO.12和13组成的组的氨基酸序列的MHC II类抗原性肽的作为肺癌诊断标记的应用。
15.SEQ ID NO22的多肽作为肺癌诊断标记的应用。
16.权利要求1-4中任一项的抗原性肽在生产药物中的应用，所述的药物用于刺激哺乳动物中的保护性抗体或免疫细胞的生成。
17.权利要求1-4中任一项的抗原性肽在生产药物中的应用，所述的药物用于通过刺激保护性抗体或免疫阳性的CD4+T细胞的生成来预防或治疗黑素瘤。
18.包含选自由SEQ ID NO.12和13组成的组的氨基酸序列的MHC II类抗原性肽在生产药物中的应用，所述的药物用于通过刺激保护性抗体或免疫阳性的CD4+T细胞的生成来预防或治疗肺癌。
19.实质上如前面所述，更具体地参考前面的实施例的抗原性肽、核酸、宿主、方法和应用。
全文摘要
本发明提供了新的天然加工的抗原性肽，它们是黑素瘤和其它肿瘤的备选肿瘤抗原。这些抗原性肽由人MHC II类HLA－DR分子呈递。它们源自翻译因子eIF－4A、IFN－γ－可诱导的蛋白p78、细胞骨架蛋白波形蛋白和结合铁的表面蛋白黑转铁蛋白。本发明的抗原性肽可以用作诊断各种肿瘤的标记和在治疗中用作抗肿瘤疫苗。
文档编号C07K14/74GK1688602SQ03823680
公开日2005年10月26日 申请日期2003年9月24日 优先权日2002年10月2日
发明者哈拉尔·克罗普绍夫尔, 蒂尔·亚历山大·勒恩, 安妮·沃格特 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司