专利名称：保持内源性促红细胞生成素组织保护活性的长效促红细胞生成素的制作方法
技术领域：
本发明涉及经修饰的能较好保持组织保护能力的长效促红细胞生成素。特别的，本发明涉及经化学修饰的长效促红细胞生成素，所述化学修饰延长了其在血清中的半衰期但还保持了天然蛋白在体内的组织保护功能。本发明还涉及使用本发明所述长效促红细胞生成素来治疗贫血及其相关疾病。最后，本发明涉及一种分析促红细胞生成素是否具有组织保护能力的检测方法。
背景技术：
自然生成的或内源性的促红细胞生成素(EPO)是一种主要由肝脏产生的糖蛋白激素。内源性的EPO包含165个氨基酸，分子量(人类的)为大约30,000大约到34,000道尔顿。EPO中的糖基，其由3个N-连接和1个O-连接的寡糖链构成，它占了整个蛋白质分子量的大约40％。N-连接的寡糖链结合在24，38和83位的天冬酰胺的氨基氮上，而O-连接的寡糖链结合在126位上的丝氨酸残基的氧原子上。EPO可能存在3种形式α、β和脱唾液酸形式(Asialo)。α和β形式具有相同的效力，生物活性，和分子量，但在糖类的组成上略有不同，而脱唾液酸形式是除去了末端唾液酸(糖类)的α或β形式。
直到最近，内源性的EPO的主要功能是和其它生长因子一同刺激响应性骨髓红细胞前体细胞的增殖和成熟，以及保持个体的血细胞比容(在含有红细胞的全血中所占的百分率)。红细胞的产生过程称为红细胞生成，它是—种被精确调控的生理机制，在不妨碍循环的情况下优化红细胞的数量使其满足组织氧化的需要。例如，当红细胞输送的氧减少时，EPO通过刺激骨髓中前体细胞吞转运化为成熟的红细胞增加红细胞的产生，产生的红细胞随即进入循环体系中。当循环系统中的红细胞的数量超过正常组织循环需要时，循环体系中的EPO就减少。因此，当机体处于健康状态时，血浆中EPO的浓度是非常低，仅足以刺激替代由于老化而正常损失的红细胞。血浆EPO的正常范围是从0.01单位/ml到0.03单位/ml。
假定个体中大多数的EPO是由肾产生的，肾功能的损失，例如慢性肾衰竭(CRE)，会导致EPO数量的减少并且常常会导致贫血。同样，贫血可能由其它的慢性疾病，例如癌症，或与这些疾病相关的治疗，如化疗所引起。因此，已经证明，给红细胞减少的个体施用重组的EPO(后面将详细叙述到)能够有效的恢复血细胞比容的水平，所述重组的EPO与内源性EPO有基本上同样的生物活性。
除了其在慢性症状下保持血细胞比容水平中的作用外，重组EPO已经被用于在选择性或预定的手术之前增加红细胞水平，从而减少或取消输血的需要。例如，施用重组EPO可以解除病人对通过输血而感染病毒或病原的顾虑，或解决宗教上限制输血的问题。
进一步的，近来的一些证据表明，EPO作为细胞因子超家族的一员，具有其它重要的治疗属性，这通过其与EPO受体(EPO-R)的相互作用来介导。例如，EPO及其受体在缓减组织损伤中起着重要的作用，因为EPO和其受体相互作用提供了改变缺氧细胞微环境的补偿性应答，以及调控由于代谢压力产生的程序性细胞死亡。事实上，患有慢性肾衰竭和/或癌症的病人使用EPO治疗后，一般会提高康复的感觉或智力的敏锐性，这样的效果此前被归功于病人血细胞比容的增加。但近来，如在国际申请号WO/02053580和美国专利公开号2002/0086818和2003/0072737中所述的，这些改进被归功于EPO的组织保护和增强的活性。
最近的研究同样表明，全身性施用的EPO可以通过血脑屏障，因为形成血脑屏障的毛细管也表达EPO受体。因此，这提供了从外周循环到脑部的受体介导的胞吞作用的解剖基础。
重组EPO(epoetinα)，可以通过商业途径获得，如商品名为PROCRIT(来自Ortho Biotech Inc.，Raritan，NJ)，和EPOGEN(来自Amgen，Inc.，Thousand Oaks，CA)，已经用于治疗由晚期肾病引起的贫血，同AZT(叠氮胸苷)疗法一起使用来治疗感染HIV的病人，和用于抵消化疗的影响。虽然重组EPO的治疗作用有很多种，但至今为止重组EPO最主要的用途是缓减慢性贫血。在这一点上，在大约6到8周内重组EPO典型的初始施用剂量是50-150单位/kg每周三次，静脉或皮下注射给药，以恢复病人体内指导性的血细胞比容范围。当病人获得预期的血细胞比容水平，例如在约30％到约36％之间的量之后，可以在无缺铁或并发症的情况下通过维持EPO疗法而维持所述的血细胞比容水平。虽然剂量的要求可能根据患者个体的需求而变化，但通常维持剂量可以是每周约给药三次(如果剂量更大的话，次数可以更少)。
重组EPO的施用剂量和次数部分取决于该分子的半衰期，当分子处于体内时可能是很有限的。例如，据报道在患有CRF的成年及儿童病人中，静脉施用的EPOGEN以符合一级动力学的速率被清除，其循环半衰期在约4-13小时范围内。因此，为了达到治疗效果考虑到重组EPO相对较短的半衰期，对施用剂量和效率进行调整。
另外，因为重组EPO通过静脉或皮下注射，这常常就需要护士或医师来给病人注射重组EPO。这给病人带来了更多的不便，这也就成为另外一个之所以要考虑分子半衰期延长的原因。因此，增加重组EPO半衰期的研究在过去的十年中受到重视，这基于如下前提，即延长的半衰期可以减少需求的剂量，同时也提供了相同的或改进了的治疗效果。
事实上，关于人类EPO最新的实验表明，EPO中含有唾液酸的糖含量，它的循环半衰期，和体内活性之间有着直接的关系。正如PCT公开号WO95/05465中描述的那样，唾液酸残基加在糖链的末端并阻止了肝脏对半乳糖的识别。典型地，每条N-连接的寡糖链含有至多4个唾液酸，每条O-连接的寡糖链含有至多2个唾液酸。因此，未被修饰的EPO多肽总共可以含有最多14个唾液酸。
随着时间的推移，这些唾液酸残基可能从蛋白质上断裂，从而暴露了可以被肝脏识别的半乳糖链。一旦肝脏识别到半乳糖链，蛋白质就从血液中过滤掉了。因此，据信逐步增加每个EPO分子所含有的唾液酸，可以更好的避免半乳糖链的暴露，也相应的逐步增加了它的生物活性(通过检测分离的相同分子量浓度的促红细胞生成素提高正常老鼠的血细胞比容的能力方法)。由于未修饰的EPO仅含有14个唾液酸位点，这样的结构限制了EPO半衰期的延长。这导致了如下假说即工程化的含有额外寡糖链的EPO类似物可能具有更强的生物学活性。通过提供额外的糖基化位点，含有末端的额外的寡糖链可以被唾液酸残基修饰。参见PCT公开号为WO91/05867，WO94/09257和WO01/81405的申请。
例如，修饰的EPO类似物可以至少含有一个额外的N-连接的糖链和/或至少—个额外的O-连接的糖链。特别是在WO01/81405中公开了在分子的30、51、57、69、88、89、136和/或138位点的氨基酸处增加N-连接的糖链。修饰过的EPO分子可以在任何位置含有1-4个额外的糖基化位点，使得EPO分子可以增加2-16个唾液酸残基。
虽然这些增加EPO血清半衰期的努力已经被证明是成功的并且在保持血细胞比容水平上证明是有用的，但是却没有注意到这些额外的糖基化位点对EPO的其它功能可能产生的影响。
因此，需要提供延长了血清半衰期(长效)并保持了内源性EPO的功能的经修饰的EPO。特别的，本领域内需要一种长效的EPO化合物，其具有促红细胞功能和组织保护功能，用于治疗贫血和/或相关疾病的药物组合物。另外，人们还需要用于确定一种特定的EPO对内源性EPO的组织保护能力是否具有拮抗性的检测方法。
发明概述本发明涉及一种调节人类血细胞比容水平的方法，包括提供一种比重组人类促红细胞生成素(rhuEPO)有更长血清半衰期的、具有组织保护功能的促红细胞生成素产品的步骤和施用治疗有效量的该促红细胞生成素产品的步骤。在一个技术方案中，提供促红细胞生成素产品的步骤还包含使用至少一种化学修饰在至少—个N-连接的寡糖链或O-连接的寡糖链上修饰重组EPO的步骤，这里所述的化学修饰包括氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化或它们的组合。
另外，施用治疗有效量的促红细胞生成素产品的步骤，可以包含施用低于rhuEPO摩尔量的该促红细胞生成素产品，以达到相当的血细胞比容。
在一个技术方案中，其血清半衰期至少比rhuEPO的血清半衰期长20％。在另一个技术方案中，其血清半衰期至少比rhuEPO的血清半衰期延40％。
本发明也涉及人造促红细胞生成素产品，其包含至少一种促红细胞生成素衍生物，其中至少一个N-连接的寡糖链或至少一个O-连接的寡糖链上有至少一种化学修饰所述化学修饰来源于氧化、硫化、磷酸化、PEG化或它们的组合，这里所述的促红细胞生成素产品具有比rhuEPO更长的血清半衰期。该促红细胞生成素产品最好具有组织保护功能。
在一个技术方案中，至少一种化学修饰包括至少一个N-连接的寡糖链或至少一个O-连接的寡糖链氧化以提供至少一个额外的酸性残基。例如，至少一种化学修饰可以包括在至少一个N-连接的寡糖链或至少一个O-连接的寡糖链的硫酸化以提供负电荷增加了的EPO产物。在另一个技术方案中，至少一种化学修饰包括至少一个N-连接的寡糖链或至少—个O-连接的寡糖链的磷酸化以提供负电荷增加了的EPO产物。在另一方面。至少一种化学修饰包括在至少一个N-连接的寡糖链或至少一个O-连接的寡糖链上增加聚乙二醇链。
本发明涉及一种制备具有延长的血清半衰期和组织保护功能的促红细胞生成素的方法，包括如下步骤提供至少一种促红细胞生成素或促红细胞生成素的衍生物；在所述至少一种内源性或重组的促红细胞生成素的至少一个N-连接的寡糖链或至少一个O-连接的寡糖链上进行氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其组合方式的修饰。
修饰的步骤还可以包括将至少一个N-连接的寡糖链或至少一个O-连接的寡糖链上的至少一个邻位羟基用至少一种酸残基进行取代。在一个实施方案中，在至少一个N-连接的寡糖链或至少一个O-连接的寡糖链上的至少一个邻位羟基用至少一种酸残基进行取代的步骤还可以包括用至少多种酸残基进行取代在至少一个N-连接的寡糖链或至少一个O-连接的寡糖链上的至少多个邻位羟基。
在另一技术方案中，修饰的步骤还包括如下的步骤提供一种有机溶剂；在溶剂中溶解促红细胞生成素或促红细胞生成素的衍生物以形成溶液；提供至少一种缩合剂；提供至少一种硫酸盐供体；并且将至少一种缩合剂和至少一种硫酸盐供体混合到上述的溶液中去。在另一个技术方案中，修饰的步骤还包括如下的步骤提供一种有机溶剂；将所述促红细胞生成素或促细红胞生成素衍生物溶解到所有有机溶剂中的形成溶液；提供至少一种缩合剂；提供磷酸；并且将至少一种缩合剂和至少一种磷酸混合到上述的溶液中去。
在另一个技术方案中，修饰的步骤还包括如下的步骤提供一种有机溶剂；在该有机溶剂中溶解促红细胞生成素或促红细胞生成素的衍生物以形成第一溶液；提供至少一种氧化剂；将至少一种氧化剂加到第一溶液中以形成第二溶液；提供至少一种聚乙二醇链；将至少一种聚乙二醇链混合到第二溶液中去。提供至少一种聚乙二醇链的步骤可以包括提供在链的末端含有至少一个伯氨基团的至少一种聚乙二醇链。
本发明也涉及一种治疗有组织损伤危险的病人的贫血的方法，其包括如下的步骤提供一种至少一个N-连接的寡糖链或至少一个O-连接的寡糖链上具有至少一种化学修饰的促红细胞生成素产品，这里所述的化学修饰包括氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其组合；施用治疗有效量的该促红细胞生成素产品，这里所述的促红细胞生成素产品的施用摩尔量低于rhuEPO，但可以达到相当的目标血细胞比容，这里所述的促红细胞生成素产品具有组织保护功能。
在本发明的这一方面，该促红细胞生成素产品优选具有比rhuEPO的血清半衰期长的半衰期。在一个实施方案中，其血清半衰期至少比rhuEPO的血清半衰期长20％。另一方面，其血清半衰期至少比rhuEPO的血清半衰期长40％。
本发明还涉及包括如下成分的药物组合物至少—种治疗有效量的促红细胞生成素的衍生物，其至少一个N-连接的寡糖链或至少一个O-连接的寡糖链上有至少一种化学修饰，所述化学修饰来源于氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其组合方式，这里所述的至少一种促红细胞生成素的衍生物具有比重组红细胞生成素更长的血清半衰期并且具有组织保护功能。在一个实施方案中，该药物组合物还包含至少一种药学上可接受的载体。该至少—种药学上可接受的载体可以包含至少一种稀释剂、佐剂、赋形剂、载体、或其组合。
在另一个实施方案中，该该药物组合物还包含至少一种润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂、或其组合。在另一个实施方案中，该该药物组合物还包含至少一种组织保护因子。
本发明进一步的特征和优点在结合下述附图进行的详细描述之后将变得更清楚，有关的附图描述如下FIG.1A是不同形式的EPO对于暴露在三甲基锡中引起的细胞死亡的保护作用有效性的比较；和FIG.1B是不同形式的EPO对于暴露在三甲基锡中引起的细胞死亡的保护作用有效性的比较。
发明详述本发明涉及具有延长了的血清半衰期(长效)的EPO分子的应用，对所述EPO分子用糖链进行化学修饰从而得以保持内源性EPO的功能。正如在背景技术中描述的那样，延长EPO半衰期的努力，通常集中在给EPO分子增加额外的糖链以防止半乳糖链的暴露。但是据信，增加的糖链影响了EPO类似物的功能，从而使得，例如，该功能被损害以获得较长半衰期。虽然已知的比重组EPO具有更长半衰期的EPO类似物具有红细胞生成活性，但这些类似物没有保留最近发现的EPO的其它治疗功能，如，组织保护活性。
例如，对应于EPO的30-47位的17个氨基酸的片断，也被称为O’Brien肽，已经在体外显示具有组织保护活性，但是在体外却没有促红细胞活性。Campana，W.M.，Misasi，R.&O’Brien，J.S.，Int.J.Mol.Med.，1，235-41(1998)。因此，据信在O’Brien肽内具有额外的糖基化位点的修饰过的EPO分子在其它体外试验中不具备组织保护活性。另外，因为EPO分子的三维取向对于其功能起着重要作用，增加的糖基化位点可能影响分子的整体功能。
因此，本发明涉及长效的EPO，其具有红细胞生成活性、组织保护活性、胞吞转运(transcytosis)能力中的至少一种或其组合。优选的，本发明所述的长效EPO具有组织保护活性、胞吞转运作用中的至少一种以及红细胞生成活性。
在一个具体的方案中，本发明所述的长效EPO具有比重组EPO长至少约20％的血清半衰期。在另一个实施方案中，本发明所述的长效EPO具有比重组EPO长至少约30％的血清半衰期。在又—个实施方案中，本发明所述的长效EPO具有比重组EPO长至少约40％的血清半衰期。
简单的说，与天然(内源性)EPO，优选与天然的人类EPO相比，本发明所述的长效EPOs包括带有通过至少一种修饰而改变的糖链的EPO分子。在一个实施方案中，本发明所述的长效EPOs经过对糖链的多种修饰。
在一个实施方案中，把天然EPO糖链的邻位(vicinyl)羟基氧化成酸性残基以制备本发明所述的长效EPO分子。在另一个实施方案中，用更稳定的酸性残基取代EPO分子上的唾液酸残基。在又一个实施方案中，对EPO糖链的硫化和/或磷酸化会产生本发明所述的长效EPO。在再一个实施方案中，可以在EPO糖链加上聚乙二醇以获得本发明所述的长效EPO。前述修饰的任意组合也包括在本发明中。并且，正如前面提到的那样，本发明还包含组合物，包括药物组合物，其包含一种或几种前面提到的长效EPO分子。
本发明所述的长效EPO分子预期应用于药物组合物中，该药物组合物可以治疗贫血及相关疾病、尤其是由包括但不限于急性肾衰竭、脓血症、HIV、化疗等等疾病所引发的并发症。
本发明也涉及治疗贫血及相关疾病的方法，同时涉及一种用于治疗过程的试剂盒。这里用到的术语“治疗”指药物治疗和预防或防护的措施，其目的是为了防止或减缓(减少)靶向的病理状况或失调。那些需要治疗的对象包括已经患有该失调(disorder)的对象，以及那些易感该失调的对象，或那些有待于对该失调进行预防的对象。本发明包括该长效EPO可用于慢性给药、急性治疗、和/或间断性给药。为了本文的目的，“慢性给药”是指相对于急性给药模式而言以连续的模式给药，以利于长期保持起始治疗效果(活性)，“间断性给药”不是无间断地连续进行的，而是循环进行的。
本发明所述的长效EPO，和其用途，可以应用于任何哺乳动物。在这里，术语“哺乳动物”是指任何分类在哺乳类的动物，包括人类、驯服的和圈养的动物，和动物园的、比赛用的、或宠物，如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔子等。优选的哺乳动物是人。本发明所述的长效EPO的给药包括但不限于，口服、静脉内、鼻内、局部、腔内、吸入或非肠胃给药，后者包括静脉、动脉、皮下、肌内、腹腔内、黏膜下层、皮内，及其组合方式。
本发明还涉及本发明所述的长效EPO的应用，其作为其它分子进入体内具有EPO受体的区域的载体。例如，因为一些分子具有低的血脑屏障穿透能力，将这些分子与本发明所述的长效EPOs分子连接，就为这些分子进入脑部提供了一个安全有效的转运体系。并且，随后将详细讨论，因为身体的其它区域表达EPO受体，如视网膜、心脏、和肺，本发明所述的长效EPO可以为对于在这些区域穿透力低的分子担当起转运体系的角色。
进一步，本发明涉及确定特定的EPO是否保持了内源性EPO的功能的检测方法。例如，本发明所述的检测可以确定修饰过的EPO是否具有组织保护活性，也就是内源性EPO的激动剂。在这里，术语“激动剂”用于其最宽的含义，包括那些模拟天然EPO生物活性的分子。用同样的方式，术语“拮抗剂”最广义上讲包括那些部分或全部阻断、抑制、或中和天然EPO活性的分子。在一个实施方案中，在体外分析中检测特殊EPO的存在，如P19细胞和/或老鼠运动神经元分析。在另—个实施方案中，本发明所述的检测包括评价特殊EPO在体内的活性，使用各种不同的分析方法如大鼠定点局部缺血、大鼠视网膜缺血、脊椎损伤、和荷包牡丹碱发作模型。
功能正如在背景技术部分描述的那样，为了增加EPO半衰期的各种尝试已经成功，因为其得到了具有较长半衰期和保持促红细胞生成活性的EPO类似物。并且，正如描述的那样，具有较长半衰期的EPO类似物主要包括在其氨基酸序列上增加额外糖链的EPO分子。但是可以预见到，增加的糖链可能影响EPO的其它治疗活性，如组织保护功能和分子胞吞转运作用。不受任何特别的理论的局限，基于O’Brien肽对组织保护功能的重要性，在O’Brien肽上增加糖链，可能影响其功能。另外，增加的糖链，不论是在O’Brien肽内或之外，据信都会影响到分子的三维取向。例如，在分子的三维构型中，增加的糖链可能阻断分子中对其功能来说必不可少的区域。进一步的，据信糖基化的方法(或增加糖链)可能也会影响到糖蛋白的功能。
组织保护能力为了评价增加的糖链影响糖蛋白功能的可能性，本发明人研究了各种形式的具有5个N-连接糖链(相比于重组EPO的3-个N-连接的糖链)的EPO类似物。具体说来，本发明人使用了EPO类似物，所述类似物在32位氨基酸处有额外的糖基化位点，其导致了比重组EPO(epoetinα)延长了约3倍的半衰期。
虽然该EPO类似物在全身注射后在脑脊髓液中出现(图1A)，但在随后的体外P19检测(图1B)中惊奇的发现没有组织保护活性。这种组织保护活性的缺失是意外的。另外，如果这些病人有需要组织保护能力的其它病况的话，组织保护活性的缺失可能会在治疗贫血病人时引起并发症。例如，如果这些没有组织保护活性的EPO类似物与有组织保护活性的内源性EPO竞争那些引发组织保护应答的受体，由损伤产生的受伤程度可能会由于这样的EPO的作用而实际上被加重。事实上，如果遭受中风的病人施用这样的EPO类似物，相比较于没有使用EPO类似物治疗的个体来说，由中风引起的梗塞体积实际上可能会更大。
不受束缚于任何特殊的理论，这些发现揭示了至少一种额外的EPO受体类型功能性地存在于神经组织中，其发出的信号不同于红细胞前体所发出的信号，存在某种EPO类似物可能拮抗内源性EPO与这种形式的受体结合的能力的危险。内源性EPO和这些EPO类似物的明显不同的生物活性揭示了受体是通过相应于EPO分子不同结构域的功能差异EPO受体产生信号的。事实上，虽然已经报道EPO受体基因蛋白质序列与红细胞前体所表达的相同，但在体外，神经型EPO受体的结合亲和力大大低于前红细胞的EPO受体。参见，例如Masuda，S.，等，J Biol Chem，268，11208-16(1993)。可能，这些不同是由辅助蛋白引起的，并且可能表明其中所用到的信号传导途径不同于红细胞成熟过程中活化的途径。有趣的是，这种亲和力上的不同不会被EPO的完全去糖基化所修饰，如果在正常的非糖基化的EPO的AB环域出现神经活性结合的话，这就并非是一个意外的结果。此外，由星形胶质细胞产生的EPO(可能是与其他细胞例如神经元所产生的相同的产物)也比由肾所产生的要小。Masuda，S.，J.Bio Chem，269，19488-93(1994)。这种差异似乎是由糖基化程序的差异引起的。脱唾液酸的天然配体与这些已知受体蛋白的亲和力是否有差异尚未确定，但是明显是有关系的。
除了存在EPO受体修饰的辅助蛋白，EPO受体是一个复杂的基团，存在多种改变形式，包括截短的可溶受体。Yamaji，R.，等，Eur J Biochem，239，494-500；Yamaji，R.，等，Bichim Biophys Acta，1403，169-78(1998)；Barron，C.，等，Gene，147，263-8(1994)；Chin，K.，等，Brain Res Mol Brain Res，81，29-42(2000)；Fujita，M.，等，Lukemia，11Suppl 3，444-5(1997)；Westenfelder，C.，Biddle，D.L.Baranowski，R &.L.，KidInternat.，55，808-820(1999).是否任何这样的形式都促进EPO的神经活性仍然还没被确定。
进一步，如在背景技术中讨论的那样，O’Brien肽在体外表现出组织保护活性，但在体外却没有促红细胞生成活性。事实上，对在O’Brien肽内包含加入的糖链的EPO类似物进行的分析表明该EPO类似物缺失组织保护功能。这一结果暗示对O’Brien肽的某种修饰，如增加糖链，影响了蛋白的功能。O’Brien肽修饰的EPO类似物可能扮演着对位于体内的内源性EPO的拮抗剂的作用，因为其部分的或全部的阻断内源性EPO结合EPO受体的能力。因此，这样的EPO类似物的使用有着导致由损伤引起的受伤程度增加的危险。因此，在其它体外的检测，例如大鼠运动神经元检测，以及体内检测例如大鼠定点局部缺血检测，荷包牡丹碱发作检测，大鼠视网膜局部缺血检测，和脊髓损伤检测中，据信在O’Brien肽上修饰过的EPO类似物将会缺失组织保护能力。
使用上述的相同EPO类似物，也就是具有5个N-连接的糖链的EPO类似物(相比于重组EPO的3个N-连接的糖链)，发明人研究了该类似物穿过血脑屏障的能力。在全身注射后(图1A和1B)，EPO类似物出现在脑脊液中。不受任何特殊理论的限制，据信该EPO类似物可以穿过完整血脑屏障，因为形成血脑屏障的毛细血管也表达EPO受体，并且为从外周循环到脑部的由受体介导的胞吞转运作用提供了解剖学的基础。这样，其它全身施用的EPO类似物据信也能够穿过血脑屏障，以及其它具有表达EPO受体的毛细血管的屏障。
总的说来，因为现有技术中的EPO类似物在牺牲内源性EPO的至少某些功能的情况下保持促红细胞生成的活性，本领域需要一种长效的EPO，其能够保持内源性EPO已知的全部功能。具有优势的，本发明所述的长效EPO不仅增加了相对于重组EPO较长的血清半衰期，而且保持了内源性EPO的全部功能，即组织保护功能和胞吞转运能力。下面的部分中提供了用于获得此类有益蛋白质的多种修饰EPO的方法。
天然EPO的修饰本发明所述的长效EPO可以用各种方法来制备。总的说来，长效EPO可以通过化学修饰连接在EPO上的糖链来获得。这里，术语“糖链”是指存在于内源性EPO上的N-连接和O-连接的寡糖链，存在于EPO类似物上的增加的N-连接和O-连接的寡糖链，和连接在EPO上的任何其他糖链，尤其是糖链(Sugar chains)。
在—个技术方案中，内源性或重组EPO被修饰以阻止对内源性EPO的组织保护能力的任何干扰。另外，根据本发明，考虑了对EPO类似物进行修饰以提供额外的糖基化位点，其并不位于O’Brien肽，即30-47位的氨基酸序列附近。这里，术语“EPO类似物”是指被修饰的EPO分子，其具有至少1个增加的的N-连接的糖链和/或至少1个增加的O-连接的糖链。在一个实施方案中，用于修饰的EPO类似物在O’Brien肽的5个氨基酸内不含有任何增加的糖基化位点。在另一个实施方案中，该EPO类似物在O’Brien肽的3个氨基酸内不含有任何增加的糖基化位点。在又—个实施方案中，该EPO类似物在O’Brien肽内不含有任何增加的糖基化位点，EPO类似物也可以用于如本发明所述的修饰，前提是应在三维空间上考虑该类似物并且确认增加的糖链没有阻碍到O’Brien肽或降低了组织保护能力。另一方面，考虑了将EPO类似物用于本发明的修饰，前提是糖基化方法不会抑制该肽的组织保护功能。在又一个方面，按照本发明提供的修饰方法修饰的EPO类似物，在O’Brien肽有—个糖链(或更少)。例如，内源性EPO在38位氨基酸处有一个糖链，并且在O’Brien肽内的额外的糖链已被证明抑制该蛋白的组织保护功能。因此，在O’Brien肽上有—个或没有糖链的EPO类似物可以用于修饰。在一个实施方案中，结合在38位氨基酸处的糖链可以重新连接到该肽的其它位置。
根据本发明所述的修饰方法的非限制性实例包括(1)通过邻位羟基的氧化作用在糖链上提供额外的酸性残基；(2)用更稳定的残基取代唾液酸残基；(3)通过硫酸化和/或磷酸化增加促红细胞生成素的负电荷；和/或(4)用更复杂的分子终止糖链。因此，对EPO糖链的修饰可以包括氧化、硫酸化、磷酸化、和/或PEG化以及其它的步骤，它们将在后面详细的描述，并且在实施例1中进一步的举例说明。
糖链的氧化和唾液酸残基的取代化学修饰的本发明所述的长效EPO可以包括在EPO的糖链(糖)上氧化以提供额外的酸性残基。一方面，可以用更稳定的酸性残基取代唾液酸残基。这种类型的修饰相对于内源性EPO而言导致了分子半衰期的增加，这是因为肝脏筛选半乳糖链并将相关蛋白从循环系统中除去，而此时半乳糖链被保护起来使之不被检测到。在EPO糖链上更显著的修饰导致本发明所述的长效EPOs的血清半衰期更多的延长。例如，当更多的邻位羟基被酸取代后，导致了血清半衰期更多的延长。
尽管本领域的普通技术人员知道几种合适的用于改变促红细胞生成素的半乳糖单元的方法，一种合适的方法包括(1)将具有邻位羟基的糖分子用高碘酸盐氧化成醛；和(2)将醛氧化成酸。适合将糖链氧化成醛的试剂对于本领域内普通技术人员来说是熟知的，包括但不限于，高碘酸盐，如高碘酸钠，和糖氧化酶，如半乳糖酶。另外，技术人员知道合适的试剂来转化醛，如定量本尼迪特试剂(Kuantitative Benedict Solution)(可以从Fisher购得)。另一方面，糖分子可以被高碘酸钠氧化，进一步用定量本尼迪特试剂(Fisher)处理将醛转化成酸。
另一方面，EPO异构体，其具有约0-13个唾液酸残基，或EPO类似物，其至少一条糖链缺失唾液酸残基，被半乳糖酶氧化。脱唾液酸形式的EPO可以用于本发明的这一方面，即末端糖基(唾液酸)去除的α或β形式的EPO。优选的使用脱唾液酸的促红细胞生成素。一旦EPO被氧化，使用其他的氧化剂如定量本尼迪特试剂将醛转化成酸。
再一方面，四氧化钌可以用来生成糖链上的酸。由于这些修饰中涉及半乳糖链，即使在转换中涉及的酸从EPO分子中被除去，该分子应该仍然能够躲避肝脏的清除，因为肝脏所筛查的成分半乳糖链将不会被暴露。
增加负电荷本发明的另一方面，本发明所述的长效EPO可以通过在EPO分子上添加硫酸盐和/或磷酸盐来制备，它将会增加分子的负电荷，从而增加分子的半衰期。也就是说，EPO分子的负电荷可以通过硫酸化来增加，其涉及了从硫酸盐供体包括蛋白质，糖脂，葡糖胺聚糖和类固醇来转移磺基。并且，还可以通过将磷酸基团引入到糖中来增加负电荷。
一种合适的用于硫酸化胰岛素的方法描述在S.Pongor等，Preparation ofHigh-Potency，Non-aggregating Insulins Using a Novel Sulfation Procedure，Diabetes，Vol.32，No.12，December 1983。例如，胰岛素的硫酸化可以在有机溶剂中，如二甲基甲酰胺(DMF)，在缩合剂存在的情况下，如N，N’-二环己基二亚胺(DCC)，和硫酸盐供体进行。硫酸化的程度可以通过改变缩合剂的量来控制在8倍范围内。尽管传统制备的硫酸化的胰岛素导致其丧失了胰岛素的主要生物活性，使用Ponger程序制备的硫酸化胰岛素的生物活性在未被修饰胰岛素的78％到87％之间。
类似的步骤用于EPO，本领域的普通技术人员可以控制硫酸化的量从而控制化学修饰的EPO的血清半衰期。例如，可以通过将EPO或EPO类似物溶解在至少一种水溶性碳二亚胺优选为DCC之中，温度约为4℃，而将硫酸加入到蛋白质中，从而增加EPO的负电荷。DCC是优选的硫酸盐供体，本领域的技术人员易知其它的用于本发明合适的硫酸盐供体。
相似的步骤可用于控制EPO的磷酸化，使用磷酸(H3PO4)作为磷酸供体。还有，虽然优选磷酸，但技术人员能够容易的选择其它的磷酸供体来对EPO磷酸化。
糖链末端使用PEGs终止EPO的糖链也可以通过增加至少一种聚乙二醇(PEG)来修饰，其具有悠久的安全的临床历史，分子式如下 PEG也可以是甲氧基化PEG(mPEG)，具有如下的分子式 在一个实施方案中，PEG是氨基PEG，优选在甲基化PEG的末端具有伯氨基团(mPEG-NH2)。末端具有伯氨基团的PEG链是非常有用的功能化多聚物。mPEG-NH2氨基端的基团比一般PEGs的羟基更倾向于发生酰化反应，并且它们也容易发生氨基还原反应(reductive amination reactions)。在另一个实施方案中，PEG是亲电子活化的PEG，如mPEG-琥珀酸丙酯(mPEG-SPA)或mPEG-琥珀酸丁酯(mPEG-SBA)，它们都可以从Nektar Therapeutics ofBirmingham，Alabama公司购得。在又一个实施方案中，PEG是甲氧基化的PEG—酰肼。
另一方面，可以通过高碘酸盐(上述讨论的)的氧化作用，随后使用氰基硼氢化物和氨基PEG来增加至少一个PEG。例如，溶液中的EPO首先用高碘酸盐氧化，如高碘酸钠，在室温下反应预先设定的一段时间，在糖链上产生醛。—种合适的高碘酸盐是间高碘酸钠，可以从Sigma公司购得。高碘酸盐然后被缓冲交换去除，与此同时，EPO的N-连接的寡糖链上的氧化的唾液酸基团可在氰基硼氢化物存在的情况下至少与—个氨基PEG接触。可用的适合的PEG包括但不限于，甲氧基化PEG-酰肼，其可以从Nektar Therapeutics ofBirmingham，Alabama公司购得。
另一方面，在用半乳糖酶氧化后，可以通过将PEG基团连接到末端的半乳糖残基来增加至少一个PEG。例如，缓冲液中的脱唾液酸形式的EPO(暴露了末端的半乳糖残基)首先与半乳糖氧化酶(从Sigma公司购得)接触以在糖链中产生醛。然后通过缓冲交换去除缓冲液，同时，在有氰基硼氢化物存在的情况下将氧化的半乳糖残基与至少一种氨基PEG接触。
上面所述的方法并不是限制性的，其它的方法也可以用于制备本发明的化合物。例如，技术人员可以认识到可以将这些化学修饰用于制造其它EPO衍生物的长效形式如在国际公开号WO/02053580和美国专利公开号2002/0086816和2003/0072737中公开的组织保护细胞因子，在此整体引入本发明作为参考。
制备EPO分子各种宿主表达载体系统可以用于生产本发明所述的长效EPO和EPO相关分子。此类宿主表达载体代表了一类载体(vehicle)，通过这些载体，感兴趣的长效EPO得以生产出来并随后被纯化；也代表了一类细胞，当所述细胞被适当的核苷酸编码序列转化或转染时，可以原位表达经修饰的促红细胞生成素基因产物。这些包括但不限于，细菌，昆虫，植物，哺乳动物宿主系统，例如但不限于，用含有编码长效EPO产物的序列的重组病毒表达载体(如棒状病毒)感染的昆虫细胞体系；用含有编码促红细胞生成素相关分子的序列的重组质粒表达载体(如，Ti质粒)转化或重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染的植物细胞系统；或哺乳动物细胞体系，包括人类细胞体系，如HT1080，COS，CHO，BHK，293，3T3，其中含有重组表达构建体，所述构建体中含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子，如金属硫蛋白启动子，或来源于哺乳动物病毒的启动子，如腺病毒晚期启动子，牛痘病毒7.5K启动子。
另外，选择的宿主细胞株可以调控插入序列的表达，或以期望的特有方式修饰和加工基因产物。蛋白产物的这样的修饰和加工，对于蛋白的功能而言可能是非常重要的。本领域的技术人员知道不同的宿主细胞具有特定的蛋白和基因产物翻译后加工和修饰的机制。可以选择合适的细胞系或宿主体系以保证对表达的外源蛋白进行正确的加工和修饰。在这一点上，具有用于初级转录产物的正确加工，基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞可以使用。这样的哺乳动物宿主细胞包括人类宿主细胞，其包括但不限于HT1080，CHO，VERO，BHK，HeLa，COS，MDCK，293，3T3，和WI38。
为了长期、高产量的产生重组蛋白，优选稳定的表达体系。例如，可以工程化稳定表达重组的组织保护细胞因子相关分子的基因产物的细胞系。不使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以用被合适的表达调控元件所控制，如启动子，增强子，序列，转录终止子，多聚腺苷酸位点等的DNA，以及选择性标记转化。引入外源DNA之后，工程化的细胞可以在营养丰富的的培养基中生长1到2天，然后转移到选择性培养基中。重组质粒中的选择性标记使之具有选择抗性，并且允许将质粒稳定的整合到细胞的染色体中，并生长成点(foci)，其随后可被克隆被扩增到细胞系中。这种方法可有利地被用于工程化表达EPO突变蛋白相关分子的基因产物的细胞系。这样的工程化细胞系在筛选和评价那些影响EPO相关分子基因产物的内源性活性的化合物中可能是特别有用的。
或者，细胞系或微生物中内源性EPO突变蛋白基因的表达特征可以通过在稳定细胞系或克隆微生物基因组中插入异源DNA调控单元以至于插入的调控单元有效的连接在内源性促红细胞生成素突变蛋白的基因上而被修饰。例如，内源性EPO突变蛋白基因其通常是“转录沉默的”，即通常不表达EPO基因，或在细胞系中表达的水平非常低，其可以通过在所述细胞系或微生物中插入能够促进基因产物表达的调控序列。或者，可以通过插入能在多种细胞类型中起作用的混合调控单元来激活转录沉默的内源性EPO基因。
异源调控单元可以插入到稳定的细胞系或克隆微生物中，使之能够有效的连接到内源性促红细胞生成素蛋白的基因上，使用的技术，如靶向同源重组，对本领域技术人员来说是熟知的，并且在法国专利号2646438，美国专利号4,215,051和5,578,461，和国际公开号WO93/09222和WO91/06667中有描述，其公开的内容在此整体引入。
药物组合物本发明也涉及包含本发明所述的长效EPO的药物组合物。因为本发明所述的长效EPOs有利的具有促红细胞生成活性以及组织保护能力和胞吞转运能力，预期它们可以治疗同时也有各种组织损伤的危险如中风和心急梗塞的个体的贫血及相关疾病。另外，预期本发明所述的长效EPOs可用于治疗同时也经历了精神系统恶化如老年性痴呆、帕金森等疾病的个体的贫血和相关疾病。进一步的，本发明所述的长效EPOs可以用来治疗遭受了由正常老化过程产生的病况(如导致跌倒的平衡问题、容易挫伤等)的个体的贫血。还有，本发明涉及本发明所述的长效EPOs作为其它分子载体的应用，其中所述分子难于穿透具有EPO受体的毛细血管的屏障。
例如，前述任何的长效EPOs可以被包含在本发明所述的药物组合物中。另外，各种形式的EPO类似物可以被包含在本发明所述的药物组合物中，并与至少一种组织保护性细胞因子混合，后者将在后面详细的讨论。
本发明所述的药物组合物含有治疗有效量的经修饰的EPO，优选为以纯化的形式存在。制剂应当与给药模式相适应。制成便于施用的形式。换句话说，本发明所述的药物组合物包含一定量的本发明所述的经修饰的EPO，从而使得在使用了正确的剂量和策略的情况下，其靶向的病况可以被治疗。并且，后面将详细讨论，药物组合应当以非毒性剂量施用。
本发明所述的药物组合物可以含有治疗有效量的长效EPO化合物和合适量的药学上可接受的载体，以便提供能够正确向病人给药的形式。在一个具体实施方式
中，术语“药学上可接受的”是指经联邦或州政府的管理机构批准或列在美国药典或其它公认的用于哺乳动物，尤其是人的外国药典上的。术语“载体”是指与治疗剂一同施用的稀释剂，佐剂，赋形剂或药载体。这样的药物载体可以是无菌液体，如水和油的盐溶液，包括石油，动物，植物或合成的来源的，如花生油，大豆油，矿物油，芝麻油等。当药物组合物静脉施用时，盐溶液是优选的载体。盐溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可以作为液体载体，特别是作为注射用溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，凝胶，麦芽，大米，面粉，白垩，硅胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油，滑石，氯化钠，干粉脱脂牛奶，甘油，丙二醇，水，乙醇等。
本发明所述的药物组合物也可以含有少量的润滑剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以制成溶液，悬浮液，乳化液，片剂，丸剂，胶囊，粉剂，缓释剂等形式。
本发明所述的组合物可以制成中性或盐的形式。药学上可接受的盐包括那些与自由氨基形成的盐，如来源于盐酸，磷酸，乙酸，草酸，酒石酸等的盐，以及那些与自由羧基生成的盐，如那些来源于钠，钾，铵，钙，氢氧化铁，异丙基胺，三乙基胺，2-乙胺乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的盐。
含有长效EPO的组合物如前所述，任何本发明所述的长效EPO可用于药物组合物中。在—个实施方案中，由邻位羟基氧化而产生的长效EPO包含在本发明所述的药物组合物中。在另一个实施方案中，本发明所述的药物组合物包含至少一种长效EPO，其是用更稳定的残基取代唾液酸残基产生的。在又一个实施方案中，包含在药物组合物中的长效EPO是通过硫酸化和/或磷酸化增加EPO的负电荷而得到的。在再一个实施方案中，包含在本发明所述的药物组合物中的长效EPO是通过用更复杂的分子如PEG链终止糖链而产生的，。
另外，本发明涉及用本发明所述任何方法产生的长效EPOs的混合物在本发明所述的药物组合物中的用途。例如，本发明所述的药物组合物可以包含至少一种用更稳定的残基取代唾液酸而形成的长效EPO，和至少一种通过硫酸化和/或磷酸化增加EPO的负电荷而形成的长效EPO。
转运体系如前所述，本发明所述的长效EPOs有利地能够跨越具有EPO受体的毛细血管的屏障。因此，本发明的在另一个实施方案中是转运体系，其使用本发明所述的长效EPOs作为一些分子的载体，这些分子进入体内含有EPO受体的靶向区域的屏障穿透能力较低。这样的转运体系优先有利地提供了一种新的安全的跨越完整屏障的转运方法。
在一个实施方案中，转运系统包括本发明所述的长效EPOs和至少一种脑部穿透能力较低的分子，提供了一种新的安全的穿越完整血脑屏障的转运方法。即，本发明所述的长效EPOs让那些脑部穿透能力低的分子扮演了分子“特洛伊木马”的角色，从而增强了脑部摄取小分子或大分子的诊断剂或治疗分子的能力。
事实上，在治疗人类脑部肿瘤中的一个重要问题来源于需要将治疗剂传送到脑部的特定区域，将其分布在脑部肿瘤其中并且靶向作用于脑部肿瘤。在其它情况下可能在诊断和治疗中有效的分子，或是不能以足够量穿过脑部紧邻肿瘤的血脑屏障(BBB)，或是不能以足够量穿过血瘤屏障(BTB)。因此，需要新的传送策略，其专门针对脑部并且能穿过脉管系统。例如，用于诊断或治疗的抗体分子，由于它们的大小而不能以足够量穿过BTB。因此，本发明所述的长效EPOs可以作为载体，使这些分子穿越BBB或BTB。一个可与本发明所述长效EPOs—起使用的分子的例子是反义寡核苷酸，其典型的用于抑制致癌基因信号或对脑部基因的体内表达进行成像。另外，本发明所述的长效EPOs可以包含在各种基因治疗剂中(病毒的或非病毒的制剂)，这些治疗剂通常太大以致于在没有辅助的情况下不能穿过BTB。
进一步的，本发明所述的长效EPOs可以用作各种化疗剂的载体介导的转运者。因为表达在BBB和BTB上的药物活性流出(efflux)转运者活跃地将化疗剂从脑部流回到血内，这些试剂在脑部的分布可能被抑制或阻止。部分地由于这些原因，大部分传统的用来治疗位于中枢神经系统(CNS)外的癌症的化疗分子对于脑部肿瘤的治疗不起作用。因此，使用本发明所述的长效EPO作为这些化疗剂的载体，不仅在把试剂传送到脑部方面是有用的，而且还可用于将试剂保持在脑部用于治疗。在另一个实施方案中，该长效EPO可以与药物一起使用，所述药物抑制活性流出转运者，以进一步的确保吸收这些通常从脑部回流到血液的化疗剂。
另外，本发明也包括修饰过的EPO作为一些分子的载体的应用，这些分子在体内表达EPO受体的其它区域具有低的穿透性。此类细胞的非限制性的例子包括视网膜、肌肉、心脏、肺、肝、肾、小肠、肾上腺皮质、肾上腺髓质、内皮毛细血管、睾丸、卵巢、胰腺、骨、皮肤和子宫内膜细胞。特别的，应答细胞包括但不限于，神经元细胞；视网膜细胞光受体细胞(视杆细胞和视锥细胞)；神经结，双极细胞，水平细胞，无长突细胞和Müeller细胞；肌肉细胞；心脏细胞心肌细胞，搏起点细胞，窦房结细胞，结细胞，和交织组织(心房结与his束)细胞；肺细胞；肝脏细胞肝细胞，星型细胞，和Kupffer细胞；肾脏细胞肾小球，肾上皮细胞，和管状间质细胞；小肠细胞杯形细胞，肠腺(腺窝)和肠内分泌细胞；肾上腺皮质细胞肾小球细胞，束状细胞，和网状细胞；肾上腺髓质细胞嗜铬细胞；毛细血管细胞外膜细胞；睾丸细胞Leydig细胞，Sertoli细胞，和精子细胞及其前体细胞；卵巢细胞Graffian囊和原始卵泡细胞；胰腺细胞Langerhans胰岛细胞，α-细胞，β-细胞，γ-细胞，和F-细胞；骨细胞骨原细胞，破骨细胞，和造骨细胞；皮肤细胞；子宫内膜细胞内膜基质和内膜细胞；和存在于上述器官中的干细胞和内皮细胞。
混合了EPO类似物和组织保护细胞因子的组合物如前所述，本发明所属的药物组合物可以包含具有至少一个增加的N-连接的糖链和/或至少一个O-连接的糖链的EPO类似物(表现出延长的血清半衰期但缺失组织保护活性)与至少一种组织保护细胞因子的混合。例如，具有至少2个增加的N-连接的糖链的EPO类似物，其中一条糖链位于O’Brien肽上，与组织保护细胞因子一起，可以形成本发明所述的组合物。在另一个实施方案中，本发明所述的药物组合物可以包含至少一种组织保护细胞因子和至少一种含有额外糖链的EPO，其中通过在三维空间中考虑该类似物，已知所述糖链阻断了O’Brien肽。在又一个实施方案中，本发明所述的药物组合物包含至少—种组织保护细胞因子和至少—种EPO类似物，所述EPO类似物由于采用了向蛋白质中增加额外糖链的方法而导致其不具有组织保护功能。
具有重新定位的糖基化位点的EPO类似物预期可以用在本发明所述的药物组合物中。不受限于任何特别的理论，据信如果在38位氨基酸处天然生成的糖基化位点被重定位于EPO类似物30-47位氨基酸片断之外的其它位点，那么EPO类似物的组织保护能力相比于在38位具有糖基化位点的EPO类似物将会增强。因此，本发明所述的药物组合物可以包含将38位氨基酸处的糖基化位点重定位在分子其它位点的EPO类似物。重定位的糖基化位点可能发生在51，57，69，88，89，136或138位上，如在PCT公开号WO01/81405中指出的那样。在一个实施方案中，O’Brien肽含有1个或更少的糖链。在另一个实施方案中，O’Brien肽含有2个或更多的糖链。
用于本发明这方面的合适的组织保护细胞因子优选那些缺失对骨髓的作用但保持内源性组织保护作用的细胞因子，但是任何具有组织保护能力的细胞因子也可以用于本发明。例如，合适的组织保护细胞因子包含由胍化作用，脒化作用，氨基甲酰化(甲氨酰化)作用，苦味酸化作用，酰化作用(乙酰化或琥珀酰化)，硝化作用，或其组合方式进行化学修饰而生成的EPOs。另外，至少一个精氨酸，赖氨酸，酪氨酸，色氨酸，半胱氨酸残基或羟基基团被修饰的EPO分子预期也可用作根据本发明该方面的组织保护细胞因子。
还有，另外用于本发明的另外的组织保护细胞因子可以通过有限的蛋白水解、去除氨基和/或以分子生物学技术引入突变取代精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基而获得，所述分子生物学技术在Satake等，1990，Biochim.Biophs.Acta 1038125-9中公开，在此整体引入。例如，合适的组织保护细胞因子包括至少一个或多个突变的EPO，所述EPO在C7S，R10I，V11S，L12A，E13A，R14A，R14B，R14E，R14Q，Y15A，Y15F，Y15I，K20A，K20E，E21A，C29S，C29Y，C33S，C33Y，P42N，T44I，K45A，K45D，V46A，N47A，F48A，F48I，Y49A，Y49S，W51F，W51N，Q59N，E62T，L67S，L70A，D96R，S100R，S100E，S100A，S100T，G101A，G101I，L102A，R103A，S104A，S104I，L105A，T106A，T106I，T107A，T107L，L108K，L108A，S126A，F142I，R143A，S146A，N147K，N147A，F148Y，L149A，R150A，G151A，K152A，L153A，L155A，C160S，16A，C7A，B13A，N24K，A30N，H32T，N38K，N83K，P42A，D43A，K52A，K97A，K116A，T132A，1133A，T134A，K140A，P148A，R150B，G151A，K152W，K154A，G158A，C161A，和/或R162A上有点突变。上面所提到的修饰的实例在共同未决的美国专利公开号2003/0104998，2002/00861816和2003/0072737中进行了描述，在此全文引入作为参考。在本文使用的突变蛋白命名法中，被改变的氨基酸采用如下方式描述首先是天然氨基酸的单字母代码，紧跟的是它在EPO分子中的位置，随后是替换氨基酸的单字母代码。例如，S100E是指在人类EPO分子中，将100位处的丝氨酸替换为谷氨酸。
在另一个实施方案中，组织保护细胞因子可以包含一个或多个上述点突变，前提是所述点突变不包括I6A，C7A，K20A，P42A，D43A，K45D，K45A，F48A，Y49A，K52A，K49A，S100B，R103A，K116A，T132A，I133A，K140A，N147K，N147A，R150A，R150E，G151A，K152A，K154A，G158A，C161A或R162A.
在又一个实施方案中，组织保护细胞因子可以包含点突变的组合，如K45D/S100E，A30N/H32T，K45D/R150E，R103E/L108S，K140A/K52A，K140A/K52A/K45A，K97A/K152A，K97A/K152A/K45A，K97A/K152A/K45A/K52A，K97A/K152A/K45A/K52A/K140A，K97A/K152AA/K45A/K52A/K140A/K154A，N24K/N38K/N83K，和N24K/Y15A。在再一个实施方案中，组织保护细胞因子不包括任一上述组合。在另一个实施方案中，组织保护细胞因子可以包含上述点突变的任何一种，前提是所述点突变不包括任何下述突变组合N24K/N38K/N83K和/或A30N/H32T。
某些修饰或修饰组合可以影响突变蛋白与其受体如EPO受体或第二受体结合能力的灵活性。此类修饰或修饰组合的例子包括但不限于，K152W，R14A/Y15A，I6A，C7A，D43A，P42A，F48A，Y49A，T132A，I133A，T134A，N147A，P148A，R150A，G151A，G158A，C161A，和R162A。对人类生长激素有害的相关突变对本领域的技术人员来说是熟知的。因此，在一个实施方案中，组织保护细胞因子不包含那些可能影响突变蛋白与其受体结合能力的灵活性的一种或多种修饰或修饰组合。对这样的组织保护细胞因子的进一步的讨论包含在共同未决的专利申请号为——，律师案卷号为10165-022-999，申请日为2003年7月1日，名称为“Recombinant Tissue Protective Cytokines andEncoding Nucleic Acid Thereof for Protection，Restoration，and Enhancement ofResponsive Cells，Tissues，and Organs”的美国专利申请，其全部公开的内容引入这里作为参考。
最后，具有组织保护能力的任何细胞因子超家族都可以使用，只要其不影响长效EPO的促红细胞生成活性或血清半衰期。实例包括但不限于，白介素-3(IL-3)，白介素-5(IL-5)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)，色素上皮衍生因子(PEDF)，血管内皮生长因子(VEGF)。
本发明的在另一个方面中，本发明所述的药物组合物包含具有至少一个增加的N-连接的糖链和/或至少一个增加的O-连接的糖链的EPO类似物(具有延长的血清半衰期但缺乏组织保护活性)与至少一种具有组织保护功能的小分子的混合。合适的小分子包括但不限于，类固醇(例如拉扎碱类和糖皮质激素)，抗氧化剂(例如辅酶Q10，α硫辛酸，和NADH)，抗分解酶(anticatabolic enzyme)(例如谷胱甘肽过氧化物酶，超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，合成催化净化剂，和模仿剂)，吲哚衍生物(例如吲哚胺，咔唑，和咔啉)，硝酸中和剂，腺苷/腺苷激动剂，植物化学剂(黄烷类)，草药提取物(银杏和姜黄)，维生素(维生素A，E和C)，氧化酶电子受体抑制剂(例如氧杂蒽氧化酶电子受体抑制剂)，矿物(例如铜，锌，和镁)，NSAIDS(例如乙酰水杨酸，甲氧萘丙酸，和异丁苯丙酸)，和它们的组合。另外，本发明所述的药物组合物含有EPO类似物、组织保护细胞因子、和具有组织保护活性的小分子。
存在于本发明所述的药物组合物中的组织保护细胞因子和/或小分子的量优选足够保持或超过由内源性EPO在神经或其它应答细胞系统中产生的活性。在一个实施方案中，组织保护细胞因子和/或小分子的量足以增强个体的组织保护能力，这是通过保护，维持，或增强促红细胞生成应答细胞的存活力和功能实现的。例如，本发明该方面中所述的药物组合物优选含有有效、非毒性量的组织保护细胞因子，例如约1ng或更多。在一个实施方案中，存在于本发明所述的药物组合物中的组织保护细胞因子的量大约是5mg或更少。在另一个实施方案中，存在于本发明所述的药物组合物中组织保护细胞因子的量大约是500ng到5mg。在又一个实施方案中，药物组合物含有约1μg到5mg的组织保护细胞因子，优选含有约500μg到5mg。在另一个实施方案中，存在于本发明所述的药物组合物中的组织保护细胞因子的量更大，约为1mg到5mg。本领域的技术人员熟知，给病人施用的药物组合物的剂量取决于以下因素，但不限于，病人的身体状况和服药的频率。关于服药的剂量将在后面详细的讨论。
治疗和给药方法前面提到的长效EPOs和含有长效EPOs的药物组合物，预期可以用于贫血、涉及贫血或贫血症状的人类疾病、或导致贫血的疾病或治疗方法的治疗性或预防性处理。通常，在不危害病人从其它组织损伤中康复的能力的情况下，本发明所述的长效EPOs可以允许频率更低的给药或使用更少剂量的促红细胞生成素来治疗上述的疾病。
本发明预期该长效EPOs可以用于全身或慢性施用，急性治疗和/或间断性施用。在一个实施方案中，本发明所述的药物组合物可以慢性的施用以保护或增强靶细胞、组织或器官。在另一个实施方案中，本发明所述的药物组合物可以急性的施用，即在损伤期间的单一治疗。在另一个实施方案中，本发明所述的药物组合物可以循环的方式施用。
该组合物的施用可以是非肠胃的，例如，通过静脉注射，腹腔注射，动脉内，肌内，皮内，或皮下施用；通过吸入；跨粘膜，例如，口服，鼻腔，直肠，阴道内，舌下，粘膜下层，和经皮；或其组合方式施用。优选的，本发明所述的药物组合物的施用方式是非肠胃的。这样的施用方式的剂量约为0.01pg到约5mg，优选约1pg到约5mg。在另—个实施方案中，剂量约为500pg到约5mg。在又—个实施方案中，剂量约为500ng到约5mg。在再一个实施方案中，剂量约为1μg到约5mg。例如，剂量可以为约500μg到约5mg。在另一个实施方案中，剂量可以是约1mg到约5mg。
适用于非肠胃给药的本发明所述的药物组合物含有水性或非水性无菌注射溶液或悬浮液，其可以包含抗氧化剂，缓冲剂，细菌抑制剂和溶质，所述溶质使该组合物基本与受试体的血液等渗。在本发明的这方面，该药物组合物也可以含有水、乙醇、多羟基化合物、甘油、植物油、及其混合物。适用于非肠胃给药的药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量的容器中，例如，密封的安瓿和小瓶，并且可以冻干(冷冻干燥)保存，在这种情况下只需在马上就要使用之前加入无菌液体载体，例如注射用的无菌盐溶液。临时用注射液和悬浮液可以配制成无菌粉末，颗粒和片剂。在一个实施方案中，含有本发明所述的长效EPOs注射液的自动注射器，可以用在救护车、应急室和战场的情况下紧急使用。
在一个实施方案中，本发明所述的组合物可以根据常规的步骤制成适合给人静脉施用的药物组合物。例如，该药物组合物可以作成无菌等渗水性缓冲溶液。如果需要，该药物组合物也可以含有增溶剂和/或局部麻醉剂如利多卡因，用于减轻注射位点处产生的疼痛。所述成分可以单独或混合在一起以单位剂量形式提供，如以冻干粉或无水浓缩物的形式存在于密封的容器内，如标有活性成分用量的安瓿或小药囊。当通过灌输的形式施用本发明所述的药物组合物时，含有无菌药物级的水或盐水溶液的输液瓶可以用来分散药物。并且，当以注射的形式施用本发明所述的药物组合物时，在施用前可以用含有无菌盐溶液的安瓿来混合各成分。
适用于口服的药物组合物可以以如下形式提供胶囊或片剂；粉剂或颗粒剂；溶液、糖浆或悬浮液(含水或不含水的液体)；可食用的泡沫(foams或whips)；乳化剂；或其组合。口服制剂可以包含重量百分比约10％到约95％的活性成分。在一个实施方案中，口服制剂中活性成分的重量百分比是约20％到约80％。在另一个实施方案中，口服制剂中活性成分的重量百分比是约25％到约75％。
片剂或硬质明胶胶囊可以含有乳糖、淀粉及其衍生物、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁、硬脂酸及其盐。软质明胶胶囊含有蔬菜油、蜡、脂肪、半固体、液体多元醇、或其混合物。溶液和糖浆含有水、多元醇、糖、或其混合物。
此外，用于口服的活性剂可以用推迟活性剂在胃肠道内崩解和/或吸收的材料进行包衣或混合。例如，用单硬脂酸甘油、双硬脂酸甘油、或其组合与活性剂混合或进行包衣。因此，活性剂的持续释放可以维持很多个小时，如果需要，可以阻止活性剂在胃内的降解。口服的药物组合物可以根据特殊的pH或酶条件进行配制，以助于在胃肠道的特定部位释放活性剂。
适合于经皮给药的药物组合物可以以不连续片(discrete patch)的方式提供，其可保持与受试者表皮紧密接触较长时间。另外，适合于局部给药的药物组合物可以以如下形式提供油膏剂、乳膏剂、悬浮剂、洗剂、粉剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂、油剂、滴眼剂、糖锭、软锭剂、和漱口剂及其组合。当局部给药用于皮肤、口腔、眼睛、或其它的外部组织时，优选使用局部油膏剂或乳膏剂。并且，当存在于油膏剂中时，活性成分，即长效EPO，可以与蜡或易与水混溶的油膏基质一起使用。或者，使用水包油或油包水的基质将活性成分制备为乳膏剂。当局部给药采用滴眼剂形式时，本发明所述的药物组合物优选含有溶解或悬浮在合适的载体例如水性溶剂中的活性剂。
适用于鼻腔和肺部给药的药物组合物可以含有固体载体，如粉末(优选颗粒大小在约20到约500微米内的)。粉末可以通过从靠近鼻子的含有粉末的容器中快速吸入鼻腔的方式来施用。在另一个实施方案中，本发明所述的用于鼻腔施用的药物组合物含有液体载体，如喷鼻剂或滴鼻剂。优选在鼻腔内直接施用本发明所述的药物组合物。
直接的肺部吸入可以通过伸入到咽喉的口腔插管和其它的特殊设计的装置深吸来完成，所述装置包括但不限于，压力气雾器、喷雾器、或喷洒器，其可经专门设计以提供预定量的活性成分。优选，药物组合物通过直接深吸入咽喉的方式施用。
适合于直肠给药的药物组合物可以以栓剂或灌肠剂的形式提供。在一个实施方案中，本发明所述的栓剂含有重量百分比为约0.5％到10％的活性成分。在另一个实施方案中，该栓剂含有重量百分比为约1％到约8％的活性成分。在另一个实施方案中，该栓剂含有的活性成分重量百分比为约2％到约6％。在本发明的这一方面，本发明所述的药物组合物可以含有常用的粘合剂和载体，如甘油三酸脂。
适于阴道给药的药物组合物可以以如下形式提供阴道栓剂、棉塞剂、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂。
本发明所述的药物组合物也可以以使用灌输液、器官注射或局部给药的方式来施用。在这些实施方式中，该药物组合物优选的含有约0.01pM到约30pM，优选是约15pM到约30nM的本发明所述的长效EPO。在一个实施方案中，灌输溶液是University of Wisconsin(UW)溶液(具有约7.4到约7.5的pH和约320mOSm/l的摩尔渗透压浓度)，它含有约1U/ml到约25U/ml的EPO；5％的羟乙基淀粉(优选具有分子量约从200,000到约300,000并且基本上不含乙二醇、2-氯乙醇、氯化钠、和丙酮)，25mM KH2PO4、3mM谷胱甘肽；5mM腺苷；10mM葡萄糖；10mM HEPES缓冲液；5mM葡萄糖酸镁；1.5mM CaCl2；105mM葡萄糖酸钠；200,000单位的青霉素；40单位的胰岛素；16mg的地塞米松；和12mg的酚红。UW溶液在美国专利号4,798,824中有详细的描述，在此全文引入作为参考。在另一个实施方案中，UW溶液可以含有约0.01pg/ml到约400ng/ml，优选40ng/ml到约300ng/ml的重组组织保护细胞因子。
向需要治疗的区域局部施用本发明所述的药物组合物可能是令人期待的。这样的给药方式可以通过如下方式来实现在手术中局部灌输；局部应用，如手术后与伤口敷料一起应用；通过注射；通过导管；通过栓剂；或通过植入的方式，所述的植入方式可以用带孔的、无孔的、或胶质材料，包括膜，如硅胶膜，或纤维。
另外，如前所述的关于经皮施用的方式，本发明所述的长效EPO可以由控释体系来输送。例如，使用静脉灌输、植入渗透泵、经皮膜片、脂质体、或其它的方式施用该肽。在—个实施方案中，可以使用泵，如在Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321574中描述的。在另—个实施方案中，可以使用载体输送该化合物，特别是脂质体，如在国际公开号WO91/04014和美国专利号4,704,355中描述的那样，在此将其整体引入参考。在另一个实施方案中，聚合物材料可以用于制备控释体系，如那些在Howard等，1989，J.Neurosurg.71105中描述的材料。
这样的控释体系可以置于靠近治疗目标的地方，即靶细胞、组织或器官，因此只需要全身剂量的一部分。参见，例如，Goodson，Medical Applications ofContolled Release，vol.2，pp.115-138，1984。可用于本发明的其它控释体系在Langer，Science 2491527-1533，1990的综述里有描述。
剂量基于本领域普通技术人员公知常识，本领域普通技术人员可以选择适用于上述施用方法的优选的有效和非毒性剂量。这些因素的实例包括长效EPO的特殊形式；该EPO的药物动力学参数，如生物利用度、新陈代谢、半衰期等(已提供给技术人员)；有待治疗的情况或疾病；在普通个体中所取得的疗效；病人的体重；给药方法；给药频率，即慢性的、急性的、间断的给药；伴随药物；和其它已知的影响所施用的药剂的有效性的因素。这样，精确的剂量应当根据专业人员的判断和特定病人的情况来确定。
例如，Physicians Desk Reference(PDR)表明了，依据使用EPO治疗的病人群体，考虑不同的血细胞比容水平以避免毒性。Physicians Desk Reference，54thEd.，519-525和2125-2131(2000)。事实上，对患有CRF的病人，PDR推荐施用的EPO剂量是达到非毒性目标血细胞比容30％到36％。相反，对于进行化疗的癌症病人，PDR教导将剂量调节到不同的血细胞比容水平，也就是如果血细胞比容水平超过40％。PDR表明，专业人员在使用EPO治疗期间监控病人的血细胞比容，并且如果病人的血细胞比容达到或超过预定范围的上限，则调整剂量和/或停止治疗以避免毒性。因而，熟练的专业人员，根据本发明的教导，应该能够使EPO的施用剂量足以达到治疗的效果而又避免了任何的毒性并发症。
在—个实施方案中，本发明所述的长效EPO以剂量为每次约0.1μg/kg体重到约100μg/kg体重慢性或全身的施用。例如，在治疗接受化疗的癌症病人时，以约1μg/kg体重到约5μg/kg体重的剂量每周施用一次。在另—个实施方案中，该长效EPO的剂量是每次约5μg/kg体重到约50μg/kg体重。在又一个实施方案中，该长效EPO的剂量是约10μg/kg体重到约30μg/kg体重。在再一个实施方案中，该长效EPO的施用量约为1μg/kg体重或更少。例如，在每周给药一次治疗CRF患者的贫血时，约0.45μg/kg体重到约0.75μg/kg体重的长效EPO可能是有效的。
有效的剂量优选足以获得大于约10,000mU/ml(80ng/ml)的长效EPO的血清水平。在一个实施方案中，有效剂量能够获得约15,000mU/ml(120ng/ml)或更高的长效EPO的血清水平。在另一个实施方案中，有效剂量能够获得约20,000mU/ml(160ng/ml)的长效EPO的血清水平。最好在施用后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小时或其组合时进行检测。本领域的普通技术人员认为需要时，可以重复施用的剂量。例如，只要临床需要，每天都可以重复给药，或经过一个适当的间歇后重复给药，如每1到12周，优选每1到3周。
由于本发明所述的长效EPOs具有延长的半衰期，因此它们在体内的活性也会增加。例如，当哺乳动物的病体进行癌症的全身性化疗治疗时，包括放疗，在治疗期间施用本发明所述的长效EPO药物组合物可以减少贫血相关的症状，其施用的频率和剂量都少于现有的重组EPO组合物。
并且，如前所述，当本发明所述的药物组合物含有本发明所述的长效EPO或EPO类似物与组织保护细胞因子的混合形式时，该组合物可以用于治疗同时还有组织损伤危险的患者的贫血及相关疾病。例如，患有贫血同时也是心脏病高危的病人，可以用本发明所述的组合物代替现有的EPO类似物来治疗，以避免因治疗而增加损害的风险。
治疗试剂盒本发明同时也提供了一种药物试剂包或盒，其含有用本发明所述的药物组合物的—种或多种成分填充的一个或多个容器。在一个实施方案中，有效量的长效EPO和药学上可接受的载体可被包装在单剂量瓶或其它容器中。
当本发明所述的药物组合物用于非肠胃给药时，例如，可在冻干的条件下保藏该组合物。因此，试剂盒可以包括冻干组合物、无菌液体载体、和用于注射的注射器。在一个实施方案中，该试剂盒包括含有足够用于几次治疗的冻干材料的安瓿，以便施用者可以称出特定量的材料并且加入特定量的载体用于每次治疗。在另一个实施方案中，试剂盒包括多个安瓿，每个安瓿中都含有特定量的冻干材料，以及多个容器，每个容器中都含有特定量的载体，以便施用者只需将一个安瓿和一个载体容器的内容物混合用于每次治疗，而不用测定或称量。在另一个实施方案中，该试剂盒包括自动注射器，其含有本发明所述的EPO的注射用溶液。在另一个实施方案中，该试剂盒包括至少一个含有冻干组合物的安瓿、至少一个含有载体溶液的容器、至少一个含有局部麻醉剂的容器、和至少—个注射器(或类似物)。安瓿和容器优选是密封的。
当以灌输的方式施用本发明所述的药物组合物时，该试剂盒优选包括至少一个含有该药物组合物的安瓿和至少一个含有无菌药物级的水或盐溶液的输液瓶。
本发明所述的试剂盒也可以包括至少一个口腔插管或适用于直接肺部吸入的特别装置如压力气雾器、喷雾器、或喷洒器。在本发明的这一方面，该试剂盒可以包括用于直接肺部吸入的装置，其含有该药物组合物，或该装置和至少一个含有本发明所述长效EPO的水或油溶液的安瓿。
当本发明所述的长效EPO药物组合物适合于口服、经皮、直肠、阴道、或鼻腔给药时，该试剂盒优选包括至少一个含有活性成分的安瓿和至少一种给药辅助物。给药辅助物的例子包括但不限于，称量勺(用于口服)、无菌清洁垫(用于经皮给药)、和鼻腔吸气器(用于鼻腔给药)。这样的试剂盒可以含有单剂量的长效EPO(急性治疗)或多剂量的长效EPO(慢性治疗)。
另外，该试剂盒可以配备有一种或多种类型的溶液。例如，本发明所述的长效EPO药物组合物可以被制备在白蛋白溶液和聚山梨醇酯溶液中。如果试剂盒含有聚山梨醇酯溶液，“不含白蛋白”的字样优选出现在容器的标签上和试剂盒的主面板上。
另外，该试剂盒还包括管理药物或生物产品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的声明，该声明反映了上述机构已经批准用于人体的生产、使用或销售。
EPO检测试验本发明也涉及用于确定本发明所述的长效EPOs以及用在本发明所述的几种药物组合物中的EPO类似物的促红细胞生成能力和组织保护能力的检测方法。例如，长效EPOs的促红细胞生成活性可以使用TF-1分析来检测，这将在实施例2中更详细的描述。EPO化合物的组织保护活性可以使用体外和体内分析来检测，这将在后面更详细的讨论。另外，预期本发明也包括不仅能用于确定特定的EPO化合物是否具有组织保护活性，而且也能用于确定该EPO化合物是否作为内源性EPO的拮抗物的检测方法。
本发明所述的检测方法优选设计成在短时间内使用最少量的EPO混合物来完成。还有，这里提供的检测方法是非限制的，因为本领域的普通技术人员能够理解到其它的用于检测EPO化合物的促红细胞生成活性和组织保护活性的方法。
促红细胞生成活性检测特定EPO化合物的促红细胞生成特性，即控制血细胞比容水平的能力，可以通过多种检测方法确定。在—个实施方案中，TF1细胞系可以用于确定EPO化合物是否具有促红细胞生成活性。该细胞可以被沉淀、冲洗、和重悬在浓度为1毫升105个细胞的培养液中，添加有一定浓度的重组EPO和感兴趣的EPO化合物。个别培养物可以被维持24小时，同时使用formazan反应物(CellTiter；Promega，Madison，WI)来测定细胞的数目。
感兴趣的EPO化合物的活性可以首先通过使用雌性BALA/c小鼠，观察其对血红蛋白浓度的影响来进行体内评价。给动物皮下施用500U/kg-bw的EPO、感兴趣的EPO化合物、或等体积的载体，每周三次给药总共三周(足以观察到红细胞生成反应的时间间隔)。如果EPO化合物提高了小鼠的血清血红蛋白的浓度，就确定它具有促红细胞生成活性。
对活性的进一步评价可以使用TF1红白血病细胞而体外获得。如果TF1细胞的相对数目超过了对照组，那么感兴趣的EPO化合物就具有促红细胞生成活性。另外，本领域的普通技术人员知道其它检测促红细胞生成活性的检测方法也可以使用。例如，欧洲药典记载了至少两种用于检测EPO化合物的促红细胞生成活性的方法，其包括组织缺氧小鼠试验及网状细胞试验。
基于EPO受体的组织保护能力检测在—个实施方案中，本发明所述的组织保护能力检测是基于EPO的组织保护性受体。一旦分离了组织保护性受体的序列，就可以使用各种检测方法来确定特定EPO化合物的组织保护能力。正如本领域内的普通技术人员己知的那样，所用的检测的类型主要取决于EPO化合物的重量。
例如，检测方法可以是竞争性检测或三明治检测或空间位阻检测。竞争性检测依赖于示踪剂类似物与检测样本分析物竞争性的结合有限个位于结合配体上的结合位点。这里，术语“分析物”是指有待于检测其组织保护活性的感兴趣的EPO化合物。术语“结合配体”是指结合分析物(特别是EPO受体)的任何蛋白。“示踪剂”是指被标记过的试剂，例如标记的分析物类似物、固定的分析物类似物、标记过的结合配体、固定的结合配体和空间偶联物。这里的示踪剂可以具有任何不影响分析物与其结合配体的结合的可被检测到的功能。非限制的例子包括可被直接检测到的部分(moiety)，如荧光染料、化学发光剂、和放射性标记物，以及必须被反应或衍生化才能被检测到的部分，如酶。合适的示踪剂可以是放射性同位素P32、C14、I125、H3、I131、及其混合物；荧光团，如稀土螯合物、荧光素、荧光素衍生物、若丹明、若丹明衍生物、丹磺酰氯、伞形酮萤光素酶(萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456))、荧光素、2，3-dihydrophthalazinediones、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、与利用过氧化氢氧化染料前体如HRP、乳过氧化物酶、微过氧化物酶和其混合物偶联的杂环氧化酶(尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)；生物素/抗生物素蛋白；自旋标记物；噬菌体标记；稳定的游离自由基；和其组合。在一个实施方案中，示踪剂为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶中的至少一种。
本领域技术人员知道将示踪剂与蛋白或多肽偶联的方法。例如，偶联剂如二醛、碳二亚胺、二顺丁烯二酰亚胺、二咪唑、二重氮化对二氨基联苯等可以用于与上面提到的荧光剂、化学发光剂、和酶标记来进行标记，其中一些已在美国专利号3,940,475和3,645,090中描述，在此全文引入作为参考。
在三明治检测方法中，需要进行反应物的固定，也就是将结合配体与游离在溶液中的任何分析物分离，其可以通过在检测步骤之前沉淀结合配体或分析物类似物来完成，如同通过共价偶联，如戊二醛交联吸附到不溶于水的基质或表面(美国专利号3,720,760)，或在检测步骤之后，通过如免疫沉淀法将配体或类似物固定。
因此，在竞争性反应之前或之后可以将结合配体沉淀出来(insolubilize)，并且与结合配体相结合的示踪剂或分析物从没有结合的示踪剂和分析物中分离出来。分离可以使用倾析(这里结合配体是提前沉淀的)或离心(这里结合配体是在竞争性反应后沉淀的)。试样分析物的量反比于由标记物质的量所测定出来的结合示踪剂的量。可以绘制已知量分析物的剂量反应曲线，并与试验结果相比较，以定量确定试样中分析物的量。当使用酶作为示踪剂时，检测方法通常是指ELISA系统。
在连续三明治检测中，例如，被固定的结合配体用于吸附试验样品分析物，冲洗去除试验样品，结合的分析物用于吸附标记过的结合配体，然后将残留的示踪剂与结合的物质分离。结合示踪剂的量正比于试验样品的分析物。在“同时”三明治检测中，加入标记过的结合配体之前，不需要分离试验样品。
竞争性和三明治检测方法使用相分离步骤作为检测方法的必要部分，但空间位阻检测方法在单个反应混合物中进行。另一种竞争性检测方法，称为“同源”检测，其不需要相分离。在这样的检测方法中，制备和使用酶与分析物的偶联物，从而使得当抗分析物连接到分析物上时，抗分析物的存在影响了该酶的活性。用双功能的有机桥将组织保护受体与酶如过氧化物酶偶联。对与EPO一起使用的偶联物进行选择，从而使得EPO的结合抑制或增强了标记酶的活性。这种类型的检测方法通常被称为EMIT。
空间偶联物用于同源检测的空间位阻方法中。这些偶联物可以通过在小分析物上共价连接一个小分子量的半抗原来合成，从而使得抗半抗原抗体基本不能与抗分析物同时结合到偶联物上。存在于试验样品中的分析物将结合抗分析物，从而允许抗半抗原结合到偶联物上，导致了偶联半抗原的特性改变，例如，当半抗原是荧光团时，荧光性发生变化。
关于组织保护能力的检测的更多信息描述于共同未决的美国专利申请号为10/188,905，申请日为2002年7月3日的专利以及申请序列号为60/456,891，申请日为2002年4月25日的专利申请，在此全文引入作为参考。
功能检测在缺失组织保护受体序列的情况下，EPO的组织保护功能可以由体内和体外的功能检测来确定。优选地，本领域的普通技术人员进行单独的体外或体内检测就可以确定EPO化合物的组织保护活性，但在某些情况下需要两者都进行以确保化合物在体内和体外都表现出相同的组织保护活性。
实践中，本领域的普通技术人员能够使用本发明公开的检测方法的组合来确定具有至少一个增加的N-连接的糖链和/或至少一个增加的O-连接的糖链的EPO类似物是否具有组织保护活性。首先，体外实验如P19细胞和大鼠运动神经元检测可以用于确定感兴趣的EPO是否具有组织保护活性。然后，体内的检测如大鼠定点局部缺血模型、荷包牡丹碱抽搐模型、或脊髓损伤模型能够用于验证体外试验的结果。
本发明的体外模型包含但不限于，那些用来确定上述过糖基化的促红细胞生成素组织保护活性的缺失的模型P19细胞检测、大鼠运动神经元检测、和cDNA微列阵，其将在后面和实施例2中更加详细的讨论。这些例子是非限制性的，因为本领域的技术人员已知道其它的适合体外检测的模型，用于确定EPO化合物的组织保护活性。总的说来，如果与对照相比，EPO化合物保持或增强了细胞的存活力，则EPO化合物将被认为是有组织保护活性的。如果与对照相比，该促红细胞生成素严重影响了检测中细胞的存活力，则其将被认为是拮抗性的。
A.基于P19细胞系的体外检测在一个实施方案中，体外组织保护活性的检测是基于P19细胞系的。例如，P19细胞可以在添加了2mM L-谷胱苷肽、100U/ml的青霉素G、100μg/ml的硫酸化链霉素(Gibco)和10％的胎牛血清(Hyclone Laboratories)的DMEM中保持不分化，其中含有1.2g/l NaHCO310mM的hepes缓冲液。除了以5μg/ml的胰岛素、100μg/ml的转移剂(transferring)、20nM的黄体酮、100μM的腐胺和30nM的Na2SeO3(Sigma)来代替胎牛血清以外，不含血清的培养液中可以含有上述培养液同样的成分。
将与50％的融合剂(confluency)反应的细胞用重组EPO和/或感兴趣的EPO化合物处理过夜，用胰蛋白酶解离，在不含血清的培养液中冲洗并且置于25cm2的组织培养瓶中，达到在不含血清的培养液中(或含有预处理添加物)的最终密度为104细胞/cm2。细胞的存活力通过台盼蓝排斥反应来检测。
正如本领域技术人员所熟知的，在未分化的神经元样P19细胞中去除血清后，加入重组EPO可以阻止细胞的死亡。例如，如果使用的浓度为0.1U/ml到100U/ml，重组EPO挽救了至多50％的神经元样细胞使之免于死亡。因此，想要确定感兴趣的EPO化合物具有组织保护活性，其必须相比于对照组挽救更多的P19细胞使之免于死亡，优选必须挽救约25％到约50％的细胞，最优选为约40％到约50％的细胞。
B.体外大鼠运动神经元分析在另一个实施方案中，大鼠运动神经元分析用于体外检测感兴趣的EPO化合物的组织保护活性。例如，初级运动神经元可以从15天大的Sprauge Dawley大鼠的胚胎的脊髓中获得并使用免疫淘选纯化。细胞优选以低密度(20000细胞/cm2)接种在24mm孔板的盖玻片上，所述24mm孔板用聚-DL-鸟氨酸(orinthine)和N-三甲基赖氨酸内盐预先包被，并且含有完全培养液(Neurobasal、B27(2％)、0.5mM L-谷氨酰胺、2％的马血清、25μM 2-巯基乙醇、25μM谷氨酸、1％的青霉素和链霉素，1ng/ml的BDNF)。经过一段时间后，优选约6天，EPO(10U/ml)和感兴趣的EPO化合物(10U/ml)或赋形剂可以加到培养液中(最好优选是在检测存活的神经元细胞密度前约5天)。然后去除培养液，细胞与含有4％多聚甲醛的PBS混合40分钟，用0.2％的Triton X-100渗透，用含10％的小牛血清的PBS封闭，与抗非磷酸化的神经丝(SMI-32；19000)的抗体温育过夜，并利用二氨基联苯胺通过抗生物素蛋白-生物素方法来显影。运动神经元的存活力可以通过SMI-32阳性细胞的计数来进行形态上的评价。
运动神经元的混合初级培养物在维持培养条件下特征性地经历程序性死亡。已经表明，在检测细胞数目的5天前向培养液中添加重组EPO(10U/ml)，在第5天明显的增加了初级运动神经元的数目。因此，被认为具有组织保护活性，与对照组相比，感兴趣的EPO化合物优选至少挽救了相同数目的运动神经元。在一个实施方案中，在维持培养条件下，如果与对照组相比感兴趣的EPO化合物挽救了更多的运动神经元，那么就认为其具有组织保护活性。
C.基于cDNA微列阵的体外检测另一种检测感兴趣的EPO化合物的组织保护活性的方法是cDNA微列阵。这种检测方法可以用于确定EPO和感兴趣的EPO化合物对P19细胞的基因表达的影响是否不同。从未分化的P19细胞中分离的mRNA可以显示出不同的基因调控模式，这是由小鼠1200cDNA微列阵确定的，其取决于暴露至EPOs的程度。例如，在P19细胞中1,200基因的表达可以通过使用来自Clontech(Atlasmouse1.2)的尼龙膜列阵来检测。细胞(107/样品)可以用盐水、重组EPO、感兴趣的EPO化合物(1mU/ml)、或其混合物处理过夜。然后溶解细胞用于提取RNA或用3小时去除血清(总是存在在预处理时加入的同样的细胞因子)。通过柱层析进行标准总RNA提取之后，使用柱上DNase处理层析柱，可以将polyA+RNA纯化出来。随后在[P32]-ATP存在的情况下构建探针。该标记的探针，优选具有两千万个计数或更多，可以在68℃的条件下杂交到cDNA尼龙膜上。冲洗该膜并曝光到x光胶片上。放射性信号的强度可以用PhosphorImager来检测并用Atlas Image 2.0计算机程序(Clontech)来分析。
本发明的体内检测包括但不限于，用于评价EPO化合物的组织保护活性的检测方法，如定点局部缺血模型和海马(intra-hippoeampal)内荷包牡丹碱模型。另外，用于评价组织保护活性的体内模型包括脊髓损伤检测。进一步的，公开在国际公开号WO/02053580和美国专利公开号2002/0086816和2003/0072737中的各种检测方法都可以用于本发明。
D.基于局部缺血模型的体内分析在一个实施方案中，这种用于检测特定EPO化合物的组织保护能力的分析方法是基于局部缺血模型。例如，雄性Sprague-Dawley大鼠(～250g)可以用于三血管局部缺血模型。简而言之，使用戊巴比妥(60mg/kg-bw)麻醉大鼠并且使用水浴保持37℃的核心温度。用两条缝合线结扎右侧颈动脉并切断。靠近右眼眶的喉孔使得中部脑血管可见，这样可以麻醉鼻腔血管的末端。为了在固定的MCA伤口周围产生半影，用钳子牵引另—侧的颈动脉使其闭塞1小时。在可逆的颈动脉闭合发作时，可以施用盐水，重组EPO(5000U/kg-bw)或感兴趣的EPO化合物(5000U/kg-bw)。
24小时后，取下脑部，使用脑部手术装置(Harvard Apparatus)从整个脑部切下连续的1-mm厚的部分。每一部分然后在含有2％的氯化三苯基四唑的154mM的NaCl中37℃孵化30分钟。受伤的体积可以用计算机图像分析系统(MCID，Imaging Reseach，St.Catharines，Ontario，Canada)来测定。在这样的检测中，如果感兴趣的EPO化合物与重组EPO相比，对改善由于大鼠MCA局部缺血造成的梗塞体积的程度相同或更好，那么就认为其具有神经保护活性。
E.基于海马内的荷包牡丹碱抽搐模型的体内检测在另一个实施方案中，EPO化合物的组织保护能力可以通过体内的海马内的荷包牡丹碱实验来检测。例如，雄性Sprangue-Dawley大鼠(250～280g)被关在恒定温度(23℃)和相对湿度(60％)的条件下，施用充分的食物和水，提供固定的12小时的昼/夜循环。在立体定位引导下手术给大鼠植入套管和电极，按照Vezzani，A.，等，J.Neurosci，19，5054-65(1999)中所述。简要的，使用Equithesin(1％的戊巴比妥/4％的水合三氯乙醛；3ml/kg i.p.)麻醉大鼠。两个螺旋的电极位于顶骨皮层的两边，还放入位于鼻窦下的接地线。双极镍镉铁合金线绝缘电极(60μm)然后可被植入到背面海马(隔膜电极)的脑回的两侧，并且可植入位于硬脑膜顶部单侧的套管(22-规格)用于海马内和脑室内灌输药物。植入电极的基于前囱的位置坐标应当是(mm)前-后-3.5；两边2.4和3硬脑膜下，使用压尺设置在-2.5.Paxinos，G.& Waston，C.，The Rat Brain in StereotaxicCoordinates，Academic Press，New York(1986)。电极可以与多孔插座连接(MarchElectronics，NY)和，连接在注射容器上，用丙烯酸牙齿粘合剂保护头骨。
该实验优选在动物手术后的3到7天动物完全康复时进行。然后给动物腹腔施用重组EPO或感兴趣的EPO化合物(都是5000U/kg-bw)或载体，在诱导荷包牡丹碱发作之前24小时给药一次，诱导前30分钟时再给药一次。记录EEG和脑内药物注射的步骤已经描述在Vezzani，A.，等，J.Pharmacol Exp Ther，239，256-63(1986)。简要的，在开始EEG记录(4道EEG多种波动描写器，型号BP8，Battaglia Rangoni，Bologna，Italy)前，动物可以放养在Plexiglass笼子中(25×25×60)最少10分钟。约15到约30分钟后，用0.8nmol/0.5μl的荷包牡丹碱甲碘化物灌输后，进行持续120分钟的EEG记录。所有的注射都是用伸到套管下方3mm的针头(28-规格)施用于非麻醉大鼠。
可通过EEG分析来检测抽搐，此前已经表明其可以提供对药物的抗惊厥活性的灵敏检测。Vezzani，A.，等，J.Pharmacol Exp Ther，239，256-63(1986)。出于该检测的目的，抽搐由全部4项记录信息(leads of recordings)中同时发生的至少两项下述改变组成高频和/或多峰值复合(multispike complex)和/或高电压同步峰值(high voltage synchronized spike)或波浪型活动。可观察到同步峰值与抽搐相混合。选择用于定量抽搐的参数优选是第一次抽搐(抽搐发作)的潜伏时间，癫痫反应总共消耗的时间(通过将发作事件的持续时间加在—起而确定；抽搐持续时间)，和在EEG记录期间(抽搐反应)的峰值反应。
使用EEG反应作为读数的海马内荷包牡丹碱抽搐模型已经被证明是药物的抗抽搐能力的灵敏和特异性的预报手段。Vezzani，A.，等，J.Pharmacol ExpTher，239，256-63(1986)。因此，要想被认为具有组织保护活性，感兴趣的EPO化合物应该相比于重组EPO而言相同程度或更大程度地减少了抽搐的频率和严重程度。
F.基于急性可逆青光眼大鼠模型的体内检测在本发明的另一种体内检测中，急性可逆青光眼大鼠模型可以用于感兴趣的特定EPO化合物的组织保护能力的检测。例如，因为视网膜细胞对局部缺血非常敏感，因此许多这样的细胞在局部缺血胁迫下30分钟后就会死亡。因此，为了检测外周施用的感兴趣的EPO化合物是否显示足以保护对局部缺血敏感的细胞的组织保护活性，可以使用急性、可逆青光眼大鼠模型，其描述参见Rosenbaum等，Vis.Res.373443-51，1997。特别的，可以注射盐水到成年雄性大鼠的眼部前腔，并使其压力超过体动脉血压并维持60分钟。然后在诱导出局部缺血之前24小时给大鼠腹腔内施用盐水和5000U EPO/kg体重，并且作为每日剂量连续施用额外的3天。
治疗后1周可以用视网膜电流描记器可以检测适应了黑暗的大鼠，以确定感兴趣的EPO化合物是否具有组织保护活性。如果该EPO具有组织保护活性，相那么比于用盐水治疗的大鼠，在视网膜电流描记中应该有很好的活性保留。
G.心肌梗塞检测心肌梗塞检测也可以应用于本发明，其用来检测EPO化合物在整体上或特别在心脏内是否具有组织保护活性。例如，在麻醉大鼠并准备进行冠状动脉结扎前24小时可以给成年雄性大鼠施用5000U/kg体重的EPO。在程序开始时可以施用额外剂量的EPO，同时结扎左边的主冠状动脉30分钟然后松开。在处理后每天施用同样剂量的EPO 1周，同时检测大鼠的心脏功能。接受了空白注射(盐水)的大鼠将显示出左边末端心脏舒张压的大幅度增加，预示了扩大的、僵硬的心脏，仅次于心肌梗塞，而对施用了感兴趣的EPO化合物的动物而言，如果该EPO有组织保护活性的话，那么该动物应当相比于空白对照组表现出未损伤的心脏功能(显著性差异在P＜0.01水平)。
H.脊髓损伤检测脊髓损伤检测也可以用于本发明来评价特定的感兴趣EPO化合物的组织保护活性。特别的，可将大鼠脊髓压缩液用于本发明。优选使用体重约为180g到约300g的Wistar大鼠(雌性)。手术前，动物优选在手术前绝食12小时，人性化监禁，并腹腔内注射戊硫代巴比妥钠(40mg/kg-bw)进行麻醉。皮肤渗透(0.25％的布比卡因)之后，在解剖用显微镜的辅助下，通过2cm的切口进行完全单水平(T-3)椎板切除术。创伤性脊髓损伤是由硬脑膜外的临时动脉瘤夹子通过施加在脊髓上0.6牛顿(65克)的闭合力1分钟而诱导的。取下夹子后，缝合皮肤的切口，大鼠从麻醉中完全苏醒，再放回到笼子中。使用至少每天两次的膀胱触诊来监控大鼠直到恢复自发性的排空。
对照组的动物在缝合切口后迅速的立即施用通常的盐水(通过静脉注射)。其余的动物静脉施用16毫克/kg-bw的感兴趣的EPO化合物。然后使用运动比率值(locomotor rating scale)来评价大鼠的运动神经学功能。在这种数值里，动物的得分范围从0(没有观察到后肢运动)到21(正常的步态)。由不了解动物所受治疗的同一个检验人员在损伤后1小时、12小时、12小时、48小时、72小时、和1周，分别测定大鼠的功能缺失。如果感兴趣的EPO化合物具有组织保护活性，施用了该EPO的大鼠应当比注射盐水的大鼠更快更好的从损伤中痊愈。
I.兔脊髓局部缺血检测在另一个实施方案中，将兔脊髓局部缺血检测用于组织保护能力的检测。例如，新西兰白兔(36，8-12月大，雄性)重1.5kg-2.5kg可以用于该检测中。动物禁食12小时并人性化的管理。麻醉诱导是通过3％的三氟溴氯乙烷，其分散在100％的氧气中，并维持于0.5-1.5％的三氟溴氯乙烷，其分散在50％的氧气和50％的空气混合气体中。将静脉注射用导管(22-规格)插入左耳静脉。在手术过程中以每小时4ml/kg体重(bw)的速度灌输Ringers乳酸盐溶液。手术前，静脉注射10ml/kg-bw的头孢唑林(Cefazoline)以预防感染。动物被放置成右边卧姿，用聚乙烯吡酮碘处理皮肤，使用布比卡因(0.25％)渗透，并在平行于脊骨的第12节处开一侧面的皮肤切口。在切开皮肤和皮下胸腰筋膜后，取出最长腰肌和腰髂肋肌。通过左边腹膜后方法暴露腹部动脉，移动到左边的肾动脉下方一点。一根PE-60管从左侧肾动脉远端绕住动脉，并且两端都穿过一个大一点的橡胶管。通过拉动PE管，非外伤性的结扎腹部动脉20分钟。
在腹部动脉结扎以静脉丸剂形式施用肝素(400IU)。结扎20分钟后，去除橡胶管和导管，缝合切口并监护动物直到痊愈，同时对动物顺序进行神经学功能的检测。在解开腹部动脉结扎后立即给对照组动物静脉注射通常的盐水。在重新灌注后立即给另一组动物静脉注射6.5μg/kg-bw的感兴趣的EPO化合物(每组的n＝6)。
由不了解动物所受治疗的检测者在重新灌注后1小时、24小时、和48小时根据Drummond和Moore的标准进行运动功能评价。每只动物得分为0到4，按如下标准打分0＝下肢麻痹，没有明显的后肢运动能力；1＝低的后肢运动能力，仅有微弱的抗重力运动；2＝中度的后肢运动能力并具有较强的抗重力能力但没有从身体下面伸腿的能力；3＝很好的运动能力并具有从身体下面伸腿和跳跃的能力，但不是正常的；4＝正常的运动能力。在对下肢麻痹的动物进行每天两次的人工膀胱排空。
如果感兴趣的EPO化合物具有组织保护活性，那么施用了该EPO的动物应该相比用盐水注射的动物应该更快更好的从损伤中痊愈。
如前所述，好几种组织具有EPO受体，从而，可能对EPO的组织保护能力有所应答。因此，根据感兴趣的EPO化合物的预期临床用途，技术人员能够认识到也可以进行涉及这些另外的应答细胞的类似体外检测，或进行涉及到相应器官的体内检测。例如，基于血清去除的体外检测可以利用心肌、视网膜、和Leydig细胞以类似于上述用于P19检测的方法来进行。
体内检测也可以直接用于具体的器官。例如，为了评价EPO对于视网膜细胞的影响，本领域内普通的技术人员可以进行上述的视网膜局部缺血检测。另外，为了评价EPO类似物对于心肌细胞的影响，本领域内普通的技术人员可以容易地改变上述的心机梗塞检测。本领域的普通技术人员能够选择合适的检测方法或模型用于评价特定的EPO对促红细胞生成应答细胞、组织或器官是否具有组织保护活性。
实施例下面所述的实施例仅仅用于解释本发明的优选实施例，不能解释为限制本发明，本发明的范围是由附加的权利要求所限定的。
实施例1化学修饰的EPOA.糖链的氧化EPO的糖链部分可以使用下述的步骤转化成酸。EPO和足以提供氧化所需量(高碘酸钠的量越大，氧化程度越高)的高碘酸钠可以被置于100mM乙酸钠缓冲液中。然后该溶液冰浴20分钟并使用蒸馏水透析。然后从透析管中取出产物并收集到一个干净的试管里(产物I)。
定量本尼迪特溶液(18g的硫酸铜，100g的碳酸钠(无水)，200g的柠檬酸钾，125g的硫氰酸钾，25g的氰亚铁酸钾)可以用蒸馏水溶解，最终体积为1升。然后在定量本尼迪特溶液(Quantitative Benedict Solution)中加入几滴甲基蓝。
产物I随后可以被加到该定量本尼迪特溶液中直到溶液的颜色变得澄清，这表明溶液已完全氧化。然后可以将该溶液去盐并用离心过滤装置(UltrafreeCentrifugal Filter Unit)浓缩。然后该样品(产物II)可以再进一步用蒸馏水透析。
B.用葡萄糖氧化酶对脱唾液酸形式的EPO进行氧化50到500μg的脱唾液酸形式EPO，10μl 1U/μl的葡萄糖氧化酶，和100μl 10mM的磷酸钠缓冲液可以在15ml的圆锥形离心管中混合(总体积为110μl)。然后该混合物可以在37℃下温育2小时，同时可用蒸馏水充分透析。然后可以从透析管中取出产物并收集到一个干净的试管里(产物III)。
定量本尼迪特溶液(上述的)可以用蒸馏水溶解到最终体积为1升。然后可以在定量本尼迪特溶液加入几滴甲基蓝。
然后产物III可以加到该定量本尼迪特溶液中，直到溶液的颜色变得澄清，表明溶液已完全氧化。然后将该溶液去盐并用离心过滤装置(Ultrafree CentrifugalFilter Unit)浓缩。然后该样品(产物IV)可以再进一步用蒸馏水充分透析。
C.EPO的硫酸化EPO可以溶解在4℃的N，N-二甲基甲酰胺(DMF-SA)中。然后加入溶解在DMF中的N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)，将溶液在4℃的条件下震荡4小时。可加入碎冰并用10N的NaOH调节pH到7.5。可以调整溶液的体积并在HN-S2型离心管(DAMONIEC，Needham Hts.，Massachusettes)中以1000xg离心15分钟。然后可以将上清液充分透析。更多的有关硫酸化的描述参见S.Pongor等，Preparation of High-Potency，Non-aggregating Insulins Using a NovelSulfation Procedure，Diabetes，Vol.32，No.12，December 1983，在此全文引入作为参考。
D.将PEG链连接到EPO上可以通过将PEG链连接到氧化的糖链上来修饰EPO，如上述在A中获得的(产物I)。修饰的程度可以通过调节氧化作用中高碘酸盐的浓度来调控。
制备PEG-EPO偶联产物时可以首先用1mM-10mM的间高碘酸钠(Sigma)室温下氧化EPO(2-4mg/ml在50mM乙酸钠中)30分钟。然后在100mM，pH5.4的乙酸钠中通过缓冲交换除去磷酸缓冲液。
各种分子量的甲氧基-PEG-酰肼(Nektar Therapeutics)随后可以以5到100倍的摩尔过量(多聚物蛋白质)加入。然后可以通过加入15mM的氰化硼氢化钠(Sigma)，在4℃反应过夜减少中间酰肼连接。获得的偶联物然后可以用本领域熟知的技术分馏/纯化。
E.连接PEG链到脱唾液酸的EPO脱唾液酸形式的EPO可以通过在用半乳糖氧化酶氧化后，将PEG链连接到新生成的末端半乳糖残基上而进行修饰，如那些在上述B中获得的产物(产物III)。
重组人类EPO(rhuEPO)可以根据制造商手册用唾液酸酶(Prozyme，Inc)进行去唾液酸化。化学修饰优选是通过将反应产物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上来确定。染色的产物带应该表明修饰的EPO具有约31kDa的表观分子量，而未修饰的EPO具有约34kDa的分子量。保留在EPO中的唾液酸优选少于0.1mol/mol EPO。
获得脱唾液酸形式的EPO后，新暴露的EPO(2-4mg/ml，在10mM的磷酸钠缓冲液中)的半乳糖残基可以用每毫升EPO溶液100单位的半乳糖氧化酶(Sigma)(溶于PBS中)进行氧化。反应混和物然后在37℃温育2小时。
然后在pH5.4的100mM乙酸钠中通过缓冲交换去除磷酸缓冲液。然后将各种分子量的甲基化-PEG-酰肼(Nektar Therapeutics)以5到100倍的摩尔过量(多聚物蛋白质)加入。然后优选通过加入15mM的氰化硼氢化钠(Sigma)进一步减少中间酰肼连接，在4℃反应过夜。然后可以用本领域熟知的技术分馏/纯化获得的偶联物。
F.连接PEG链到脱唾液酸的EPO脱唾液酸形式的EPO可以通过在用半乳糖氧化酶氧化后，将PEG链连接到新生成的末端半乳糖残基上而进行修饰，如那些在上述B中获得的产物(产物III)。
RhuEPO(1mg)可以用唾液酸苷酶(Seikagaku Corporation of Japan，将1U的冻干粉溶解在100μL的75mM NaPO4(pH6.5)中)以1mgEPO比0.05单位唾液酸苷酶(5μL)的比例进行去唾液酸化。然后在混合物中添加5个单位(5μL)的半乳糖氧化酶(450μL溶解在75mMNaPO4(pH6.5)(Sigma)中)。
然后通过缓冲交换在pH5.4的100mM乙酸钠中去除磷酸缓冲液。然后向混合物中加入PEG-NH2(750分子量，Nektar Therapeutics)和15mM的氰化硼氢化钠(Sigma)然后在4℃反应过夜。优选地，PEG-NH2加入量为250倍的摩尔过量(多聚物蛋白质)(80mg的PEG-NH2)。然后用本领域熟知的技术分馏/纯化获得的偶联物。
实施例2.功能检测A.促红细胞生成检测一种特定的EPO化合物的促红细胞生成能力，即调控血细胞比容水平的能力，通过如下的检测方法确定。
TF1是—种完全依赖于生长因子(包括EPO)的人类红细胞白血病细胞。Kitamura，等，Blood 73，375-80。TF1细胞系从ACTT获得并且用含有2mM L-谷氨酰胺，10mM Hepes，1mM丙酮酸钠，4.5g/L葡萄糖，1.5g/L重碳酸钠，5ng/mlGM-CSF，和10％胎牛血清的RPMI 1640一直保存到实验时。从活性生长期获得的TF1细胞被沉淀下来，用培养液单独冲洗三次，并以1ml培养液中含有105个细胞的浓度重悬浮，其中可以有或没有GM-CSF，并且添加有特定浓度的EPO或具有至少一个增加的N-连接的糖链和/或至少一个增加的O-连接的糖链的EPO类似物。各培养物保持24小时，使用formazan反应物(CellTiter；Promega，WI)根据制造商手册来确定细胞的数目。
EPO化合物的活性通过观察它对雌性BALB/c小鼠血红蛋白浓度的影响而首先进行体内评价。给动物皮下施用500U/kg-bw的EPO，感兴趣的EPO化合物，或等体积的载体，1周3次总共3周(足以观察到促红细胞生成反应的时间间隔)。如果EPO化合物提高了小鼠的血清血红蛋白的浓度，那么就认为其具有促红细胞生成活性。进—步的活性检测通过在体外使用TF1红细胞白血病细胞而获得。研究确认如果相对TF1细胞数的增加超过了对照组，那么就认为EPO具有促红细胞生成活性。
本领域的普通技术人员知道其它的检测方法，如组织缺氧小鼠检测方法和网状细胞检测方法(欧洲药典)，也适用于本发明以确定促红细胞生成活性。
B.组织保护活性检测具有至少—个增加的N-连接的糖链和/或至少一个增加的O-连接的糖链的EPO类似物的组织保护功能通过如下的方法来检测。
由18天大的大鼠胚胎的海马体构建神经元培养物。从脑膜中取出并分离脑部，分离出海马体。然后细胞分散在2.5％的胰蛋白酶溶液中，在37℃下温育5分钟，然后滴定。细胞悬浮液用不含血清的、含有1％B-27的补充液(Gibco，Rockville，MD，USA)的神经基质(neurobasal)培养液稀释，并以每片盖玻片80,000个细胞密度放置在覆盖有多聚鸟苷酸的盖玻片上。细胞然后用EPO过夜预处理，然后暴露在5μM TMT中24小时，有或没有1)EPO，2)具有至少一个增加的N-连接的糖链和/或至少—个增加的O-连接的糖链的EPO类似物，或3)脱唾液酸形式的EPO。然后在体外使用介于10到14天的培养物。
可以通过溴化3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-联苯四唑(MTT)检测来测定细胞的存活力。Denziot，F，and Lang，R.1986.Rapid Colormetric Assay forCell Growth and Survial.Modifications to the tetrazolium dye procedure givingimproved reliability.J Immunol Methods 89271-277。简言之，将MTT四唑盐溶解在不含血清的培养液中，至最终浓度为0.75mg/ml并在处理结束时加入到细胞中，在37℃下3小时。然后去除培养液并用1N HCl∶异丙醇(1∶24)提取formazan。在微量培养板读数器上读取560nm处的吸收值。
如在附图1A中描述的那样，具有至少一个增加的N-连接的糖链和/或至少—个增加的O-连接的糖链的EPO类似物不具有组织保护功能。
这里描述和要求保护的发明的范围不被本文所公开的具体实施方案所限制，因为这些具体实施方案仅用于解释本发明的几个方面。任何等价的实施方案也包含在本发明的范围之内。事实上，除了那些在这里描述的发明以外，本发明的各种修饰对本领域的普通技术人员来说，在阅读了前面的描述之后将是显而易见的。这样的修饰也落在了所附的权利要求的范围之内。在此引用的所有文献为各种目的全文引入作为参考。
权利要求
1.调节人类血细胞比容水平的方法，包括以下的步骤提供比rhuEPO具有更长血清半衰期并包含组织保护功能的促红细胞生成素产品；和施用治疗有效量的该促红细胞生成素产品。
2.权利要求1所述的方法，所述提供促红细胞生成素产品的步骤还包括以下的步骤用至少一种化学修饰在rhuEPO的至少一条N-连接的寡糖链或O-连接的寡糖链上修饰，其中，所述的化学修饰包括氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其组合。
3.权利要求1所述的方法，其中所述施用治疗有效量的该促红细胞生成素产品的步骤包括以低于rhuEPO的摩尔量施用该促红细胞生成素产品以获得相当的目标血细胞比容。
4.权利要求1所述的方法，其中所述的血清半衰期比rhuEPO的血清半衰期至少长约20％。
5.权利要求4所述的方法，其中所述的血清半衰期比rhuEPO的血清半衰期至少长约40％。
6.人工促红细胞生成素产品包括至少一种促红细胞生成素衍生物，其中至少一条N-连接的寡糖链或至少一条O-连接的寡糖链具有至少一种化学修饰，所述化学修饰来源于氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其混合，并且其中所述促红细胞生成素产品的血清半衰期比rhnEPO长。
7.权利要求6所述的促红细胞生成素产品，其中，所述的促红细胞生成素产品具有组织保护功能。
8.权利要求6所述的促红细胞生成素产品，所述的至少一种化学修饰包括至少一条N-连接的寡糖链或至少一条O-连接的寡糖链的氧化以提供至少一个增加的酸残基。
9.权利要求6所述的促红细胞生成素产品，所述的至少一种化学修饰包括至少一条N-连接的寡糖链或至少一条O-连接的寡糖链的硫酸化以在该促红细胞生成素产品上提供增加的负电荷。
10.权利要求6所述的促红细胞生成素产品，所述的至少一种化学修饰包括至少一条N-连接的寡糖链或至少一条O-连接的寡糖链的磷酸化以在该促红细胞生成素产品上提供增加的负电荷。
11.权利要求6所述的促红细胞生成素产品，所述的至少一种化学修饰包括在至少一条N-连接的寡糖链或至少一条O-连接的寡糖链上增加至少一条聚乙二醇链。
12.制备具有延长的血清半衰期和组织保护活性的促红细胞生成素产品的方法，包括以下的步骤提供至少一种促红细胞生成素或促红细胞生成素衍生物；和在至少一种内源性或重组促红细胞生成素的至少一条N-连接的寡糖链或至少一条O-连接的寡糖链上通过氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其组合进行修饰。
13.权利要求12所述的方法，所述的修饰步骤还包括用至少一个酸残基取代至少一条N-连接的寡糖链或至少一条O-连接的寡糖链上的至少一个邻位羟基的步骤。
14.权利要求13所述的方法，所述的用至少一种酸残基取代至少一条N-连接的寡糖链或至少一条O-连接的寡糖链上的至少一个邻位羟基的步骤还包括用多个酸残基取代至少一条N-连接的寡糖链或至少一条O-连接的寡糖链上的多个邻位羟基。
15.权利要求12所述的方法，所述的修饰步骤还包括以下的步骤提供一种有机溶剂；在该有机溶剂中溶解该促红细胞生成素或促红细胞生成素衍生物以形成溶液；提供至少一种缩合剂；提供至少一种硫酸盐供体；和将所述的至少一种缩合剂和至少一种硫酸盐供体混合到溶液中。
16.权利要求12所述的方法，其中，所述的修饰步骤还包括以下的步骤提供一种有机溶剂；在该有机溶剂中溶解该促红细胞生成素或促红细胞生成素衍生物以形成溶液；提供至少一种缩合剂；提供磷酸；和将所述的至少一种缩合剂和至少一种磷酸混合到上述溶液中。
17.权利要求12所述的方法，所述的修饰步骤还包括以下的步骤提供一种有机溶剂；在该有机溶剂中溶解促红细胞生成素或促红细胞生成素衍生物以形成第一溶液；提供至少一种氧化剂；在该第一溶液中加入该至少一种氧化剂以形成第二溶液；提供至少一种聚乙二醇链；和将所述至少一种聚乙二醇链混合到第二溶液中。
18.权利要求17所述的方法，所述的提供至少一种聚乙二醇链的步骤包括提供链的末端具有至少一个伯氨基团的至少一种聚乙二醇链。
19.治疗处于组织损伤危险中的病人贫血的方法，包括如下的步骤提供在至少一条N-连接的寡糖链或O-连接的寡糖链上有至少一种化学修饰的促红细胞生成素产品，其中所述的化学修饰包括氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其组合；施用治疗有效量的所述促红细胞生成素产品，其中所述的促红细胞生成素产品施用的摩尔量低于rhuEPO，以获得相当的目标血细胞比容，其中所述的促红细胞生成素产品具有细胞保护功能。
20.权利要求19所述的方法，所述的促红细胞生成素产品具有比rhuEPO长的血清半衰期。
21.权利要求20所述的方法，所述的血清半衰期比rhuEPO的血清半衰期至少长约20％。
22.权利要求21所述的方法，所述的血清半衰期比rhuEPO的血清半衰期至少长约40％。
23.一种药物组合物包含治疗有效量的至少一种促红细胞生成素衍生物，在其至少一条N-连接的寡糖链或至少一条O-连接的寡糖链上具有至少一种化学修饰，所述化学修饰来源于氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其组合，所述的至少一种促红细胞生成素衍生物具有比重组促红细胞生成素更长的血清半衰期并具有组织保护功能。
24.权利要求23所述的药物组合物，还包含至少一种药学上可接受的载体。
25.权利要求24所述的药物组合物，其中所述的至少一种药学上可接受的载体包含至少一种稀释剂、佐剂、赋形剂、载体、或其混合。
26.权利要求23所述的药物组合物，还包含至少一种润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂或其组合。
27.权利要求23所述的药物组合物，还包含至少一种组织保护细胞因子。
全文摘要
一种通过施用含有化学修饰的长效促红细胞生成素的药物组合物增加个体血细胞比容同时保持了内源性组织保护活性的方法。同时也公开了一种新的化学修饰的长效促红细胞生成素，制备该化学修饰的长效促红细胞生成素的方法，和含有该化学修饰的长效促红细胞生成素的组合物。
文档编号C07K1/10GK1729015SQ03824915
公开日2006年2月1日 申请日期2003年9月9日 优先权日2002年9月9日
发明者A·切拉米, J·斯马特, M·布赖恩斯, C·切拉米 申请人:沃伦药品公司, 肯尼思·S·沃伦研究院