专利名称：酿酒酵母erg4突变体在表达哺乳动物来源的葡萄糖转运蛋白中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够功能性表达人GLut4和GLut1转运蛋白的酵母菌株。
背景技术：
多数异养细胞经由特定的转运蛋白将葡萄糖转运到细胞内。不同的生物发展出不同的介导葡萄糖转运的机制，如特别是质子协同运输系统、Na+葡萄糖转运蛋白、结合蛋白依赖的系统、磷酸转移酶系统和用于易化扩散的系统。在真核生物中，由哺乳动物体内GLUT基因(GLUT＝葡萄糖转运蛋白)编码和由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中HXT基因(HXT＝己糖转运蛋白)编码的葡萄糖转运蛋白家族介导经由易化扩散的葡萄糖摄取。所述转运蛋白属于更大的糖转运蛋白家族。它们的特征在于存在12个跨膜螺旋和多个保守氨基酸残基。葡萄糖转运在与葡萄糖稳态缺陷相关的紊乱(如糖尿病或Fanconi-Bickel综合症)中扮演重要的角色。因此，哺乳动物体内的葡萄糖转运已成为许多研究的主题。到目前为止，已鉴定了13种葡萄糖转运蛋白样蛋白质(GLUT1到GLUT12、HMIT-H-肌醇转运蛋白)。所述转运蛋白在以下方面扮演着关键的角色，包括将葡萄糖摄取进各种组织、葡萄糖在肝脏中的储存、肌细胞和脂肪细胞对葡萄糖的胰岛素依赖性摄取以及胰腺β-细胞对葡萄糖的测量。
GLUT1介导将葡萄糖转运进红细胞并通过血脑屏障，但GLUT1也表达于许多其它组织，而GLUT4限于胰岛素依赖性组织，主要是肌肉和脂肪组织。在所述胰岛素依赖性组织中，控制GLUT4转运蛋白的胞内区室或质膜区室定向是一种重要的调节葡萄糖摄取的机制。在胰岛素存在下，胞内GLUT4重分布穿过质膜，以便促进葡萄糖摄取。GLUT1同样表达于所述胰岛素依赖性组织，并且其在细胞内的分布同样受胰岛素影响，虽然影响强度并不如GLUT4。此外，GLUT1或GLUT4催化糖转运的相对效率不仅被各转运蛋白导向细胞表面的程度所决定，还受它们的动力学特性所决定。
不同的葡萄糖转运蛋白同种型被共表达的事实以及迅速的葡萄糖代谢已经使有关胰岛素依赖性组织中各种葡萄糖转运蛋白同种型的作用和确切性质的研究变得复杂。为了解决这些难题，使用了如非洲爪蟾属(Xenopus)卵母细胞、组织培养细胞、昆虫细胞和酵母细胞之类的异源表达系统。但是，出现了一些看来与这些系统有关的困难异源表达的转运蛋白的活性太低、所述系统自身的葡萄糖转运蛋白、相当比例的转运蛋白滞留在胞内或甚至产生无活性的转运蛋白。
可以在特定的条件下，在酿酒酵母菌株中以功能方式表达天然哺乳动物GLUT4蛋白质，特别是人的GLUT4蛋白质。
酵母细胞是单细胞真核生物。因此，它们比细菌系统更适合表达某些蛋白质，特别是涉及进行鉴定药物活性物质的筛选试验时。
发明内容
本发明涉及纯化和分离的多核苷酸，其含有编码GLUT4V85M蛋白质的DNA序列。
所述蛋白质在人GLUT4蛋白质氨基酸链的85位置含有由缬氨酸到甲硫氨酸的氨基酸交换。这一改变的GLUT4V85M蛋白质为表达有功能的GLUT4蛋白质提供了另外的可选方案。如果自身葡萄糖转运蛋白完全失活(＝hxt(-))的酿酒酵母菌株在表达所述GLUT4蛋白质之后能够被观测到存在葡萄糖的摄取，则应该认为就酿酒酵母而言GLUT4蛋白质是有功能的。可以通过对放射性标记葡萄糖的转运测量或通过以葡萄糖作为唯一碳源的培养基上的生长来测定葡萄糖摄取。
在一个优选的实施方案中，纯化和分离的包含编码GLUT4V85M蛋白质之DNA序列的多核苷酸可以包括或含有以下序列a)根据Seq ID No.1的核苷酸序列，b)在严紧性条件下与Seq ID No.1的序列杂交并编码GLUT4V85M蛋白质的核苷酸序列。
纯化和分离的多核苷酸优选编码具有Seq ID No.2的氨基酸序列的GLUT4V85M蛋白质。
纯化和分离的含有如先前讨论的编码GLUT4V85M蛋白质的DNA序列的多核苷酸可以与启动子操作性连接(operationally link)。合适的启动子尤其是原核或真核启动子，如Lac-、trp-、ADH-或HXT7启动子。如果细菌或真核生物在载体的协助下通过所述启动子产生能够被翻译成GLUT4V85M蛋白质的mRNA，则编码GLUT4V85M蛋白质的多核苷酸部分精确地与启动子操作性连接。这种载体的例子是p4H7GLUT4V85M(Seq ID No.3)载体。可以通过所述载体在酵母细胞中表达GLUT4V85M蛋白质。
在一个优选的实施方案中，以上描述的含有编码GLUT4V85M蛋白质之DNA序列的多核苷酸适于在酵母细胞中复制，或适于在酵母细胞中表达编码GLUT4V85M蛋白质的多核苷酸部分以提供GLUT4V85M蛋白质。来自酿酒酵母的酵母细胞特别合适。为了在酵母细胞中复制和表达，含有编码GLUT4V85M蛋白质之DNA序列的多核苷酸以酵母载体的形式存在。编码GLUT4V85M蛋白质的多核苷酸区域可以与酵母细胞特异的启动子操作性连接，所述启动子如ADH启动子(醇脱氢酶启动子)或HXT7启动子(己糖转运蛋白启动子)。酵母载体是开发用于在酵母中克隆DNA的一组载体。
本发明还涉及来自酿酒酵母的酵母细胞，其中所有的葡萄糖转运蛋白不再具有功能(＝hxt(-))并且不含有功能性Erg4蛋白质。优选的这种酵母细胞是作为酿酒酵母DSM 15187保藏于DSMZ(德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，38124 Brunswick，Germany))的酵母细胞。
本发明还涉及其所有的葡萄糖转运蛋白不再具有功能并且不含有功能性Fgy1和功能性Erg4蛋白质的酵母细胞。Erg4蛋白质或Fgy1蛋白质的缺乏尤其可以由相应的基因组编码区域的中断或所述基因组编码区域的部分或完全去除而引起。
对于不含有功能性葡萄糖转运蛋白、功能性Fgy1蛋白质和功能性Erg4蛋白质的酵母细胞，优选使用以酿酒酵母DSM 15184保藏于DSMZ的酵母细胞。
如上所述的酵母细胞优选用于表达哺乳动物GLUT1蛋白质或哺乳动物GLUT4蛋白质，特别是来自大鼠、小鼠、兔、猪、牛或灵长类的蛋白质。一个优选的实施方案使用酵母细胞表达人GLUT4或GLUT1蛋白质。
其全部葡萄糖转运蛋白及Erg4蛋白质不再具有功能的酿酒酵母细胞可以含有本发明多核苷酸，其中该多核苷酸含有编码GLUT4V85M蛋白质的DNA序列。所述酵母细胞也可以表达GLUT4V85M蛋白质并因此含有该蛋白质。
优选保藏于DSMZ的酿酒酵母DSM 15185酵母菌株作为这种含有包含编码GLUT4V85M蛋白质之DNA序列的多核苷酸的酵母菌株。
可以通过下述方法制备其全部葡萄糖转运蛋白及Erg4蛋白质不再具有功能并且含有包含编码GLUT4V85M蛋白质之DNA序列的多核苷酸的酵母细胞a)提供其全部葡萄糖转运蛋白及Erg4蛋白质不再具有功能的酵母细胞，b)提供可以在酵母细胞中复制的分离并纯化的多核苷酸，该多核苷酸含有编码GLUT4V85M蛋白质的DNA序列，c)用来自b)的多核苷酸转化来自a)的酵母细胞，d)选择转化的酵母细胞，e)适当时表达GLUT4V85M蛋白质。
分离并纯化的含有编码GLUT4V85M蛋白质之DNA序列的多核苷酸优选是能够在酵母细胞中复制的载体，其中所述DNA序列被克隆在此载体中。这种载体的例子是p4H7GLUT4V85M(Seq ID No.3)。
本发明还涉及其全部葡萄糖转运蛋白及Fgy1和Erg4蛋白质不再具有功能的酵母细胞，其中该酵母细胞含有包含编码GLUT4V85M蛋白质之DNA序列的多核苷酸。所述酵母细胞也可以表达GLUT4V85M蛋白质并因此含有该蛋白质。这种酵母菌株优选为保藏于DSMZ的酿酒酵母DSM15186。
可以通过下述方法制备其全部葡萄糖转运蛋白及Fgy1和Erg4蛋白质不再具有功能并且含有包含编码GLUT4V85M蛋白质之DNA序列的多核苷酸的酵母细胞a)提供其全部葡萄糖转运蛋白及Fgy1和Erg4蛋白质不再具有功能的酵母细胞，b)提供可以在酵母细胞中复制的分离并纯化的多核苷酸，该多核苷酸含有编码GLUT4V85M蛋白质的DNA序列，c)用来自b)的多核苷酸转化来自a)的酵母细胞，d)选择转化的酵母细胞，e)适当时表达GLUT4V85M蛋白质。
上述分离并纯化的含有编码GLUT4V85M蛋白质之DNA序列的多核苷酸优选是能够在酵母细胞中复制的载体，其中所述DNA序列被克隆在此载体中。这种载体的例子是p4H7GLUT4V85M(Seq ID No.3)。
本发明还涉及其全部葡萄糖转运蛋白不再具有功能的酵母细胞，其中所述酵母细胞含有包含编码GLUT4V85M蛋白质之DNA序列的多核苷酸。
所述酵母细胞也可以表达GLUT4V85M蛋白质并因此含有该蛋白质。优选的这种酵母菌株是保藏于DSMZ的酿酒酵母DSM 15188菌株。
可以通过下述方法制备其全部葡萄糖转运蛋白不再具有功能并且含有包含编码GLUT4V85M蛋白质之DNA序列的多核苷酸的酵母细胞a)提供其全部葡萄糖转运蛋白不再具有功能的酵母细胞，b)提供可以在酵母细胞中复制的分离并纯化的多核苷酸，该多核苷酸含有编码GLUT4V85M蛋白质的DNA序列，c)用来自b)的多核苷酸转化来自a)的酵母细胞，d)选择转化的酵母细胞，e)适当时表达GLUT4V85M蛋白质。
分离并纯化的含有编码GLUT4V85M蛋白质之DNA序列的多核苷酸优选是能够在酵母细胞中复制的载体，其中所述DNA序列被克隆在此载体中。这种载体的例子是p4H7GLUT4V85M(Seq ID No.3)。
本发明还涉及具有根据Seq ID No.2的氨基酸序列的蛋白质。该蛋白质是人GLUT4蛋白质，其中在氨基酸链85位置的缬氨酸已经被甲硫氨酸所替代。
本发明还涉及鉴定刺激GLUT4蛋白质活性的化合物的方法，其包括步骤a)提供其全部葡萄糖转运蛋白及Erg4蛋白质不再具有功能并含有包含编码GLUT4V85M蛋白质之DNA序列的多核苷酸的酵母细胞，b)提供化学化合物，c)将a)的酵母细胞与b)的化学化合物接触，d)测定c)的酵母的葡萄糖摄取，e)将d)的葡萄糖摄取检测值和未与b)中所述的化学化合物相接触的a)中所述酵母细胞的葡萄糖摄取检测值相比，导致d)中所述酵母细胞的葡萄糖摄取量增加的化合物刺激所述GLUT4蛋白质的活性。可以想到刺激GLUT4V85M蛋白质活性的化合物也刺激GLUT4活性。
本发明也涉及含有以上述方法鉴定的化合物以及用于配制药物的添加剂和赋形剂的药物。此外，本发明涉及以上述方法鉴定的化合物在生产用于治疗I型和/或II型糖尿病的药物中的用途。
本发明也涉及含有上述方法鉴定的化合物以及用于配制药物的添加剂和赋形剂的药物。此外，本发明涉及上述方法鉴定的化合物在生产用于治疗糖尿病的药物中的用途。
本发明此外还涉及上述方法鉴定的化合物在生产用于治疗糖尿病的药物中的用途。本发明也包括鉴定抑制Erg4基因编码之蛋白质的化合物的方法，其包括步骤a)提供其全部葡萄糖转运蛋白不再具有功能的酵母细胞，其中该酵母细胞含有包含编码GLUT4V85M蛋白质之DNA序列并能够在酵母细胞中复制的多核苷酸，b)提供化学化合物，c)将a)的酵母与b)的化学化合物接触，d)测定c)的酵母的葡萄糖摄取，e)将d)的葡萄糖摄取检测值和未与b)中所述化学化合物相接触的a)中所述酵母细胞的葡萄糖摄取检测值比较，导致d)中所述酵母的葡萄糖摄取量增加的化合物抑制Erg4蛋白质的活性。
本发明此外还涉及鉴定抑制Fgy1基因之相应蛋白质的化合物的方法，其包括步骤a)提供其全部葡萄糖转运蛋白及Erg4蛋白质不再具有功能并且含有GLUT4蛋白质的酵母细胞，b)提供化学化合物，c)将a)的酵母与b)的化学化合物接触，d)测定c)的酵母的葡萄糖摄取，e)将d)的葡萄糖摄取检测值和未与b)中所述化学化合物相接触的a)中所述酵母细胞的葡萄糖摄取检测值比较，导致d)中所述酵母的葡萄糖摄取量增加的化合物抑制Fgy1蛋白质的活性。
本发明还涉及含有上述方法鉴定的化合物以及用于配制药物的添加剂和赋形剂的药物。
以下就技术细节更详细的说明本发明。
杂交是指具有互补碱基序列的两条核酸单链装配成双链。杂交可以在两条DNA链、一条DNA链和一条RNA链以及两条RNA链之间进行。原则上，通过加热最初可能是双链形式的有关核酸，可以制备杂交分子，例如在水浴中煮沸10分钟，直到它们分解成不具有二级结构的单链分子。随后，可以缓慢冷却它们。在冷却阶段，互补链配对形成双链杂交分子。在实验室条件下，通常在杂交滤膜的协助下进行杂交，其中通过印迹或电泳将单链或变性的多核苷酸加样于杂交滤膜上。可以使用适当的互补多核苷酸分子，通过将待杂交的该多核苷酸分子加上放射性荧光标记来显示杂交。严紧性描述特定条件下匹配或对齐的程度。高严紧性在匹配上比低严紧性具有更高的要求。根据应用和目的，设定用于核酸杂交的具有不同严紧性的特定条件。在高严紧性下，设定的杂交反应条件使得只有匹配得非常好的互补分子才能够彼此杂交。低严紧性使具有相对大的非配对或错误配对碱基部分的分子也能部分杂交。
特别是，如果在含2xSSC的水溶液中68℃杂交至少两小时，随后于室温下2xSSC/0.1％SDS中进行为时5分钟的第一次洗涤，然后在68℃于1xSSC/0.1％SDS中洗涤1小时，然后在68℃于0.2％SSC/0.1％SDS中再洗涤1小时，则该杂交条件被认为是严紧的。
通过适当稀释20xSSC溶液而制备2xSSC、1xSSC或0.2xSSC溶液。20xSSC溶液含有3mol/l NaCl和0.3mol/l柠檬酸钠。pH为7.0。技术人员熟悉在严紧性条件杂交多核苷酸的方法。适当的指导可见于专业手册，特别是如《Current Protocols in Molecular Biology》(Wiley Interscience；编者Frederich M.Ausubel、Roger Brant、Robert E.Kingston、David J.Moore、J.G.Seidmann、Kevin Struhl；ISBN0-471-50338-X)。
酵母载体可以被分成不同的亚组。YIp载体(酵母整合型质粒)基本上相应于用于在细菌中克隆的载体，但是含有选择性酵母基因(如URA3、LEU2)。
在引入所述载体后，只有当外源DNA整合进酵母染色体中，这些序列才与染色体一同复制，并随着克隆的形成稳定地传递给所有的子代细胞。
基于这一方法，衍生出由于真核ORI(复制起点)而能自主复制的质粒。这种酵母载体被称为YRp载体(酵母复制型质粒)或ARS载体(自主复制序列)。此外，还有衍生自酵母2μm质粒并含有选择性标记基因的YEp载体(酵母附加型质粒)。YAC(酵母人工染色体)类载体的行为如同独立的染色体。
通过转化的方式将含有要表达基因的酵母载体引入酵母，以便能够表达所述基因。适合这一目的的方法的例子是电穿孔或与载体DNA一起孵育感受态细胞。技术人员知道合适的酵母表达启动子，例子是SOD1(超氧化物歧化酶)启动子、ADH(醇脱氢酶)启动子、酸性磷酸酶基因的启动子、HXT2(葡萄糖转运蛋白2)启动子、HXT7(葡萄糖转运蛋白7)启动子、GAL2(半乳糖转运蛋白)启动子和其它。为了表达目的，含有酵母表达启动子和要表达的基因(如GLUT4V85M)的构建体是酵母载体的一部分。为了实现表达，所述酵母载体可以是独立于酵母基因组的自复制微粒或者可以稳定整合进酵母基因组。原则上，合适的酵母载体是任何可以在酵母中增殖的多核苷酸序列。可以使用的酵母载体尤其是酵母质粒或酵母人工染色体。酵母载体通常含有复制起点(2μ，ars)或起始复制过程的起点和通常包含辅源营养标记或抗生素抗性基因的选择性标记。技术人员知道的酵母载体的例子是pBM272、pCS19、pEMBCYe23、pFL26、pG6、pNN414、pTV3、p426MET25、p4H7和其它。
根据本发明，细胞的选择是指通过选择性标记(如抗生素抗性或生长于特殊基本培养基上的能力)和进一步的分离及随后的培养(在琼脂平板上对其进行培养或者是深层培养)而对它进行的特定浓缩。
培养、转化以及转化的酵母细胞的选择，还有蛋白质在酵母细胞中的表达属于技术人员常规使用的方法。关于所述方法的说明可见于标准的教科书，如Walker Graeme M.《Yeast Physiology and Biotechnology》(Wileyand Sons，ISBN0-471-9446-8)或《Protein Synthesis and Targeting inYeast》(Alistair J.P.Brown，Mick F.Fruite和John E.G.Mc Cartly编；Springer Berlin；ISBN3-540-56521-3)或“《Methods in Yeast Genetics》，1997A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual；Adams Alison(编辑)；Cold Spring Harbor Laboratory；ISBN0-87969-508-0”。
酿酒酵母具有17种已知的己糖转运蛋白和3种已知的麦芽糖转运蛋白，在表达足够高的情况下，所述麦芽糖转运蛋白能够将己糖转运进所述酵母。在一种已知的菌株中，通过缺失去掉了所有适合于己糖摄取的转运蛋白。该菌株只含有两种同源于麦芽糖转运蛋白质的基因MPH2和MPH3。当培养基中存在葡萄糖时，MPH2和MPH3两基因受到抑制。Wieczorke等人(FEBS Lett.464，123-128(1999))描述了此酵母菌株的制备和特征。该菌株不能在含有葡萄糖作为唯一碳源的培养基上繁殖。可以起始于相应载体选择功能性表达GLUT1的该菌株突变体(hxt fgy1-1菌株)。如果使用携带酵母启动子控制下的GLUT4基因的质粒载体转化hxt fgy1-1酵母菌株，仍然只有非常少量的葡萄糖被转运。对于这一酵母菌株而言，需要进一步调整功能性GLUT4表达，以便实现通过GLUT4手段的显著的葡萄糖转运。可以在具有葡萄糖作为唯一碳源的培养基上分离这种其细胞通过单一GLUT4葡萄糖转运蛋白摄取葡萄糖的酵母菌株。为了这一目的，用处于酵母启动子功能性控制下的GLUT4基因转化hxt fgy1-1菌株。将这些以这一方式转化的酵母细胞加于含有葡萄糖作为唯一碳源的营养培养基上，并在其上孵育。在例如30℃孵育几天后，观察单菌落的生长。分离这些菌落中的一个。从所述菌落中去掉酵母质粒阻止在含有葡萄糖作为唯一碳源的营养培养基上的繁殖。如果用携带处于酵母启动子功能性控制下的GLUT4基因的酵母载体再次转化这一不再含有载体质粒的菌株，那么所述菌株能够再次在含有葡萄糖作为唯一碳源的培养基上繁殖。
以上提及的酵母菌株是提交于2002年2月9日的国际申请PCT/EP02/01373的主题，该申请要求2002年2月14日的DE 10106718.6的优先权。
自身全部的己糖转运蛋白(葡萄糖转运蛋白)已不再具有功能的酵母菌株已于更早的日期与国际申请PCT/EP02/01373相关以保藏号DSM14035、DSM 14036或DSM 14037保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ)。
GLUT4的多核苷酸和氨基酸序列可以例如，经由以下条目取得GeneBankM20747(cDNA；人)、EMBLD28561(cDNA；大鼠)、EMBLM23382(cDNA；小鼠)、SwissprotP14672(蛋白质；人)、SwissprotP19357(蛋白质；大鼠)和SwissprotP14142(蛋白质；小鼠)。
GLUT1的多核苷酸序列和氨基酸序列在以下所示的数据库代码下被公开EMBLM20653(cDNA；人)、EMBLM13979(cDNA；大鼠)、EMBLM23384(cDNA；小鼠)、SwissprotP11166(蛋白质；人)，SwissprotP11167(蛋白质；大鼠)和SwissprotP17809(蛋白质；小鼠)。
药物是治疗人和动物疾病或身体机能障碍的药理学活性物质的剂形。口服治疗的剂量形式的例子是散剂、颗粒剂、片剂、药丸、锭剂、糖衣片剂、胶囊剂、流浸膏剂、酊剂和糖浆剂。用于外用的例子是气雾剂、喷雾剂、凝胶剂、软膏剂或粉末。使用小瓶、瓶或预灌装注射器，可注射或可输注的溶液可以进行胃肠道外投药。对于药物技术领域的技术人员而言，这些和其它药物是熟知的。
用于配制药物的赋形剂使得可以制备活性物质以便为特定应用优化活性成分的施用、分布和作用。这类赋形剂的例子是填充剂、粘合剂、崩解剂或助流剂，如乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素、淀粉、磷酸氢钙、聚乙二醇、藻酸盐、聚乙烯吡咯烷酮、羧基甲基纤维素、滑石粉或二氧化硅。
由于是胰岛素缺乏或胰岛素作用降低导致的慢性代谢疾病，糖尿病表现为葡萄糖随尿液排出以及血液葡萄糖水平异常增高(高血糖症)。胰岛素作用的缺乏或降低导致细胞对摄取进血液的葡萄糖的吸收和转化不足。在脂肪组织中，胰岛素拮抗激素具有增加脂解作用的效果，伴随血液中游离脂肪酸水平的增加。
多脂(肥胖)是摄取热量过多导致的能量失衡引起的体重异常增加，肥胖对健康构成威胁。
可以通过摄取研究的手段，使用放射性标记的葡萄糖测定由所提供的酵母菌株(如刚在前文描述的)摄取的己糖量。为此目的，将特定浓度的酵母细胞悬浮于如100μl缓冲液中(例如以每毫升60mg湿重的浓度)，并混合入确定量的14C-或3H-标记的葡萄糖作为唯一的碳源。孵育细胞，并在特定时间取出确定量的细胞。在LSC(液体闪烁计数器)的帮助下测定摄取的葡萄糖量。然而，也可以通过在含有葡萄糖作为唯一碳源的培养基上的生长实验来测定由所提供的并且如刚在前文描述的酵母菌株摄取的己糖量。为此目的，在加入化合物之后测定菌株的生长速率(例如每隔一定时间在600nm测量培养物的光密度)，并且将这一值与对照菌株(如酵母野生型菌株)的生长速率相比较。
提供化合物，特别是通过化学方式合成或通过从生物有机体中分离化学物质。也可以以自动的方式进行化学合成。可以将通过合成或分离获得的化合物溶解于合适的溶剂。合适的溶剂尤其是含有特定比例的有机溶剂(如DMSO(二甲基亚砜))的水溶液。
对于用化合物处理酵母菌株以便鉴定根据前述发明的化合物而言，特别可以在为此提供的自动实验室系统中进行。此系统可以包括特定制备的具有凹坑的小室或微量滴定板、Eppendorf管或实验室玻璃器皿。自动实验室系统通常为高通量速率设计。因此，在自动实验室系统协助下进行的方法，例如上述方法也被称为HTS(高流通量筛选)。
Seq ID No.1公开了含有GLUT4V85M蛋白质编码区的多核苷酸序列。Seq ID No.2公开了GLUT4V85M蛋白质的氨基酸序列。Seq ID No.3公开了p4H7GLUT4V85M载体的多核苷酸序列。
实施例酵母菌株的使用这里描述的所有酵母菌株都来自菌株CEN-PK2-1C(MATa leu2-3、112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1MAL2-8CSUC2)。己糖转运蛋白(HXT)基因缺失的酵母菌株的制备已由Wieczorke等人描述(FEBS Lett.464，123-128(1999)EBY-18ga(MATa Δhxt1-17 Δgal2 Δagt1 Δstl1 leu2-3，112 ura3-52trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8CSUC2)，EBY.VW4000(MATa Δhxt1-17 Δgal2Δagt1 Δmph2 Δmph3 Δstl1 leu2-3，112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8CSUC2))。培养基基于1％的酵母提取物和2％的蛋白胨(YP)，而基本培养基由无氨基酸的0.67％的Difco酵母氮源(YNB)组成，并含有辅源营养所需的添加剂和不同的碳源。酵母细胞于30℃、有氧条件下生长于旋转振荡器或琼脂平板上。通过在600nm测量光密度(OD600)或测定酵母菌落的直径来监控细胞生长。
葡萄糖摄取的测定以对D-[U-14C]-葡萄糖(Amersham)的摄取来测量葡萄糖转运，并从Eadie-Hofstee图测定动力学参数。离心移走细胞，用磷酸缓冲液洗涤，并以每毫升60mg湿重的浓度重悬浮于磷酸缓冲液。针对0.2到100mM的葡萄糖浓度测定葡萄糖的摄取，并且底物的比活力介于0.1到55.5kBqμmol-1。在30℃对细胞和葡萄糖溶液预孵育5分钟。通过向细胞加入放射性葡萄糖而起始葡萄糖摄取。孵育5秒钟后加入10ml冰冷却的终止缓冲液(0.1M KiPO4，pH6.5，500mM葡萄糖)并通过在玻璃纤维滤器(Φ＝24mm，Whatman)上过滤而迅速移出细胞。用冰冷却的缓冲液迅速洗涤滤器3次，使用液体闪烁计数器测量掺入的放射性。细胞在抑制剂存在下或在仅有溶剂存在下孵育15分钟后，使用50mM或100mM放射性葡萄糖在15秒的摄取试验中测量细胞松弛素B(终浓度20μM，溶解于乙醇中)的阻碍作用。
已发展出异源表达哺乳细胞来源的葡萄糖转运蛋白的新系统。此系统基于酿酒酵母菌株，在所述菌株中，通过破坏编码基因，已经去掉了所有的内源葡萄糖转运蛋白。该菌株不再能够经由质膜摄取葡萄糖并不再能够以葡萄糖作为唯一碳源生长。为了将人或其它哺乳动物的异源葡萄糖转运蛋白GLUT1和GLUT4以活性形式整合进酵母质膜，必须对酵母菌株引入额外的突变。GLUT1只有在fgy1-1突变菌株中才有活性，GLUT4只有在fgy1-1 fgy4-x双突变菌株中才有活性。
已经克隆了FGY1基因。它是酿酒酵母ORF YMR212c。就功能而言，结果表明Fgy1或Fgy1生成的产物抑制人葡萄糖转运蛋白的活性或涉及GLUT转运小泡与质膜的融合。
与GLUT1相反并相似于哺乳动物细胞，酵母中大比例的GLUT4蛋白质定位于细胞内结构中。总共分离了9种隐性突变体(fgy4-1到fgy4-9)，其中GLUT4此时被进一步指引到质膜，并且在伴随fgy1-1突变的情况下，在那里具有活性。
Bruns等人描述的插入基因库(Genes Dev.1994；81087-105)被用于互补分析。先用GLUT4质粒，然后用移动的插入基因库转化hxt fgy1-1菌株。在此之后是筛选能够在葡萄糖培养基上生长的转化体。结果，在一个研究的突变体中ERG4基因已被破坏。ERG4编码麦角固醇生物合成的酶(氧化还原酶)。此酶(固醇-C-24(28)-还原酶)催化麦角固醇生物合成的最后步骤，将麦角甾-5，7，22，24，(28)-四烯醇转变为终产物麦角固醇。Erg4蛋白质目前含有8个跨膜域并定位于内质网。因为麦角固醇前体掺入酵母质膜可以弥补麦角固醇的丧失，因此erg4突变体可以存活。
通过在hxt fgy1-1菌株中特异性缺失erg4而确证了Erg4对GLUT4功能的抑制性影响。产生的菌株(hxt fgy1-1 Δerg4)被称为SDY022。
在Split-Ubiquitin系统协助下的蛋白质相互作用试验显示人GLUT4直接与酵母Erg4相互作用。因此，可以推定内质网中的酵母Erg4蛋白质或直接阻止GLUT4的进一步移位，或以对于移位和/或功能而言是重要的某种方式修饰GLUT4。
同样也证实在Δhxt菌株中，仅ERG4缺失(即，尽管FGY1具有功能)也可以激活GLUT1，但不激活GLUT4。生长试验的结果总结于表1。
为了排除麦角固醇自身对GLUT4施以负面影响，于厌氧条件下在含有麦角固醇的琼脂平板上进行生长试验。在这些条件下，任何用GLUT4转化的酵母菌株都不能生长(表2)。与有氧生长相反，在缺氧情况下hxtfgy1-1菌株中的GLUT1转化体没有表现出在葡萄糖中生长。只有在缺失ERG4后，GLUT1转化体才能够生长。
通过体外诱变进行的Val85与Met的交换使得GLUT4独立于fgy1-1突变，并产生了即使是在hxt erg4菌株中也具功能的GLUT4V85M。这一观察表明Fgy1直接或间接作用于这一位置，该位置定位于GLUT转运蛋白的第二个跨膜螺旋中。
表3展示与本专利申请相关保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ)-Mascheroder Weg 1b，38124 Brunswick，Germany的酵母菌株的说明。
表1GLUT1和GLUT4转化体在葡萄糖培养基上的生长。
表2GLUT1和GLUT4转化体于缺氧情况下在具有或不具有麦角固醇的葡萄糖培养基上的生长。
表3保藏的酵母菌株(酿酒酵母)的特征
基础培养基0.67％的无氨基酸酵母氮源(Difco)；pH6.2。
辅源营养补充亮氨酸(0.44mM)、色氨酸(0.19mM)、组氨酸(0.25mM)、尿嘧啶(0.44mM)。麦芽糖可以为1-2％。
生物材料国际保藏证明
生物材料国际保藏存活证明
生物材料国际保藏证明
生物材料国际保藏存活证明
生物材料国际保藏证明
生物材料国际保藏存活证明
生物材料国际保藏证明
生物材料国际保藏存活证明
生物材料国际保藏证明
生物材料国际保藏存活证明
序列表<110>安万特医药德国有限公司(Aventis Pharma Deutschland GmbH)<120>酿酒酵母ERG4突变体在表达哺乳动物来源的葡萄糖转运蛋白中的用途<130>2002/0065<140>
<141>
<150>10242763.1<151>2002-09-14<160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1530<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atgccgtcgg gcttccaaca gataggctcc gaagatgggg aaccccctca gcagcgagtg 60actgggaccc tggtccttgc tgtgttctct gcggtgcttg gctccctgca gtttgggtac 120aacattgggg tcatcaatgc ccctcagaag gtgattgaac agagctacaa tgagacgtgg 180ctggggaggc aggggcctga gggacccagc tccatccctc caggcaccct caccaccctc 240tgggccctct ccatggccat cttttccgtg ggcggcatga tttcctcctt cctcattggt 300atcatctctc agtggcttgg aaggaaaagg gccatgctgg tcaacaatgt cctggcggtg 360ctggggggca gcctcatggg cctggccaac gctgctgcct cctatgaaat gctcatcctt 420ggacgattcc tcattggcgc ctactcaggg ctgacatcag ggctggtgcc catgtacgtg 480ggggagattg ctcccactca cctgcggggc gccctgggga cgctcaacca actggccatt 540gttatcggca ttctgatcgc ccaggtgctg ggcttggagt ccctcctggg cactgccagc 600ctgtggccac tgctcctggg cctcacagtg ctacctgccc tcctgcagct ggtcctgctg 660cccttctgtc ccgagagccc ccgctacctc tacatcatcc agaatctcga ggggcctgcc 720agaaagagtc tgaagcgcct gacaggctgg gccgatgttt ctggagtgct ggctgagctg 780aaggatgaga agcggaagct ggagcgtgag cggccactgt ccctgctcca gctcctgggc 840agccgtaccc accggcagcc cctgatcatt gcggtcgtgc tgcagctgag ccagcagctc 900tctggcatca atgctgtttt ctattattcg accagcatct tcgagacagc aggggtaggc 960cagcctgcct atgccaccat aggagctggt gtggtcaaca cagtcttcac cttggtctcg 1020gtgttgttgg tggagcgggc ggggcgccgg acgctccatc tcctgggcct ggcgggcatg 1080tgtggctgtg ccatcctgat gactgtggct ctgctcctgc tggagcgagt tccagccatg 1140agctacgtct ccattgtggc catctttggc ttcgtggcat tttttgagat tggccctggc 1200cccattcctt ggttcatcgt ggccgagctc ttcagccagg gaccccgccc ggcagccatg 1260gctgtggctg gtttctccaa ctggacgagc aacttcatca ttggcatggg tttccagtat 1320gttgcggagg ctatggggcc ctacgtcttc cttctatttg cggtcctcct gctgggcttc 1380ttcatcttca ccttcttaag agtacctgaa actcgaggcc ggacgtttga ccagatctca 1440gctgccttcc accggacacc ctctctttta gagcaggagg tgaaacccag cacagaactt 1500gagtatttag ggccagatga gaacgactga 1530<210>2<211>509<212>PRT<213>智人<400>2Met Pro Ser Gly Phe Gln Gln Ile Gly Ser Glu Asp Gly Glu Pro Pro1 5 10 15
Gln Gln Arg Val Thr Gly Thr Leu Val Leu Ala Val Phe Ser Ala Val20 25 30Leu Gly Ser Leu Gln Phe Gly Tyr Asn Ile Gly Val Ile Asn Ala Pro35 40 45Gln Lys Val Ile Glu Gln Ser Tyr Asn Glu Thr Trp Leu Gly Arg Gln50 55 60Gly Pro Glu Gly Pro Ser Set Ile Pro Pro Gly Thr Leu Thr Thr Leu65 70 75 80Trp Ala Leu Ser Met Ala Ile Phe Ser Val Gly Gly Met Ile Ser Ser85 90 95Phe Leu Ile Gly Ile Ile Ser Gln Trp Leu Gly Arg Lys Arg Ala Met100 105 110Leu Val Asn Asn Val Leu Ala Val Leu Gly Gly Ser Leu Met Gly Leu115 120 125Ala Asn Ala Ala Ala Ser Tyr Glu Met Leu Ile Leu Gly Arg Phe Leu130 135 140Ile Gly Ala Tyr Ser Gly Leu Thr Ser Gly Leu Val Pro Met Tyr Val145 150 155 160Gly Glu Ile Ala Pro Thr His Leu Arg Gly Ala Leu Gly Thr Leu Asn165 170 175Gln Leu Ala Ile Val Ile Gly Ile Leu Ile Ala Gln Val Leu Gly Leu180 185 190Glu Ser Leu Leu Gly Thr Ala Ser Leu Trp Pro Leu Leu Leu Gly Leu195 200 205Thr Val Leu Pro Ala Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Pro Phe Cys Pro210 215 220Glu Ser Pro Arg Tyr Leu Tyr Ile Ile Gln Asn Leu Glu Gly Pro Ala225 230 235 240Arg Lys Ser Leu Lys Arg Leu Thr Gly Trp Ala Asp Val Ser Gly Val245 250 255Leu Ala Glu Leu Lys Asp Glu Lys Arg Lys Leu Glu Arg Glu Arg Pro260 265 270Leu Ser Leu Leu Gln Leu Leu Gly Ser Arg Thr His Arg Gln Pro Leu275 280 285Ile Ile Ala Val Val Leu Gln Leu Ser Gln Gln Leu Ser Gly Ile Asn290 295 300Ala Val Phe Tyr Tyr Ser Thr Ser Ile Phe Glu Thr Ala Gly Val Gly305 310 315 320Gln Pro Ala Tyr Ala Thr Ile Gly Ala Gly Val Val Asn Thr Val Phe325 330 335Thr Leu Val Ser Val Leu Leu Val Glu Arg Ala Gly Arg Arg Thr Leu
340 345 350His Leu Leu Gly Leu Ala Gly Met Cys Gly Cys Ala Ile Leu Met Thr355 360 365Val Ala Leu Leu Leu Leu Glu Arg Val Pro Ala Met Ser Tyr Val Ser370 375 380Ile Val Ala Ile Phe Gly Phe Val Ala Phe Phe Glu Ile Gly Pro Gly385 390 395 400Pro Ile Pro Trp Phe Ile Val Ala Glu Leu Phe Ser Gln Gly Pro Arg405 410 415Pro Ala Ala Met Ala Val Ala Gly Phe Ser Asn Trp Thr Ser Asn Phe420 425 430Ile Ile Gly Met Gly Phe Gln Tyr Val Ala Glu Ala Met Gly Pro Tyr435 440 445Val Phe Leu Leu Phe Ala Val Leu Leu Leu Gly Phe Phe Ile Phe Thr450 455 460Phe Leu Arg Val Pro Glu Thr Arg Gly Arg Thr Phe Asp Gln Ile Ser465 470 475 480Ala Ala Phe His Arg Thr Pro Ser Leu Leu Glu Gln Glu Val Lys Pro485 490 495Ser Thr Glu Leu Glu Tyr Leu Gly Pro Asp Glu Asn Asp500 505<210>3<211>7809<212>DNA<213>酿酒酵母<400>3cgtaggaaca atttcgggcc cctgcgtgtt cttctgaggt tcatctttta catttgcttc 60tgctggataa ttttcagagg caacaaggaa aaattagatg gcaaaaagtc gtctttcaag 120gaaaaatccc caccatcttt cgagatcccc tgtaacttat tggcaactga aagaatgaaa 180aggaggaaaa tacaaaatat actagaactg aaaaaaaaaa agtataaata gagacgatat 240atgccaatac ttcacaatgt tcgaatctat tcttcatttg cagctattgt aaaataataa 300aacatcaaga acaaacaagc tcaacttgtc ttttctaaga acaaagaata aacacaaaaa 360caaaaagttt ttttaatttt aatcaaaaaa tgccgtcggg cttccaacag ataggctccg 420aagatgggga accccctcag cagcgagtga ctgggaccct ggtccttgct gtgttctctg 480cggtgcttgg ctccctgcag tttgggtaca acattggggt catcaatgcc cctcagaagg 540tgattgaaca gagctacaat gagacgtggc tggggaggca ggggcctgag ggacccagct 600ccatccctcc aggcaccctc accaccctct gggccctctc catggccatc ttttccgtgg 660gcggcatgat ttcctccttc ctcattggta tcatctctca gtggcttgga aggaaaaggg 720ccatgctggt caacaatgtc ctggcggtgc tggggggcag cctcatgggc ctggccaacg 780ctgctgcctc ctatgaaatg ctcatccttg gacgattcct cattggcgcc tactcagggc 840tgacatcagg gctggtgccc atgtacgtgg gggagattgc tcccactcac ctgcggggcg 900ccctggggac gctcaaccaa ctggccattg ttatcggcat tctgatcgcc caggtgctgg 960gcttggagtc cctcctgggc actgccagcc tgtggccact gctcctgggc ctcacagtgc 1020tacctgccct cctgcagctg gtcctgctgc ccttctgtcc cgagagcccc cgctacctct 1080acatcatcca gaatctcgag gggcctgcca gaaagagtct gaagcgcctg acaggctggg 1140ccgatgtttc tggagtgctg gctgagctga aggatgagaa gcggaagctg gagcgtgagc 1200ggccactgtc cctgctccag ctcctgggca gccgtaccca ccggcagccc ctgatcattg 1260cggtcgtgct gcagctgagc cagcagctct ctggcatcaa tgctgttttc tattattcga 1320
ccagcatctt cgagacagca ggggtaggcc agcctgccta tgccaccata ggagctggtg 1380tggtcaacac agtcttcacc ttggtctcgg tgttgttggt ggagcgggcg gggcgccgga 1440cgctccatct cctgggcctg gcgggcatgt gtggctgtgc catcctgatg actgtggctc 1500tgctcctgct ggagcgagtt ccagccatga gctacgtctc cattgtggcc atctttggct 1560tcgtggcatt ttttgagatt ggccctggcc ccattccttg gttcatcgtg gccgagctct 1620tcagccaggg accccgcccg gcagccatgg ctgtggctgg tttctccaac tggacgagca 1680acttcatcat tggcatgggt ttccagtatg ttgcggaggc tatggggccc tacgtcttcc 1740ttctatttgc ggtcctcctg ctgggcttct tcatcttcac cttcttaaga gtacctgaaa 1800ctcgaggccg gacgtttgac cagatctcag ctgccttcca ccggacaccc tctcttttag 1860agcaggaggt gaaacccagc acagaacttg agtatttagg gccagatgag aacgactgac 1920tcgagtcatg taattagtta tgtcacgctt acattcacgc cctcccccca catccgctct 1980aaccgaaaag gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc cctatttatt tttttatagt 2040tatgttagta ttaagaacgt tatttatatt tcaaattttt cttttttttc tgtacagacg 2100cgtgtacgca tgtaacatta tactgaaaac cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa 2160ggctttaatt tgcggccggt acccaattcg ccctatagtg agtcgtatta cgcgcgctca 2220ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc 2280cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc 2340ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcg acgcgccctg tagcggcgca 2400ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta 2460gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt 2520caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac 2580cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt 2640tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga 2700acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg 2760gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata 2820ttaacgttta caatttcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 2880accgcatagg gtaataactg atataattaa attgaagctc taatttgtga gtttagtata 2940catgcattta cttataatac agttttttag ttttgctggc cgcatcttct caaatatgct 3000tcccagcctg cttttctgta acgttcaccc tctaccttag catcccttcc ctttgcaaat 3060agtcctcttc caacaataat aatgtcagat cctgtagaga ccacatcatc cacggttcta 3120tactgttgac ccaatgcgtc tcccttgtca tctaaaccca caccgggtgt cataatcaac 3180caatcgtaac cttcatctct tccacccatg tctctttgag caataaagcc gataacaaaa 3240tctttgtcgc tcttcgcaat gtcaacagta cccttagtat attctccagt agatagggag 3300cccttgcatg acaattctgc taacatcaaa aggcctctag gttcctttgt tacttcttct 3360gccgcctgct tcaaaccgct aacaatacct gggcccacca caccgtgtgc attcgtaatg 3420tctgcccatt ctgctattct gtatacaccc gcagagtact gcaatttgac tgtattacca 3480atgtcagcaa attttctgtc ttcgaagagt aaaaaattgt acttggcgga taatgccttt 3540agcggcttaa ctgtgccctc catggaaaaa tcagtcaaga tatccacatg tgtttttagt 3600aaacaaattt tgggacctaa tgcttcaact aactccagta attccttggt ggtacgaaca 3660tccaatgaag cacacaagtt tgtttgcttt tcgtgcatga tattaaatag cttggcagca 3720acaggactag gatgagtagc agcacgttcc ttatatgtag ctttcgacat gatttatctt 3780cgtttcctgc aggtttttgt tctgtgcagt tgggttaaga atactgggca atttcatgtt 3840tcttcaacac tacatatgcg tatatatacc aatctaagtc tgtgctcctt ccttcgttct 3900tccttctgtt cggagattac cgaatcaaaa aaatttcaaa gaaaccgaaa tcaaaaaaaa 3960gaataaaaaa aaaatgatga attgaattga aaagctgtgg tatggtgcac tctcagtaca 4020atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg 4080ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 4140agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc 4200gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gtatgatcca 4260atatcaaagg aaatgatagc attgaaggat gagactaatc caattgagga gtggcagcat 4320atagaacagc taaagggtag tgctgaagga agcatacgat accccgcatg gaatgggata 4380atatcacagg aggtactaga ctacctttca tcctacataa atagacgcat ataagtacgc 4440atttaagcat aaacacgcac tatgccgttc ttctcatgta tatatatata caggcaacac 4500gcagatatag gtgcgacgtg aacagtgagc tgtatgtgcg cagctcgcgt tgcattttcg 4560gaagcgctcg ttttcggaaa cgctttgaag ttcctattcc gaagttccta ttctctagaa 4620agtataggaa cttcagagcg cttttgaaaa ccaaaagcgc tctgaagacg cactttcaaa 4680aaaccaaaaa cgcaccggac tgtaacgagc tactaaaata ttgcgaatac cgcttccaca 4740aacattgctc aaaagtatct ctttgctata tatctctgtg ctatatccct atataaccta 4800cccatccacc tttcgctcct tgaacttgca tctaaactcg acctctacat tttttatgtt 4860tatctctagt attactcttt agacaaaaaa attgtagtaa gaactattca tagagtgaat 4920cgaaaacaat acgaaaatgt aaacatttcc tatacgtagt atatagagac aaaatagaag 4980aaaccgttca taattttctg accaatgaag aatcatcaac gctatcactt tctgttcaca 5040
aagtatgcgc aatccacatc ggtatagaat ataatcgggg atgcctttat cttgaaaaaa 5100tgcacccgca gcttcgctag taatcagtaa acgcgggaag tggagtcagg ctttttttat 5160ggaagagaaa atagacacca aagtagcctt cttctaacct taacggacct acagtgcaaa 5220aagttatcaa gagactgcat tatagagcgc acaaaggaga aaaaaagtaa tctaagatgc 5280tttgttagaa aaatagcgct ctcgggatgc atttttgtag aacaaaaaag aagtatagat 5340tctttgttgg taaaatagcg ctctcgcgtt gcatttctgt tctgtaaaaa tgcagctcag 5400attctttgtt tgaaaaatta gcgctctcgc gttgcatttt tgttttacaa aaatgaagca 5460cagattcttc gttggtaaaa tagcgctttc gcgttgcatt tctgttctgt aaaaatgcag 5520ctcagattct ttgtttgaaa aattagcgct ctcgcgttgc atttttgttc tacaaaatga 5580agcacagatg cttcgttcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 5640tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 5700gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 5760tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 5820aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 5880cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 5940agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 6000ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 6060tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 6120tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 6180caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 6240accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 6300attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 6360ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 6420taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 6480taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 6540aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 6600agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 6660ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 6720ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 6780cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 6840tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 6900tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 6960tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 7020tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 7080ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 7140acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 7200ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 7260gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 7320ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 7380ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 7440taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 7500cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 7560gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 7620tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg ctttacactt 7680tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 7740cagctatgac catgattacg ccaagcgcgc aattaaccct cactaaaggg aacaaaagct 7800ggagctttt 7809
权利要求
1.纯化和分离的多核苷酸，其含有编码GLUT4V85M蛋白质的DNA序列。
2.权利要求1的多核苷酸，其含有来自下组之任一的序列a)根据Seq ID No.1的核苷酸序列b)在严紧条件下与Seq ID No.1序列杂交并编码GLUT4V85M蛋白质的核苷酸序列。
3.权利要求1或2的多核苷酸，其中GLUT4V85M蛋白质具有根据Seq ID No.2的氨基酸序列。
4.权利要求1到3的多核苷酸，其中GLUT4V85M蛋白质的编码区与启动子操作性连接。
5.权利要求1到4的多核苷酸，其可以在酵母细胞中复制。
6.权利要求5的多核苷酸，其可用于在酵母细胞中表达蛋白质。
7.来自酿酒酵母的酵母细胞，其中所有的葡萄糖转运蛋白不再具有功能并且不含有功能性Erg4蛋白质。
8.来自酿酒酵母的酵母细胞，其中所有的葡萄糖转运蛋白不再具有功能并且不含有功能性Fgy1蛋白质和功能性Erg4蛋白质。
9.权利要求7或8的酵母细胞，其中ERG4基因被完全或部分缺失。
10.权利要求7的酵母细胞，其作为酿酒酵母DSM 15187保藏。
11.权利要求8或9的酵母细胞，其作为酿酒酵母DSM 15184保藏。
12.权利要求15到18的酵母细胞在表达哺乳动物GLUT1蛋白质或GLUT4蛋白质中的用途。
13.权利要求12的用途，用于表达人GLUT1蛋白质或人GLUT4蛋白质。
14.权利要求7的酵母细胞，其含有权利要求1到6的多核苷酸。
15.权利要求14的酵母细胞，其含有GLUT4V85M蛋白质。
16.权利要求14或15的酵母细胞，其作为酿酒酵母DSM 15185保藏。
17.制备权利要求14到16的酵母细胞的方法，其包括步骤a)提供权利要求7的酵母细胞，b)提供权利要求5或6的多核苷酸，c)用b)的多核苷酸转化a)的酵母细胞，d)选择转化的酵母细胞，e)适当时表达GLUT4V85M蛋白质。
18.权利要求8或9的酵母细胞，其含有权利要求1到6的多核苷酸。
19.权利要求18的酵母细胞，其含有GLUT4V85M蛋白质。
20.权利要求18或19的酵母细胞，其作为酿酒酵母DSM 15186保藏。
21.制备权利要求18到20的酵母细胞的方法，其包括步骤a)提供权利要求8或9的酵母细胞，b)提供权利要求5或6的多核苷酸，c)用b)的多核苷酸转化a)的酵母细胞，d)选择转化的酵母细胞，e)适当时表达GLUT4V85M蛋白质。
22.其全部葡萄糖转运蛋白不再具有功能的酵母细胞，其含有权利要求1到6的多核苷酸。
23.权利要求22的酵母细胞，其含有GLUT4V85M蛋白质。
24.权利要求22或23的酵母细胞，其作为酿酒酵母DSM 15188保藏。
25.制备权利要求22到24的酵母细胞的方法，其包括步骤a)产生其全部葡萄糖转运蛋白不再具有功能的酵母细胞，b)提供权利要求5或6的多核苷酸，c)用b)的多核苷酸转化a)的酵母细胞，d)选择转化的酵母细胞，e)适当时表达GLUT4V85M蛋白质。
26.具有葡萄糖转运蛋白的功能活性的蛋白质，其由权利要求1到3中任一项的多核苷酸序列编码。
27.权利要求13的蛋白质，其含有根据Seq ID No.2的氨基酸序列。
28.鉴定刺激GLUT4蛋白质活性的化合物的方法，其包括步骤a)提供权利要求14到17中一项或多项的酵母细胞，b)提供化学化合物，c)将a)的酵母与b)的化学化合物接触，d)测定c)的酵母的葡萄糖摄取，e)将d)的葡萄糖摄取检测值和未与b)中所述化学化合物相接触的a)中所述酵母细胞的葡萄糖摄取检测值相比较，导致d)中所述酵母的葡萄糖摄取量增加的化合物刺激所述GLUT4蛋白质的活性。
29.含有权利要求28的方法所鉴定的化合物以及用于配制药物的添加剂和赋形剂的药物。
30.权利要求28的方法所鉴定的化合物在制备用于治疗I型和/或II型糖尿病的药物中的用途。
31.鉴定抑制Fgy1基因的相应蛋白质的化合物的方法，其包括步骤a)提供权利要求7到10中一项或多项的酵母细胞，该酵母细胞含有GLUT4蛋白质，b)提供化学化合物，c)将a)的酵母与b)的化学化合物接触，d)测定c)的酵母的葡萄糖摄取，e)将d)的葡萄糖摄取检测值和未与b)中所述化学化合物相接触的a)中所述酵母细胞的葡萄糖摄取检测值相比较，导致d)中所述酵母的葡萄糖摄取量增加的化合物抑制Fgy1蛋白质的活性。
32.含有权利要求31的方法所鉴定的化合物以及用于配制药物的添加剂和赋形剂的药物。
33.权利要求31的方法所鉴定的化合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
34.鉴定抑制ERG4基因编码之蛋白质的化合物的方法，其包括步骤a)提供权利要求22到25中一项或多项的酵母细胞，b)提供化学化合物，c)将a)的酵母与b)的化学化合物接触，d)测定c)的酵母的葡萄糖摄取，e)将d)的葡萄糖摄取检测值和未与b)中所述化学化合物相接触的a)中所述酵母细胞的葡萄糖摄取检测值相比较，导致d)中所述酵母的葡萄糖摄取量增加的化合物抑制Erg4蛋白质的活性。
35.含有权利要求34的方法所鉴定的化合物以及用于配制药物的添加剂和赋形剂的药物。
36.权利要求34的方法所鉴定的化合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及能够功能性表达人GLUT4转运蛋白或人GLUT1转运蛋白的酵母菌株以及特别是能够在酵母菌株中特别容易地功能性表达的GLUT4转运蛋白。
文档编号C07K14/62GK1694960SQ03825148
公开日2005年11月9日 申请日期2003年9月4日 优先权日2002年9月14日
发明者G·米勒, S·德卢盖伊, D·福斯, E·博尔斯 申请人:安万特医药德国有限公司