专利名称：蛋白a免疫吸附介质再生利用的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学工程技术领域，尤其是涉及一种可吸附免疫球蛋白G的亲和介质蛋白A免疫吸附介质再生利用的工艺。
背景技术：
近年来，免疫性疾病的临床治疗中，采用了一种生物工程技术开发的新疗法，即免疫吸附，该治疗方法通过蛋白A免疫吸附介质免疫吸附去除病人内源性和外源性致病因子，净化血液，从而达到治疗的目的。
本专利涉及的蛋白A免疫吸附介质是葡萄球菌蛋白A(Staphylococcusaureus Protein A SPA)-琼脂糖凝胶(Sepharose)。
SPA是某些金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种天然蛋白成分，系单链多肽结构，分子量为42,000D，等电点5.1。SPA氨基末端有5个高度类似的同源结构域，可以与人和一些哺乳动物血清中IgG的可结晶片断(Fc片断)发生紧密结合，SPA羧基末端可以将SPA共价耦合到各种网状结构上。现在有包括生化分析，蛋白质工程等很多领域应用到了SPA-Sepharose吸附介质，目前已经将这种材料应用到了免疫吸附治疗上。
目前，市场上的SPA-Sepharose吸附介质功能分子有天然金黄色葡萄球菌SPA和重组蛋白A(r ProteinA)两种。本发明包括以上两种介质的新的再生工艺。
本发明的目的在于提供一种更加安全有效的再生方案，达到重复利用介质的目的，以达到节约成本，保证试验结果前后一致的目的。
方明方案(1)用PH1.0-PH3.0的固定浓度的强酸溶液作为洗脱液，对完成工作呈饱和吸附状态的蛋白A免疫吸附介质进行洗脱，洗脱速度为10-50毫升/分钟，洗脱时间为1-30分钟；(2)用PH6.4-PH7.4的固定浓度的磷酸盐缓冲液作为平衡液，对洗脱后的蛋白A免疫吸附介质进行冲洗，冲洗速度为10-50毫升/分钟，冲洗时间为5-30分钟。
平衡后的蛋白A免疫吸附介质贮存于0.01-1％的叠氮钠水溶液中，0℃～8℃条件下保存。
蛋白A免疫吸附介质使用前用PH7.0的0.9％的氯化钠溶液预冲，冲洗速度为10～50毫升/分钟，冲洗时间10-60分钟。
本方案洗脱步骤中所述PH1.10-PH3.0的固定浓度的强酸溶液为柠檬酸-氯化钠溶液或醋酸-氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液。
具体实施例方式实施例1洗脱用PH1.0的固定浓度的柠檬酸-氯化钠溶液以50毫升/分钟的流速冲洗已呈饱和吸附状态的蛋白A免疫吸附介质，冲洗15分钟后，经测定无IgG残留。
平衡用PH6.4的固定浓度的磷酸盐缓冲液以50毫升/分钟的流速冲洗上述洗脱后的蛋白A介质，5-10分钟后完成平衡。
贮存经洗脱、平衡后的蛋白A免疫吸附介质已得到再生，可以进行重新利用。若非立即使用，则必须贮存于0.01％-1％的叠氮钠水溶液中，置0℃-8℃的条件保存。
预冲贮存后的蛋白A免疫吸附介质在使用前必须用PH为7.0的0.9％的氯化钠溶液预冲，冲洗速度为10-50毫升/分钟，冲洗10-60分钟后，用紫外分光光度计检测样液OD240≤0.001，表示没有叠氮钠残留，鸡抗SPA抗体用酶联免疫分析法检测不到PA残留。则贮存后的蛋白A免疫吸附介质可以用于吸附工作。
为了更好地达到蛋白A吸附介质循环利用的目的，吸附人或哺乳动物IgG介质时流速可控制在50毫升/分钟。
实施例2洗脱用PH3.0的固定浓度的醋酸-氯化钠溶液，以10毫升/分钟的流速冲洗已呈饱和吸附状态的蛋白A免疫吸附介质，经30分钟后，测定无IgG残留。
平衡用PH7.4的固定浓度的磷酸盐缓冲液以10-50毫升/分钟流速冲洗5-30分钟完成平衡。
实施例3洗脱用PH2.0的固定浓度的柠檬酸盐缓冲液以10-50毫升/分钟流速冲洗已呈饱和吸附状态的蛋白A免疫吸附介质，经1-30分钟后，测定无IgG残留。
平衡用PH7.0的固定浓度的磷酸盐缓冲液以10-50毫升/分钟的流速冲洗5-30分钟完成平衡。
通过本发明的再生步骤，可以实现蛋白A吸附介质的多次循环使用，连续循环使用999次，蛋白A免疫吸附介质性能没有降低。
实验证明，用0.01-1％的叠氮钠贮存液将蛋白A介质贮存于1℃-8℃，保存期可达1年。
权利要求
1.一种蛋白A免疫吸附介质再生利用的工艺，其特征在于如下步骤(1)洗脱用pH1.0-pH3.0的浓度固定的强酸溶液作为洗脱液，对完成工作呈饱和吸附状态的蛋白A免疫吸附介质进行洗脱，洗脱速度为10-50毫升/分钟，洗脱时间为1-30分钟；(2)平衡用pH6.4-pH7.4的固定浓度的磷酸盐缓冲液作为平衡液，对洗脱后的蛋白A免疫吸附介质进行冲洗，冲洗速度为10-50毫升/分钟，冲洗时间为5-30分钟。
2.根据权利要求1所述蛋白A免疫吸附介质再生利用的工艺，其特征在于所述固定浓度的强酸溶液为柠檬酸—氯化钠溶液或醋酸—氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述蛋白A免疫吸附介质再生利用的工艺，其特征在于平衡后的蛋白A免疫吸附介质贮存于0.01％-1％的叠氮钠水溶液中，0℃-8℃保存。
4.根据权利要求1所述蛋白A免疫吸附介质再生利用的工艺，其特征在于贮存后的蛋白A免疫吸附介质使用前用pH7.0的0.9％的氯化钠预冲，冲洗速度为10-50毫升/分钟，冲洗时间为10-60分钟。
全文摘要
本发明根据蛋白A免疫吸附介质的主要功能分子—蛋白A的物理、化学和生物特征，为蛋白A免疫吸附介质设计了预冲、洗脱、平衡、贮存的方案，在各个步骤中使用各种功能溶液，并确定了具体实施的方案，从而达到蛋白A免疫吸附介质高效重复利用，降低使用成本的目的。
文档编号C07K17/10GK1544460SQ20031010867
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月12日 优先权日2003年11月12日
发明者肖海军 申请人:浙江科锐生物科技有限公司