专利名称：鼠脑分区组织核糖核酸分子膜及其制备方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鼠脑分区组织核糖核酸分子膜及其制备方法和试剂盒。
背景技术：
在分子生物学研究中，为了检测组织或细胞内的基因表达的状况常常需要用到一种称之为Northern Blot的核糖核酸(RNA)杂交分析技术。通过这种核糖核酸杂交实验可以鉴定出组织、细胞中特定基因或新基因的表达；检测基因表达的丰度、转录本大小及剪接方式；比较不同组织、细胞间的基因同源性及表达差异等。
随着分子生物学研究的不断进展，核糖核酸杂交技术也在不断得到改进和发展，起先是将核糖核酸固定在不很稳定的重氮化纤维素膜上或易碎的硝酸纤维素膜上，变为现在固定在更为牢靠的尼龙膜上；变性琼脂糖凝胶电泳由最初使用剧毒的氢氧化甲汞作为变性剂改为现在使用较为安全的甲醛作为变性剂；转膜方法由最初的毛细管洗脱法，发展为现在的真空转移法、电印迹法等多种方法。
尽管如此，许多研究人员在进行核糖核酸杂交分析实验时仍有不少困难核糖核酸极易降解，不熟练人员不容易分离到质量合格的核糖核酸分子；有的实验材料(组织、细胞)不容易采集到；制膜需耗费太多的时间和精力；因制膜方法的差异各实验室间的杂交结果可比性差。这种困难在从事大脑功能研究的领域中更为突出。人的大脑是一种结构非常精细复杂、生理功能非常庞大的神经系统，各分区组织(前皮质、后皮质、海马、嗅球、纹状体、丘脑、小脑、中脑、延髓、脑桥、扁桃体、垂体、松果体等)都有其独特而又互相协调的功能，要揭开大脑功能的奥秘需要进行大量深入细致的研究，特别是在基因结构和基因功能水平上作深入细致的研究。但是，其中许多研究是无法直接用人的大脑组织进行研究的，需要利用实验动物的大脑组织来进行研究，其中小白鼠和大白鼠便是最常用的实验动物之一。由于实验材料(脑各分区组织)更难得到，核糖核酸的分离更加困难，因而实验室中许多相关研究工作受到阻碍。
因此，在本技术领域迫切需要一种按统一质量标准制备的、方便使用的鼠脑分区组织核糖核酸分子膜。
发明内容
本发明的目的在于开发一种方便使用的、按统一质量标准制备的鼠脑分区组织核糖核酸分子膜。
本发明利用从鼠脑部分别采集的脑分区组织和全脑组织，通过总核糖核酸分离、信使核糖核酸分离、变性琼脂糖凝胶电泳、转膜和固定，开发出一种方便使用的鼠脑分区组织核糖核酸分子膜，从而实现了本发明的目的。
本发明的鼠脑分区组织核糖核酸分子膜，其特征在于有用来固定核糖核酸的载体，所述载体上固定有从变性凝胶上转移过来的、组合排列的鼠脑分区组织核糖核酸分子和鼠全脑组织核糖核酸分子，膜上标示出点样孔和核糖核酸分子质量的位置。
所述的载体是一切适合于固定核糖核酸分子的材料，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜或重氮化纤维膜等，最好是尼龙膜。
所述的鼠是指所有实验用的鼠，一般是小白鼠或大白鼠，可以使用其所有不同的品系，例如BALB/C或NC/S或RNN或SCID或DBA/2或S.D或KM或N2H或WISTAR或CBA等。
所述的脑分区组织是指脑的前皮质、后皮质、海马、嗅球、纹状体、丘脑、小脑、中脑、延髓、脑桥、扁桃体、垂体和松果体等组织中的部分或全部。
所述的核糖核酸可以是总核糖核酸也可以是信使核糖核酸，所述点样孔和核糖核酸分子质量在膜上的位置可以根据实际操作而定。
本发明的鼠脑分区组织核糖核酸分子膜的制备方法，包括以下几个步骤(1)从鼠脑部分别采集脑分区组织和全脑组织，立即放液氮中冻存备用；(2)核糖核酸的分离(a)总核糖核酸的分离从脑分区组织和全脑组织中分离出总核糖核酸，经甲醛或乙二醛-二甲基亚砜变性琼脂糖凝胶电泳检测，18S核糖体核糖核酸(rRNA)带和28S核糖体核糖核酸带清晰锐利，且两者亮度比为1∶2；(b)信使核糖核酸的分离从总核糖核酸中分离出信使核糖核酸(mRNA)；(3)取一定量的鼠脑分区组织核糖核酸样品、全脑核糖核酸样品和核糖核酸分子质量标准品，以排列组合方式点样进行甲醛或乙二醛-二甲基亚砜变性琼脂糖凝胶电泳，总RNA上样量为5～50μg/泳道，mRNA上样量为0.5～5μg/泳道，RNA分子质量标准品为0.24～9.5kb(Life Technologies公司)，上样量为2～5μg/泳道；(4)将变性凝胶中的核糖核酸分子转移到载体上；(5)将核糖核酸分子固定在载体上，固定后在膜上标示出点样孔和核糖核酸分子质量的位置。
所述的鼠是指所有实验用的鼠，一般是小白鼠或大白鼠，可以使用其所有不同的品系，例如BALB/C或NC/S或RNN或SCID或DBA/2或S.D或KM或N2H或WISTAR或CBA等。
所述的脑分区组织是指脑的前皮质、后皮质、海马、嗅球、纹状体、丘脑、小脑、中脑、延髓、脑桥、扁桃体、垂体和松果体等组织中的部分或全部。
所述的核糖核酸可以是总核糖核酸也可以是信使核糖核酸。
所述的步骤(2)中所述的总核糖核酸分离方法是常规的方法，例如TRIZOL法或“一步法”(Chomzynski P，Sacchi N.Single-step methed of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanatr-phonol-chloroform extraction.Anal.Biochem.，1987，162156～159)。
所述的步骤(2)中所述的信使核糖核酸的分离方法可以采用现有的方法，例如Oligo(dT)-纤维素或poly(U)-Sephadex的亲和层析法(Sambroook J，et al.Molecular CloningALaboratory Manual.2nd ed.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989.7.26)，也可以采用市售各种mRNA分离试剂盒分离mRNA。
所述的步骤(4)中所述的转移是采用常规的方法，例如毛细管洗脱法(Sambroook J，etal.Molecular CloningA Laboratory Manual.2nd ed.New Yorkcold spring HarborLaboratory Press，1989.7.49)或真空转移法或电印迹法等。
所述的步骤(5)中所述的固定是采用常规的方法，例如真空干燥法或紫外照射交联法(Sambroook J，et al.Molecular Cloninga Laboratory Manual.2nd ed.New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989.7.49)等。
所述的步骤(4)和步骤(5)中所述的载体是一切适合于固定核糖核酸分子的材料，例如尼龙膜或硝酸纤维素膜或重氮化纤维膜等，最好是尼龙膜。
本发明的核糖核酸分子膜的质量检测用地高辛标记的β-action(肌动蛋白)或G3PDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)cDNA探针和“DIG DNA Labeling and Detection Kit”(Roche公司)进行杂交检测，β-action或G3PDH的杂交带清晰锐利，且各泳道的杂交信号强度约略相等，并能耐受3～5轮次的杂交检测，杂交带仍清晰可见的分子膜为合格的分子膜。
本发明的鼠脑分区组织核糖核酸分子膜试剂盒，其特征在于该试剂盒中有本发明鼠脑分区组织核糖核酸分子膜、杂交液和cDNA对照探针。
本发明的用途用本发明的鼠脑分区组织核糖核酸分子膜进行Northern杂交可以(1)检测脑分区组织中特定基因或新基因的表达；(2)分析基因表达的丰度、转录本大小及剪接方式；(3)比较脑分区组织间基因表达的差异性等。
因而本发明在分子生物学研究领域，特别是在大脑的基因结构和基因功能的研究上有着重要用途。
本发明有如下优点(1)使用方便研究人员取得本发明鼠脑分区组织核糖核酸分子膜后立即就可以进行杂交试验，省去了采集组织、分离RNA和制膜等大量费时的工作，提高了工作效率，降低了研究成本；而且有各种不同脑分区组织的核糖核酸样品组合的膜可供选择，给研究工作带来极大方便
(2)质量保证鼠脑分区组织核糖核酸分子膜制作的全过程都严格遵守操作规范，并严格执行统一的质量标准，因此保证了膜的质量；(3)可比性强由于膜是按统一的质量标准制备的，因此各实验室使用后得到的实验数据可比性强，有利研究成果交流；(4)可重复使用由于本发明采用尼龙膜作为载体(支持物)，因此膜的强度大大加强，可以反复杂交使用3～5次以上，杂交信号仍可清晰检出。
图1小鼠脑分区组织核糖核酸分子膜杂交图谱(mRNA 2μg/泳道)mRNA来源1.前皮质，2.后皮质，3.海马，4.嗅球，5.纹状体，6.丘脑，7.小脑，8.中脑，9.延髓，10.扁桃体，11.脑桥，12.全脑用DIG标记的β-actin cDNA探针(8ng/mL)杂交结果具体实施方式
下面的实施例是举例说明本发明，而不是进行限定。
实施例1取小白鼠(BALB/C品系，清洁级)14种脑组织前皮质、后皮质、海马、嗅球、纹状体、丘脑、小脑、中脑、延髓、脑桥、扁桃体、垂体、松果体、全脑，按“一步法”(具体操作按文献Chomzynski P，Sacchi N.Single-step methed of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanatr-phonol-chloroform extraction.Anal.Biochem.，1987，162156～159)分离总核糖核酸，经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测，18S核糖体核糖核酸带和28S核糖体核糖核酸带清晰，且两者亮度比为1∶2；然后用Oligo(dT)-纤维素亲和层析法从总核糖核酸中分离出信使核糖核酸(具体操作按文献Sambroook J，etal.Molecular CloningA LaboratoryManual.2nd ed.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989.7.26)，再取一定量的鼠脑分区组织核糖核酸样品、全脑核糖核酸样品和核糖核酸分子质量标准品，以一定的排列组合方式点样进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，甲醛含量为质量分数3％，琼脂糖为质量分数1.2％，总RNA上样量为20μg/泳道，mRNA上样量为2μg/泳道，RNA分子质量标准品(0.24～9.5kb)上样量为3μg/泳道，具体操作按文献(Sambroook J，et al.MolecularCloningA Laboratory Manual.2nd ed.New YorkCold Spring Laboratory Press，1989.7.43.)；接着用毛细管洗脱法在中性条件下按文献方法(Sambroook J，et al.MolecularCloningA Laboratory Manual.2nd ed.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989.7.49)将变性凝胶中的核糖核酸分子转移到尼龙膜上，80℃真空干燥2小时，将核糖核酸分子固定在尼龙膜上；固定后在膜上标记出点样孔位置、RNA分子质量标准品位置、产品编号和批号，并剪去膜右下一小角(以便于暗房操作时定位)，用塑料薄膜密封。从一批产品中随机抽取1张膜，用DIG标记的β-actin cDNA探针进行杂交检测，具体操作按“DIG DNALabeling and Detection kit”(Roche公司)使用说明。质量合格的产品应杂交带清晰锐利(见图1)，具能耐受3～5次的杂交检测。
实施例2取实施例1质量合格的小鼠脑分区组织核糖核酸分子膜产品(1张)，连同附加的杂交液(30mL)、β-actin cDNA对照探针(100ng)包装成试剂盒。
权利要求
1.一种鼠脑分区组织核糖核酸分子膜，其特征在于有用来固定核糖核酸的载体，所述载体上固定有从变性凝胶上转移过来的、组合排列的鼠脑分区组织核糖核酸分子和鼠全脑组织核糖核酸分子，膜上标示出点样孔和核糖核酸分子质量的位置。
2.根据权利要求1所述的一种鼠脑分区组织核糖核酸分子膜，其特征在于所述的载体是尼龙膜；所述的的鼠是指小白鼠或大白鼠；所述的脑分区组织是指脑的前皮质、后皮质、海马、嗅球、纹状体、丘脑、小脑、中脑、延髓、脑桥、扁桃体、垂体和松果体组织中的部分或全部；所述的核糖核酸是总核糖核酸或信使核糖核酸。
3.一种鼠脑分区组织核糖核酸分子膜的制备方法，包括以下几个步骤(1)从鼠脑部分别采集脑分区组织和全脑组织，立即放液氮中冻存备用；(2)核糖核酸的分离(a)总核糖核酸的分离从脑分区组织和全脑组织中分离出总核糖核酸，经甲醛或乙二醛-二甲基亚砜变性琼脂糖凝胶电泳检测，18S核糖体核糖核酸带和28S核糖体核糖核酸带清晰，且两者亮度比为1∶2；(b)信使核糖核酸的分离从总核糖核酸中分离出信使核糖核酸；(3)取一定量的鼠脑分区组织核糖核酸样品、全脑核糖核酸样品和核糖核酸分子质量标准品，以排列组合方式点样进行甲醛或乙二醛-二甲基亚砜变性琼脂糖凝胶电泳，总核糖核酸上样量为5～50μg/泳道，信使核糖核酸上样量为0.5～5μg/泳道，核糖核酸分子质量标准品为0.24～9.5kb，上样量为2～5μg/泳道；(4)将变性凝胶中的核糖核酸分子转移到载体上；(5)将核糖核酸分子固定在载体上，固定后在膜上标示出点样孔和核糖核酸分子质量的位置。
4.根据权利要求3所述的一种鼠脑分区组织核糖核酸分子膜的制备方法，其特征在于所述的鼠是指小白鼠或大白鼠，所述的脑分区组织是指脑的前皮质、后皮质、海马、嗅球、纹状体、丘脑、小脑、中脑、延髓、脑桥、扁桃体、垂体和松果体组织中的部分或全部；所述的核糖核酸是总核糖核酸或信使核糖核酸；所述的载体是尼龙膜。
5.权利要求1、2所述的鼠脑分区组织核糖核酸分子膜的试剂盒，其特征在于该试剂盒中有所述的鼠脑分区组织核糖核酸分子膜、杂交液和cDNA对照探针。
全文摘要
本发明涉及一种鼠脑分区组织核糖核酸分子膜及其制备方法和试剂盒。其特征在于利用从鼠脑部分别采集的脑分区组织和全脑组织，通过总核糖核酸分离、信使核糖核酸分离、变性琼脂糖凝胶电泳、转膜和固定，得到一种方便使用的鼠脑分区组织核糖核酸分子膜，膜上标示出点样孔和核糖核酸分子质量的位置。本发明鼠脑分区组织核糖核酸分子膜与杂交液和cDNA对照探针构成试剂盒。本发明的核糖核酸分子膜使用方便，可比性强可重复使用，在分子生物学研究领域，特别是在大脑的基因结构和基因功能的研究上有着重要用途。
文档编号C07H1/06GK1634643SQ20031011753
公开日2005年7月6日 申请日期2003年12月26日 优先权日2003年12月26日
发明者叶志华, 郭俊, 梁建庆 申请人:广东省微生物研究所