人低分子量cd14测定试剂盒和抗体的制作方法

专利名称：人低分子量cd14测定试剂盒和抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用肽作为抗原制备的抗体，该肽具有选自人高分子量CD14的特定氨基酸序列的8到30个氨基酸残基。此外，本发明涉及结合具有人高分子量CD14的氨基酸序列中特定氨基酸序列的肽。
此外，本发明涉及人低分子量CD14的测定试剂盒和测量人低分子量CD14的方法。此外，本发明涉及脓毒症的新诊断方法，其中低分子量CD14被直接确定。此外，本发明涉及可用于制备上面的抗体的肽和制备该抗体的方法。
背景技术：
在1986年的第三届白细胞分型会议(Third Leukocyte TypingConference)上将CD14分子命名为通过识别在单核细胞的膜表面上表达的糖蛋白的抗体家族鉴定的蛋白质。1990年，Wright等人阐明CD14分子是内毒素LPS的受体(“Science”，卷249，1431-1433页，1990)。该CD14分子是分子量为53-55kDa的糖蛋白，对cDNA的分析揭示1.4kbmRNA具有356个氨基酸的编码序列(“Nucleic AcidsResearch”(U.K.)，卷16，4173页，1988)。
据报导人CD14分子包括可溶性CD14分子以及膜结合的CD14分子，并且血液含有具有不同分子量的可溶性CD14分子(“EuropeanJournal of Immunology”(德国)，卷23，2144-2151页，1993)。此外，Landmann等人进行了对患有脓毒症的患者的血清中可溶性CD14的蛋白质印迹分析并且报导在未幸存的脓毒症患者和阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)患者中有高水平的约55kDa的可溶性CD14，在正常血清中，没有检测到该分子但是检测到49kDa(分子量比前者稍低)的可溶性CD14分子(“The Journal of Infectious Disease”，卷171，639-644页，1995)。
Stelter报导糖链的差异与具有不同分子量的那些亚型有关，并且甚至在除去N-和O-连接的糖链后仍然发现血液中具有不同分子量的两种可溶性CD14亚型(“European Journal of Biochemistry”(德国)，卷236，457-464页，1996)。此外，Bufler等人对可溶性CD14进行了C-末端分析并报导GPI组结合可溶性CD14的327位的丝氨酸残基，并且具有约56kDa分子量的一种CD14分子是GPI不锚定的分子种类之一(“European Journal of Immunology”(德国)，卷25，604-610页，1995)。
抗CD14分子的抗体包括许多抗CD14抗体，它们已经被制备并用于CD14蛋白的鉴定，如Bazil等人(“European Journal ofImmunology”(德国)，卷16，1583-1589页，1986)MEM-18，shutt等人制备的RoMo-1(“Allergie and Immunologie”(Germany)，Vol.34，p.17-26，1988)，和Steinman等人(Journal of ExperimentalMedicine”(美国)，卷158，126-145页，1983)制备的3C10。
此外，Shutt等人(DE-286876-A)、Bazil等人(“MolecularImmunology”(英国)，卷26，657-662，1989)，和Grunwald等人(“Journal of Immunological Methods”(荷兰)，卷155，225-232页，1992)已经报导使用这些抗体的可溶性CD-14测定系统，容许分析人体液中的可溶性CD14。
此外，IBL-Hanburg、Medgenix，和R&D Systems已经上市了可溶性CD14-ELISA试剂盒，并且已经为许多疾病如脓毒症进行了可溶性CD14测定(“Clinical Immunology And Immunopathology”(美国)，卷80，307-310页，1996；和“Rinshokensa”，卷38，341-344页，1994)。
然而，发现可溶性CD14不是脓毒症-特异性标记物，因为既使在脓毒症之外的疾病中，约55kDa和49kDa(不同报导之间，分子量是不同的并且不限于约55kDa和49kDa，并且这同样适用于下面的描述中)的可溶性分子的水平也根据疾病发展的程度而增加(“Infectionand Immunity”(美国)，卷67，417-420页，1999；“Clinical andExperimentl Immunology”(英国)，卷120，483-487页，2000；和“Clinical Experimental Immunology”(英国)，卷96，15-19页，1994)。此外，预期可溶性CD14是脓毒症严重性的标记。然而，可溶性CD14还没有被提供作为脓毒症的诊断性产品，因为可溶性CD1 4与脓毒性休克没有相关性(”Pediatric allergy and immunology)(丹麦)，卷8，194-199，1997页)并且与系统性炎症反应综合症也没有相关性(SIRS)(“European Journal of Clinical Investigation”(英国)，卷28，672-678，1998)。
本发明的发明人已经发现血液中存在约为36kDa的低分子量可溶性CD14分子以及其他分子如Landmann等报导的约55kDa和49kDa的上述两种可溶性CD14分子(高分子量CD14(不同报导之间，分子量是不同的并且不限于约55kDa和49kDa，并且这同样适用于下面的描述中))。本发明的发明人还发现在正常个体中存在少量低分子量CD14并且在脓毒症患者中存在增加量的该低分子量CD14。从而，本发明的发明人证实了对可溶性低分子量CD14的测定的临床效能。然而，本领域中公知的抗-CD14抗体是识别高分子量可溶CD14蛋白或者识别高-和低-分子量可溶CD14蛋白的抗体。因而，本领域中还没有仅识别低分子量CD14的抗体。此外，已经认为低分子量CD14蛋白的氨基酸序列与高分子量可溶性CD14蛋白的氨基酸序列的一部分相同，所以认为制备如上述的抗体和使用该抗体对低分子量CD14的直接免疫学测定是困难的。因此，作为对可溶性低分子量CD14的测定，建议血液中可溶性CD14的总水平减去血液中高分子量CD14的水平间接得到血液中低分子量CD14的水平。

发明内容
在这种情况下，希望存在方便地、高度灵敏和特异地定性或定量确定人低分子量CD14的测定法，该测定法容许直接确定人低分子量CD14并且可用于脓毒症患者的诊断，和该测定法的测定试剂盒。此外，希望有用于该测定法的针对人低分子量CD14的抗体。
本发明的发明人在大量研究后已经发明了使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有选自人高分子量CD14的1到68位的氨基酸序列的8到30个氨基酸残基，该抗体可用于方便地、高度灵敏和特异地定性或定量确定人低分子量CD14。此外，本发明的发明人发明了结合具有人高分子量CD14的氨基酸序列中特定氨基酸序列的肽的抗体。
此外，本发明的发明人发明了特异确定人低分子量CD14的测定法和人低分子量CD14的测定试剂盒。而且，本发明的发明人发明了脓毒症的新的诊断方法，其中人低分子量CD14被直接确定。此外，本发明的发明人发明了用于制备上面的抗体的肽和制备上面抗体的方法。
换句话说，本发明提供了下面的新抗体和人低分子量CD14的测定试剂盒。
(1)如在下面的(1-1)到(1-5)中描述的抗体(1-1)使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有选自SEQ IDNO1中描述的氨基酸序列的连续的8到30个氨基酸残基。
(1-2)使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有选自SEQ IDNO1中描述的氨基酸序列的连续的8到20个氨基酸残基。
(1-3)使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有选自SEQ IDNO1中描述的氨基酸序列中53到68位的氨基酸序列的连续的8到16个氨基酸残基。
(1-4)使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有SEQ ID NO2到4任何一个中描述的氨基酸序列。
(1-5)使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有选自SEQ IDNO2中描述的16个氨基酸残基。
(2)如在下面的(2-1)和(2-2)中描述的抗体(2-1)结合具有SEQ ID NO2到4任何一个中描述的氨基酸残基的肽的抗体。
(2-2)结合具有SEQ ID2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体。
(3)人低分子量CD14测定试剂盒，其在下面的(3-1)和(3-22)中表示(3-1)用于直接测定样品中人低分子量CD14而不检测人高分子量CD1 4的人低分子量CD14的测定试剂盒，该试剂盒含有结合至少一种人低分子量CD14或者其片段的抗体。
(3-2)(3-1)的人低分子量CD14测定试剂盒，其中结合人低分子量CD14或者其片段的抗体是上面的(1-1)到(1-5)、(2-1)、或(2-2)任一项中描述的抗体，或者其片段。
(3-3)(3-1)的人低分子量CD14测定试剂盒，其中结合人低分子量CD14或者其片段的抗体是上面的(1-4)、(1-5)、(2-1)、或(2-2)任一项中描述的抗体，或者其片段。
(3-4)(3-1)的人低分子量CD14测定试剂盒，其中结合人低分子量CD14或者其片段的抗体是上面的(1-5)或(2-2)任一项中描述的抗体，或者其片段。
(3-5)(3-1)到(3-4)任一项的人低分子量CD14测定试剂盒，其中人低分子量CD14通过三明治免疫测定法测定。
(3-6)(3-5)的人低分子量CD14测定试剂盒，其还含有结合人低分子量CD14的第二结合物质。
(3-7)(3-6)的人低分子量CD14测定试剂盒，其中第二结合物质是结合人低分子量CD14或者其片段的抗体。
(3-8)(3-6)的人低分子量CD14测定试剂盒，其中第二结合物质是结合人低分子量CD14的单克隆抗体。
(3-9)(3-6)的测定试剂盒，其中第二结合物质是结合下面的任一区域的抗体人高分子量CD14的1到52位的氨基酸残基；其片段；与结合人高分子量CD14的1到52位的氨基酸残基的任一区域的抗体竞争或者显示出交叉反应性的抗体；或者其片段。
(3-10)(3-6)的测定试剂盒，其中第二结合物质是结合人高分子量CD14的17到26位任一个氨基酸残基的抗体；其片段；与结合人高分子量CD14的17到26位的任一个氨基酸残基的抗体竞争或者显示出交叉反应性的抗体；或者其片段。
(3-11)(3-6)到(3-10)任一项的人低分子量CD14的测定试剂盒，其中在上面的(1-1)到(1-5)、(2-1)，或(2-2)的任一项中描述的抗体或者其片段与不可溶的载体结合。
(3-12)(3-6)到(3-10)任一项的人低分子量CD14的测定试剂盒，其中第二结合物质与不可溶的载体结合。
(3-13)(3-6)到(3-10)任一项的人低分子量CD14的测定试剂盒，其中在上面的(1-1)到(1-5)、(2-1)，或(2-2)的任一项中描述的抗体，或者其片段被标记。
(3-14)(3-6)到(3-11)任一项的人低分子量CD14的测定试剂盒，其中第二结合物质被标记。
(3-15)(3-6)到(3-14)任一项的人低分子量CD14的测定试剂盒，其还含有第二特异结合物质和该第二特异结合物质的配偶体，其中该第二结合物质和其配偶体一起形成第二特异结合。
(3-16)(3-15)的人低分子量CD14的测定试剂盒，其中第二结合物质或其配偶体与不可溶的载体结合。
(3-17)(3-15)的人低分子量CD14的测定试剂盒，其中第二特异结合物质或其配偶体被标记。
(3-18)(3-5)到(3-12)、(3-15)，和(3-16)任一项的人低分子量CD14的测定试剂盒，其还含有标记的人低分子量CD14或者标记的人低分子量CD14类似物，其中通过三明治免疫测定法基于竞争方法实施测定。
(3-19)(3-5)到(3-18)任一项的人低分子量CD14的测定试剂盒，其中标记为酶、染料、金胶体、有色乳胶、化学发光物质、荧光物质，和同位素中的至少一种。
(3-20)(3-5)到(3-19)任一项的人低分子量CD14的测定试剂盒，其中三明治免疫测定法是使用免疫层析的测定方法。
(3-21)(3-5)到(3-19)任一项的人低分子量CD14的测定试剂盒，其中三明治免疫测定法是使用流通(flow through)方法的测定方法。
(3-22)(3-1)的人低分子量CD14的测定试剂盒，其中通过凝集方法、直接固相方法，或者竞争方法实施测定。
此外，提供了下面的人低分子量CD14的测定法、脓毒症的新型诊断方法、肽、和制备抗体的方法(4)如下面的(4-1)到(4-3)中描述的人低分子量CD14的测定法。
(4-1)人低分子量CD14的测定方法，其使用结合至少一种人低分子量CD14的抗体直接测定人低分子量CD14以便检测人低分子量CD14而不检测人高分子量CD14。
(4-2)(4-1)的人低分子量CD14的测定方法，其中结合人低分子量CD14的抗体是上面(1-1)到(1-5)、(2-1)或(2-2)任一项中描述的抗体，或者其片段。
(4-3)(4-2)的人低分子量CD14的测定方法，其中通过三明治免疫测定法确定人低分子量CD14。
(5)脓毒症的诊断方法，其直接测定人低分子量CD14。
(6)具有SEQ ID NO2到4任一项中描述的氨基酸残基的肽。
(7)如下面的(7-1)和(7-2)中描述的制备抗体的方法。
(7-1)制备上面的(1-1)到(1-5)、(2-1)、和(2-2)的任一项的抗体的方法，其中具有选自SEQ ID NO1中描述的氨基酸序列的连续8到30个氨基酸残基的肽，或者具有SEQ ID NO2到4任一项中描述的氨基酸残基的肽被用作抗原。
(7-2)制备(1-4)、(1-5)、(2-1)、和(2-2)的任一项抗体的方法，其中具有SEQ ID NO2到4任一项中描述的氨基酸残基的肽被用作抗原。
本发明的抗体可用于本发明的人低分子量CD14的测定试剂盒，并且该试剂盒容许方便地、高度灵敏和特异地定性或定量测量人低分子量CD14并且用于脓毒症患者的诊断。
附图简述

图1是使用S68-肽多克隆抗体的免疫层析试剂盒的示意图，其中(A)部分是使用金-胶体-标记的F1031-8-3作为标记抗体的免疫层析测定法的示意图，(B)部分是使用生物素和链霉抗生物素作为第二结合物质的免疫层析试剂盒的示意图。
图2显示了通过免疫层析试剂盒使用S68-肽多克隆抗体对标准物质实施的测定法的结果。
图3显示了其中仅仅S68肽抑制S68-肽多克隆抗体和低分子量CD14蛋白质之间的结合的结果，其中(A)部分显示了在正常个体的血清中没有发现结合的状态，(B)部分显示了脓毒症患者的血清中使用S68肽对结合的抑制。
图4是代表使用本发明的低分子量CD14的EIA试剂盒，通过sCD14(1-307)S286C蛋白质，得到的标准曲线的图。
图5阐明了一种情况，其中来自正常个体的血清的可溶性CD14蛋白不影响通过本发明的低分子量CD14的EIA试剂盒，使用sCD14(1-307)S286C测量的值。
图6是显示通过分别使用低分子量CD14的EIA试剂盒和商业途径可得到的CD14-EIA试剂盒(IBL-Hamburg)，利用凝胶过滤层析，分析脓毒症患者的血清中低分子量CD14蛋白和高分子量CD14蛋白所得到的结果的图。
图7是显示通过分别使用低分子量CD14的EIA试剂盒和商业途径可得到的CD14-EIA试剂盒(IBL-Hamburg)，利用凝胶过滤层析，分析脓毒症患者的血清中低分子量CD14蛋白和高分子量CD14蛋白所得到的结果的图，其中，图的上面的黑色箭头分别指出用于校准的标记物的位置，即，从左到右为BSA、卵清蛋白、胰凝乳蛋白酶原-A，和核糖核酸酶-A。
实施本发明的最佳模式此后，将更详细地描述本发明。
人血液中的主要可溶性CD14分子包括约55kDa和约49kDa的可溶性CD14分子(此后，“人”可被省略并且它们可被描述为高分子量CD14分子)，它们在背景技术中描述的Landmann等的报导中描述。已经证实那些高分子量CD14分子结合F1025-3-1抗体(见WO01/22085)。
另一方面，还发现存在不结合F1025-3-1抗体的CD14片段，换句话说，存在不同于高分子量CD14的具有低分子量的低分子量CD14。还表明关于特定疾病的血液中低分子量CD14水平的增加。
此后，将描述作为本发明的测定法分析物的人低分子量CD14(此后，“人”可被省略并且其可以被描述为低分子量CD14)。
作为本发明的测定法的分析物的人低分子量CD14具有如下至少三个特征(1)不结合F102-3-1抗体；(2)特异结合使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有SEQID NO2中描述的16个氨基酸残基；和(3)凝胶过滤层析时显示出25到45kDa的分子量范围中的峰。
上述特征(1)容许作为本发明的测定法分析物的人低分子量CD14被识别为与上述高分子量CD14不同的分子。特征(1)中描述的F1025-3-1抗体是使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有SEQ IDNO5中描述的全长人CD14的316到328位的氨基酸序列。从而，因为不结合F1025-3-1抗体，可想象SEQ ID NO5中描述的全长人CD14的316位和后面的序列不存在于人低分子量CD14中。
上面的特征(2)中描述的SEQ ID NO2中描述的具有16个氨基酸的肽相应于SEQ ID NO5中描述的人CD14的53到68位的16个氨基酸残基。在人蛋白质中，除了人CD14，含有SEQ ID NO2的其他蛋白质迄今仍属未知，从而该序列可能是对人CD14特异的序列。该事实证实作为本发明中测定法的分析物的肽可以是一种人CD14。
此外作为代替特征(2)的特征(2’)，作为本发明中测定法的分析物的人低分子量CD14的特征可以是结合一种抗体，该抗体结合SEQ IDNO2中描述的具有16个氨基酸的肽。
从上面的特征(3)，通过凝胶过滤层析，作为本发明中测定法的分析物的人低分子量CD14显示出分子量范围为25到45kDa的洗脱峰。通常，使用用凝胶过滤层析的分子量分析导致分析结果的变化，该变化依赖于实验条件，其包括用于层析的树脂、柱子的尺寸，和所用标记的分子量。作为本发明中测定法的分析物的人低分子量CD14的特征是其可以在凝胶过滤层析中与高分子量CD14区分开来并且在较低分子量被洗脱。
提供了具有可以被上面的(1)到(3)解释的特征的人低分子量CD14，作为本发明中测定法的分析物。下面将描述作为本发明中测定法的分析物的人低分子量CD14的其他优选特征。
(4)对抗-人CD14多克隆抗体的特异结合作为本发明中测定法的分析物的人低分子量CD14特异结合使用全长人CD14或重组全长人CD14作为抗原得到的多克隆抗体。抗人CD14多克隆抗体的实例包括如后面在实施例3-(2)-(2)中描述的用人血液中的CD14蛋白免疫小鼠得到的具有增强的抗体效价的抗血清；和其中包括的特定抗体。
此外，人低分子量CD14的特征是结合特异抗-CD14单克隆抗体。例如，人低分子量CD14的独特特征是其结合识别SEQ ID NO5中描述的全长人CD14的17到26位的氨基酸序列的抗CD14单克隆抗体或者与该抗体竞争的抗-CD14单克隆抗体。这种抗体的具体实例包括使用人血清中的CD14作为抗原制备的下述F1031-8-3抗体和使用重组人CD14作为抗原制备的下述F1106-13-3抗体。
另一方面，人低分子量CD14的其他特征如下。人低分子量CD14的特征是其可以同时在两个位置结合识别SEQ ID NO5中描述的全长人CD14的17到26位的氨基酸序列的抗-CD14单克隆抗体和与该抗体竞争的抗-CD14单克隆抗体之一；和使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基，如上面的特征(2)中描述的。例如，人低分子量CD14的特征是其可以通过三明治方法，使用这两种抗体的组合来测定。
本发明的发明人发现上面描述中揭示的人低分子量CD14是人血液中的可溶蛋白并且与正常个体相比更多地存在于脓毒症患者的血液中，并且可以使用特异抗体直接测定该蛋白。另外，在上述WO 01/22085中，分子量为36kDa的一种蛋白被例示为作为测定法的分析物的低分子量CD14的一种分子种类。
此外，在本说明书中描述的“可溶性CD14”指存在于人血浆中并且用于与附着在细胞膜上但是没有在人血浆中发现的“膜-结合CD14”形成对比的蛋白质。
用于本发明的“使用一种肽作为抗原制备的抗体”指一种抗体，其中用作“抗原”的肽作为表位或表位的一部分提供。此外，其显示出结合“使用一种肽作为抗原制备的抗体”的“抗原”的肽的能力。“使用一种肽作为抗原制备的抗体”的实例包括代表上述特征的抗体，尽管使用肽作为它们的免疫原，加入载体或载体蛋白或者其他氨基酸残基以提供作为具有免疫原性的“抗原”的各自肽制得这些抗体。
根据本发明的第一个方面，提供了使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有选自SEQ ID1中描述的氨基酸序列的连续的8到30个氨基酸残基。
使用一种肽作为抗原制备根据本发明的第一个方面的抗体，该肽具有选自SEQ ID1中描述的氨基酸序列的连续的8到30个氨基酸残基。
氨基酸残基的数目不被特别限制，只要其是使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有选自SEQ ID1中描述的氨基酸序列的连续的8到30个氨基酸残基。其是使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有优选10个或更多连续氨基酸，更优选12个或更多连续氨基酸，尤其优选16个连续氨基酸。此外，其是使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽优选有25个或更少，更优选20个或更少的氨基酸。
此外，其可以是SEQ ID NO1中描述的氨基酸序列中1到68位的任一区域并且不被具体限制。然而，优选为使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有SEQ ID NO1中描述的氨基酸序列中53到68位氨基酸位置的连续的8到16个氨基酸残基。此外，优选使用肽作为抗原制备的抗体，该肽分别具有SEQ ID NO2-4中描述的氨基酸残基。SEQID NO5描述了全长人CD14的氨基酸序列。SEQ ID NO1中描述的氨基酸序列相应于SEQ ID5中描述的氨基酸序列的1到68位。此外，SEQ ID NO2、3和4中描述的氨基酸序列分别相应于SEQ ID NO5中描述的氨基酸序列的53到68位(16个氨基酸残基)、1到17位(17个氨基酸残基)，和14到32位(19个氨基酸残基)。即，SEQ ID NO2到4中描述的每种氨基酸残基是包括在SEQ ID NO1中描述的氨基酸序列中的连续氨基酸残基。
更优选地，其是使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有SEQ IDNO2中描述的16个氨基酸残基。
根据本发明的第一个方面的抗体的特征是结合人低分子量CD14。该特征容许该抗体用于根据本发明的第四个方面的试剂盒或者根据本发明的第五个方面的测定法。
此外，人低分子量CD14的分子量与高分子量CD14的不同，并且前者的氨基酸序列短于后者的。为此，血液中低分子量CD14的构象与高分子量CD14的构象不同，从而它们与抗体的反应性可能相互不同。这样，可想象根据本发明的第一方面的抗体强烈结合低分子量CD14。
根据本发明的第二方面，提供了结合具有SEQ ID NO2到4任一个中描述的氨基酸残基的肽的抗体。
根据本发明的第二方面的抗体可结合肽的任何区域，只要其结合具有SEQ ID NO2到4任一个中描述的氨基酸残基的肽，该区域不被特别限制。
优选地，其是结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体。
根据本发明的第二方面的抗体的特征是结合人低分子量CD14抗体。该特征容许该抗体用于根据本发明的第四个方面的试剂盒或者根据本发明的第五个方面的测定法。
此外，人低分子量CD14的分子量与高分子量CD14的不同，并且前者的氨基酸序列短于后者的。为此，血液中低分子量CD14的构象与高分子量CD14的构象不同，从而它们与抗体的反应性可能相互不同。这样，可想象根据本发明的第二方面的抗体强烈结合低分子量CD14。
短语“结合具有SEQ ID NO2到4任一个中描述的氨基酸残基的肽”指抗体特异结合作为抗原的肽，该肽具有每一个SEQ ID编号中描述的氨基酸残基并且显示出通常的抗原-抗体反应。例如，短语“结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽”指抗体特异结合作为抗原的肽，该肽具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基并且显示出通常的抗原-抗体反应。抗体-抗原反应的表示可通过凝集方法、三明治方法、固相直接方法或固相结合方法、竞争方法等鉴定。
根据本发明的第二方面的抗体的解离常数(KD)为，当解离常数表达为对肽或低分子量CD14的亲和性时，优选小于10-7M，更优选10-8M或更小，更优选10-9M或更小。
在根据本发明的第二方面的抗体的制备中，用作抗原的肽是含有SEQ ID NO2到4任一个中描述的氨基酸残基的连续8个或更多氨基酸，优选连续10个或更多，更优选连续12个或更多，尤其优选连续16个或更多氨基酸的肽。此外，只要该肽含有SEQ ID NO2到4任一个中描述的氨基酸残基的连续8个或更多氨基酸，那么其他氨基酸序列不被限制。该肽的全部氨基酸序列优选来自SEQ ID NO2到4任一个中描述的氨基酸序列。
根据本发明的第二方面的抗体优选为使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有SEQ ID NO2中描述的氨基酸残基的连续8个或更多氨基酸。其是使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有优选连续10个或更多，更优选连续12个或更多，尤其优选连续16个或更多氨基酸。
根据本发明的第一方面的抗体和根据本发明的第二方面的抗体(此后，它们可被描述为本发明的抗体)可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本发明的抗体所来自的动物的种类不被特别限制。根据方便该抗体的制备，优选兔、山羊，等。此外，免疫球蛋白种类可用于类、亚类和同种型的任一种。
制备将用作免疫原的方法的实例包括通常使用肽合成仪(433A型肽合成仪，Perkin-Elmer，日本)等的方法和遗传重组方法(“新细胞工程化实验方案”，编者Department of Carcinostatic Research，The Institute of Medical Science，The University of Tokyo，Shujunsha)。
例如，通过Fmoc方法使用433A型肽合成仪可以合成具有SEQ IDNO2中描述的氨基酸残基的连续8个或更多氨基酸的肽。用TFA去保护并从树脂切掉后，所得产物通过使用C18 HPLC柱(Capcell-pak，Shiseido Co.，Ltd.)纯化，从而制备靶标肽。
当抗原是蛋白质时，其可直接用作免疫原。然而，当肽具有8到30个氨基酸残基或更少残基时，该肽的分子量较小，通常不足以用作免疫原。在该情况下，通过将该肽结合到载体或者使用多抗原肽(MAP)方法可以提供该肽作为抗原。然后，制备MAP肽并且其提供了使得该抗原具有免疫原性的分子量。
将要结合到上述肽的载体包括载体蛋白和聚合物。所用载体蛋白可以是异种蛋白如牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、和卵清蛋白。那些载体蛋白利用肽或载体蛋白氨基酸侧链的官能团或者导入马来酰亚胺基、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基，或者醛基以容许该载体结合上面的肽。聚合物的实例包括糖如甘露聚糖和壳聚糖和聚乙烯吡咯烷酮(PVA)。那些聚合物可通过吸附或者如上述的化学结合结合上面的肽。
本发明的抗体可以通过使用本领域中公知的技术(见，例如，《免疫学实验方法》，日本免疫学协会编辑，日本免疫学协会出版)制备。例如，通过下面的方法可制备多克隆抗体。
通过如上述制备的20到1,000μg免疫原与佐剂如弗氏完全佐剂、RIBI佐剂或ALUM的混合物可以免疫各种动物的任一种。可以使用的各种动物的实例包括马、绵羊、山羊、猪、兔、大鼠和小鼠。可以使用的免疫方法包括肌内施用、皮内施用、皮下施用、腹膜内施用、和淋巴结施用。可以进行加强免疫从而在第一次施用后每1-4周，类似施用与佐剂如弗氏不完全佐剂、RIBI佐剂或ALUM混合的免疫原，或者该免疫原直接被静脉内施用。通过常规采血方法可以从被免疫的动物制备抗血清，该方法例如，包括从颈动脉、耳静脉、心脏、腿静脉等收集血液，通过离心等方法从血液分离血清。将所得抗血清进行盐析方法，该方法包括加入硫酸铵、硫酸钠等沉淀γ-球蛋白部分。然后，该部分在适宜的缓冲液中透析后，使用能够特异纯化γ-球蛋白的蛋白质A、蛋白质G等的亲和基质可以制备抗靶标肽的IgG部分的纯化的多克隆抗体。此外，通过选择结合上面的抗原的抗体可以进行特异纯化。
而且，通过下面的方法可以制备单克隆抗体。
通过下面的步骤可以制备本发明的抗体将被免疫动物的免疫细胞与骨髓瘤细胞融合以制备杂交瘤；从杂交瘤选择产生能够结合上面的肽的抗体的克隆。优选地，免疫原是具有53到68位的连续10个或更多氨基酸残基的肽。此外，免疫原更优选为具有连续12个或更多氨基酸的肽，尤其优选具有连续16个氨基酸的肽。
虽然所要免疫的哺乳动物不被特别限制，但是优选考虑与用于细胞融合的骨髓瘤细胞的相容性来选择哺乳动物，并且其优选为小鼠、大鼠、仓鼠，等。可以使用的骨髓瘤细胞是本领域中熟知的各种类型的细胞，包括骨髓瘤细胞P3、P3U1、SP2/0、NS-1、YB2/0、和Y3-Ag1、2和3。
可通过公知的方法实施免疫。例如，通过将抗原腹膜内、皮下、静脉内施用或者施用到爪垫中实施免疫。抗原可以与佐剂组合施用并且优选多次施用抗原。免疫细胞优选为抗原的最后一次施用后几天，例如，3天后的脾细胞或者从分离的淋巴结得到的细胞。使用公知方法如Milstein等人(Methods in Enzymol.，卷73，第3页)的方法可以融合免疫细胞和骨髓瘤细胞。例如，可提及使用聚乙二醇(PEG)作为融合剂的方法、电场诱导的细胞融合方法等。只要其容许融合，那么免疫细胞和骨髓瘤细胞的混合比不被特别限制。然而，优选使得骨髓瘤细胞的量的1/10相当于免疫细胞的量。在使用PEG(平均分子量1,000到4,000)的细胞融合方法中，PEG的浓度不被特别限制。然而，优选在50％的浓度实施融合。可加入助剂如二甲亚砜(DMSO)作为融合效率的增强剂。通过加入37℃保温的PEG溶液开始融合并在溶液和细胞反应1到5分钟后加入培养基结束融合。融合产生的杂交瘤在选择培养基如含有次黄嘌呤、胸腺嘧啶和氨基碟呤(HAT培养基)的培养基孵育1到7天以将它们与未融合的细胞分离。
所得杂交瘤进一步通过它们所产生的抗体选择。通过公知的有限稀释方法将所选择的杂交瘤转化成单克隆的以建立产生单克隆抗体的杂交瘤。任一种公知的方法可用作检测杂交瘤产生的抗体的活性的方法。这些方法的实例包括ELISA、凝集反应、放射免疫测定法。通过公知的方法可培养所建立的杂交瘤的实例并且可从培养上清液得到单克隆抗体。此外，将杂交瘤施用于与之有相容性的哺乳动物以允许增殖，并且从腹水得到增殖的杂交瘤。使用公知的纯化方法如盐析、凝胶过滤、离子交换层析、或者亲和层析可以进行抗体的纯化。
此外，如在下面的方面中描述的，本发明的抗体可用于本发明的人低分子量CD14的测定试剂盒，可以想象可以制备结合人低分子量CD14但是不结合人高分子量CD14的抗体。
还可以想象通过使用低分子量CD14作为抗原制备抗体并选择不结合高分子量CD14的抗体，可以得到结合人低分子量CD14但是不结合人高分子量CD14的抗体。
在WO 01/72993的实施例16中描述了制备低分子量CD14的方法。此外，使用本发明的抗体，通过从人血清，优选从脓毒症患者的血清特异纯化可以制备低分子量CD14。
为了选择不结合高分子量CD14的抗体，可通过凝集方法、三明治方法、固相直接方法或固相结合方法、竞争方法等评估所得抗体和高分子量CD14之间的结合。那些方法将在后面描述。
使用对高分子量CD14特异的抗体可以制备高分子量CD14，该抗体在WO 01/22085的实施例5中描述。
还可以想象通过如上述的相同方法使用一种肽作为抗原，该肽具有人CD14的氨基酸序列的一部分，制备并选择不结合高分子量CD14的抗体来制备该抗体。“具有人CD14的氨基酸序列的一部分的肽”指，例如，含有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸的序列中连续8个或更多氨基酸的每种肽。
根据本发明的第三方面，提供了人低分子量CD14的测定试剂盒，其含有结合至少一种人低分子量CD14的抗体或者该抗体的片段，并且其直接测定样品中的低分子量CD14而不检测人高分子量CD14。
本发明的试剂盒含有结合至少一种人低分子量CD14的抗体或者该抗体的片段并且直接测定样品中的低分子量CD14。此外，该试剂盒检测作为分析物的人低分子量CD14但是不检测人高分子量CD14，从而人低分子量CD14可以直接测定。“抗体的片段”指抗体的Fab、Fab’、或F(ab’)2。
本发明的人低分子量CD14测定试剂盒不被特别限制，只要其含有结合至少一种人低分子量CD14的抗体或者该抗体的片段并且直接测定样品中的低分子量CD14。优选地，其是含有本发明的抗体或者该抗体的片段作为结合人低分子量CD14的抗体或者该抗体的片段的人低分子量CD14的测定试剂盒。更优选地，其是包括使用一种肽作为抗原(该肽具有SEQ ID NO2到4任一个中描述的氨基酸残基)制备的抗体，或者该抗体的片段的人低分子量CD14的测定试剂盒。此外，优选地，其是含有结合具有SEQ ID NO2到4任一个中描述的氨基酸残基的肽的抗体或者该抗体的片段，作为结合人低分子量CD14的抗体或者该抗体的片段的人低分子量CD14的测定试剂盒。尤其优选地，其是包括使用一种肽作为抗原(该肽具有SEQ ID NO2中描述的氨基酸残基)制备的抗体或者该抗体的片段，或者结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体或者该抗体的片段，作为结合人低分子量CD14的抗体或者该抗体的片段的人低分子量CD14的测定试剂盒。
而且，该测定法的原理不被特别限制，只要该测定法是使用该抗体或者其片段免疫测定人低分子量CD14的方法。
作为该测定法的原理的一个实例，将具体描述人低分子量CD14的测定试剂盒(此后，其可被描述为三明治免疫测定试剂盒)，其通过使用“结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”作为根据本发明的第二方面的优选实例确定人低分子量CD14。
一种熟知的方法可用作三明治免疫测定法。该测定法的原理、应用和改良在例如“超灵敏酶免疫测定法”，Eiji Ishikawa编著，Centerfor Academic Publication日本(1993)、“诊断试剂的新应用实例和应用/免疫测定的药物开发”，Immunoassay Development ResearchSociety，Keiei-Kyoiku Shuppan、和“酶免疫测定法”(第三版)，Eiji Ishikawa编著，Igaku-Shoin Ltd.(1987)中描述。
此外，本发明的三明治免疫测定法含有结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体。结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体、制备这种抗体的方法等和根据本发明的第一方面的那些抗体和方法相同。该抗体可以是，但不特别限于，多克隆抗体或单克隆抗体。
三明治免疫测定法是使用识别通常将要测定的蛋白质上两个不同位点的两种或多种抗体的方法，其中通过形成抗体—抗原—抗体复合体实施该测定法。
首先，制备与第一抗体偶联的不可溶载体并将该载体作为固相或反应位置。将样品加到作为固相的不可溶载体然后让它们相互反应。它们反应预定时间段后，洗涤固相以从其除去未结合的物质。随后，加入标记的第二抗体。混合物反应预定时间后，通过洗涤除去不形成复合体的标记抗体，然后以特定方式基于标记产物定性或定量确定结合于固相的复合体的量。三明治方法可使用包括如上述的两步的方法(两步方法)和包括同时加入抗原和标记抗体的步骤的方法(一步方法)之一。
在本发明的三明治免疫测定试剂盒中，通过形成“结合具有SEQ IDNO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”-人低分子量CD14-“结合人低分子量CD14的第二结合物质”的复合体可以实施该测定法。
本发明的三明治免疫测定试剂盒的形式包括与结合具有SEQ IDNO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体结合的不可溶载体和结合标记的低分子量CD14的第二结合物质(此后，其可简单地被描述为第二结合物质)；或者与第二结合物质结合的不溶载体和结合具有SEQ IDNO2中描述的16个氨基酸残基的标记肽的抗体。
第二结合物质的实例包括结合低分子量CD14的抗体。结合低分子量CD14的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体并且不被特别限制。考虑到使用结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸的肽的抗体的三明治免疫测定法的亲和性，优选单克隆抗体。此外，第二结合物质可以是单克隆抗体的片段。抗体的片段为单克隆抗体的Fab、Fab’、或F(ab’)2。
结合低分子量CD14的抗体(此后，其可以被描述为第二抗体)可以是特异结合低分子量CD14的抗体或者结合高分子量CD14的抗体并且不被特别限制。优选地，其是结合与本发明抗体的结合位点不同位点的抗体。当结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体被用作本发明的抗体时，第二抗体是结合除了相应于低分子量CD14的SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸的区域之外的区域的抗体。更优选地，上述第二物质是结合人高分子量CD14的1到52位氨基酸残基的任一区域的抗体或者该抗体的片段；或者与结合人高分子量CD14的1到52位氨基酸残基的任一区域的抗体或者该抗体的片段竞争或者与其显示出交叉反应性的抗体。尤其优选地，上述第二物质是结合人低分子量CD14的17到26位任一氨基酸残基的抗体或者该抗体的片段；或者与结合人低分子量CD14的17到26位任一氨基酸残基的抗体或者该抗体的片段竞争(显示出交叉反应性)的抗体。
可以例如，使用高分子量CD14、低分子量CD14、高分子量CD14与低分子量CD1 4的混合物、或者重组CD14作为抗原，制备多克隆抗体或单克隆抗体，如使用根据本发明的第一方面的方法中的情况。在下述实施例3中将描述使用高分子量CD14与低分子量CD14的混合物，和重组CD14作为抗原制备第二抗体的示例性方法。
此外，优选选择第二抗体从而，在实际实施测定法之前，就如在后面描述的实施例3中一样，预先构建三明治方法系统，该系统包括结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽和第二抗体的候选抗体，以证实该测定法的灵敏性。
另外，通过熟知的方法(“Hypersensitive EnzymeImmunoassay”，Eiji Ishikawa撰写，25-40页，Center for AcademicPublication Japan(1993))可以制备抗体片段Fab、Fab’、和F(ab’)2。
在三明治免疫测定法中，通过作为上面方法的备选方法的竞争方法实施测定法。该方法允许在抗体-抗原-抗体复合体的形成过程中，样品中的抗原与标记抗原或标记抗原类似物竞争。
在本发明的三明治免疫测定法试剂盒中，通过形成“结合具有SEQID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”-标记的人低分子量CD14(或者其类似物)-“结合人低分子量CD14的第二结合物质”的复合体实施该测定法。
本发明的三明治免疫测定试剂盒的竞争方法的形式包括与结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体结合的不可溶载体；第二结合物质；被标记的人低分子量CD14或被标记的人低分子量CD14类似物，或者包括结合具有SEQ ID NO2中描述的1 6个氨基酸残基的肽的抗体；与第二结合物质结合的不可溶载体；和被标记的人低分子量CD14或被标记的人低分子量CD14类似物。
人低分子量CD14类似物的实例包括具有人CD14的N-末端1到285位上的氨基酸的可溶性多肽(此后，描述为sCD14(1-285))和具有人CD14的N-末端1到307位上的氨基酸的重组多肽，其中286位的丝氨酸被半胱氨酸置换(此后，描述为sCD14(1-307)S286C)。然而，在该测定系统中，人低分子量CD14类似物不被特别限制，只要其是能够与样品中人低分子量CD14竞争的物质。在WO 01/72993中描述了制备sCD14(1-285)和sCD14(1-307)S286C的方法。
此外，在三明治免疫测定法中，通过利用第二特异结合作为备选方法可以实施测定法。该备选方法通过形成抗体-抗原-抗体-第二特异结合物质-第二特异结合物质的特异结合配偶体(此后，其可被描述为第二特异结合配偶体)的复合体实施测定。
在本发明的三明治免疫测定试剂盒中，通过形成“结合具有SEQ IDNO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”-人低分子量CD14-“结合人低分子量CD14的第二结合物质”-第二特异结合物质-第二特异结合配偶体的复合体，或者形成“结合人低分子量CD14的第二结合物质”-人低分子量CD14-“结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”-第二特异结合物质-第二特异结合配偶体的复合体来实施测定。
利用本发明的三明治免疫测定试剂盒的第二特异结合的形式包括用结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的第二特异结合物质标记的抗体；结合标记的低分子量CD14的第二特异结合物质、与第二特异结合配偶体结合的不可溶载体，或者包括结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的标记抗体；结合用第二特异结合物质标记的低分子量CD14的第二结合物质；和与第二特异结合配偶体结合的不可溶载体。
第二特异结合物质和第二特异结合配偶体的组合的实例包括抗原及其抗体、配体及其受体、含有某些糖和凝集素的物质、和生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。
此外，三明治免疫测定法的实例包括利用针对抗体的抗体，即，抗-免疫球蛋白抗体，形成抗体-抗原-抗体-抗免疫球蛋白抗体复合体的测定法；和利用抗-免疫球蛋白抗体和第二特异结合形成抗-免疫球蛋白抗体-抗体-抗原-抗体-第二特异结合物质-第二特异结合配偶体的测定法。
本发明的三明治免疫测定试剂盒通过以下进行测定形成“结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”-人低分子量CD14-“结合人低分子量CD14的第二结合物质”-抗免疫球蛋白抗体的复合体；形成“结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”-人低分子量CD14-“结合人低分子量CD14的第二结合物质”-抗免疫球蛋白抗体的复合体；形成抗免疫球蛋白抗体-“结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”-人低分子量CD14-“结合人低分子量CD14的第二结合物质”-第二特异结合物质-第二特异结合配偶体的复合体；形成抗免疫球蛋白抗体-“结合人低分子量CD14的第二结合物质”-人低分子量CD14-“结合具有SEQ IDNO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”-第二特异结合物质-第二特异结合配偶体的复合体等等。
任何三明治免疫测定都位于本发明测定法的范围内，即使利用第二特异结合形成固相、标记物质等。只要其通过形成“结合具有SEQ IDNO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”-人低分子量CD14-“结合人低分子量CD14的第二结合物质”复合体实施测定法。
换句话说，只要本发明的三明治免疫测定试剂盒包括结合具有SEQID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体，那么本发明的三明治免疫测定试剂盒就在本发明的试剂盒范围内。
用于本发明的三明治免疫测定试剂盒中的不可溶载体可以是珠、乳胶颗粒、磁性颗粒、板、管、膜等。珠、板、或管的材料包括聚苯乙烯、尼龙、玻璃、硅酮橡胶、不锈钢，和塑料。该膜可以是纤维素、纤维素衍生物、硝基纤维素、多孔合成聚合物、玻璃纤维、布、非纺织织品、滤纸，等。珠子、乳胶颗粒、磁性颗粒等可以以球形使用。球形在节约存储空间方面是有利的。板或管可以以孔的形式使用。孔形式是有利的，因为其将被商业的自动化测量仪器、平板读数仪等接受。膜可用于后面描述的免疫层析方法或流通方法。
结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体、第二结合物质、第二特异结合物质或其配偶体、或者抗免疫球蛋白抗体可以通过热吸附方法、化学结合方法等结合到不可溶的载体。
此外，优选将没有上面物质的不可溶载体的非吸附表面实施封闭处理，该封闭处理使用不影响测定系统的物质，因为该处理将赋予该测定系统增强的特异性或灵敏性。不影响该测定系统的物质包括蛋白质如BSA和酪蛋白；和如吐温20和NP-40的表面活性物质。
可用于本发明的三明治免疫测定试剂盒的标记物包括酶，如过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、氧化酶、和尿激酶；化学发光物质如吖啶 或其衍生物和水母发光蛋白或其修饰产物；荧光物质如FITC；染料、金胶体、有色乳胶，和同位素。
例如，对于使用过氧化物酶作为酶的情况，3，3’，5，5’-四联苯胺或1，2-苯二胺可以作为生色底物的实例。对于使用碱性磷酸酶的情况，4-硝基苯基磷酸盐可以作为作为生色底物的实例。对于使用β-D-半乳糖苷酶的情况，2-硝基苯基β-D-半乳糖苷可以作为生色底物的实例。
通过两步戊二醛方法、高碘酸方法、马来酰亚胺方法、二硫化吡啶方法等可以实施结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体、第二结合物质、第二特异结合物质或其配偶体，或者抗-免疫球蛋白抗体的酶-标记。
除了酶，在标记中可以使用一种熟知的技术如热吸附方法或化学结合方法。
优选酶标记，因为如果使用上面示例的生色底物，那么可以使用常规比色系统测定酶标记，还因为其灵敏性相对高。此外，优选用于简单试剂盒如使用免疫层析方法或流通方法的试剂盒的试剂盒的标记，因为可以在视觉上观察到染料、金胶体或者有色乳胶。
本发明的三明治免疫测定试剂盒的特征在于通过三明治免疫测定法实施测定并且包括结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体。三明治免疫测定法可使用如上述的熟知技术。除了上面的具体描述，基于三明治免疫测定的任何试剂盒都在本发明的三明治免疫测定试剂盒的范围内并且只要该试剂盒包括结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体，则该试剂盒不被特别限制。换句话说，试剂盒含有结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体和该三明治免疫测定所需要的试剂就足够了。此外，只要基于该测定法的原理，含量不抑制测定结果，则该含量不被限制。
例如，样品的缓冲剂或稀释剂、标记抗体等、当酶用于标记抗体时适于该酶的生色底物(见上面的描述)、封闭剂、中止试剂，或者洗涤溶液可以作为任选的组成成分的实例。此外，标准物质也可作为任选组成成分的实例。标准物质包括人低分子量CD14和人低分子量CD14类似物。
此外，利用基于三明治免疫测定法作为测定原理的免疫层析方法或流通方法也在本发明的三明治免疫测定试剂盒的范围内。
在免疫层析方法中，所提供的作为样品中的受试物质的抗原沿着试验条移动到固定有抗体的不可溶载体上，而该抗原与被安排在试验条中的标记抗体反应从而能够移动，然后在不可溶载体上形成抗体-抗原-抗体复合物。通常，通过将样品滴在试验条上的单个步骤可以测定抗原。
例如，在JP 01-063865A、WO 88/08534和WO 90/09592中公开了免疫层析方法的设备。此外，在WO 89/03993和WO 99/27364中公开了具有具不同展开速度的流体通道的免疫层析方法的设备，并且例如，可以应用该设备从而通过容许被固定的抗体和抗原之间的反应形成复合体后标记抗体可以反应。
下面将描述使用本发明的三明治免疫测定的免疫层析方法。
例如，一种设备(例如，试剂盒)是试验条，其上面提供了样品加入部分、试剂部分、检测部分和吸收部分从而加到样品-加入部分上的液体样品被容许以此顺序沿着这些部分移动。标记的第二结合物质浸渗在试剂部分中和与结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体结合的不可溶载体被排列在检测部分是充分的。
加在样品加入部分的样品吸收试剂部分的被标记的第二结合物质。人低分子量CD14与被标记的第二结合物质反应形成复合体并移动到检测部分。在检测部分上，该复合体与具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽结合的抗原反应，导致在不可溶载体上形成“结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”-人低分子量CD14-“结合人低分子量CD14的第二结合物质”的复合体。不参与反应的样品中的任何物质和试剂都移动到吸收部分。可以确定，尤其可通过视觉确定检测部分上形成的复合体的标记。
多孔载体等可以用作试验条。多孔载体可以是，例如，硝酸纤维素、纤维素、纤维素衍生物、尼龙、尼龙纤维、玻璃纤维，或者多孔合成聚合物。
部分试验条可直接用作样品-加入部分或者试剂部分。备选地，根据样品的量或者试剂的剂量，可以使用例如，纤维素滤纸、玻璃纤维、布、非纺织织品、多孔合成聚合物，等等。
纤维素、纤维素衍生物、硝酸纤维素、多孔合成聚合物、玻璃纤维、布、非纺织织品、滤纸，等等可以用作如上述的检测部分。
可吸收水的材料可用作吸收部分。可吸收水的材料的实例包括吸收剂聚合物如海绵、纤维素滤纸，和滤纸。
上面的是免疫层析方法的一个实例。可以加入证实反应进展的参照部分，或者可以为试验条体提供载体或者将其用外部掩蔽物掩蔽。然而，本发明的试剂盒不限于它们。
此外，如在关于三明治免疫测定法的解释中描述的，免疫层析方法的试剂盒也在本发明的三明治免疫测定试剂盒的范围内，通过所述试剂盒，在不可溶载体上形成“结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”-人低分子量CD14-“结合人低分子量CD14的第二结合物质”的复合体，并通过利用抗免疫球蛋白抗体和第二特异结合形成复合体实施测定。
流通方法是通过一种方法，通过该方法，所提供的作为试验物质的抗原与样品中的溶液一起在所提供的作为不可溶载体的膜上形成抗体-抗原-抗体复合体。在此时，不能固定在膜上的物质通常通过垂直地从膜的前面穿过到达膜的背面而被除去。
WO 88/01603公开了基于多个步骤的方法的设备，通过该设备，样品、试剂和清洁剂被滴到膜上。
JP 06-273419A公开了被改良为一步方法的方法，其中形成多层膜并且其上提供了试剂部分以便通过仅仅滴一次样品实施测定。
此后，将描述使用流通方法的根据本发明的三明治免疫测定试剂盒的一个实例。
例如，设备(例如，试剂盒)为试剂盒，在试剂盒上面，样品加入部分、试剂部分、检测部分，和吸收部分一个叠在另一个上面，从而加到样品加入部分上面的液体样品可以以此顺序沿着那些部分移动。只要标记的第二结合物质浸渗在试剂部分中并且与结合具有SEQ IDNO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体结合的不可溶载体被排列在检测部分便足够。
加在样品加入部分上的样品垂直地从膜的顶部到膜的背面通过样品加入部分(此后，样品移动也是这样的)，然后吸收试剂部分的第二结合物质。人低分子量CD14与被标记的第二结合物质反应形成复合物并迁移到检测部分。在检测部分上，该复合物与结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗原反应，导致在不可溶载体上形成“结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”-人低分子量CD14-“结合人低分子量CD14的第二结合物质”的复合体。不参与反应的样品中的任何物质和试剂都移动到吸收部分。可以确定，尤其可通过视觉确定检测部分上形成的复合体的标记。如果设计设备使得检测部分可以与样品加入部分和试剂部分或者吸收部分分离，那么可以以简单的方式通过视觉观察标记。此外，如果每个样品加入部分和试剂部分由半透明材料制成，那么可以通过视觉从样品加入部分观察标记，或者如果如JP 06-0273419A中的情形，吸收部分被排列在检测部分上面(样品加入部分)，那么可通过视觉从较低侧观察标记。
可以应用与免疫层析方法的成员相同的成员并且每个成员可以形成容许样品中的溶液移动的膜。
上面是流通方法的实例之一。可以加入证实反应进展的参比部分，或者可以为每个成员提供载体或者用外部掩蔽物掩蔽。然而，本发明的三明治免疫测定试剂盒不限于它们。
此外，如在三明治免疫测定法的解释中描述的，除了在不可溶载体上形成“结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”-人低分子量CD14-“结合人低分子量CD14的第二结合物质”的复合体，通过利用抗免疫球蛋白抗体和第二特异结合形成复合体实施测定法的流通方法试剂盒也在本发明的三明治免疫测定试剂盒的范围内。
此外，本发明的三明治免疫测定试剂盒可用于通过电化学测量来自标记物的信号的基于MEDIA的方法(JP 05-264552A)的测定法和使用微芯片的免疫测定方法的测定法(“Bioscience and Industry”，卷61，449-454页，2003)。只要使用那些原理的测定试剂盒的特征是它们的测定法基于三明治免疫测定法并且包括结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体，那么这些测定试剂盒就在本发明的三明治免疫测定试剂盒的范围内。
本发明的三明治免疫测定试剂盒的特征是包括结合具有SEQ IDNO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体并且能够特异测定低分子量CD14。用于本发明的三明治免疫测定试剂盒的样品优选为水性样品。该样品的尤其优选的实例包括血液、血液组分如血清或血浆、尿或其他体液、细胞培养上清液，和柱洗脱液。它们用于测定它们中的低分子量C14。然而，也可以从除了人血液组分的样品，如人尿或其他体液、血液组分、尿、或者除人之外种类的其他体液形式、细胞培养上清液，和柱洗脱液，测定类似于低分子量CD14的蛋白质、多肽等以及低分子量CD14。只要是类似于低分子量CD14的上面的多肽等的任何测定试剂盒，每种都包括结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体，那么这些试剂盒也在本发明的三明治免疫测定试剂盒的范围内。
此外，在上面的说明中，可以用“结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”的片段Fab、Fab’、或F(ab’)2代替“结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”。
在上面的描述中，使用“结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”的具体实例已经被描述为根据本发明的第二方面的抗体的优选实例。然而，也可以使用根据本发明的第一方面的抗体、除了“结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”之外的根据本发明的第二方面的抗体、或者那些抗体的片段Fab、Fab’、或F(ab’)2。
优选为使用根据本发明的第二方面的抗体的三明治免疫测定试剂盒。更优选的是使用“结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体”的三明治免疫测定试剂盒。
此外，该测定法的原理除了三明治免疫测定法之外还包括凝集方法、固相结合方法，和溶液反应方法。根据那些方法，可以构建各自的试剂盒从而每种试剂盒含有结合至少一种人低分子量CD14的抗体或者该抗体的片段，优选本发明的抗体或该抗体的片段。
在凝集方法中，抗体结合到微粒表面并且抗原的存在导致微粒凝集，从而可以参考微粒的凝集程度，以特定方法定性或定量测定抗原。
本发明的凝集免疫测定试剂盒通过形成“本发明的抗体”-人低分子量CD14并导致其凝集来实施该测定法。
本发明的凝集免疫测定试剂盒的形式包括微粒，本发明的抗体结合到该微粒的表面。
所用微粒可以是通常使用的微粒，包括乳胶、血红细胞(例如，绵羊血红细胞)、明胶、微珠、碳微粒，等。
固相结合方法是通过在固相上形成抗体和抗原复合体实施测定法的一种方法。含有抗原的样品被吸附在不可溶载体(即，固相，同样应用于后面)中。然后，加入标记抗体并让混合物反应以根据标记产物以特异方式定性或定量地确定结合在固相上的复合体的量。
此外，作为竞争方法，抗原类似物被吸附在不可溶载体上以容许标记抗原与样品中的抗原竞争反应，从而确定结合到抗原类似物的标记抗体的量。此外，作为竞争方法的备选方法，抗体被吸附在不可溶载体中并且使用样品中抗原的反应与标记的抗原类似物竞争以测定结合到抗体的标记抗原类似物的量。
在本发明的固相结合免疫测定试剂盒中，通过形成“本发明的抗体”一人低分子量CD14复合体、“本发明的抗体”-标记的人低分子量CD14(或者其类似物)复合体、或者“本发明的标记抗体”-人低分子量CD14(或者其类似物)复合体实施测定。
本发明的固相结合免疫测定试剂盒的形式实例包括本发明的抗体、不可溶载体，和用于将样品吸附在不可溶载体上的试剂；或包括本发明的抗体和与标记的人低分子量CD14(或者其类似物)结合的不可溶载体；或者包括与本发明的标记抗体结合的不可溶载体和与标记的人低分子量CD14(或者其类似物)结合的不可溶载体。
不可溶载体、人低分子量CD14类似物，和标记和吸附剂与三明治免疫测定试剂盒的解释中描述的相同。
溶液-反应方法可以是通过在液相中进行抗原和标记抗体之间的反应；然后通过使用抗体的凝集方法或者通过物理和化学方法从抗原和抗体分离抗原-抗体复合物，以特异方式定性或定量确定低分子量CD14的方法。
溶液-反应免疫测定试剂盒的形式实例实施测定法使得在液相中形成“本发明的标记抗体”-人低分子量CD14复合体，然后从液相中除去未结合的标记抗体。
本发明的溶液-反应免疫测定试剂盒的形式实例包括本发明的标记抗体。
此外，在上面的说明中，可以用“本发明抗体的片段Fab、Fab’、或F(ab’)2”代替本发明的“抗体”。
上面已经基于它们的测定原理描述了本发明的测定试剂盒的实例。然而，本发明的试剂盒不限于那些原理。只要测定试剂盒含有结合至少一种人低分子量CD14或者该抗原的片段的抗体，那么该测定试剂盒就在本发明的测定试剂盒的范围内。对于免疫测定法的原理，可以得到本领域中熟知的技术。可以参考上面提到的“超灵敏酶免疫测定法”，Eiji Ishikawa编者，Center for Academic Publications日本(1993)、“免疫测定法的新应用实例和诊断试剂/药物开发的应用”，Immunoassay Development Research Society，Keiei-KyoikuShuppan，和“酶免疫测定法(第三版)，Eiji Ishikawa编著，IgakuShoin Ltd.(1987)。
通过本发明的试剂盒可特异测定的低分子量CD14的水平在脓毒症患者中增加。因而，将提供低分子量CD14的测定作为脓毒症的诊断指数，并且本发明的试剂盒可用于脓毒症的诊断。
根据本发明的第四方面，提供了低分子量CD14的测定方法，使用该测定法，用结合至少一种人低分子量CD14的抗体直接进行样品中人低分子量CD14的测定，以检测人低分子量CD14而不检测人高分子量CD14。
本发明的测定方法是检测人低分子量CD14而不检测人高分子量CD14的测定方法并且使用结合至少一种人低分子量CD14的抗体以直接确定样品中人低分子量CD14。优选地，它是使用本发明的抗体测定低分子量CD14的方法。更优选地，它是使用一种肽作为抗原制备的抗体(该肽具有SEQ ID NO2到4任一个中描述的氨基酸残基)，来测定低分子量CD14的方法。此外，它是使用结合具有SEQ ID NO2到4任一个中描述的氨基酸残基的肽测定低分子量CD14的优选方法。它是使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有SEQ ID NO2中描述的氨基酸残基，或者使用结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸序列的肽的抗体，测定低分子量CD14的尤其优选的方法。此外，在上面的说明中，可以使用“抗体片段，Fab、Fab’、或F(ab’)2”代替“抗体”。
此外，优选地，它是低分子量CD14测定的方法，使用该方法，通过三明治免疫测定确定人低分子量CD14。
本发明的抗体可用作固定化抗体、标记抗体，等。此外，还包括使用第二特异结合和抗-免疫球蛋白抗体的测定方法。在该情况中，本发明的第一方面的抗体可用作游离抗体、结合第二特异结合物质或者第二特异结合配偶体等的抗体。
本发明的测定方法可以是三明治免疫测定的非竞争性或竞争性方法，并且可以包括使用免疫层析方法或者流通方法测量。
此外，本发明的测定方法的原理不限于三明治免疫测定法，其他实例包括凝集方法、固相结合方法，和溶液反应方法。
细节在本发明的第三方面中描述。
根据本发明的第五方面，提供了脓毒症的诊断方法，通过该方法直接测定人低分子量CD14。
脓毒症的诊断方法直接测定低分子量CD14。
直接测定低分子量CD14的方法在本发明的第四方面中描述。此外，使用本发明的第三方面中描述的试剂盒可以实施诊断。
如在下面的实施例3、10和11中描述的，来自每个正常个体和各种患者的血液中的低分子量CD14的测定证实脓毒症患者特异显示出高水平的低分子量CD14。该事实表明通过使用上面的试剂盒得到的结果可用作脓毒症的诊断中的指数。例如，测定患者血液中低分子量CD14水平并将其与正常个体的标准水平比较，该标准水平是例如通过将这些个体的测量值平均，或者使用正常个体的水平范围所得到。例如，正常个体的平均值+2SD或3SD被用作取舍点水平并且，当低分子量CD14的水平高于这一水平时，其被定义为正指数。此外，通过将每个个体的低分子量CD14的测量水平与正常个体和脓毒症患者的低分子量CD14水平或者通过提前将那些水平标准化所得标准水平比较，也可以提供诊断指数。例如，正常个体的低分子量CD14水平被定义为0到0.1μg/ml并且脓毒症患者的水平被定义为0.2μg/ml或以上，然后通过与测量水平比较以提供阴性、假阳性、或阳性指数。
根据本发明的第六个方面，提供了具有SEQ ID NO2到4中任一个中描述的氨基酸残基的肽。本发明的肽由SEQ ID NO2到4中任一个中描述的氨基酸残基。本发明的肽用作用于制备本发明的抗体的抗原。
根据本发明的第七方面，提供了制备本发明抗体的方法，其中抗原为具有选自SEQ ID NO.1中描述的氨基酸序列的连续8到30个氨基酸残基的肽。用作抗原的肽的优选实例包括本发明的第六方面的肽和具有SEQ ID NO2中描述的氨基酸残基的连续8个或更多氨基酸的肽。“具有SEQ ID NO2中描述的氨基酸的连续8个或更多和16个或更少的肽”指含有下面的(1)到(9)任一个的肽，其是SEQ ID NO2中描述序列后(上游和/或下游侧)的序列并且优选由共10个或更多、12个或更多，或者16个或更多氨基酸组成。
1)Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro(SEQ ID NO6)2)Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg(SEQ ID NO7)3)Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln(SEQ ID NO8)4)Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr(SEQ ID NO9)5)Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala(SEQ ID NO10)6)Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala Asp(SEQ ID NO11)7)Asp Pro Arg Gln Tyr Ala Asp Thr(SEQ ID NO12)8)Pro Arg Gln Tyr Ala Asp Thr Val(SEQ ID NO13)9)Arg Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys(SEQ ID NO14)本发明方法的细节如在本发明的抗体方面部分中描述的。
通过本发明的抗体方面部分中描述的方法可以制备本发明的抗体。
实施例此后，将通过实施例更具体地描述本发明。然而，这些实施例只是代表性的并且本发明将决不被理解为被这些实施例所限制。此外，用于下面描述中的符号是基于本领域惯例的符号。
在下面的实施例中使用用作正常个体的血清的从生产商PromedDx和Sera Care Life Science购买的血清和脓毒症患者的血清。
实施例1使用合成肽作为抗原制备多克隆抗体1-(1)作为抗原的肽的制备<1>
为了将具有SEQ ID NO2中描述的序列(相应于SEQ ID NO5中描述的53到68位的序列)的肽(此后，描述为S68肽)通过SH基团结合到载体蛋白的N末端，通过将半胱氨酸插入到N-末端合成肽。即，使用肽合成仪ABI433A(Applied)，氨基酸柱根据氨基酸序列排列，并将半胱氨酸的氨基酸柱置于N-末端上，然后实施自动合成。通过常规方法将合成的肽从树脂切下，然后将该肽用乙醚沉淀，回收，并再次溶于蒸馏水，然后冰冻干燥。所得粗肽被溶解后，使用C18反相HPLC(CAPCELL-PAK，Shiseido Corp.)，将肽用5-70％乙腈浓度的线性梯度洗脱，然后收集含有靶标肽的部分。将所收集的部分冰冻干燥，得到2到3mg纯化的肽。
1-(2)使用合成肽制备肽载体抗原<1>
将1-(1)中制备的两种肽的每一种都溶于蒸馏水至10mg/mL并将溶液与等量的10mg/mL马来酰亚胺活化的匙孔血蓝蛋白(Imject马来酰亚胺活化的海水养殖匙孔血蓝蛋白(KLH)(PIERCE)混合。混合物在室温反应2小时后，通过用生理盐水平衡的NAP-10柱(AmershamBioscience)对反应混合物脱盐得到1mg S68-肽载体抗原(此后，描述为S68肽-KLH)。通过将所用KLH的量与液体的量相除得到在下面实施例中描述的蛋白质的浓度。
1-(3)作为抗原的肽的制备<2>
通过和1-(1)中相同的方法使用肽合成仪(PSSH-8，ShimadzuCorporation)分别合成表1中给出的两种肽序列并将它们纯化。所得肽的每一种的量为约5mg。另外，表中的“编号”代表下面解释的肽的名称，“位置”代表在SEQ ID NO5中描述的氨基酸序列中发现的肽的位置。
表1

1-(4)使用合成肽制备肽载体抗原<2>
将1-(3)中制备的每种肽溶于含有0.1M EDTA的PBS(pH7.2)中，并且如1-(2)的情形，得到了3mg每种肽载体抗原，其中KLH结合到各自的肽。
1-(5)使用合成肽制备多克隆抗体<1>
为了制备针对1-(2)中制备的S68肽-KLH的多克隆抗体，用S68肽-KLH免疫兔。即，将100μg每种S68肽-KLH用500μL生理盐水稀释并将溶液与500μL弗氏完全佐剂(DIFCO)等量混合，然后将混合物皮下施用于2.1到2.2kg重的新西兰白色雌兔(Kitayama Labes)的背部。2周后，将100μg每种S68肽-KLH用500μL生理盐水稀释并将溶液与500μL弗氏不完全佐剂(DIFCO)等量混合，然后将混合物皮下施用于背部。再过2周后，将100μg S68肽-KLH用1mL生理盐水稀释并将该溶液施用于耳静脉。
施用完成1周后，从耳静脉收集血液并通过常规方法从血液分离抗血清，并纯化抗体。首先，向抗血清中加入硫酸铵直到最终饱和浓度为33％。4℃下搅拌混合物1小时后，离心所分离的沉淀。然后，将沉淀溶解于76mM磷酸缓冲液(此后，描述为PBS(pH6.4))并将溶液过夜透析。过滤透析物后，将滤液应用于蛋白质A柱(Prosep-A，Millipore)。然后，用0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)洗脱结合IgG部分得到纯化的抗体。用PBS(pH6.4)透析后，从280nm波长(吸收系数0.533mg/ml)的吸收度计算蛋白质浓度。此后，所得抗体将被描述为S68肽多克隆抗体。
1-(6)使用合成肽作为抗原制备多克隆抗体<2>
使用1-(4)中制备的肽载体抗原的每一种，如1-(3)中的情况，实施免疫和抗血清的纯化以制备肽多克隆抗体的每一种(P001和P002多克隆抗体)。此外，实施免疫使得肽载体抗原(0.5mg/只兔)在2个月内被施用5次。收集全血后，得到每种抗血清(抗血清P001和P002)。
1-(7)特异纯化的多克隆抗体的制备为了从S68-肽多克隆抗体仅纯化针对S68肽的抗体，通过下面的方法实施特异纯化。首先，为了将插入半胱氨酸的S68肽(此后，描述为C-S68肽)通过SH基结合到载体，将200μg C-S68肽与1mLSufoLink Coulping Gel(PIERCE)混合并根据其使用手册反应。反应完成后，封闭剩余的活性基团并制备S68肽-结合亲和柱。其次，应用1-(3)中描述的7.92mg纯化的IgG部分，然后将柱用磷酸盐缓冲液(pH7.4)(Dulbecco，此后，描述为D-PBS(pH7.4))洗涤，然后用0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)洗脱抗-S68-肽抗体。洗脱后，将pH重新调节到中性，然后用PBS进行透析，之后从280nm的吸收度计算蛋白质浓度(吸收系数0.533mg/mL)。结果，得到0.52mg抗-S68-肽抗体(此后，描述为S68抗体)。
实施例2使用合成肽作为抗原制备单克隆抗体将20μg实施例1-(2)中制备的S68肽-KLH溶解于100μL生理盐水中并与等量弗氏完全佐剂(DIFCO)混合，之后将100μL混合物施用于8周龄的雌性Wister大鼠的每个后爪垫。2周后，手术切除髂淋巴结并实施细胞融合。根据Tamie Ando和Takeshi Chiba“单克隆抗体实验操作介绍”，83页，1991(Kodansha)进行细胞融合。换句话说，使用细胞渗滤器(Falcon)从淋巴结分离淋巴细胞并将淋巴细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/O-Ag14)以5∶1的比例混合，然后使用聚乙二醇进行细胞融合。将融合的细胞悬浮于HAT培养基中并选择杂交瘤，接着筛选产生靶抗体的杂交瘤。
通过ELISA方法实施筛选，其中sCD14(1-307)S286C被直接固定在平板上。即，将用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释到1μg/mL的50μL sCD14(1-307)S286C加到免疫板(Maxisorb，NUNC)的每孔中并在37℃静置1小时。之后，将平板用离子交换水洗涤5次，然后向每孔中加入100μL含有0.1％BSA的PBS(pH6.4)，接着让平板在室温静置1小时以实施封闭。然后，将从所选杂交瘤取样的培养上清液加到每孔并容许在37℃反应1小时。此后，用含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤平板3次。接着，向每孔加入通过用含有10％兔血清的PBS将过氧化物酶标记的抗-大鼠免疫球蛋白抗体(DAKO)稀释1000倍得到的50μL溶液。37℃下反应1小时后，将平板以和上面相同的方式洗涤5次并向每孔加入四甲基联苯胺溶液(TMB，BioFix)。室温下反应10分钟后，用0.5M硫酸溶液中止反应并使用平板分光光度计(NJ-2100，日本Intermed)测量450nm的吸收。结果，筛选出含有能够产生结合sCD14(1-307)S286C的抗体的杂交瘤的孔。
接着，从所选择的孔，通过根据Tamie Ando和Takeshi Chiba“单克隆抗体实验操作介绍”，83页，1991(Kodansha)的有限稀释方法实施克隆。10天后，同样，使用与sCD14(1-307)S286C的反应性作为指数实施筛选并选择了6种杂交瘤。将所选杂交瘤培养于10％FCS/RPMI 1640培养基(Sigma)中然后培养于杂交瘤-SFM培养基(Invitrogen)中以产生抗体。使用蛋白质G柱(Prosep-G柱，Millipore)纯化抗体。使用大鼠分型试剂盒(ZYMED)确定所纯化的F1146-17-2抗体的亚型是大鼠IgG2b.κ。
此外，用WO 01/72993的实施例9中描述的方法制备sCD14(1-307)S286C。
实施例3人低分子量CD14的测定系统研究使用实施例1和2中描述的抗体，用三明治EIA方法研究了人低分子量CD14的测定系统。
3-(1)重组人CD14的制备首先，为了制备将用作三明治ELISA方法中的第二抗体的针对sCD14(1-285)的单克隆抗体，在大肠杆菌中制备了作为免疫原的sCD14(1-285)。为了在大肠杆菌中表达sCD14(1-285)，通过下面的方法构建了表达质粒pTrp1659。
首先，合成了寡聚体8，linkS(5’-agc tta gga att t-3’)(SEQ IDNO15)和寡聚体8，linkA(5’-cta gaa att cct a-3’)(SEQ ID NO16)。
那些寡聚体以等量混合并在99℃加热1分钟，然后将混合逐渐冷却到室温使其退火。此外，通过T4多核苷酸激酶将寡聚体的5’末端磷酸化以制备接头。
接着，合成有义引物(5’-aca tct aga tga cca cgc cag aacct-3’)(SEQ ID NO17)和反义引物(5’-ttt gga tcc tta cta gag atcgag cac tct-3’)(SEQ ID NO18)并使用Pyrobest DNA聚合酶和WO01/72933的实施例8中描述的质粒pM1659作为模板实施PCR。
反应溶液在90℃被加热2分钟后，重复30次98℃10秒，55℃30秒，和72℃1分钟的循环。
将所得约900bp的扩增产物用XbaI和BamHI双消化以收集DNA片段。JP 06-025289A的实施例10中描述的载体pM710被HindIII和BamHI双消化，然后置于琼脂糖凝胶电泳并收集。经过已经磷酸化的接头与上述PCR-扩增的DNA片段/XbaI+BamHI消化的片段，和载体/HindIII+BamHI片段的三次连接后，将产物转化到大肠杆菌感受态细胞(JM109(TOYOBO))以得到含有靶质粒的克隆。通过常规方法制备质粒DNA。
随后，使用电穿孔方法制备用于产生sCD14(1-285)的JE7924转化菌株。
首先从甘油原种恢复大肠杆菌JE7924(J.Bacteriol 173，p.4799，(1991))并将其在LB培养基中37℃过夜孵育。此外，将该细菌接种到50ml新鲜LB培养基中并连续孵育直到600nm的吸光度达到0.5到0.6，然后直接冰-冷却培养瓶30分钟。接着，收集大肠杆菌细胞并用冰-冷却的无菌蒸馏水洗涤2次并用冰-冷却的10％甘油溶液洗涤1次，然后将细胞悬浮在100μL冰-冷却的10％甘油溶液中。将悬浮物分散到50μL等分试样的两管中并快速在液氮中冷冻以制备感受态细胞(JE7924)，将其保存在-80℃待用。
接着，通过电穿孔设备--BIO-RAD有限公司的Gene Pulser--用30ng转化50μL JE7924感受态细胞。此外，此时的设置为2.5kV的电压和200欧姆的电阻，和25μF的电容。此后，将所得产物在含有50μL/mL氨苄青霉素的LB琼脂板中过夜孵育以得到用pTrp1659转化的克隆。该克隆在LB培养基中37℃下过夜孵育并接种到新鲜培养基中，然后被孵育额外的5小时。培养悬浮物的600nm OD达到2到3，加入3β-吲哚丙烯酸(Sigma Co.，Ltd.)至终浓度100μg/mL并将混合物在37℃孵育4小时，导致sCD14(1-285)的诱导表达。接着，收集大肠杆菌并使用Bug Buster蛋白质提取试剂(Novagen，Co.，Ltd.)制备包涵体。之后，将包涵体溶于SDS-PAGE缓冲液并实施SDS-PAGE以通过蛋白质印迹通过抗-CD14抗体鉴定sCD14(1-285)的表达。
类似地，通过在1L LB培养基中接种JE7924转化株制备将用作免疫原的sCD14(1-285)。首先，离心培养液。收集大肠杆菌细胞后，将细菌细胞用D-PBS洗涤并将50mL Bug Buster蛋白质提取试剂(Novagen，Co.，Ltd.)加到所收集的细菌细胞中。悬浮细菌细胞并让其在室温静置30分钟。裂解后，将细菌细胞进行10分钟的超声处理(US-3，Iuchi Seieido)并在4℃以10000×g离心20分钟以除去上清液。同样，对细胞进行额外的超声处理并将所得沉淀悬浮在50mL BugBuster中。将1mL 10mg/mL溶菌酶(Seikagaku公司)加入悬浮物，并将全部的轻微搅拌并在室温静置10分钟。随后，将200mL 1/10体积高浓度Bug Buster加入混合物中并将全部进行搅拌，然后进行类似离心以除去上清液。通过加入200mL 1/10浓度的Bug Buster悬浮所得沉淀并将悬浮物类似地离心，然后重复这种操作几次。将100mLD-PBS加入最终得到的沉淀，得到包含体。
为了制备sCD14(1-285)，将包含体溶于含有1％Triton-X100的TE缓冲液(pH8.0，Nippon Gene)并将溶液进行冻融3次，然后通过离心收集沉淀。将沉淀再次溶于含有1％Triton-X100的TE缓冲液(pH8.0，Nippon Gene)，将溶液冰-冷却并进行250μA间隔10秒的12分钟超声处理并离心，然后收集沉淀。将沉淀溶于含有1％Triton-X100和0.2M NaOH的TE缓冲液(pH8.0，Nippon Gene)，然后在37℃处理10分钟，离心，并再溶解3次，然后收集沉淀。将所得沉淀溶解于含有6M盐酸胍的水性溶液中以制备纯化的sCD14(1-285)。通过Bradford的蛋白质测定法使用标准制剂计算sCD14(1-285)的浓度。
3-(2)抗-CD14单克隆抗体的制备[1]F1106-13-3抗体的制备使用来自上述大肠杆菌的sCD14(1-285)作为将要施用的抗原，制备单克隆抗体。首先，将20μg纯化的sCD14(1-285)与弗氏完全佐剂(DIFCO)以等量混合，然后将200μl混合物腹腔内施用于6周龄雌性ddy小鼠。2周后，将20μg纯化的sCD14(1-285)与弗氏不完全佐剂(DIFCO)以等量混合，然后腹腔内使用200μL混合物。细胞融合前3天将50μL抗原腹腔内施用于小鼠。3天后，无菌切除脾脏。从脾脏分离淋巴细胞并将其与骨髓瘤细胞(P3x63-Ag.8.U.1)以10∶1的比例混合并根据Tamie Ando和Takeshi Chiba“单克隆抗体实验操作介绍”，83页，1991(Kodansha)描述的方法用聚乙二醇进行细胞融合。使用HAT培养基选择杂交瘤后，通过ELISA方法对产生结合sCD14(1-285)的抗体的杂交瘤进行筛选。
首先，将sCD14(1-285)用PBS(pH6.4)稀释到0.4μg/mL并将50μL所得溶液加到免疫板(Maxisorb，NUNC)的每孔中并在4℃过夜反应。之后，将平板用离子交换水洗涤5次，然后向每孔中加入含有0.5％BSA的100μL PBS(pH6.4)进行封闭。然后，将取样的培养上清液加到每孔中并容许在37℃反应1小时。此后，用含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤平板3次。随后，向每孔加入通过用含有10％兔血清的PBS将过氧化物酶标记的抗-小鼠免疫球蛋白抗体(DAKO)稀释1000倍得到的50μL溶液。37℃下反应1小时后，将平板以和上面相同的方式洗涤5次并向每孔加入四甲基联苯胺溶液(TMB，BioFix)。室温下反应10分钟后，用0.5M硫酸溶液中止反应并使用平板分光光度计(NJ-2100，日本Intermed)测量450nm的吸光度。根据结果，选择了含有能够产生结合sCD14(1-285)的抗体的杂交瘤的孔。接着，从所选择的孔，通过根据Tamie Ando和Takeshi Chiba“单克隆抗体实验操作介绍”，83页，1991(Kodansha)的有限稀释方法进行克隆。10天后，同样，使用与sCD14(1-285)的反应性作为指数实施筛选。结果，选择了12种产生抗-sCD14(1-285)单克隆抗体的杂交瘤。
将所选杂交瘤培养于10％FCS/RPMI 1640培养基(Sigma)中然后培养于杂交瘤-SFM培养基(Invitrogen)中以产生抗体。使用蛋白质A柱(Prosep-A柱，Millipore)纯化抗体。
使用IsoStrip小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(Roche)确定F1106-13-3抗体(其是具有尤其高的灵敏性的抗体)的亚型为IgG2b.κ。
F1031-8-3抗体的制备使用WO 01/22085中描述的方法制备F1031-8-3抗体。简述如下，将来自人血液的20μg CD14蛋白溶解于生理盐水中，并将溶液与弗氏完全佐剂(DIFCO)以等量混合。然后，每种最初的腹内施用1周后和最初施用2周后，如WO 01/22085的实施例5中的情况，通过关于与重组人CD14蛋白的反应性的ELISA方法证实血清中抗体效价的增加的水平。将100μg抗原作为最终施用腹内施用于小鼠，3天后从小鼠手术切除脾脏。从脾脏分离淋巴细胞并将其与骨髓瘤细胞(P3x63-Ag.8.U.1)以10∶1的比例混合用聚乙二醇进行细胞融合。使用HAT培养基选择杂交瘤，一周后，通过上述ELISA方法实施产生抗体的杂交瘤的筛选。通过有限稀释方法克隆已经与固定的可溶性CD14蛋白质反应的杂交瘤。10天后，类似地，进行筛选得到抗-CD14单克隆抗体。使用IsoStrip小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(Roche)确定F1031-8-3抗体的亚型为IgG2b.κ，该抗体为典型抗体。
3-(3)人低分子量CD14测定系统的研究为了制备能够特异检测人低分子量CD14的系统，使用实施例1、2和3-(2)中描述的抗体制备三明治EIA系统。
过氧化物酶-标记的抗体的制备根据Nakane等(J.histochem.Cytochemn.，22卷，1084页，1974)的方法制备过氧化物酶-标记的抗体。即，将4mg过氧化物酶(Toyobo)溶于蒸馏水并通过加入100mM高碘酸使溶液在25℃反应20分钟。反应完成后，将1.5％乙二醇加入反应产物并将全部在25℃反应10分钟，然后对1mM乙酸缓冲液(pH4.4)透析。每种纯化的F1031-8-3抗体和F1106-13-3抗体用10mM碳酸氢盐缓冲液(pH9.5)透析，然后将通过加入70μL 0.2M碳酸氢盐缓冲液(pH9.5)/4mg活化的4mg过氧化物酶与抗原以等量混合以容许在25℃反应2小时。接着，加入4mg/mL硼氢化钠并让反应在4℃再继续2小时。反应液用PBS透析，产生过氧化物酶-标记的F1031-8-3抗体(此后，其可被描述为F1031-8-3-HRP)和过氧化物酶-标记的F1106-13-3抗体(此后，其可被描述为F1106-13-3-HRP)。从所用的抗体的量和标记抗体溶液的体积计算抗体的浓度。
三明治EIA系统的制备<1>
使用所制备的S68抗体作为实施例1中的固定化抗体和实施例3-(2)[1]和[2]中制备的抗体作为标记抗体制备两步三明治EIA系统。即，将S68抗体用D-PBS(pH7.4)稀释到10μg/mL然后将50μL所得溶液加到免疫板(Maxisorb，NUNC)的每孔中并在4℃过夜反应。此后，将平板用离子交换水洗涤5次，然后向每孔中加入含有0.1％StabilGuard(SurModics，Inc)和0.1％吐温10的D-PBS 100μL以实现封闭。使用含有1％正常个体血清(使用3C10除去可溶性CD14的血清，此后，描述为CD14-吸收血清)和0.1％BSA的PBS(pH7.4)作为稀释剂，通过稀释血清20倍分别制备正常个体的人血清和脓毒症患者的人血清的稀释样品。以每孔50μL的浓度加入稀释样品并在37℃反应2小时。
反应完成后，将样品用合有0.05％吐温20的生理盐水洗涤3次，并将含有5％大鼠血清、1％小鼠血清和0.1％吐温20，用76mM PBS(pH8.0)稀释到0.6μg/mL的50μL F1031-8-3-HRP或者F1106-13-3-HRP加到每个孔中。37℃下反应2小时后，将平板以和上面相同的方式洗涤5次并向每孔加入四甲基联苯胺溶液(TMB，BioFix)。室温下反应20分钟后，用0.5M硫酸溶液中止反应并使用平板分光光度计(NJ-2100，日本Intermed)测量450nm的吸光度。结果，如表2中所示，能够测定血液中的可溶蛋白，即，本发明中定义的低分子量CD14，在使用来自S68肽的抗体的系统中，该蛋白不能在正常个体中增加但是在脓毒症患者中增加。
三明治EIA系统的制备<2>
1)使用所制备的F1146-17-2抗体作为实施例2中的固定化抗体和实施例3-(2)和[2]中制备的抗体作为标记抗体制备两步三明治EIA系统。将F1146-17-2抗体用PBS(pH6.4)稀释到120μg/mL并将50μL所得溶液加到免疫板(Maxisorb，NUNC)的每孔中并在56℃反应30分钟。此后，将平板用离子交换水洗涤5次，然后向每孔中加入含有0.1％StabilGuard(SurModics，Inc)和0.1％吐温20(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)的PBS 100μL以实现封闭。使用含有1％BSA的PBS(pH6.4)作为稀释剂，通过将血清稀释10倍分别制备人正常个体的血清和人脓毒症患者的血清的稀释样品。将稀释的样品以50μL/孔的浓度加入并在25℃反应2小时。
反应完成后，将平板用含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤3次，并将含有5％大鼠血清、1％小鼠血清和0.1％吐温20，用76mM PBS(pH8.0)稀释到0.5μg/mL的50μL过氧化物酶标记的F1031-8-3抗体加到每个孔中。25℃下反应2小时后，将平板以和上面相同的方式洗涤5次并向每孔加入四甲基联苯胺溶液(TMB，BioFix)。室温下反应20分钟后，用0.5M硫酸溶液终止反应并使用平板分光光度计(NJ-2100，日本Intermed)测量450nm的吸光度。结果，类似于S68抗体，在如表2中所示的S68-肽特异的单克隆抗体的情况中，能够测定低分子量CD14，其几乎不能在正常个体中发现但是在脓毒症患者中以高水平被发现。即，该结果证实结合S68肽的抗体可以制备三明治系统，而不管该抗体是多克隆还是单克隆的。
2)制备了两步三明治EIA系统，其中所用的固定化抗体是实施例1-(6)中使用合成肽作为抗原制备的多克隆抗体。通过和3-[2]相同的方法使用人类正常个体和人类脓毒症患者的血清作为样品实施测定法，但是使用P001多克隆抗体、P002多克隆抗体或P012多克隆抗体代替S68抗体。结果，如表2所示，类似于S68抗体，在使用合成肽作为抗原的多克隆抗体情况中，能够测定低分子量CD14，其几乎不能在人正常个体中发现但是在脓毒症患者中以高水平被发现。该结果证实甚至在使用用一种肽作为抗原(肽具有选自人高分子量CD14的1到285位氨基酸序列的8到16个氨基酸残基)的系统中，也可以实施三明治系统。
在表2中，“++”代表与稀释液自身的吸光度相比在450nm处4倍或更高的吸光度，“+”代表2倍或更高的吸光度，“-”代表等于稀释液的吸光度的吸光度。
表2

(4)三明治EIA系统的制备<3>
使用F-1031-8-3抗体作为固定化抗体和S68抗体作为标记的抗体制备了三步三明治EIA系统。通过如下生物素化S68抗体实施该EIA系统。即，将50μL通过溶于DMSO得到的300μg/mL的D-生物素化-ε-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Roche)加到通过用含有0.15MNaCl的0.05M磷酸盐缓冲液(pH8.0)置换制备的0.93mg/mL的S68抗体0.5mL中混合并且混合物在室温搅拌下反应2小时。反应完成后，通过脱盐柱(NAP-5，Amersham Bioscience)用PBS(pH7.4)置换反应产物。基于280nm处的吸光度使用1.4的吸收系数计算所制备的生物素化S68抗体(此后，其被描述为Bio-S68抗体)的浓度。
三明治EIA系统将F1031-8-3抗体固定在免疫板(NUNC)上并封闭。除去封闭溶液。然后，将溶于0.1％BSA/PBS中的500ng/mLsCD14(1-307)s268c(此后，其可被描述为标准制剂)和没有加入标准制剂的溶液分别加入孔中作为阴性对照。37℃反应1小时后洗涤板，并随后向板中加入通过用含有2％大鼠血清、1％小鼠血清、1％兔血清和0.1％吐温20的PBS(pH7.4)稀释制备的1μg/mL生物素化S68抗体50μL并在37℃反应1小时。反应完成后，洗涤板并加入稀释10,000倍的过氧化物酶-标记的链霉抗生物素蛋白(其被描述为SA-HRP，Invitrogen)。反应1小时后洗涤板。用TMB溶液(BioFix)显色后，通过终止液终止反应，并使用平板分光光度计E-Max(MolecularDevice，Co.，Ltd.)测量450nm处的吸光度。
如在表3中所示的，在该系统中，可以制备三明治EIA系统。换句话说，本发明人证实即使结合S68的抗体被用作固定化抗体或者用作游离抗体或标记抗体，也可以制备三明治测定系统。在表3中，“++”代表与0到500ng/mL的标准制剂的吸光度差异是0.5Abs或更多，“+”代表0.1或更多，“-”代表小于0.1。
三明治EIA系统的制备<4>
制备了一步EIA系统使得固定化和被标记抗体和[2]的系统的固定化和被标记抗体相同，并同时加入样品和被标记抗体。即，将25μL的0ng/mL和500ng/mL标准制剂加到S68-抗体-固定化板中，然后加入通过用含有2％大鼠血清、1％小鼠血清、1％兔血清和0.1％吐温20的PBS(pH7.4)稀释制备的1μg/mL F1031-8-3-HRP 25μL。37℃下反应1小时。反应完成后，洗涤板并通过TMB溶液(BioFix)显色。然后通过终止液终止反应，使用平板分光光度计E-Max(MolecularDevice，Co.，Ltd.)测量450nm处的吸光度。如表3中所示，还在本系统中制备了三明治EIA系统。即，本发明人证实使用结合S68肽的抗体的三明治测定系统可以实施测定而与反应顺序无关。
三明治EIA系统的制备<5>
固定化和被标记抗体和[2]的系统的固定化和被标记抗体相同，并且样品和被标记抗体同时反应。然后，制备了与固定化抗体反应的两步EIA系统。即，将25μL的0ng/mL和500ng/mL标准制剂与25μL通过用含有2％大鼠血清、1％小鼠血清、1％兔血清和0.1％吐温20的PBS(pH7.4)制备的2μg/mL F1031-8-3-HRP混合。反应完成后，将反应液加到S68-抗体-固定化板，并将全部在37℃反应1小时。洗涤板并通过TMB溶液(BioFix)显色，然后通过终止液终止反应，接着使用平板分光光度计E-Max(Molecular Device，Co.，Ltd.)测量450nm处的吸光度。如表3中所示，还在本系统中制备了三明治EIA系统。即，本发明人证实使用结合S68肽的抗体的三明治测定系统可以实施测定而与反应顺序无关。
三明治EIA系统的制备<6>
使用生物素-链霉抗生物素蛋白的特异结合制备了三明治EIA系统。
1)在固定化侧使用链霉抗生物素蛋白的测定系统将用PBS(pH7.4)稀释到10μg/mL的链霉抗生物素蛋白(PIERCE)以50μL等分试样分散到免疫板(NUNC)并通过将其在4℃过夜处理固定化。封闭后，将免疫板中的液体弃去并加入通过用含有2％大鼠血清、1％小鼠血清、1％兔血清和0.1％吐温20的PBS(pH7.4)制备的2μg/mL的生物素化S68抗体和溶于0.1％BSA/PBS的0ng/mL和500ng/mL标准制剂各25μL。37℃反应1小时后，洗涤板并随后加入稀释到1μg/mL的F1031-8-3-HRP 50μL中，接着在37℃反应1小时。反应完成后，洗涤板并通过TMB溶液(BioFix)显色，然后通过终止液终止反应，使用平板分光光度计E-Max(Molecular Device，Co.，Ltd.)测量450nm处的吸光度。即使标准制剂、生物素化S68抗体，和过氧化物酶-标记的F1031-8-3抗体同时加入，也类似地试验本系统。如表3中所示，三明治EIA系统能够在两种系统中制备。
2)使用过氧化物酶-标记的链霉抗生物素蛋白的测定系统通过[4]中所示方法制备了本发明系统。此外，研究了两步方法，其中同时加入标准制剂和根据[4]制备的生物素化F1031-8-3抗体(其可被描述为Bio-F1031-8-3)后在37℃实施反应1小时并且洗涤后加入稀释约10,000倍的过氧化物酶-标记的链霉抗生物素蛋白(Invitrogen)。反应完成后，洗涤板并通过TMB溶液(BioFix)显色，然后通过终止液终止反应，使用平板分光光度计E-Max(MolecularDevice，Co.，Ltd.)测量450nm处的吸光度。如表3中所示，在本系统中，也能够制备三明治EIA系统。即，本发明人证实即使使用另一特异结合如生物素和链霉抗生物素蛋白的结合制备固相化或标记的物质，也可以得到测定，只要低分子量CD14被夹在结合S68肽的抗体和结合分析物的抗体之间。另外，“Str”代表链霉抗生物素蛋白，“Bio”代表生物素化。
表3

实施例4免疫层析测定系统的制备4-(1)使用金-胶体标记的抗体的免疫层析方法<1>
制备了易于在实验室或床边使用的测定系统。该测定系统的略图在图1(A)中显示。首先，通过将1mL金胶体(微粒直径40nm，B.B.International)与9μg F1106-13-3抗体混合制备金胶体-标记的F1106-13-3抗体。然后，制备了偶联垫。即，将金胶体-标记的F1106-13-3抗体用偶联-应用缓冲液稀释从而520nm处的吸光度将为约1.5，然后将1mL所得溶液应用于10×150nm的33-玻璃条上，接着减压下过夜干燥。此时，每次试验中试剂中金胶体-标记的F1106-13-3抗体的抗体效价为约50单位(1单位等于1μL OD520＝1.0的金胶体-标记的F1106-13-3抗体)。如下制备抗体-固定化膜。将S68抗体用PBS(pH7.4)稀释到1mg/mL并使用BioDot有限公司生产的喷墨包被机将溶液以0.75μL/cm线性应用于硝酸纤维素膜(FF85/100，Schleicher & Schuell)上。此时，同时应用对照线(抗小鼠多克隆抗体，DAKO)。干燥后，将膜浸入含有0.5％酪蛋白的封闭液中30分钟，然后除去液体的过量部分，接着再次干燥。然后，使用每种所备的物质配制免疫层析试剂。即，将偶联垫、固定化膜上-吸附垫(#900滤纸，Schleicher & Schuell)，或者样品-滴入垫(33-Glass玻璃纤维滤器，Schleicher & Schuell)附着在PB020塑料-支持片(BioDot)上然后通过BioDot有限公司生产的条带切割机以5mm宽度切割。所切割的带用装装载盒(NIPPN Technocluster，Inc.)放置并作为免疫层析试剂提供。
使用所制备的试剂如下面描述的实施测定。提供用1％BSA-PBS稀释10n倍，浓度为10,000到1ng/mL的标准制剂作为样品。然后，将100μL样品滴到试剂中以确定混合物在室温静置20分钟后线的存在或不存在。判断标准如下(++)在该水平产生浓线从而该线可被清楚地判断为阳性；(+)在该水平显色可被判断为线，尽管颜色显现黯淡；(±)在该水平隐约观察到看起来像显色，但是难以识别为线；和(-)在该水平没有观察到显色。
结果，如图2和表4中所示，在10ng/mL或更高的样品浓度得到“+”或以上的灵敏性。因此，该结果证实通过免疫层析系统可以简单而快速地实施测定。
4-(2)使用金胶体标记的抗体的免疫层析方法<2>
4-(1)中制备的免疫测定系统固定化抗原和金胶体-标记的抗体反向排列实施测定法。通过和4-(1)相同的方法能够制备S68抗体的金胶体标记物和免疫层析系统。结果，如表4中所示，在100ng/mL或更高的样品浓度得到“+”或以上的灵敏性。
表4

4-(3)使用链霉抗生物素蛋白-生物素系统制备免疫层析方法此外，使用链霉抗生物素蛋白-生物素系统制备了免疫层析测定法。该测定法的略图在图1(B)中显示。首先，根据实施例3-2[4]，将F1031-8-3抗体生物素化。然后，将1mL金胶体(微粒直径40nm，B.B.International)与10μg链霉抗生物素混合制备金胶体-标记的链霉抗生物素。将金胶体-标记的链霉抗生物素用偶联-应用缓冲液稀释从而520nm处的吸光度将为约1.5，然后将1mL所得溶液应用于10×150nm的33-Glass条上，接着减压下过夜干燥。此时，每次试验中试剂中金胶体-标记的链霉抗生物素的抗体效价为约50单位(1单位等于1μL OD520＝1.0的金胶体-标记的链霉抗生物素)。如下制备抗体-固定化膜。将S68抗体用PBS(pH7.4)稀释到1mg/mL并使用BioDot有限公司生产的喷墨包被机将溶液以0.75μL/cm线性应用于硝酸纤维素膜(FF85/100，Schleicher & Schuell)上。此时，同时应用对照线(抗小鼠多克隆抗体，DAKO)。干燥后，将膜浸入含有0.5％酪蛋白的封闭液中30分钟，然后除去液体的过量部分，接着再次干燥。然后，使用每种所备的物质配制免疫层析试剂。
即，将偶联垫、固定化膜上-吸附垫(#900滤纸，Schleicher &Schuell)，或者样品-滴入垫(33-Glass玻璃纤维滤器，Schleicher &Schuell)附着在PB020塑料-支持片(BioDot)上然后通过BioDot有限公司生产的条带切割机以5mm宽度切割。所切割的带用装载盒(NIPPNTechnocluster，Inc.)放置并作为免疫层析试剂提供。使用所制备的试剂如下面描述的实施测定。提供用1％BSA-PBS稀释10n倍，浓度为10,000到1ng/mL的标准制剂作为样品。然后，将100μL样品滴到含有0.1μg生物素化F1031-8-3的100μL试剂中，并将全部混合。然后，将100μL混合物滴到装载盒的样品滴入垫以确定混合物在室温静置20分钟后线的存在或不存在。因此，在本系统中，就像(1)中的情形，在100ng/mL或以上的浓度下也得到“+”或以上的灵敏性。
实施例5流通测定系统的制备根据JP 06-273419A制备流通测定系统。即，将1g分散染料(RedViolet，Kayaron，Co.，Ltd.)悬浮在10mL蒸馏水中，用蒸馏水洗涤后重悬在5mL蒸馏水中。将用生理盐水稀释的0.2mL的0.5mg/mLF1031-8-3抗体加到0.2mL分散染料中并将全部的在45℃温育30分钟。产物在冰上冷却后，进行离心分离。将所得沉淀重悬在含有0.5％BSA和10％乳糖的PBS(pH7.4)中以制备分散染料-标记的F1031-8-3抗体。接着，将分散染料-标记的F1031-8-3抗体以0.1mL等分试样分配并浸入切成直径为14mm的滤纸(No.63，Advantec Toyo)中，然后冰冻-干燥以制备粘附可溶试剂的有孔体。
如下实施膜上的固定化。首先，将用生理盐水稀释的2mg/mL S68抗体应用于孔径5微米的硝酸纤维素膜(Advantec Toyo)上并在37℃干燥。然后，使用含有1％BSA的PBS(pH7.4)进行封闭以制备抗体-固定化膜。将所制备的物质以下面的顺序装配在装载盒中。通过按顺序装配粘附可溶试剂的有孔体、抗体-固定化膜、聚丙烯-层叠的滤纸(No.28，Advantec Toyo)，和厚为0.5mm、由聚碳酸酯制造的透明板，制备测定试剂。将0.5mL样品加入测定试剂启动测定，样品被完全吸收后通过肉眼从背侧观测颜色进行判断。
实施例6 S68抗体的特异性为了证实实施例1中制备的S68抗体的特异性，本发明人研究了通过肽通过和实施例3-(3)的相同的测定法是否发生封闭。即，将S68肽(53到68位的氨基酸序列)、通过和实施例1相同的方法制备的合成肽(53到58位的氨基酸序列、57到62位的氨基酸序列、59到64位的氨基酸序列)、或者阴性对照肽(Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn PheGlu Ser Arg Glu Ala Cys)稀释到0、0.1、1和10μg/mL并将25μL每种稀释液加到从脓毒症患者所得血清和正常个体的血清的稀释50倍的溶液各25μL以通过与S68抗体混合启动竞争性反应。此后，确定未被任何肽抑制的结合S68抗体的低分子量CD14的水平。结果，如图3所示，在显示出低水平的正常个体血清和显示出高水平的脓毒症患者的血清中，S68抗体和血液中低分子量蛋白之间的结合在S68肽的情况下被抑制但是在其他部分肽(每种含有6个氨基酸)和阴性对照肽的情况下不被抑制。上面的结果证实在血液中被S68抗体检测到的蛋白质被S68抗体特异识别。此外，该结果还证实被该抗体识别的序列需要至少7个氨基酸的长度，因为通过相应于S68肽的部分肽的三种合成肽(氨基酸数目6)不能达到抑制。
实施例7所制备抗体的反应速度常数使用Biacore 3000(Biacore)分别分析了实施例1中制备的S68抗体和实施例2中制备的F1146-17-2抗体的特异性和反应速度常数。首先，使用马来酰亚胺化BSA(Imject Maleimed活化的BSA，PIERCE)通过和实施例1中描述的相同的方法制备将要被固定的S68肽-BSA。接着，使用胺-偶联试剂盒(Biacore)将S68肽-BSA固定在传感头(Biacore)上。实施测定从而HBS-EP(Biacore)被用作流动缓冲液并将F1146-17-2抗体的稀释系列(50、100、150、200，和300nM)注射到流槽中。使用Biaevaluation软件版本3.0(Biacore)，通过从S68肽-BSA的流槽测量数据减去对照-槽数据进行数据分析。作为分析解离常数(KD)的结果，F1146-17-2抗体显示出高为4.8×10-9M的亲和性。另外，类似测量的特异纯化的兔S68肽多克隆抗体的KD值为2.2×10-10M。
实施例8抗-CD14单克隆抗体的特异性8-(1)F1106-13-3抗体的分析为了阐明F1106-13-3抗体的结合区(表位)，将一种肽文库膜(Custom SPOTs，Sigma Genosys)用于分析，该肽文库膜上，从其N-末端10个氨基酸一次合成CD14的氨基酸序列。即，基于其使用手册将膜封闭，然后与F1106-13-3抗体反应，洗涤，然后与结合β-半乳糖苷酶的抗小鼠抗体反应。膜被洗涤后，使用X-gal检测结合该抗体的肽序列。另外，使用19种肽分析肽文库膜上的肽序列，合成这19种肽使得10个氨基酸被一次合成从1到54位氨基酸序列的各自C末端的两个氨基酸重叠。通过和实施例1-(1)相同的方法制备肽。
结果发现F1106-13-3抗体结合高分子量CD14的从N-末端开始的17到26位(CNFSEPQPDW)氨基酸序列的区域。
8-(2)F1031-8-3抗体的分析<1>
为了证实F1031-8-3抗体的特异性，使用实施例3-(1)中描述的来自大肠杆菌的sCD14(1-285)和从COS细胞制备的sCD14(1-356)和sCD14(1-307)，使用WO 01/72993的实施例8和9中描述的方法，测定了结合活性。
首先，将sCD14(1-356)、sCD14(1-307)S286C、sCD14(1-285)，或者BSA以250ng/点固定在膜Hybond-C extra(AmershamBioscience)上，干燥后，将其通过含有0.05g/mL脱脂乳(Meiji MilkProducts)和0.05％吐温20的PBS(pH6.4)封闭。所得物在室温静置1小时后，将F1031-8-3抗体用含有0.5％BSA的0.05％吐温20稀释到3μg/mL，加入PBS(pH6.4)并在室温反应1小时，然后用0.05％吐温20的PBS(pH6.4)洗涤。
接着，加入用含有10％兔血清的0.05％吐温20％PBS(pH6.4)将过氧化物酶-标记的抗-小鼠免疫球蛋白抗体(DAKO)稀释500倍并在37℃反应30分钟。然后，类似地洗涤膜，然后用ECL试剂盒(AmershamBioscience)证实抗体的结合活性。结果，如表5中所示，F1031-8-3抗体结合来自大肠杆菌的sCD14(1-285)、sCD14(1-307)S286C、和sCD14(1-356)，但是不结合BSA。从而，该结果发现F1031-8-3抗体特异识别所有类型的CD14蛋白。在表5中，“+”代表其中在膜上检测到点的情形，“-”代表其中没有检测到点的情形。
表5 8-(3)F1031-8-3抗体的分析<2>
为了阐明F1031-8-3抗体的结合区域(表位)，如8-(1)中的情形进行了斑点分析。然而，在斑点方法中，不能指定F1031-8-3抗体的识别区域。为了分析两种抗体的识别区域的相似性，在实施例3-(3)[2]的三明治EIA系统中，其中S68抗体被用作固定化抗体，F1031-8-3-HRP被用作被标记抗体，使用F1106-1-3抗体进行了抑制试验。
首先，如实施例3-(3)[2]中的情况，将100ng/mL标准制剂加入固定S68-抗体的板并与该板反应。洗涤板后，加入F1031-8-3-HRP抗体之前，加入含有6μg/mL F1106-13-3抗体、小鼠IgG抗体，或者无抗体的25μL缓冲液。然后，加入25μL F1031-8-3-HRP抗体，然后通过和实施例3-(3)-[2]相同的方法进行测定。
如表6中所示，在小鼠IgG抗体加入系统中没有发生抑制，而发生了F1106-13-3抗体对F1031-8-3和标准制剂之间结合的抑制。该事实指出F1106-13-3抗体可以结合将被F1031-8-3抗体识别的至少一个区域。另外，从在将仅缓冲液的吸光度定义为100％的时候降低的每种吸光度计算“抑制率”。
表6

实施例8人低分子量CD14的测定试剂盒8-(1)三明治EIA系统的测定试剂盒的典型形式下面将描述可溶蛋白质试剂盒的典型形式，该试剂盒使用在实施例3-(3)中在脓毒症患者样品中显示出高水平的人低分子量CD14并且在正常个体的样品中显示出低水平的人低分子量CD14固定化和被标记抗体的组合。
<1>固定化抗体板上固定S68抗体<2>被标记抗体过氧化物酶-标记的F1031-8-3抗体<3>底物溶液(四甲基联苯胺溶液)其他附属物平板系统的配置实施例<4>板-洗涤液(0.9％NaCl，0.05％吐温20溶液)<5>样品-稀释液(含有0.1％BSA的PBS溶液)<6>反应-终止液(0.5M H2SO4溶液)<7>标准制剂(CD14(1-307)S286C)使用上面的测定试剂盒进行测定的测量仪器<实施例>
<8>平板分光光度计(例如，E-Max(Molecular Device，Co.，Ltd.))8-(2)到(11)三明治EIA系统的测定试剂盒的配置实例除了8-(1)，还在表7中显示了三明治EIA系统的测定试剂盒的实例。<1>代表固定在板上的结合物质。<2>代表被标记的结合物质。作为参比实例的<3>到<7>的组成要素和测量仪器<8>与8-(1)相同。<9>代表结合第二特异结合物质的抗体。
表7

8-(12)三明治EIA系统的测定试剂盒的标准曲线使用(1)的测定试剂盒，通过和实施例3-(3)[2]相同的方法实施测定。即，用D-PBS(pH7.4)将S68抗体稀释到10μg/mL，然后将50μL所得溶液加到免疫板(Maxisorb，NUNC)的每孔中。4℃过夜反应后，将板用离子交换水洗涤并通过向每孔中加入含有0.1％Stabil Guard(SurModics，Inc.)和0.1％吐温20的100μL PBS封闭。接着将含有1％CD14-吸收血清和0.1％BSA的76mM PBS(pH7.4)用作稀释剂以制备CD14(1-307)S286C蛋白质标准制剂的0、3、25、60、100和150ng/mL的稀释系列。以每孔50μL的量加入标准制剂的稀释系列并在37℃反应2小时。反应完成后，用含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤板3次。然后，向每孔加入通过用含有0.1％吐温20的76mMPBS(pH8.0)将5％大鼠血清、1％小鼠血清和过氧化物酶-标记的F1031-8-3抗体制备的被稀释的标记抗体50μL。37℃下反应2小时后，以和上面相同的方法洗涤板5次，并向每孔加入四甲基联苯胺溶液(TMB，BioFix)。室温下反应20分钟后，用0.5M硫酸溶液终止反应并使用平板分光光度计(NJ-2100，日本Intermed)测量450nm的吸光度。所制备的标准曲线在图4中显示。实现了测量灵敏度为0.6ng/mL(空白+3SD)的高灵敏性简单测定系统。
8-(13)三明治EIA系统的特异性为了研究人血清中存在的高分子量CD14对所制备的测定系统的影响，将浓度为0到4μg/mL来自正常个体的可溶性CD14加入CD14(1-307)S286C的标准制剂中以实施和(12)相同的测定。结果，即使来自正常个体的血清的可溶性CD14的浓度为4μg/mL，对所测水平也没有影响。该结果发现本三明治EIA系统与高分子量CD14的交叉反应性为0.3％或更低。换句话说，该结果证实本系统不检测人血清高分子量CD14并且对在脓毒症患者的血清中显示出高水平的可溶性蛋白质是特异的。
8-(14)对三明治EIA系统的测定试剂盒的评价评价了(1)的试剂盒的测定结果的再现性。使用如(12)中的3种样品的组内再现性的变异系数(CV)分别为5.8、3.6和3.5％，测量值之间的再现性分别为6.2、5.2和5.1％。从而，得到良好结果，而没有观察到抗凝剂(肝素、柠檬酸，或EDTA)的影响。上面描述的结果表明本试剂盒具有测定人低分子量CD14的足够能力。
8-(15)免疫层析测定试剂盒的实例<1>被标记抗体用金胶体标记的F1031-8-3抗体<2>偶联垫玻璃纤维滤器(33-Glass条，Schleicher & Schuell生产)，其中应用<1>
<3>固定抗体的膜硝酸纤维素膜(FF85/100，Schleicher &Schue11生产)，其被0.5％酪蛋白封闭，并且具有S68抗体的固定化线和该固定化线下游的对照线(抗-小鼠多克隆抗体的固定化线)。
<4>样品-滴入垫33-Glass玻璃纤维滤器(Schleicher & Schuell生产)<5>吸收垫(#900滤纸(Schleicher & Schuell生产))<6>片PB020塑料支持片(BioDot生产)；<2>到<5>被装配在<6>上从而<4>中滴入的液体可以按照<2>、<3>和<5>的顺序流过。
<7>装载盒(可从NIPPN Technocluster，Inc得到的OEM盒)
另外，在图1(A)中给出了<1>到<5>的略图。
8-(16)到(19)免疫层析测定试剂盒的实例表8显示了，除了8-(15)之外，利用生物素和链霉抗生物素蛋白之间的结合的第二特异结合的三明治EIA系统的测定试剂盒的实例，和利用结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽的抗体的片段的三明治EIA系统的测定试剂盒的实例。<1>代表被标记的结合物质。组成元件<2>到<7>是相同的。作为应用于<3>上的物质，<3>-(i)代表将固定在固定化膜上的结合物质，<3>-(ii)代表将固定在对照线上的结合物质。<8>代表与第二特异结合物质结合的抗体，该物质为将应用在<2>或<4>上的试剂，如<1>中的情形，或者将被加到样品或者与该样品一起同时加入的试剂。
另外，在图1(B)中显示了(16)<1>到<5>的略图，类似地理解(17)到(20)。
表8

另外，如下制备用(20)<1>的金胶体标记的S68抗体的F(ab’)2。使用固定化胃蛋白酶(PIERCE)如下实施从S68抗体制备F(ab’)2。即，将S68抗体溶解于20mM乙酸缓冲液(pH4.5)以制备成5mg/mL。根据PIERCE的方案通过悬浮制备0.25mL固定化胃蛋白酶并与1mL上面的抗体混合。接着，将混合物在培养箱中37℃下搅拌4小时，然后，通过加入1.5mL 10mM Tris-HCl(pH7.5)终止反应。将反应溶液离心(1000×g)以分离凝胶和上清液。然后，将分离的上清液加到1mLprosep-A(Millipore)以容许包括Fc部分的肽(如Fc片段及未被消化的肽)的结合，然后将上清液对PBS(pH6.4)透析。测量280nm处F(ab)’2的吸光度，然后从吸光度常数(0.533mg/mL/cm-1)计算F(ab)’2的浓度。所得F(ab’)2如实施例中的情形用金胶体标记，得到金胶体标记的S68抗体的F(ab’)2。
8-(21)流通系统的配置实例<1>染料-标记的抗体RED VIOLET染料-标记的S68抗体<2>偶联垫用上面的(1)浸渗的滤纸(No.63，Advantec Toyo Co.，Ltd.生产)<3>固定抗体的膜硝酸纤维素膜(Advantec Toyo)，其上固定S68抗体<4>吸收垫用聚丙烯层压的滤纸(No.28，Advantec Toyo)<5>装载盒JP 06-273419A 中描述的盒子(MochidaPharmaceutical生产)；<2>到<4>在<5>中装配从而滴入<2>中的液体可以按顺序流经<2>、<3>和<4>。
实施例9人低分子量CD14的检测(1)凝胶过滤层析<1>
为了分析通过实施例8-(1)中描述的测定试剂盒检测的脓毒症患者血清中的物质，使用SMART SYSTEM(Amersham Biosciences)，使脓毒症患者的血清通过凝胶过滤层析柱Superdex 200PC3.2/30(Amersham Biosciences)分级，用D-PBS作为洗脱缓冲液。然后，用实施例8-(1)中描述的测定试剂盒和通过商业途径可得到的CD14-EIA试剂盒(IBL-Hamburg)测定每个级分。通过用来自LMW校准试剂盒和HMW校准试剂盒(Amersham Biosciences)的醛缩酶(158kDa)、BSA(67kDa)、卵清蛋白(43kDa)和胰凝乳蛋白酶(25kDa)校准层析柱计算各级分的分子量。
结果，如图6中所示，该商业途径可得到的CD14-EIA试剂盒检测到分子量为约57kDa的可溶性CD14，其被定义为通常报导的49到55kDa的高分子量可溶性CD14。另一方面，在实施例8-(1)中描述的试剂盒中，检测到来自脓毒症患者中检测到的人低分子量CD14分子量约为35到45kDa的峰，但是没有检测到约57kDa的峰。从而，该结果证实实施例8-(1)中描述的试剂盒特异检测血液中的仅一种可溶蛋白。
(2)凝胶过滤层析<2>
如(2)-<1>的情况，来自脓毒症患者的血清50μL通过凝胶过滤层析柱Superdex 7510/300GL(Amersham Bioscience)分级，使用200mM乙酸铵(pH6.8)作为洗脱缓冲液并使用每种试剂盒测定。通过用来自LMW校准试剂盒和HMW校准试剂盒(Amersham Biosciences)的BSA(67kDa)、卵清蛋白(43kDa)和胰凝乳蛋白酶(25kDa)和核糖核酸酶A(13.7kDa)校准层析柱计算各级分的分子量。
结果在图7中显示。在实施例8-(1)中描述的试剂盒中，检测到分子量约25到35kDa来自人低分子量CD14的峰。
(3)F1025-3-1抗体亲和柱层析当来自(2)-<2>中得到的人低分子量CD14的峰级分(例如级分12)被应用于F1025-3-1抗体亲和柱层析时，在亲和柱非吸附部分洗脱出来自人低分子量CD14的峰。另外，可以基于WO 01/22085的实施例10中描述的方法实施F1025-3-1抗体亲和柱的调节和操作。
这些结果表明人低分子量CD14是血液中的一种可溶蛋白，其特异结合针对SEQ ID NO2中描述的特定肽的抗体，该特定肽具有仅在人CD14中检测到的序列，该可溶蛋白还结合识别人CD14从N-末端开始的17到26位氨基酸序列的抗-CD14抗体。凝胶过滤测定该可溶蛋白的分子量为25到45kDa。从而，可定义人低分子量CD14的分子量小于人高分子量CD14(常规的天然CD14)。此外，人低分子量CD14不结合特异结合高分子量CD14的F1025-3-1抗体。
实施例10各种疾病患者的血清中低分子量CD14的测定10个病例(从中鉴定了分离物)被用作(表9)脓毒症患者的血清。此外，使用实施例8-(1)中描述的测定试剂盒对52例正常个体(男性31例，女性21例)和各种疾病的患者(20种疾病，60例)实施了测定。
表9

正常个体血清中低分子量CD14的水平为0.008到0.100μg/mL，其平均值为0.04μg/mL。对于脓毒症患者，低分子量CD14的水平为0.190到7.260μg/mL，其平均值为2.0μg/mL。脓毒症患者的低分子量CD14水平高于正常个体和其他各种疾病患者的低分子量CD14水平。在其他各种疾病患者中，与正常个体相比，没有患者表现出高水平。
实施例11与关于血液中可溶性CD14的通过商业途径可得到的ELISA试剂盒的比较11-(1)各种疾病患者的血液中可溶性CD14的测定使用通过商业途径可得到的CD14-ELISA试剂盒(IBL-Hamburg)测定了实施例10的样品。正常个体的血液中可溶性CD14的水平(估计为低分子量CD14和高分子量CD14的总和)为5.6到11.2μg/mL，但是观察到脓毒症患者的一例高水平。然而，在各种疾病患者的血清中发现显示可溶性CD14的高水平的许多病例，从而与脓毒症患者之间没有差异。
11-(2)与使用S68抗体的试剂盒的比较实施了实施例11中确定的低分子量CD14的测量水平的比较和研究。如表10中所示，商业途径可得到的CD14-EIA试剂盒在正常、各种疾病和脓毒症之间显示出最大几乎1.7倍的差异，而实施例9-(1)中的试剂盒在正常个体和脓毒症患者之间显示出50倍差异，尽管正常个体和各种疾病之间没有差异。因此，结果很明显，实施例9-(1)的测定试剂盒的测量水平在脓毒症中特异增加。
表10

将受试的正常个体的平均水平+3S.D.作为截断水平(低分子量CD14-EIA0.134μg/mL，商业途径可得到的CD14-EIA11.14μg/mL)，然后将分析分成阳性样品(脓毒症)和阴性样品(正常的+各种疾病)。结果在表11中显示。根据结果，计算了两种试剂盒之间的同一率((EIA阳性相同数+EIA阴性相同数)/总数×100)、灵敏度(EIA阳性相同数/阳性病例×100)和特异性(对EIA阳性相同数/阴性病例×100)。结果，如表12中所示，对于低分子量CD14-EIA，同一率为94.3％，灵敏度为100.0％，特异性为93.8％。从而，发现低分子量CD14-EIA可用于通过限定截断水平对脓毒症的差别诊断。另一方面，对于商业途径可得到的CD14-EIA，没有特异容许脓毒症诊断的灵敏度和特异性。
表11

表12 工业实用性根据本发明，提供了使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有选自人高分子量CD14的1到68位氨基酸序列的8到30个氨基酸残基，还提供了结合具有SEQ ID NO2到4中描述的氨基酸残基的肽的抗体。
那些抗体可用于人低分子量CD14测定试剂盒，并且该试剂盒能够以简单的方式高度灵敏地定量或定性地确定人低分子量CD14，从而该试剂盒可用于脓毒症患者的诊断。在本发明中，提供了含有上面抗体的人低分子量CD14测定试剂盒和测定方法。此外，提供了新的脓毒症诊断方法，其中直接测定人低分子量CD14。此外，提供了用于制备上面的抗体的肽和制备该抗体的方法。
序列表<110>Mochida Pharmaceutical Co..Ltd.
<120>测量低分子人CD14蛋白的试剂盒和结合所述蛋白的抗体<130>MD0688<150>JP2002/328866<151>2002-11-12<150>JP2003/330775<151>2003-09-22<160>18<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>68<212>PRT<213>人<400>1Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu Asp Phe Arg Cys Val1 5 10 15Cys Asn Phe Ser Glu Pro Gln Pro Asp Trp Ser Glu Ala Phe Gln Cys20 25 30Val Ser Ala Val Glu Val Glu Ile His Ala Gly Gly Leu Asn Leu Glu35 40 45Pro Phe Leu Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala50 55 60Asp Thr Val Lys65
<210>2<211>16<212>PRT<213>人<400>2Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys1 5 10 15<210>3<211>17<212>PRT<213>人<400>3Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu Asp Phe Arg Cys Val1 5 10 15Cys<210>4<211>19<212>PRT<213>人<400>4Arg Cys Val Cys Asn Phe Ser Glu Pro Gln Pro Asp Trp Ser Glu Ala1 5 10 15Phe Gln Cys<210>5<211>356<212>PRT
<213>人<400>5Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu Asp Phe Arg Cys Val1 5 10 15Cys Asn Phe Ser Glu Pro Gln Pro Asp Trp Ser Glu Ala Phe Gln Cys20 25 30Val Ser Ala Val Glu Val Glu Ile His Ala Gly Gly Leu Asn Leu Glu35 40 45Pro Phe Leu Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala50 55 60Asp Thr Val Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Thr Val Gly Ala Ala65 70 75 80Gln Val Pro Ala Gln Leu Leu Val Gly Ala Leu Arg Val Leu Ala Tyr85 90 95Ser Arg Leu Lys Glu Leu Thr Leu Glu Asp Leu Lys Ile Thr Gly Thr100 105 110Met Pro Pro Leu Pro Leu Glu Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Ser Leu115 120 125Arg Leu Arg Asn Val Ser Trp Ala Thr Gly Arg Ser Trp Leu Ala Glu130 135 140Leu Gln Gln Trp Leu Lys Pro Gly Leu Lys Val Leu Ser Ile Ala Gln145 150 155 160
Ala His Ser Pro Ala Phe Ser Cys Glu Gln Val Arg Ala Phe Pro Ala165 170 175Leu Thr Ser Leu Asp Leu Ser Asp Asn Pro Gly Leu Gly Glu Arg Gly180 185 190Leu Met Ala Ala Leu Cys Pro His Lys Phe Pro Ala Ile Gln Asn Leu195 200 205Ala Leu Arg Asn Thr Gly Ile Glu Thr Pro Thr Gly Val Cys Ala Ala210 215 220Leu Ala Ala Ala Gly Val Gln Pro His Ser Leu Asp Leu Ser His Asn225 230 235 240Ser Leu Arg Ala Thr Val Asn Pro Ser Ala Pro Arg Cys Met Trp Ser245 250 255Ser Ala Leu Asn Ser Leu Asn Leu Ser Phe Ala Gly Leu Glu Gln Val260 265 270Pro Lys Gly Leu Pro Ala Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser Cys Asn275 280 285Arg Leu Asn Arg Ala Pro Gln Pro Asp Glu Leu Pro Glu Val Asp Asn290 295 300Leu Thr Leu Asp Gly Asn Pro Phe Leu Val Pro Gly Thr Ala Leu Pro305 310 315 320His Glu Gly Ser Met Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Cys Ala Arg Ser325 330 335
Thr Leu Ser Val Gly Val Ser Gly Thr Leu Val Leu Leu Gln Gly Ala340 345 350Arg Gly Phe Ala355<210>6<211>8<212>PRT<213>人<400>6Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro1 5<210>7<211>8<212>PRT<213>人<400>7Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg1 5<210>8<211>8<212>PRT<213>人<400>8Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln1 5<210>9<211>8<212>PRT
<213>人<400>9Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr1 5<210>10<211>8<212>PRT<213>人<400>10Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Alal 5<210>11<211>8<212>PRT<213>人<400>11Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala Asp1 5<210>12<211>8<212>PRT<213>人<400>12Asp Pro Arg Gln Tyr Ala Asp Thr1 5<210>13<211>8<212>PRT
<213>人<400>13Pro Arg Gln Tyr Ala Asp Thr Val1 5<210>14<211>8<212>PRT<213>人<400>14Arg Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys1 5<210>15<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚体8 linkS<400>15agcttaggaa ttt 13<210>16<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚体8 linkA<400>16ctagaaattc cta 13<210>17
<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>有义引物<400>17acatctagat gaccacgcca gaacct 26<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义引物<400>18tttggatect tactagagat cgageaatet 30权利要求
1.用肽作为抗原制备的抗体，所述肽具有选自SEQ ID NO1中描述的氨基酸序列的连续8到30个氨基酸残基。
2.用肽作为抗原制备的抗体，所述肽具有SEQ ID NO2到4任一个中描述的氨基酸残基。
3.一种抗体，其结合具有SEQ ID NO2到4任一个中描述的氨基酸残基的肽。
4.一种抗体，其结合具有SEQ ID NO2中描述的16个氨基酸残基的肽。
5.用于直接测定样品中人低分子量CD14而不检测人高分子量CD14的人低分子量CD14测定试剂盒，该试剂盒含有结合至少一种人低分子量CD14或其片段的抗体。
6.根据权利要求5的人低分子量CD14测定试剂盒，其中结合人低分子量CD14或其片段的抗体是权利要求1到4任一项中描述的抗体或者其片段。
7.根据权利要求5的人低分子量CD14测定试剂盒，其中结合人低分子量CD14或其片段的抗体是权利要求4中描述的抗体或者其片段。
8.根据权利要求5到7任一项的人低分子量CD14测定试剂盒，其中通过三明治免疫测定方法测定人低分子量CD14。
9.根据权利要求8的人低分子量CD14测定试剂盒，其还含有结合人低分子量CD14的第二结合物质。
10.根据权利要求9的人低分子量CD14测定试剂盒，其中第二结合物质是结合人低分子量CD14或其片段的抗体。
11.根据权利要求9的人低分子量CD14测定试剂盒，其中第二结合物质是结合人低分子量CD14或其片段的单克隆抗体。
12.根据权利要求9的人低分子量CD14测定试剂盒，其中第二结合物质是结合人高分子量CD14的17到26位中任何一个氨基酸残基的抗体、其片段、与结合人高分子量CD14的17到26位中任何一个氨基酸残基的抗体竞争或者与其显示出交叉反应性的抗体或者其片段。
13.根据权利要求9到12任一项的人低分子量CD14测定试剂盒，其中权利要求1到4任一项中描述的抗体或者其片段结合到不可溶载体。
14.根据权利要求9到12任一项的人低分子量CD14测定试剂盒，其中权利要求1到4任一项中描述的抗体或者其片段被标记。
15.根据权利要求9到14任一项的人低分子量CD14测定试剂盒，其还含有第二特异结合物质和该第二特异结合物质的配偶体，其中第二特异结合物质和该第二特异结合物质的配偶体一起形成第二特异结合。
16.根据权利要求8到15任一项的人低分子量CD14测定试剂盒，其中三明治免疫测定方法是利用免疫层析的测定方法。
17.根据权利要求8到15任一项的人低分子量CD14测定试剂盒，其中三明治免疫测定方法是利用流通方法的测定方法。
18.人低分子量CD14的测定方法，其使用结合至少一种人低分子量CD14的抗体直接测定样品中人低分子量CD14以检测人低分子量CD14而不检测人高分子量CD14。
19.根据权利要求18的人低分子量CD14测定方法，其中结合人低分子量CD14的抗体是权利要求1到4任一项中描述的抗体或者其片段。
20.脓毒症诊断方法，该方法直接测定人低分子量CD14。
21.具有如SEQ ID NO2到4之一中描述的氨基酸残基的肽。
22.制备如权利要求1到4任一项中描述的抗体的方法，其中具有选自SEQ ID NO1中描述的氨基酸序列的连续8到30个氨基酸的肽或者具有SEQ ID NO2到4之一中描述的氨基酸的肽被用作抗原。
全文摘要
本发明提供了使用一种肽作为抗原制备的抗体，该肽具有选自人高分子量CD14的1到68位的氨基酸序列的8到30个氨基酸残基，或者结合包括1到68位特定氨基酸序列的肽的抗体。使用该抗体的人低分子量CD14的测定试剂盒和本发明的测定方法，优选三明治方法，能够以简单方式高度灵敏和特异地定性或定量确定人低分子量CD14，从而它们可用于脓毒症患者的诊断。
文档编号C07K16/28GK1711283SQ20038010314
公开日2005年12月21日 申请日期2003年11月12日 优先权日2002年11月12日
发明者古迫正司, 白川嘉门 申请人:持田制药株式会社