专利名称：能够结合il－18bp和抑制第二细胞因子活性的细胞因子的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够与IL-18结合蛋白结合和抑制第二细胞因子活性的细胞因子的用途，所述第二细胞因子是IL-1家族的成员。
背景技术：
1989年有人描述了从小鼠脾细胞获得的能诱导干扰素-γ(IFN-γ)的一种内毒素诱导的血清活性(Nakamura等，1989)。此种血清活性不是作为IFN-γ的直接诱导剂，而是与IL-2、IFNα/β、TNF或有丝分裂原一起作为协同刺激剂起作用。尝试从内毒素(诱导)后的小鼠血清纯化此种活性，显示一种看起来均一的50-55KDa的蛋白质(Nakamura等，1993)。因为其他细胞因子对IFN-γ的产生可能起协同刺激作用，抗IL-1、IL-4、IL-5、IL-6或TNF的中和抗体不能中和此种血清活性，提示它是一种独特的因子。1995年，还是这些科学家证实，产生IFN-γ所需的内毒素诱导的协同刺激物存在于用P.acnas预处理的小鼠肝脏提取液中(Okamura等，1995)。在此模型中，肝脏巨噬细胞群(Kupffer细胞)扩增，低剂量的细菌脂多糖(LPS)在未预处理的小鼠中不致死，但却引起了这些小鼠死亡。该因子称为IFN-γ诱导因子(IGIF)，后命名为白介素18(IL-18)，并从1200克重的P.acnas处理小鼠肝脏中提纯至均浆。采用纯化IL-18的氨基酸序列衍生的简并寡核苷酸克隆了小鼠的IL-18cDNA(Okamura等，1995)。已在活化巨噬细胞中检测到IL-18和白介素-12(IL-12)的信使RNA。IL-18本身不诱导IFN-γ，其主要功能是作为有丝分裂原或IL-12的协同刺激剂。IL-18的人cDNA序列在1996年已有报导。
白细胞介素IL-18具有IL-1蛋白质家族的结构特征(Tsutsui等人，1996；Nakamura等人，1993；Okamura等人，1995；Ushio等人，1996)。与其他大多数具有四螺旋束结构的细胞因子不同，IL-18和IL-1β全部为β-折叠结构(Tsutsui等，1996)。IL-18与IL-1β相似，被合成为一种没有生物活性的前体(proIL-18)，缺少信号肽(Ushio等人，1996)。IL-1β和IL-18前体由caspase-1(IL-1β转化酶或ICE)切割，caspase-1在P1位置上天冬氨酸残基之后割开前体。所得到的成熟细胞因子易从细胞释放出来(Ghayur等人，1997和Gu等人，1997)。
IL-18是一种通过T辅助I型(Th1)细胞产生细胞因子(IFN-γ、IL-2和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)的协同刺激剂(Kohnoet等人，1997)，也是小鼠自然杀伤细胞克隆中由FAS配体介导的细胞毒性的协同刺激剂(Tsutsui等人，1996)。
Th1淋巴细胞参与抗肿瘤的免疫反应(Seki等人，2000)。Th1反应包括分泌细胞因子IL-2、IL-12、IL-18和IFN-γ，以及产生识别特异性肿瘤抗原的具有细胞毒性的特异性T淋巴细胞。Th1反应也是宿主防御许多微生物的一条生命臂(vital arm)。然而，Th1反应也与不希望的副作用相关，如产生一些自身免疫疾病、炎症和器官移植排斥。
细胞因子结合蛋白(可溶性细胞因子受体)通常是其各自细胞表面细胞因子受体的胞外配体结合结构域。它们或通过可变换的剪接或通过细胞表面受体蛋白裂解而产生。过去已对这些可溶性受体进行了叙述，例如，IL-6和IFN-γ的可溶性受体(Novick等人，1989)、TNF(Engelmann等人，1989；Engelmann等人，1990)、IL-1和IL-4(Maliszewski等人，1990)和IFN-α/β(Novick等人，1994；Novick等人，1992)。一种称为骨保护素(OPG，也称破骨抑制因子-OCIF)的细胞因子结合蛋白是TNFR/Fas家族的一个成员，似乎是仅作为分泌性蛋白存在的可溶性受体的第一个例子(Anderson等人，1997；Simonet等人，1997；Yasuda等人，1998)。
在IL-18柱上进行亲和纯化从尿中得到了白介素-18结合蛋白(IL-18BP)(Novick等人，1999)。IL-18BP在体外消除了IL-18对IFN-γ的诱导和IL-18对NF-κB的活化，以及在体内消除了IL-18对IFN-γ的诱导。IL-18是一种可溶性循环蛋白质，在脾中固有地表达，属于免疫球蛋白超家族。最丰富的IL-18BP同种型，即剪接变体同种型a，对IL-18具有高亲和力，结合速率快，解离速率慢，解离常数(Kd)约为400pM(Kim等人，2000)。
有人利用计算机模型(Kim等人，2000)和基于IL-1β与IL-1R I型的相互作用(Vigers等人，1997)对参与IL-18和IL-18BP相互作用的残基进行了描述。在IL-18与IL-18BP结合的模型中，已经提出IL-18的42位上Glu(E)残基和89位上Lys(K)残基分别与IL-18BP的Lys-130和Glu-114结合(Kim等人，2000)。
IL-18BP固有地存在于许多细胞中(Puren等人，1999)，并在健康人体内循环(Urushihara等人，2000)。IL-18BP对IL-18具有高亲和力以及在循环中发现IL-18BP的浓度较高(相对IL-18过量20倍摩尔)，表示细胞因子生物学一种独有现象。因此，可以推测，在循环中即使不是全部但大部分IL-18分子与IL-18BP结合。与IL-18的细胞表面受体竞争的循环IL-18BP可用作天然消炎和免疫抑制分子。
一些病毒试剂编码IL-18BP类蛋白质，例如传染性软疣病毒性蛋白MC53和MC54与哺乳动物IL-18BP高度同源(Novick等人，1999)。传染性软疣病毒性蛋白MC53和MC54具有结合与中和人IL-18的能力，方式与IL-18BP相似(Xiang和Moss，1999)。缺肢痘病毒p13蛋白质与IL-18BP同源，在体外与IL-18结合，并抑制其活性。感染p13缺失突变病毒的小鼠显示感染水平下降(Born等人，2000)。故感染程度似乎与是否有IL-18BP相关。
循环IL-18BP的水平高可能表示一种自然防御，这种防御针对自身免疫疾病感染和发病的过度Th1反应。
包括IL-18在内的IL-1家族细胞因子在第一线和第二应答感染过程中具有各种各样炎性和免疫调节性质(Dinarello 1996和Nakanishi 2001)。从表达序列标签(ETS)数据库搜索中已经发现了白介素-1(IL-1)基因家族的六个新成员(Barton 2000，Busfield 2000，Debets 2001，Kumar 2000，Lin 2001，Mulero 1999，Pan 2001和Smith 2000)。这些蛋白质都有共同的β-桶模式，它由12个β-链和与IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)、IL-1β和IL-18高度同源的氨基酸组成。IL-1家族的这些新成员来源于共同的祖先，例如IL-1和IL-18(Nicklin 2002，Taylor2002)。除了IL-18外，各自对应于人染色体2上同一个区域(Nicklin 2002，Mulero 2000，Taylor 2002和Busfield 2000)。现时尚未知道这些IL-1同源物的生物功能。IL-1的新同源物IL-IH4的五个不同剪切变体(IL-IF7a-e)已有描述(Busfield 2000，Kumar 2000，Pan 2001，Smith 2000，Taylor 2002)。所述的第一个同种型IL-1F7a具有由IL-1F7基因的外显子3组成的独特的N-末端，该基因的其他它剪切变体不存在这样的N-末端。短的同种型IL-IF7c、IL-IF7d和IL-IF7e分别缺少外显子4、2或二者。只有含外显子1和2的IL-1F7b与c表达具有潜在caspase-1(ICE)切割位点的N-末端前结构域(Kumar 2002)。除了这些剪切变体外，根据外显子2内的两个碱基对突变，IL-1F7b还存在氨基酸多态性(V31G和A42T)(Kumar 2000，Pan 2001)。尽管对很多数据库进行搜索以及对IL-1-基因座排序，但仍未发现IL-1H4的小鼠同源物。IL-1F7b的序列与IL-18高度同源。IL-18活性的特点是它在IL-2、IL-12或IL-15作为协同刺激剂存在下能够诱导T细胞或自然杀伤(NK)细胞产生IFNγ。IL-18这一活性通过由配体结合链(命名为IL-18Rα)(Torgoe，1999)和信号传导链(命名为IL-18Rβ)(Born 1998，Kim 2001)组成的IL-18R复合物介导(Torigoe 1997)。与IL-18Rα链结合再与IL-18Rβ链形成复合物后，IL-18诱导IL-1受体相关激酶和TNF受体相关因子6(TRAF-6)的活化。这些被激活的激酶最后导致核因子κ-B(NF-κB)易位(Matsumoto，Robinson)。据报导，利用受体pulldown试验(Pan 2001)或者基于计算机芯片的结合研究(BiaCore)(Mulero 2000)将IL-1F7b与IL-18Rα结合。对于没有前肽的IL-1F7b成熟形式，只观察到有效但低的亲和力结合，其解离常数为Kd＝130Mm，提示与ICE加工IL-1F7b的生物相关性(Kumar 2002)。虽然可与IL-18Rα结合，但已经验证IL-1F7b前体或成熟IL-1F7b没有IL-18样或拮抗活性(Pan 2001，Kumar 2002)。
最近有人提出，白介素IL-18参与了慢性炎症性疾病的病理过程，包括内毒素性休克、肝炎和自身免疫性糖尿病(Kahiwamura和Okamura，1998)。Tsuij等(1999)发表关于IL-18在肝损伤产生中可能的作用的实验结果显示，脂多糖诱导的急性肝损伤小鼠模型中IL-18水平升高。然而，迄今尚未阐明该多功能因子IL-18在肝损伤产生中的作用机理。
肝损害或损伤可能有不同原因，例如，可能由于病毒或细菌感染、滥饮酒、免疫性疾病或癌症。
病毒性肝炎，例如由乙肝病毒和丙肝病毒引起的肝炎是很难对付的疾病，影响到世界上许多人。已知肝炎病毒的数量持续增加，除乙肝和丙肝病毒外，迄今已发现至少4个引起病毒相关肝炎的其他病毒，称为甲、丁、戊、庚肝炎病毒。
酒精性肝病是另一种广泛分布的与长期饮用酒精相关的疾病。免疫性肝炎是一种罕见的自身免疫病，很难对付。肝损伤还包括胆管损伤。原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种自身免疫性肝病，其特征是肝内胆管的破坏。
几项研究显示酒精性肝炎、肝硬化、病毒性肝炎和原发性胆汁性肝硬化这些疾病中，肝损伤与T辅助细胞-1(Th1)应答反应相关。一项研究中，通过将含卵白蛋白的脂质体导向肝脏，随后过继性转移卵白蛋白特异性Th1细胞，建立了一种小鼠新型肝损伤模型。用含卵白蛋白的脂质体和Th1细胞转移联合处理小鼠，导致血清转氨酶活性增高，与血清IFN-γ水平升高相平行。恰恰相反，卵白蛋白特异性Th2细胞转移导致血清IL-4水平增高，但不诱导肝损伤。抗IFN-γ抗体和抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抗体可阻止肝损伤。这些发现表明Th1细胞是急性肝损伤中的主要效应细胞(Nishimura和Ohta，1999)。另一系列研究表明，过度表达IFN-γ的小鼠在无任何病原体或其他刺激物时表现出自发性肝炎(Okamoto等，1998)。
另一项研究表明原发性胆汁性肝硬化(PBC)中有Th1应答反应。PBC是一种自身免疫性肝病，其特征是肝内胆道破坏。一般认为细胞免疫机制，尤其涉及T细胞时，导致了这种胆管损伤。最近提出，Th1和Th2应答反应的相对强度是各种自身免疫病病理生理过程的重要因素。在此项研究中通过检测这两种T细胞亚组的特异性细胞因子，即Th1细胞的IFN-γ和Th2细胞的IL-4，评价了PBC中细胞亚组的平衡。用非同位素原位杂交和免疫组织化学方法，计数了18个PBC病人和35个疾病对照(包括慢性活动性丙肝、肝外胆道阻塞)和正常肝脏的肝切片中IFN-γ和IL-4信使RNA(mRNA)阳性细胞数。表达IFN-γ和IL4mRNA的单核细胞聚集在PBC肝脏发炎的肝门管道中，但罕见于肝外胆道阻塞、酒精性纤维化或正常肝切片中。PBC肝脏中检测到的IFN-γ和IL-4mRNA阳性细胞数比对照肝脏明显高(P＜0.01)。而PBC肝中IFN-γmRNA的表达比IL-4表达更常检测到，IFN-γmRNA表达水平与肝门炎症活动程度高度相关。检测到IFN-γmRNA阳性细胞主要在损伤的胆管周围，围绕以淋巴样聚集体。该资料表明Th1细胞是PBC淋巴样浸润中较重要的T细胞亚组(Harada等，1997)。
还认为，病毒抗原识别的细胞因子模式对分辨病毒感染和病毒清除起着深刻影响。一项研究调查了细胞因子向Th2型应答转移而失平衡是否在慢性乙肝中起作用，用RT-PCR分析了与慢性乙肝相关的外周血单核细胞的细胞因子谱。乙肝表面抗原(HbsAg)刺激后，在41％、8％、41％和50％的病人中分别检测到IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表达。这些细胞因子中，Th1细胞因子IFN-γ的表达与血清AST/ALT(天冬氨酸氨基转移酶/丙氨酸氨基转移酶)高水平(肝损伤的典型标志)相关。Th2型细胞因子没有显示出对肝细胞有保护性作用。结论是HBsAg反应性细胞产生Th1细胞因子IFN-γ与慢性乙肝的肝细胞损伤相关(Lee等，1999)。据报告乙肝病人的肝脏中有高水平的FAS配体及其受体(CD95)(Luo等，1997)，认为FAS配体是导致肝细胞凋亡的重要细胞毒因子之一。
另一项研究鉴定了三十位未治疗的慢性肝炎丙肝病毒/RNA(HCV/RNA)阳性病人中，与肝损伤进展相关的因子。用Ishak’s评分法评价了坏死性炎症性和结构性损伤。通过α平滑肌肌动蛋白(αSMA)免疫组织化学测定，显示出激活的肝星形细胞(HSC)，并用形态测定法定量，用竞争性RT-PCR法评价血浆HCV/RNA。为研究涉及肝损伤进展的免疫应答反应类型，用免疫组织化学评价IFN-γ阳性细胞(Th1样应答的表达)，并用形态测定法定量。发现大多数在靠近小叶坏死性炎症或衬垫的纤维中隔区域可检测到HSC。αSHA和Sirius红阳性的实质，与坏死性炎症和结构性评分显着相关。肝门外周区域测到的IFN-γ阳性细胞与炎症浸润相关，也与结构破坏显着相关。因此结论是，HSC的激活和肝损伤进展与Th1样应答相关(Baroui等，1999)。与乙肝情况相似，在丙肝病人的肝脏和血清中发现了Fas配体及其受体(Hiramatsu等，1994；Okazaki等，1996；Lio等，1998)。
已发现，Th1细胞因子和其他Th1标记物与酒精性肝炎和肝硬化相关。炎性刺激和脂质过氧化激活了核因子κB(NF-κB)并上调促炎性细胞因子和趋化因子。一项研究中，评价了病理性肝损伤、内毒素血症、脂质过氧化和NF-κB激活之间的关系及促炎症和抗炎症细胞因子之间的失平衡。通过胃内灌注给大鼠(每组5只)喂食乙醇和含饱和脂肪、棕榈油、玉米油或鱼油的饮食。对照大鼠用等卡路里的葡萄糖代替乙醇，进行了病理分析和内毒素测定，包括脂质过氧化，NF-κB和促炎症细胞因子(TNFα、IL-1β、IFN-γ和IL-12)，C-C趋化因子(调节活化，由正常T细胞表达和分泌[RANTES]，单核细胞趋化蛋白[MCP]-1、巨噬细胞炎性蛋白[MIP]-1-α)，C-X-C趋化因子(诱导中性粒细胞趋化附着的细胞因子[CINC]、MIP-2、IP-10和上皮中性粒细胞活化蛋白[ENA]-78)及抗炎症细胞因子(IL-10、IL-4和IL-13)的信使RNA(Mrna)水平。在显示坏死性炎症损伤(鱼油-乙醇和玉米油-乙醇)的大鼠中观察到NF-κB激活和促炎细胞因子C-C及C-X-C趋化因子的表达增加。这几组大鼠还有最高水平的内毒素和脂质过氧化。在显示炎性肝损伤的组中IL-10和IL-4mRNA水平较低。因此在存在促炎症刺激时，发生NF-κB激活并导致Th1促炎症细胞因子和趋化因子表达增加(Naji等，1999)。酒精性肝病中FAS配体及其受体也升高，再次提示Th1细胞因子参与了酒精性肝炎诱导的自身免疫过程(GaIle等，1995；Taieb等，1998；Fiore等，1999)。
在酒精相关的肝坏死炎症病理过程中，TNF-αγ也出现于共同途径中，文献报道酒精性肝病的动物模型中和人酒精性肝病中，肝和血清TNF水平升高，推测这种TNF代谢异常在酒精性肝病的许多代谢性并发症和肝损伤中起了作用(Grove等，1997；McClain和Cohen，1999)。例如，一项研究发现酒精性肝炎患者TNF-α水平(均值26.3ng/L；95％置信区间(CI)，21.7-30.9)比正常人(6.4ng/L；CI 5.4-7.4)高。后来死亡的患者的TNF-α水平(34.7ng/L；CI27.8-41.6)比存活者(16.6ng/L；CI 14.0-19.2)高。酒精性肝炎患者TNF-α水平与血清胆红素(r＝0.74；p＝0.0009)和血清肌酸酐(r＝0.81；p＝0.0003)正相关。酒精性肝炎患者的TNF-α水平比非活动性酒精肝硬化患者(11.1ng/L；CI 8.9-13.3)和无肝病严重饮酒(6.4ng/L；CI 5.0-7.8)高。肾功能异常患者TNF-α水平(14.1ng/L；C15.4-22.8)比酒精性肝病患者低。因此结论是酒精性肝炎TNF-α升高在疾病严重时最显着，提示TNF-α在致病过程中起了作用(Bird等，1990)。
TNF介导了内毒素的许多生物作用。最近的研究显示给予TNF可引起肝损伤，TNF可能介导肝细胞毒素半乳糖胺的致死性。内毒素是最强的TNF诱导剂之一。由于酒精性肝病患者常有内毒素血症，由于酒精性肝炎的许多临床表现是已知的TNF的生物作用，故在酒精性肝炎病人中评价其作用。测定了16位酒精性肝炎病人和16位健康志愿者外周血单核细胞(TNF产生的主要来源)的基础TNF和脂多糖刺激后的TNF释放，16位酒精性肝炎病人有8人，16位健康志愿者只有2人具有可检测的自发性TNF活性(P＜0.05)。脂多糖刺激后，酒精性肝炎病人的平均单核细胞TNF释放显着增加，超过健康对照的二倍(25.3±3.7对10.9±2.4单位/ml，p＜0.05)。因此结论是与健康志愿者的单核细胞相比，酒精性肝炎病人的单核细胞具有显着增加的自发性TNF和脂多糖刺激的TNF释放(McClain和Cohen，1989)。
脂多糖(LPS)结合蛋白(LBP)和CD14在内毒素激活细胞中起着关键的中介作用。推测肠LPS参与了酒精性肝病中促进肝损伤的病理过程。已证明胃内喂食油和酒精4周的大鼠，其Kupffer细胞和肝细胞中CD14和LBP水平升高，非骨髓性细胞中的CD14mRNA表达也升高。LBP和CD14表达升高迅速增加了LPS诱导的各种促炎症细胞因子的表达，并与酒精性肝病的病理性肝损伤相关(Su等1998；Lukkari等1999)。
关节炎是一种涉及关节炎症的疾病。这些关节呈现肿胀、僵硬、触痛、发红或发热，可能伴有体重减轻、发烧或虚弱症状。当这些症状持续2周以上时，原因可能是炎症性关节炎，如类风湿性关节炎。关节炎症也可由感染引起，导致脓毒性关节炎。一种很常见的关节炎是退行性关节病(骨关节炎)。
关节炎和相关疾病的常用处方药是非类固醇抗炎药(NSAID)，其包括阿斯匹林和阿斯匹林类药物，它们可减轻引起关节疼痛的炎症，关节僵硬和肿胀。然而NSAID是非特异性药物，有许多副作用，包括胃出血(华盛顿大学关节炎矫形外科，Frederick Matsen(Chairman)，www.orthop.washington.edu)。除NSAID外，采用CelebrexTM，一种环氧合酶(COX-2)抑制剂来缓解成人骨关节炎和类风湿关节炎的体症和症状，它还可治疗家族性腺瘤息肉病病人。
WO 01/00229描述了用肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂和COX-2抑制剂联合治疗炎症。
TNF拮抗剂也用于治疗关节炎。例如WO 9103553描述了TNF拮抗剂。
最近研究表明，IL-18在关节代谢中起着促炎症作用。Olee等(1999)证明，IL-18由关节软骨细胞产生并诱导促炎症和分解代谢反应。软骨细胞中IL-1β诱导了IL-18mRNA。软骨细胞产生IL-18前体并在对IL-1刺激反应中分泌成熟形式的IL-18。研究IL-18对软骨细胞的作用进一步证明它抑制TGF-β诱导的增殖和增加氧化氮产生。IL-18激发正常人关节软骨细胞中的几种基因的表达，包括可诱导性氧化氮合成酶、可诱导性环氧合酶、IL-6和基质裂解素(stromelysin)。基因表达与相应蛋白质的合成相关。用IL-18处理正常人关节软骨增加了葡糖胺聚糖的释放。这些发现鉴定IL-18是一种调节软骨细胞反应和对软骨退化有作用的细胞因子。
Saha等(1999)已证明IL-1β转化酶(ICE)/Caspase-1位于人骨关节炎组织中，在IL-1β和IL-18成熟中起作用，他研究了人正常软骨和骨关节炎(OA)软骨及滑液中Caspase-1的表达和产生，定量测定了骨关节炎软骨细胞中的ICE水平，检测了ICE、IL-1β和IL-18局部分布之间的关系以及软骨细胞的凋亡。该研究所做的实验表明，人滑膜和软骨均表达和合成ICE，OA组织中阳性染色细胞数明显高于正常组织。关节软骨的浅表层和上中层优先产生ICE。OA软骨外植体和软骨细胞产生成熟的IL-1β，用特异性ICE抑制剂处理完全阻抑了软骨细胞，ICE抑制剂还明显减少IL-18阳性细胞的数量。活性IL-1β和ICE之间的这种关系提示，ICE可能通过激活此促炎症细胞因子而促进OA的发展，IL-18可能在软骨病理学中起作用。
Gracie等(1999)提出，IL-18在类风湿关节炎中有促炎症作用。他们检测到类风湿关节炎滑膜组织中的IL-18mRNA和蛋白水平明显高于骨关节炎对照。还证明体外IL-12或IL-15与IL-18联合诱导了滑膜组织产生IFN-γ。给予用胶原/弗氏不完全佐剂免疫的小鼠IL-18，加速了其侵蚀性炎症关节炎的发展，提示IL-18在体内可能是促炎症的。
然而迄今除了化学药物外，采用可溶性受体或单克隆抗体只阻断TNFα和IL-1β，已显示能降低小鼠胶原诱导的关节炎(CIA，是类风湿关节炎的一种小鼠模型)(Williams等，1994)，从而提示可用作类风湿关节炎的治疗药物。
术语“慢性或特发性炎症性肠病”包括至少两种状况节段性回肠炎(也称克隆氏病，Crohn′s disease)和溃疡性结肠炎，二者都是肠胃道疾病。节段性回肠炎最常影响小肠，当其还涉及结肠时对溃疡性结肠炎的鉴别诊断可能是一个问题。
节段性回肠炎的慢性炎症和溃疡通常以小肠梗阻或腹痛开始，这可能类似于急性阑尾炎，其他表现可能是关于其并发症的。该病进程缓慢，尽管治疗也可能恶化和缓解，通常发生于青壮年，约一半病例年龄在20-30岁之间，90％在10-40岁之间，男性略多于女性。
显微镜检查反映了该病的总体外观，炎症涉及部位是不连续的，呈局灶性或斑块状。主要在粘膜和粘膜下层见到淋巴细胞和浆细胞集聚，但常影响全层(穿透性炎症)。节段性回肠炎的典型显微镜特征是存在颗粒细胞，围绕着淋巴细胞套。特发性炎症性肠病的发生率显示因地理而有相当差异。北欧和美国这些病的发病率比南欧、非洲、南美和亚洲国家高得多，虽然南欧部分地区和日本都市化和财富的增加导致较高的发病率(General and SystematicPathology，Churchill Livingstone第三版，2000，JCE Underwood编)。
节段性回肠炎临床上有二种主要类型，第一种病人在发作后三年内病情持续缓解，第二种病人病情持续三年以上。
不论病因学如何，有证据表明节段性回肠炎具有持续和不恰当的T细胞和巨噬细胞激活，伴有促炎症细胞因子，特别是白介素1，2，6和8，IFN-γ和TNF-α产生的增高。节段性回肠炎的特征是伴有纤维化的持续性(慢性)炎症。成纤维细胞增殖和胶原沉积过程可能由转化生长因子β所介导，该因子具有明确的抗炎症作用，即成纤维细胞募集、基质合成和炎性细胞下调，但可能牵涉到许多其他介质。
溃疡性结肠炎是大肠的一种非特异性炎症，通常起始于直肠，以不同程度向邻近结肠延伸。不象节段性回肠炎，溃疡性结肠炎局限于大肠。
越来越多的证据表明，溃疡性结肠炎是改变的自身免疫性反应的一种结果，但粘膜损伤也可能是T细胞不恰当激活以及由巨噬细胞和中性粒细胞的细胞因子、蛋白酶和反应性氧代谢物造成的间接损伤所致。对结肠上皮造成损伤的后一种机制称为“无辜傍观者(innocent bystander)”损伤。有利于自身免疫的证据是存在自身反应性T淋巴细胞和针对结肠上皮细胞和内皮细胞的自身抗体及抗中性粒细胞胞浆性自身抗体(ANCA)。然而，不应考虑溃疡性结肠炎是自身免疫病，其粘膜损伤是对自身抗原的免疫反应的直接结果(Generaland Systematic Pathology，同上)。
关于节段性回肠炎的治疗，大多数人首先用含美沙拉敏(mesalamine，一种有助于控制炎症的物质)的药物治疗。不能从其获益或不能耐受此药的病人可用其他含mesalamine的药，通常称为5-ASA。Mesalamine制剂的可能副作用包括恶心、呕吐、心灼热、腹泻和头痛。
某些病人服用皮质类固醇以控制炎症，这些药对急性节段性回肠炎最有效，但可引起严重副作用，包括对感染的易感性增大。
也可采用抑制免疫系统的药物来治疗节段性回肠炎，最常用处方药是6-巯基嘌呤及相关药物硫唑嘌呤。免疫抑制剂通过阻断产生炎症的免疫反应而起作用。这些药物可能引起副作用，如恶心、呕吐和腹泻，并可降低病人对感染的抵抗力。当合用皮质类固醇和免疫抑制药治疗病人时，可减少皮质类固醇的剂量。某些研究提示免疫抑制药可增强皮质类固醇的效果。
美国食品和药物管理局批准了药物infliximab用于治疗对标准疗法(mesalamine物质，皮质类固醇，免疫抑制剂)无反应的中度至重度节段性回肠炎和治疗开放性引流瘘。首次批准专用于节段性回肠炎治疗的infliximab是一种抗肿瘤坏死因子(TNF)单克隆抗体。抗TNF在TNF到达小肠前从血流中去除TNF从而预防了炎症。
狭窄、瘘管或外科手术引起的小肠中细菌过度生长可用抗生素治疗。对此常见问题，医生可处方以下抗菌素之一种或多种氨苄青霉素、磺胺、头孢菌素、四环素或灭滴灵。
炎症消退时腹泻和痉挛性腹痛常缓解，但还可能需要其他药物，可采用几种抗腹泻药，包括地芬诺酯、氯哌丁胺和可待因。因腹泻而脱水的病人常输液和电解质治疗。
故仍然需要有效的疗法来治疗和/或预防炎症性肠病，特别是节段性回肠炎和溃疡性结肠炎，该疗法应减少副作用或甚至无副作用为理想。
组织学和免疫学观察表明，细胞介导免疫力和T细胞激活是节段性回肠炎(CD)的关键特征。对人和实验动物模型的研究提示，在此病中，局部免疫应答反应倾向于以Th1型为主(Desreumaux等，1997)，局部释放的细胞因子，如IFN-γ、IL-1β和TNF-α导致促进和扩大炎症反应(Reimund等，1996)。
细胞因子IL-18在Th1介导的免疫应答反应中，与细胞因子IL-12合作，通过刺激IFN-γ分泌、增强自然杀伤细胞的细胞毒性和刺激Th1细胞分化，而起着重要作用(Uschito等，1996)。
IL-18与IL-12、IL-2、抗原、有丝分裂原，可能还有其他因子一起作用，诱导产生IFN-γ。IL-18还增强GM-CSF和IL-2的产生，促进抗CD3诱导的T细胞增殖和加强自然杀伤细胞的Fas介导的杀伤。成熟的IL-18由其前体经IL-1β转化酶(ICE caspase-1)而产生。IL-18受体由至少二个组分组成，在配体结合中起协同作用。在小鼠受IL-12激活的T细胞中发现有IL-18的高亲和力和低亲和力结合位点(Okamoto等，1998)提示其为多条链的受体复合物。迄今已鉴定到二个受体亚基，二者均属于IL-1受体家族(Okamoto等，1999)。IL-18的信号转导涉及NF-κB的激活(Matsumoto等，1997)。
最近有人提出IL-18涉及炎症性肠病(Pizarro等，1999；Monteleone等，1999)。
Pizarro等(1999)特征分析了节段性回肠炎(CD)病人结肠标本中IL-18的表达和定位并分离了粘膜细胞群。采用半定量RT-PCR法，与溃疡性结肠炎(UC)和非炎症对照病人相比，发现CD病人新鲜分离的小肠上皮细胞和固有层单核细胞中IL-18mRNA转录增加。与固有层单核细胞相比，小肠上皮细胞中的IL-18mRNA转录更加丰富。免疫组织化学分析手术切除的结肠组织将IL-18定位于固有层单核细胞(尤其是巨噬细胞和树突状细胞)以及小肠上皮细胞。Western blot分析揭示，与重组和成熟的人IL-18蛋白相符的18.3KDa条带，主要见于CD而非UC的肠粘膜活检标本中。在CD和UC二者活检标本的非炎症区域中检测到与无活性IL-18前体相符的第二条24KDa条带。此条带在非炎症对照中是唯一的形式。
Monteleone等(1999)证实了这些发现，采用半定量RT-PCR和Western blot分析检测了12个CD、9个UC病人和15个非炎症性肠病对照者的整个肠粘膜组织和固有层单核细胞中的IL-18。发现所有测试标本中均有IL-18转录，然而与UC和对照相比，在CD的粘膜和固有层单核细胞样本中均检测到IL-18mRNA积累增高。CD中取自炎症区域的粘膜标本中IL-18转录更丰富。与成熟IL-18相符的18KDa条带主要见于CD粘膜标本中。非炎症性肠病(non-IBD)对照粘膜标本中IL-18以24KDa多肽存在。与此相一致，CD或UC标本中表达了活性IL-1β转化酶(ICE)的亚基(p20)，而non-IBD对照的结肠粘膜中，只合成ICE作用前体(p45)。
Ohta等(2001)表明，牛皮癣病变皮肤中IL-18表达相对于正常皮肤高。他们的发现提示从角化细胞产生的IL-18参与了牛皮癣病变中Th1应答反应的产生，并且它的生物活性似乎受皮肤炎症严格控制。
在一些动物模型中，中和内源性IL-18的抗体减轻了疾病的严重程度。抗IL-18可防止内毒素致死性。即使在不依赖于干扰素-γ的模型中，中和IL-18也可延长存活期。抗IL-18也可保护肝脏免受于毒素或激活T细胞所诱导的细胞损伤。在肝黑素瘤转移的模型中，IL-18阻塞可防止血管内皮粘附-1分子表达的IL-18上调，从而减少恶性细胞粘着。IL-18和IL-12协同地作用刺激I细胞和天然杀伤细胞以产生IFN-γ，但中和IL-18可防止IL-12诱导IFN-γ。IL-18类似某些细胞，能用来增强小鼠抗肿瘤的宿主防御，这是一种最常见的依赖于IFN-γ的机制。但它是IL-18的促炎功能，可能有助于增强宿主防御。在关节炎、肺损伤或炎症性肠病模型中，中和IL-18揭示该种细胞因子在介导炎症中有重要作用(Dinarello 2000)。
发表的数据提示，IL-18可能在炎症性CNS疾病中起着病理作用。已经发现，在动物模型中中和IL-18可预防脑损伤(Yatsiv等，2002)、缺血性损伤(Mallat等，2002)、心功能不全(Raeburn 2002)和神经炎(Yu等，2002)。
但有证据显示，IL-18促进了小鼠体内抗肿瘤的宿主防御。例如，同系小鼠中表达鼠IL-12或鼠IL-18的鼠乳腺癌细胞较少生成肿瘤，而且形成肿瘤的速度也比对照的不表达细胞慢(Coughlin等，1998)。抗体中和研究揭示抗肿瘤作用需要IFN-γ。Tasaki进行的一项研究发现，表达白介素-18在鼠结肠癌细胞诱导保护性免疫性。而用编码IL-18基因的载体转导的大肠癌细胞当引入免疫活性小鼠时无法形成皮下肿瘤，而且对非转导的接种结肠癌细胞产生抗性。免疫组织化学分析揭示，带有IL-18载体转导的细胞的结肠癌中血管数目明显减少。而在缺乏免疫力的小鼠中观察不到结肠IL-18转导细胞丧失致肿瘤性。因此，从肿瘤细胞分泌出来的IL-18用作辅助剂，因为它刺激T辅助1型细胞诱导抗肿瘤应答(Tasaki等，2000)。
已经有人提出，IFN-α通过诱导IL-18BP在慢性丙肝病人体内发挥其抗炎作用(Kaser等2002)。
先前的研究工作中已经发现，与健康个体相比，很多疾病的病人，例如脓毒症(Novick 2001)、急性移植物抗宿主病(Zecchina 2001)、节段性回肠炎(Corbaz 2002)，他们的IL-18BP水平大幅提高。不过也发现这些病人的循环IL-18水平非常高，因此在循环中存在的IL-18BP水平不足以中和全部IL-18。
所以，有必要提供关于病理涉及IL-1家族的细胞因子如IL-18的疾病的治疗和/预防方法。
发明内容
本发明涉及一种细胞因子-1或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段在制备治疗或预防因诱导细胞因子-2受体而引起或加重的疾病的药物中的应用，其中所述细胞因子-1优选来自IL-1家族，更好是IL-1F7b，能够结合IL-18BP或其突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段，和能够抑制所述细胞因子-2受体，该细胞因子-2是IL-1家族成员，优选IL-18。
更具体地说，细胞因子-1通过结合细胞因子-2受体的信号传导链来抑制细胞因子-2的活性。所以，可采用细胞因子-1治疗或预防炎症性疾病，其选自内毒素致死性(脓毒症)、毒素或激活T细胞或丙肝引起的肝损伤、关节炎、肺损伤、牛皮癣、炎症性肠病、脑损伤、缺血性损伤、心功能不全和神经炎，或者治疗或预防转移(metastasis)形成。有需要的话，本发明的药物还可含有IL-18BP或其突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段。
编码这种细胞因子-1的载体可代替该细胞因子-1，用来制备治疗或预防因诱导所述细胞因子-2受体而引起或加重的疾病的药物。
本发明的上述蛋白质和/或载体可全身、皮下和/或肌内给予。
此外，本发明还提供一种内源基因激活细胞因子-1的载体，其可治疗或预防因诱导细胞因子-2受体而引起或加重的疾病，其中所述细胞因子-1优选来自IL-1家族，更好是IL-1F7b，能够结合IL-18BP或其突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段，和能够抑制所述细胞因子-2受体，该细胞因子-2是IL-1家族成员，优选为IL-18。更具体地说，细胞因子-1通过结合细胞因子-2受体的信号传导链来抑制细胞因子-2的活性。更具体地说，本发明涉及细胞因子-1在治疗或预防炎症性疾病，例如内毒素致死性(脓毒症)、毒素或激活T细胞或丙肝引起的肝损伤、关节炎、肺损伤、牛皮癣、炎症性肠病、脑损伤、缺血性损伤、心功能不全和神经炎，或者在治疗或预防转移形成中的应用。有需要的话，本发明的药物还可含有IL-18BP或其突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段。
本发明用于内源基因激活的载体可全身、皮下和/或肌内给予。
本发明另一方面内容提供一种细胞因子-1或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段的抑制剂在治疗或预防因诱导细胞因子-2受体可预防或减缓的疾病中的应用，其中所述细胞因子-1优选来自IL-1家族，更好是IL-1F7b，能够结合IL-18BP或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、或片段，和能够抑制所述细胞因子-2受体，该细胞因子-2是IL-1家族成员，优选为IL-18。更具体地说，本发明涉及本发明的细胞因子-1抑制剂在治疗或预防病毒性疾病或者在治疗或预防癌症中的应用。
例如，细胞因子-1抑制剂包括抗体、反义核酸、RNAi、或者能够结合细胞因子-1的可溶性细胞因子-2受体或其片段。
本发明还提供一种抑制有需要病人的细胞因子-2受体的方法，所述细胞因子-2是IL-1家族成员，优选为IL-18，所述方法包括给予治疗有效量的细胞因子-1或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段，其中所述细胞因子-1优选是IL-1F7b，能够结合IL-18BP或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、或片段。更具体地说，细胞因子-1通过结合细胞因子-2受体的信号传导链来抑制细胞因子-2的活性。更具体而言，本发明涉及细胞因子-1在治疗或预防炎症性疾病，其选自内毒素致死性(脓毒症)、毒素或激活T细胞或丙肝引起的肝损伤、关节炎、肺损伤、牛皮癣、炎症性肠病、脑损伤、缺血性损伤、心功能不全和神经炎，或者在治疗或预防转移形成中的应用。有需要的话，IL-18BP或其突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段可与细胞因子-1共结予。本发明的细胞因子-1可全身、皮下和/或肌内给予。
另一个选择是，本发明的方法包括给予编码所述细胞因子-1的载体。
另外，本发明也提供一种抑制有需要病人的细胞因子-2受体的方法，所述细胞因子-2是IL-1家族成员，优选为IL-18，所述方法包括给予治疗有效量的可基因激活细胞因子-1或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、或片段的载体，其中所述的细胞因子-1优选是IL-1F7b，能够结合IL-18BP或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、或片段。更具体地说，细胞因子-1通过结合细胞因子-2受体的信号传导链来抑制细胞因子-2的活性。可采用细胞因子-1治疗或预防炎症性疾病，例如内毒素致死性(脓毒症)、毒素或激活T细胞或丙肝引起的肝损伤、关节炎、肺损伤、牛皮癣、炎症性肠病、脑损伤、缺血性损伤、心功能不全和神经炎，或者治疗或预防转移形成。有需要的话，IL-18BP或其突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段可与细胞因子-1共结予。本发明的用于基因激活的载体可全身、皮下和/或肌内给予。
本发明又一方面内容涉及一种抑制细胞因子-1或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段的方法，用于治疗或预防因诱导细胞因子-2受体可预防或减缓的疾病，其中所述细胞因子-1优选来自IL-1家族，更好是IL-1F7b，能够结合IL-18BP或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、或片段，和能够抑制所述细胞因子-2受体，该细胞因子-2是IL-1家族成员，优选为IL-18。更具体地说，本发明的方法包括用细胞因子-1抑制剂治疗或预防病毒性疾病或者治疗或预防癌症。
图1所示为人IL-18和IL-IF7b的序列相似性。
图中给出人IL-18(accession no.D4995)和人IL-IF7b(accession no.AF200496)。运用专家蛋白质分析系统(ExPasy)再加上人工调整产生序列对比。IL-18和IL-IF7b的氨基酸相同性为28％，相似性为55％。下划线氨基酸代表IL-18的ICE切割位点和IL-IF7b的预计切割位点。
图2所示为IL-IF7b既不刺激也不抑制IL-18诱导产生IFNγ。
图2A所示为人NKO细胞、全人血培养基、PBMC(用IL-12(1ng/ml)协同刺激)和KG-1细胞(用TNFα(10ng/ml)协同刺激)用100ng/ml重组IL-IF7b(前体或成熟形式)或者IL-18处理。18小时(KG-1是48小时)后测量上清液的IFNγ。结果以三个不同实验的平均值+/-SEM表示。
图2B所示为在IL-12(1ng/ml)和增加浓度的IL-IF7b前体或成熟IL-IF7b存在下，以IL-18(20ng/ml)诱导NK细胞。数据以三个不同实验的平均值+/-SEM表示。
图3A和图3B所示为IL-IF7b和IL-18Ra-胞外结构域3的交联。
图3A所示为与IL-18RaD3交联的IL-IF7b的还原SDS-PAGE。在硝基纤维素上印迹后，通过针对IL-18Rα的单抗mAb可目测到交联蛋白质。
图3B所示为化学交联后在IL-18而非IL-IF7b存在下形成IL-18Rα-和β-ECD三元复合物。在Western blot后，通过针对his6-tagged IL-18Rβ的抗his6tag单抗可目测到该复合物。
图4A和图4B所示为IL-IF7b和IL-18BP的交联。
图4A所示为采用兔抗IL-18BP血清以Western blot检测交联蛋白质(每次1.5μg)。
图4B所示为用针对IL-18BP的mAb免疫沉淀交联蛋白质(每次10μg)。交联IL-1F7b/IL-18BP和对照泳道(IL-18BP+/-BS3，交联剂)用兔抗IL-1F7b血清染色。采用兔抗IL-18血清检测IL-18/IL-18BP复合物。
图5A和图5B所示为IL-IF7b增强IL-18BP抑制IL-18诱导NKO细胞释放IFNγ的能力。
加入NKO细胞(0.5×106/ml)和IL-12(1ng/ml)前1小时，使成熟IL-IF7b250ng/ml(A，0＝9)(图5A)或者IL-IF7b前体250ng/ml(B，0＝8)(图5B)、IL-18(25ng/ml)和以RPMI/FCS 10％稀释IL-18BP的稀释液在96孔微滴定板上培育1小时。与细胞培育16小时后，收集上清液并测量IFNγ。数值表示为在不存在IL-IF7b或IL-18BP情况下用IL-18 25ng/ml加上IL-121ng/ml刺激NKO细胞所产生的IFNγ百分比。运用Student′s配对t检验进行统计分析(***p值＜0.001)。
图6所示为转染RAW264.7中IL-IF7b的表达。
稳定转染后，通过SDS-PAGE分离各个克隆的溶胞产物(5×106细胞)，用Western blot分析检测IL-1F7b表达。兔抗IL-1F7b血清(稀释1∶500)特异性染色IL1F7b阳性克隆。
具体实施例方式
本发明涉及能够结合IL-18BP或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段以及能够抑制细胞因子-2受体(细胞因子-2是IL-1受体家族成，例如IL-18R)的细胞因子-1(例如IL-1F7b)在制备治疗或预防因诱导所述细胞因子-2受体而引起或加重的疾病的药物中的应用。本说明书所用的术语“抑制细胞因子-2受体”和“抑制细胞因子-2的活性”是可互换的。所以，本发明涉及能够结合IL-18BP或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段以及能够抑制细胞因子-2(细胞因子-2是IL-1家族细胞因子的成员)的活性的细胞因子-1的应用。本发明基于IL-1F7b能增强IL-18BP抑制IL-18活性的发现。已经发现，IL-1F7b与IL-18BP结合，其复合物可通过IL-18，可能的话，通过募集IL-18R的信号传导链(即IL-18Rβ)来抑制IL-18R的活化。
本发明的细胞因子-1可优选是IL-1家族成员，如IL-1F7b、IL-18、IL-1和IL-1Ra。根据本发明，细胞因子-1和细胞因子-2是两个不同的细胞因子。例如可选择细胞因子-1和2的下列组合IL-1F7b(细胞因子-1)和IL-18(细胞因子-2)、IL-1F7b(细胞因子-1)和IL-1(细胞因子-2)、IL-18(细胞因子-1)和IL-1(细胞因子-2)、IL-1(细胞因子-1)和IL-18(细胞因子-2)、IL-1F7b(细胞因子-1)和IL-1Ra(细胞因子-2)、IL-1Ra(细胞因子-1)和IL-18(细胞因子-2)以及IL-18(细胞因子-1)和IL-1Ra(细胞因子-2)。
最近发现，IL-1F7b(也称IL-1H4)是与IL-1α/β、IL-1Ra和IL-18(IL-1家族)具有序列同源性的递增蛋白质家族的新成员。虽然IL-1F7b与IL-18受体亚基之一IL-18Rα亚基结合，但该结合不会产生IL-18激动或拮抗功能。根据本发明，用化学交联使IL-1F7b与IL-18Rα结合，但与IL-18不同，IL-1F7b不能募集IL-18Rβ链形成具有功能活性的三元复合物。
对IL-1F7b和IL-18的序列进行比较，发现这两种蛋白质都有两个保守性氨基酸，即IL-1F7b有氨基酸E35和K124，而IL-18有氨基酸E42和K89。IL-18的残基E42和K89对IL-18的活性和抑制都很重要，这是因为它们参与结合IL-18Rα(活化)和结合IL-18BP(抑制)。
此外，我们在交联实验中还发现，IL-1F7b与IL-18BP结合，而且IL-1F7b与IL-18类似，可通过两个对结合于IL18Rα有重要作用的相同保守性氨基酸残基(即氨基酸E35和K124)与IL-18BP结合。因此，在IL-1F7b与IL-18BP形成复合物后，IL-1F7b可能无法再与IL-18Rα结合。已经发现，IL-1F7b不仅与IL-18BP结合，而且能够增值它的活性，即增强IL-18活性的抑制。IL-F7b蛋白质的前体和成熟形式都发现有该活性。因为IL-1F7b与IL-18BP形成复合物后不能结合于IL-18Rα，所以IL-18活性的抑制可能是由这个复合物与信号传导链IL-18Rβ结合所致。故β-链可被募集到该复合物，从而消除β-链以形成IL-18Rα和IL-18的功能性受体复合物。
因此，本发明包括通过一个能够结合IL-18BP或其同种型、突变蛋白、等位基因变体或片段的不同细胞因子(细胞因子-1)或其同种型、突变蛋白、等位基因变体或片段抑制信号传导通过细胞因子-2受体，所述细胞因子-2是IL-1家族成员。
免疫组织化学定位研究表明单核细胞群存在IL-1F7b，这证明了IL-1F7b具有作为IL-18生物活性的天然表达调节剂的作用。
本文所用术语“突变型蛋白”指细胞因子-1如IL-1F7b的同类物，此同类物中细胞因子-1如IL-1F7b的一个或多个氨基酸残基被不同氨基酸残基所置换，或缺失，或IL-1F7b中加入了一个或多个氨基酸残基，但所产生的产物的活性与IL-1F7b相比无显着改变。更具体地说，IL-1F7b的一个或多个氨基酸，但不超过30个，较佳不超过20个，更好不超过10个，最好不超过1或2个，可被其他氨基酸所置换、或缺失，或者可加入。采用已知的合成和/或定点诱变技术，或任何适合的其他已知技术制备这些突变蛋白。
本发明的突变蛋白包括由在严格条件下杂交于编码细胞因子-1如IL-1F7b的DNA或RNA的核酸(如DNA或RNA)所编码的蛋白质。术语“严格条件”是指本领域一般技术人员常规地称为“严格的”杂交条件以及随后的洗涤条件。参照Ausubel等人，Current Protocol的Molecular Biology(分子生物学的目前方案)，同上，Interscience，N.Y.，§§6.3和6.4(1987，1992)，以及Sambrook等人(同上)。不起限制作用，严格条件的例子包括洗涤条件，在低于所研究的杂交体的Tm计算值12-20摄氏度下，如在2×SSC和0.5％SDS中洗涤5分钟，在2×SSC和0.1％SDS中洗涤15分钟；在0.1×SSC和0.5％SDS，于37摄氏度洗涤30-60分钟并且在0.1×SSC和0.5％SDS，于68摄氏度洗涤30-60分钟。本领域一般技术人员知道，严格条件还依赖于DNA序列、寡核苷酸探针(如10-40碱基)或混合的寡核苷酸探针的长度。如果使用混合探针，优选使用四甲基氯化铵(TMAC)来代替SSC。参考Ausubel(同上)。
任何这样的突变蛋白优选具有与细胞因子-1如IL-1F7b高度相同的氨基酸序列，从而具有与IL-1F7b相当的活性。IL-1F7b的一种活性是其结合IL-18BP的能力。因此，可通过常规实验来确定任一给定的突变蛋白是否具有与IL-1F7b相同的活性，该实验包括对该突变蛋白进行简单的夹心竞争测试，以测定它是否结合于适当标记的IL-18BP(如放射免疫测试或ELISA测试)。
在一个较佳实施例中，与IL-1F7b的氨基酸序列相比，任何这类突变蛋白具有至少40％的相同性或同源性。更佳地，它具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或最佳地至少90％的相同性或同源性。
本发明可用的细胞因子-1如IL-1F7b的突变蛋白，或相应的编码核酸，包括由基本一致的、作为置换肽或多核苷酸序列所构成的有限集合，这些物质可由本领域一般技术人员基于本文的教导和指导，在无过分试验的情况下，通过常规方法制得。
根据本发明，突变蛋白的优选改变是已知的“保守性”置换。细胞因子-1如IL-1F7b的保守性氨基酸置换，可包括一组内的同义氨基酸，这些同义氨基酸有足够相似的物理化学特性以致于在组成员之间的置换将保持分子的生物功能(Grantham，1974)。很清楚，还可在上述氨基酸序列中插入和缺失氨基酸，而不改变它们功能，尤其是如果这些插入或缺失只涉及到少数氨基酸，比如少于30个，较佳地少于10个，并且不取消或置换那些对功能构象至关重要的氨基酸，比如半胱氨酸残基。由这些插入和/或缺失所产生的蛋白质和突变蛋白属于本发明的范围之内。
较佳地，同义氨基酸(synonymous amino acid)组为表1所定义的那些；更佳地，同义氨基酸组为表2所定义的那些；最佳地，同义氨基酸组为表3所定义的那些。
表1优选的同义氨基酸组氨基酸 同义组SerSer，Thr，Gly，AsnArgArg，Gln，Lys，Glu，His
LeuIle，Phe，Tyr，Met，Val，LeuProGly，Ala，Thr，ProThrPro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrAlaGly，Thr，Pro，AlaValMet，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGlyAla，Thr，Pro，Ser，GlyIleMet，Tyr，Phe，Val，Leu，IlePheTrp，Met，Mer，Ile，Val，Leu，PheTyrTrp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrCysSer，Thr，CysHisGlu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGlnGlu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnAsnGln，Asp，Ser，AsnLysGlu，Gln，His，Arg，LysAspGlu，Asn，AspGluAsp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluMetPhe，Ile，Val，Leu，MetTrpTrp表2更优选的同义氨基酸组氨基酸 同义组SerSerArgHis，Lys，ArgLeuLeu，Ile，Phe，MetProAla，ProThrThrAlaPro，AlaValVal，Met，Ile
GlyGlyIleIle，Met，Phe，Val，LeuPheMet，Tyr，Ile，Leu，PheTyrPhe，TyrCysCys，SerHisHis，Gln，ArgGlnGlu，Gln，HisAsnAsp，AsnLysLys，ArgAspAsp，AsnGluGlu，GlnMetMet，Phe，Ile，Val，LeuTrpTrp表3最优选的同义氨基酸组氨基酸 同义组SerSerArgArgLeuLeu，Ile，MetProProThrThrAlaAlaValValGlyGlyIleIle，Met，LeuPhePheTyrTyrCysCys，Ser
HisHisGlnGlnAsnAsnLysLysAspAspGluGluMetMet，Ile，LeuTrpMet可通过在蛋白质内的产生氨基酸置换，得到用于本发明的细胞因子-1如IL-1F7b多肽或蛋白的突变蛋白，其例子包括任何已知的方法步骤，如在Mark等的美国专利4959314，4588585，4737462；Koths等的美国专利5116943，Namen等的美国专利4965195；Chong等的美国专利4879111，和Lee等的美国专利5017691中所述的方法；以及美国专利4904584(Shaw等)中所述的赖氨酸置换蛋白质。
术语“融合蛋白”是指一种多肽，其中包含细胞因子-1优选IL-1F7b，或其突变蛋白或片段，并和另一种蛋白质(如在体液中有更长保留时间的蛋白)融合在一起。因而IL-1F7b可与其他蛋白质、多肽等融合，如免疫球蛋白或其片段。
如本文所用，“功能衍生物”涵盖细胞因子-1优选IL-1F7b的衍生物，以及它们的突变蛋白和融合蛋白，这些物质可用本领域已知的手段，从作为残基侧链或作为N末端或C末端基团存在的官能团制备而得，并且只要它们仍然是药学上可接受的(即它们没有破坏蛋白的与IL-1F7b的活性基本相似的活性，并且不会使含该物质的组合物具有毒性)，那幺它们就被包括在本发明中。
这些衍生物可以例如包括聚乙二醇支链，它可掩盖抗原位点并且延长细胞因子-1优选IL-1F7b在体液中的停留时间。其他的衍生物包括羧基的脂肪酯，羧基通过与氨或伯胺或仲胺反应而形成的酰胺，氨基酸残基的自由氨基与酰基部分(如烷酰基或碳环芳酰基基团)形成的N-酰基衍生物，或自由羟基(如丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基)与酰基部分形成的O-酰基衍生物。
作为细胞因子-1和/优选IL-1F7b或其突变蛋白和融合蛋白的“片段”，本发明包括了单独的蛋白质分子多肽链或其与相关分子或残基相连(如糖或磷酸残基)的多肽链的任何片段或前体，或蛋白质分子或糖残基自身的聚集体，只要所述片段具有与IL-1F7b基本上相似的活性，例如结合IL-18BP和抑制细胞因子-2受体。
本发明还涉及细胞因子-1优选IL-1F7b的同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或循环变换衍生物。这些同种型、突变蛋白、融合蛋白或功能衍生物保留了细胞因子-1的生物活性(尤其是结合于IL-18BP)，并且较佳地增强细胞因子-2的抑制。例如，IL-1F7b突变蛋白保留了结合IL-18BP的能力，较佳地增强IL-18的抑制。该突变蛋白保留了参与细胞因子-1与IL-18BP结合的氨基酸。例如，对于IL-1F7b，其突变蛋白保留了氨基酸酸E35和K124。理想地，与未经修饰的细胞因子-1相比，这些突变蛋白有增强的生物活性。较佳的活性片段具有比细胞因子-1活性更好的活性，或具有其他优势，例如更好的稳定性或更低的毒性或免疫原性，或者它们更容易大批量生产，或更容易纯化。
细胞因子-1优选IL-1F7b可用于治疗或预防由细胞因子-2最好由IL-18引起或加重的炎症性疾病或转移形成的药物组合物。已经发现，一些炎症性疾病病人的循环IL-18BP水平很高，然而，IL-18BP的浓度不足以完全中和这些病人体内的高浓度IL-18。所以，把细胞因子-1优选IL-1F7b给予这些IL-18BP水平高的病人，可能有助于完全抑制IL-18的作用。另一个选择是，把IL-1F7b和IL-18BP共给予病人，用于治疗或预防炎症性疾病，其选自内毒素致死性(脓毒症)、毒素或激活T细胞或丙肝引起的肝损伤、关节炎、肺损伤、牛皮癣、炎症性肠病、脑损伤、缺血性损伤、心功能不全和神经炎，或者用于治疗或预防转移形成。
因为已经发现，IL-1F7b不仅结合IL-18BP，而且可增强它的活性(抑制IL-18的活性)，所以如果需要给予低剂量IL-18BP，那么共给予IL-1F7b和IL-18BP是有利的。
给予细胞因子-1优选IL-1F7b的适合途径取决于疾病本身。所以它可以通过例如局部、全身、皮下和肌内途径给予。
在动物模型中，中和IL-18表明该细胞因子在介导炎症中的重要作用(Interleukin-18，a proinflammatory cytokine.Dinarello CA.Eur Cytokine Netw2000Sep；11(3)483-6)。所以，本发明还涉及细胞因子-1或包含细胞因子-1优选IL-1F7b的编码序列的表达载体在制备治疗或预防炎症的药物中的应用。因此，给予细胞因子-1优选IL-1F7b可治疗或预防病理涉及IL-18的炎症性疾病，例如内毒素致死性(脓毒症)、毒素或激活T细胞或丙肝引起的肝损伤、关节炎、肺损伤、牛皮癣、炎症性肠病、脑损伤、缺血性损伤、心功能不全和神经炎。
因为IL-18阻塞可防止血管内皮粘附-1分子表达的IL-18上调，从而减少恶性细胞粘着，所以本发明还涉及一种表达载体在制备预防转移形成的药物中的应用。为了将细胞因子-1输送至所需部位，可考虑基因疗法。为了治疗失调或疾病，包含细胞因子-1(例如IL-1F7b)序列的基因治疗载体可被直接注射入患病组织，从而避免基因治疗载体的全身给药所涉及的问题，比如载体的稀释，到达和定位于靶细胞或组织，以及副作用。或者，包含本发明细胞因子-1的编码序列的表达载体可通过肌内注射给予。
如上所述的细胞因子-1优选IL-1F7b以及它的同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能衍生物或活性片段是药物组合物中较佳的活性成份。药物组合物也可包括如上所述的IL-18BP以及它的同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能衍生物或活性片段作为活性成份。
“药学上可接受”的定义包括任何载体，其并不干扰活性成份的生物活性的有效性，并且给予后对宿主没有毒性。例如，对肠胃外给药而言，活性蛋白质可在诸如盐水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和Ringer氏溶液等载体中，配制成用于注射的单位剂型。
根据本发明的药物组合物中的活性成份可以通过几种方法施用于人。给药途径包括皮内、透皮(例如在缓释剂型中)、肌内、腹膜内、静脉内(全身)、皮下、口服、颅内、硬膜外、局部、和鼻内的途径。可以采用任何其他在治疗上有效的给药途径，例如通过上皮或内皮组织的吸收或通过基因疗法(其中编码活性成分的DNA分子被给予病人(如通过载体)，这导致了该活性成分在体内表达和分泌。此外，本发明的蛋白质可与其他一些生物活性物质成分(例如药学上可接受的表面活性剂、赋形剂、载体、稀释剂和运载体)一起给予。
对于肠胃外给药(如静脉内、皮下、肌内)来说，活性蛋白质可以与药学上可接受的肠胃外载体(例如水、盐水、葡萄糖溶液)以及维持渗透压(如甘露醇)或化学稳定性(如防腐剂和缓冲剂)的添加剂一起配制成溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末。制剂可用常用的技术进行灭菌。
本发明的活性蛋白质的生物利用度也可通过延长分子在人体中半衰期的偶联法加以改善，例如如PCT专利申请WO92/13095中所述的那样，把分子连于聚乙二醇。
如上所述的细胞因子-1优选IL-1F7b或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能衍生物或活性片段可用来抑制炎症性疾病病人的细胞因子-2的活性，所述的炎症性疾病例如是脓毒症、毒素或激活T细胞引起的肝损伤、关节炎、肺损伤、牛皮癣或炎症性肠病。如上所述的本发明细胞因子-1或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能衍生物或活性片段还可用来预防转移形成，这是因为IL-18阻塞可防止血管内皮粘附-1分子表达的IL-18上调，从而减少恶性细胞粘着。上述方法包括把治疗有效量的细胞因子-1如IL-1F7b给予有需要的病人。细胞因子-1可与上述的IL-18BP或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能衍生物或活性片段共给予。
活性蛋白质的治疗有效量是一个有很多变量的函数，包括突变蛋白的类型、突变蛋白对IL-18BP的亲和性、突变蛋白所体现的任何残余细胞毒活性、给药途径、病人的临床状况。
“治疗有效量”是指给予时，细胞因子-1如IL-1F7b导致如上所述的IL-18BP或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能衍生物或活性片段中IL-18抑制活性的增强。给予个体的剂量(作为单剂或多剂)可随各种不同因素而变化，包括给药途径、病人症状和特征(性别、年龄、体重、健康状况、体格)、病症的程度、并行的治疗、治疗的频率和所需的效果。对已建立的剂量范围进行调整和操作，以及用体外和体内的方法来测定个体中细胞因子-1的活性，都在本领域技术人员的技能之内。
在通常不表达细胞因子-1或细胞因子-1表达数量不足的细胞中，使用载体来诱导和/或增强内源性产生细胞因子-1优选IL-1F7b的方法，也在本发明构思中。载体可包括在需要表达细胞因子-1的细胞中起作用的调控序列。这种调控序列包括启动子或增强子。调控序列然后可以通过同源重组引入基因组的正确位置，这样使调控序列与需要诱导或增强表达的基因可操作地连接。该技术通常被称为“内源基因激活”(EGA)，并且在例如WO91/09955中有描述。
本领域技术人员会理解，可用同样技术关闭细胞因子-1的表达，即将负调控元件(如沉默元件)引入细胞因子-1基因座，从而导致下调或防止细胞因子-1表达。本领域技术人员会理解，这种使细胞因子-1表达的下调或沉默与用细胞因子-1抑制剂来预防和/或治疗疾病有相同效果。
所以，当需要减少例如炎症性疾病中IL-18的作用，或者抑制转移形成时，增加细胞内细胞因子-1如IL-1F7b的数量或活性是有利的。IL-18BP可与细胞因子-1如IL-1F7b共给予，用于治疗有需要的受试者。
然而，当要求增强IL-18作用例如治疗/预防肿瘤或者治疗或预防病毒性疾病的某些情况下，可能希望减少细胞因子-1如IL-1F7b的数量或降低其活性。所以，使用细胞因子-1优选IL-1F7b作为靶也在本发明构思中。
实施例实施例1IL-1F7b对刺激IFNγ产生的影响基于已报导的IL-1F7b能与IL-18Rα链结合(Pan 2001，Kumar 2002)，设计了一些实验用来评估IL-1F7b是否象IL-18一样在结合IL-18α受体后刺激细胞内产生IFNγ。以下实验采用全长分子(IL-1F7b前体)或成熟分子(成熟IL-1F7b)，它们都是在预计ICE-切割位点上使用E21为N-末端。人NKO细胞(Kim 2000)、全人血培养基、外周血单核细胞(PBMC)(用来自Preprotech的IL-121ng/ml协同刺激)(PBMC的制备见实施例8)或者KG-1细胞(用TNFα10ng/ml协同刺激)(该细胞系自ATCC Rockville，MD获得)都用100ng/ml重组IL-1F7b(前体或成熟形式，实施例5)或IL-18刺激。刺激后18小时(KG-1是48小时)在细胞的条件培养基中测量IFNγ(按照Puren(1998)的液相电化学发光(ECL)法测量)。IL-18明显地刺激IFNγ的产生(图2A)，而IL-1F7b的前体或成熟形式都不能刺激这些细胞产生IFNγ。
所以，IL-1F7b与IL18不同，与IL-18Rα链结合后不能引发IFNγ的产生，即IL-1F7b与IL-18Rα链结合不能募集IL-18Rβ链，因而无法形成具有功能活性的三元复合物。
进行实验测试IL-1F7b是否用作IL-18拮抗剂，防止IL-18与IL-18Rα链结合并最终抑制它的生物活性及1FNγ的产生。在IL-12(1ng/ml)和递增浓度的IL-1F7b前体或成熟IL-1F7b存在下用IL-18(20ng/ml)刺激人NK细胞系，并监测所产生的IFNγ。得到的结果显示IL-1F7b前体或成熟IL-1F7b没有抑制IL-18诱导产生IFNγ，即使当IL-1F7b的浓度过量IL-18高达40倍(图2B)，或者在加入IL-18前先使IL-1F7b与测试细胞预培育一段长时间也是这样。人PBMC也获得类似的结果(数据未示出)。
这些结果显示IL-1F7b既不能刺激也不能抑制IL-18诱导产生IFNγ。
实施例2IL-1F7b与IL-18受体结合的特性分析据报导，IL-18通过第三个胞外结构域结合于IL-18Rα(IL-18RαD3)(Azam 2002)。为了特性分析IL-1F7b与IL-18Rα的结合，在大肠杆菌中单个地表达IL-18Rα的第三个胞外结构域(D3)作为his6标记蛋白质，并通过Talon-亲和色谱法纯化。然后，使IL-1F7b与这样纯化的IL-18RαD3培育，并进行化学交联(实施例7)。如图3A所示，SDS-PAGE和Western blot分析揭示43kDa复合物对应于交联的IL-1F7b和IL-18RαD3。发现IL-1F7b前体或成熟IL-1F7b都与IL-18Rα交联。这些结果提示，IL-18RαD3是与IL-1F7b结合的关键，这一结构域以前已被证实对结合于IL-18是非常重要的。
在IL-18与IL-18Rα结合后，IL-18Rβ被募集并且形成一个活性三元复合物IL-18/IL18Rα/IL-18Rβ。因此，设计了以下实验来检验IL-18Rα与IL-1F7b的结合是否类似IL-18，可以引发形成三元复合物IL-1F7b/IL18Rα/IL-18Rβ。在Cos细胞内产生IL-18Rα和IL-18Rβ的胞外结构域，以确保正确的翻译后修饰，例如糖基化(Azam 2002)。IL-18、IL-18Rα和IL-18Rβ经过培育和化学交联后，在对该交联蛋白质的SDS-PAGE分析中观察到一个由IL-18Rα、IL-18Rβ和IL-18组成的高分子量复合物(图3B)。不过，与IL-18不同，当将IL-1F7b前体或成熟IL-1F7b与IL-18Rα和IL-18Rβ一起培育，观察不到这样的三元复合物(图3B)。
这些结果显示IL-1F7b与IL-18Rα结合后没有形成一个活性三元复合物，即IL-18Rβ没有被募集。
实施例3IL-1F7b与IL-18BP的结合比较IL-18和IL-1F7b的氨基酸序列。如图1所示，IL-1F7b与IL-18都有两个保守性氨基酸，后者的保守性氨基酸是E42和K89。E42和K89已被证明对IL-18的活性及结合于IL-18BP起着关键作用(Novick 1999)。因此，基于IL-1F7b和IL-18的序列相似性，研究IL-1F7b与IL-18BP结合的可能性。
在IL-18BP存在或不存在下培育IL-1F7b(前体或成熟形成，1.5μg)或者IL-18(1.5μg)，并与交联剂BS3作用(实施例7)。制备两个对照组，每组均只含有IL-18BP蛋白质，将其中一个对照组在交联剂BS3存在下培育，另一个对照组在交联剂BS3不存在下培育。还原条件下将这些蛋白质在10％SDS-PAGE上分离，硝基纤维素印迹。使用对IL-1F7b或对IL-18特异的多克隆抗体经印迹检测蛋白质。简要结果示于图4A中，检测到除了含有IL-18BP外还有IL-1F7b前体、成熟IL-1F7b或IL-18的组有新条带，但对照组没有。经过印迹鉴定到约66kDa的新条带是含有与IL-18BP交联的IL-1F7b前体，约64kDa的新条带是含有与IL-18BP交联的成熟IL-1F7b(图4A)。
还进行免疫沉淀研究，所用的IL-1F7b(10μg)或IL-18(10μg)在IL-18BP(10μg)存在或不存在下培育，并进行交联。采用对IL-18BP特异的单克隆抗体使与IL-18BP结合和交联的蛋白质共免疫沉淀。免疫复合物在SDS-PAGE上分离，硝基纤维素印迹。使用对IL-1F7b或对IL-18特异的抗体产生印迹。
在IL-18BP的共沉淀研究中发现相同的64和66kDa条带(图4B)。这些交联带64和66kDa分别表示成熟IL-1F7b/IL-18BP和IL-1F7b前体/IL-18BP的复合物。这些结果确认了IL-1F7b与IL-18BP结合。
实施例4IL-1F7b对抑制IL-18BP介导的IL-18活性的影响基于IL-1F7b与IL-18BP(见前一实施例)，可能与结合IL-18的同一个结构域结合的发现，研究IL-1F7b对抑制IL-18BP介导的IL-18活性的影响。研究的一个假设是IL-1F7b可与IL-18竞争结合于IL-18BP，因此在IL-1F7b存在下IL-18BP中和的IL-18较少。
使成熟IL-1F7b 250ng/ml或IL-1F7b前体250ng/ml与IL-18(25ng/ml)和增加浓度的IL-18BP(1.56-50ng/ml)在96孔微滴定板上培育1小时，然后与IL-12(1ng/ml)一起加入到NKO细胞(0.5×106/ml)。培育16小时后，收集上清液并监测IFNγ(参照上文引用的Puren(1998)的液相电化学发光(ECL)法测量)。
结果显示，低浓度IL-18BP时与假设相反，IL-IF7b的存在增加了IL-18BP抑制IL-18诱导产生IFNγ的能力(图5A和B)。IL-18BP为6.25ng/ml和在成熟IL-1F7b存在下，IL-18的活性从76％减至55％(活性降低21％)。IL-18BP为3.12ng/ml和在成熟IL-1F7b存在下，IL-18的活性从59％减至40％(活性降低19％)。在此试验中IL-1F7b前体的活性比成熟IL-1F7b的活性弱(图5B)。IL-1F7b的这一作用重现性很高，并且只在IL-18BP浓度低的情况下看到。用PBMC也获得类似的结果(数据未示出)。
实施例5IL-1F7b的定位从多克隆兔抗IL-1F7b血清纯化得到对IL-1F7b特异的IgG，并用来研究IL-1F7b在人PBMC中的表达。使用两个不同方法测试兔抗IL-1F7b血清和IgG制剂的特异性，所述方法采用IL-1F7b cDNA转染的RAW264.7巨噬细胞。首先，IL-1F7b抗血清特异性地识别IL-1F7b转染的RAW264.7细胞溶胞产物中的IL-1F7b(图6)。其次，通过共焦数字显微镜方法，经亲和纯化的抗IL-1F7b IgG识别转染的RAW264.7中的IL-1F7b表达，但不模拟对照细胞(未示出)。采用1μg/ml亲和纯化的多克隆兔抗人IL-1F7b-IgG使新鲜分离的人PBMC(实施例8)相对于IL-1F7b染色。以共焦激光显微镜积层观察表达IL-1F7b的人血单核细胞。发现IL-1F7b在位于质膜内表面的细胞质以及在细胞核中表达(未示出)。观察不到淋巴细胞群染色。
实施例6蛋白质的表达和纯化采用以下寡核苷酸引物从人脾文库(ClontechHLOOllB，BD BiosciencesClontech，Palo Alto，CA)克隆IL-1F7b cDNA有义引物5′GTTGAGTAATAAACTCAACG(SEQ ID NO1)，反向引物5′GTTCAATGGGGCAGTTTC(SEQ ID NO2)(对克隆AF200496有特异性(GenBank)(Kumar 2000)。用第二对引物导入切割位点(5′端为EcoRI，3′端为XbaI)再扩增IL-1F7b cDNA(有义引物5′-ATATGAATTCATGTCCTlTGTGGGGGAG(SEQ ID NO3)；反向引物5′-TATATCTAGAAGTTTCCTAATCGCTGACC(SEQ ID NO4)。按照制造商的说明，用TA-克隆将IL-1F7b cDNA转染到pGEM-T Easy(Promega Corp.Medison，WI)，并验证正确序列。然后把IL-1F7b cDNA与pPROEXTMHTa(Gibco-BRL)连接，以便用EcoRI和XbaI位点作细菌表达。pPROEXTMHTa载体含有一个N-末端Hisx6 tag，用于亲和纯化该表达蛋白。将pPROEXTMHTa/IL-IH4质粒转化为感受态大肠杆菌株DH5a(Gibco-BRL)。在含100μg/ml氨苄青霉素的200ml LB培养基中加入过夜培养的培养液(10ml)，一直培育至密度为0.6-1OD600。
通过加入异丙基硫代半乳糖苷(0.3mM)并在37℃摇动培育3小时，可诱导蛋白质表达。离心(5,000xg，15分钟，4℃)收获细菌，沉淀物悬于25ml Talon缓冲液(50mM NaH2PO4，20mM Tris-HCI，100mM NaCl，pH 8)中。先用冰上超声波降解法(4×10秒裂解)再用离心法(4,000xg，30分钟，4℃)溶解细胞。以8M尿素处理从内含体回收IL-1F7b。通过离心、对Talon缓冲液透析和加在2ml mini-Talon柱上处理消除经尿素处理后的上清液。所用的柱先用30床体积的Talon缓冲液洗涤再洗脱，洗脱液为5毫升100mM在Talon缓冲液中的咪唑。含亲和纯化的IL-1F7b的洗脱液经制备SDS-PAGE分离。凝胶以考马斯蓝(Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA)染色，切除含IL-IH4的条带。按照标准方案(Rockland Inc.Gilbertsville，AP)采用含IL-1F7b的凝胶在兔中产生多克隆血清。按照已有技术(Kumar 2002)，在大肠杆菌中产生全长(前体)和成熟IL-1F7b(N-末端E21)，用于生物分析和交联研究。
实施例7蛋白质的交联将纯化蛋白质与30μl PBS混合，冰上培育2小时。
然后，在1mM终浓度中加入BS3(二(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯)(Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL)，混合物室温培育1小时。加入Tris-CI，pH 7.4，(20mM终浓度)使反应淬灭。沸腾5分钟后，还原条件(50mM DTT)下用10％SDS-PAGE分离蛋白质，硝基纤维素印迹。利用针对人IL-18BP、IL-1F7b或IL-18的兔抗血清(稀释1∶500)检测交联蛋白质。
实施例8PBMC的分离从除去血小板的剩余白细胞或者从健康供者的肝素化血液纯化得到PBMC。除去血小板的白细胞或全血用盐水以1∶1稀释，按照已有技术(Kim2001)施加于Ficoll-Histopaque梯度(Sigma)。离心后从界面收获细胞，用盐水洗三次，重悬于RPMI。将分离出来的PBMC冰上保存直至开始进行试验。
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权利要求
1.一种细胞因子-1或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段在制备治疗或预防因诱导细胞因子-2受体而引起或加重的疾病的药物中的应用，其中所述细胞因子-1能够结合IL-18BP或其突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段，和能够抑制所述细胞因子-2受体，该细胞因子-2是IL-1家族成员。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞因子-1属于IL-1家族。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞因子-1是IL-1F7b。
4.根据权利要求1至3中任何一项所述的应用，其特征在于，所述细胞因子-2受体是IL-18R。
5.根据权利要求1至4中任何一项所述的应用，其特征在于，所述细胞因子-1的抑制涉及细胞因子-1与细胞因子-2受体的信号传导链的结合。
6.根据权利要求1至5中任何一项所述的应用，其特征在于，用于治疗或预防炎症性疾病，其选自内毒素致死性(脓毒症)、毒素或激活T细胞或丙肝引起的肝损伤、关节炎、肺损伤、牛皮癣、炎症性肠病、脑损伤、缺血性损伤、心功能不全和神经炎。
7.根据权利要求1至5中任何一项所述的应用，其特征在于，用于治疗或预防转移形成。
8.根据权利要求1至7中任何一项所述的应用，其特征在于，所述药物还含有IL-18BP或其突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段。
9.根据上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于，所述细胞因子-1可全身、皮下和/或肌内给予。
10.一种包含细胞因子-1或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段的编码序列的载体在制备治疗或预防因诱导细胞因子-2受体而引起或加重的疾病的药物中的应用，其中所述细胞因子-1能够结合IL-18BP或其突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段，和能够抑制所述细胞因子-2受体，该细胞因子-2是IL-1家族成员。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述细胞因子-1属于IL-1家族。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述细胞因子-1是IL-1F7b。
13.根据权利要求10至12中任何一项所述的应用，其特征在于，所述细胞因子-2受体是IL-18R。
14.根据权利要求10至13中任何一项所述的应用，其特征在于，所述细胞因子-1的抑制涉及细胞因子-1与细胞因子-2受体的信号传导链的结合。
15.根据权利要求10至14中任何一项所述的应用，其特征在于，用于治疗或预防炎症性疾病，其选自内毒素致死性(脓毒症)、毒素或激活T细胞或丙肝引起的肝损伤、关节炎、肺损伤、牛皮癣、炎症性肠病、脑损伤、缺血性损伤、心功能不全和神经炎。
16.根据权利要求10至14中任何一项所述的应用，其特征在于，用于治疗或预防转移形成。
17.根据权利要求10至16中任何一项所述的应用，其特征在于，所述药物还含有IL-18BP或其突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段。
18.根据上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于，所述编码细胞因子-1的载体可全身、皮下和/或肌内给予。
19.一种内源基因激活细胞因子-1的载体在治疗或预防因诱导细胞因子-2受体而引起或加重的疾病中的应用，其中所述细胞因子-1能够结合IL-18BP或其突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段，和能够抑制所述细胞因子-2受体，该细胞因子-2是IL-1家族成员。
20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述细胞因子-1属于IL-1家族。
21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述细胞因子-1是IL-1F7b。
22.根据权利要求19至21中任何一项所述的应用，其特征在于，所述细胞因子-2受体是IL-18R。
23.根据权利要求19至22中任何一项所述的应用，其特征在于，所述细胞因子-1的抑制涉及细胞因子-1与细胞因子-2受体的信号传导链的结合。
24.根据权利要求19至23中任何一项所述的应用，其特征在于，用于治疗或预防炎症性疾病，其选自内毒素致死性(脓毒症)、毒素或激活T细胞或丙肝引起的肝损伤、关节炎、肺损伤、牛皮癣、炎症性肠病、脑损伤、缺血性损伤、心功能不全和神经炎。
25.根据权利要求19至23中任何一项所述的应用，其特征在于，用于治疗或预防转移形成。
26.根据权利要求19至25中任何一项所述的应用，其特征在于，所述药物还含有IL-18BP或其突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段。
27.根据上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于，所述编码细胞因子-1的载体可全身、皮下和/或肌内给予。
28.一种细胞因子-1或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段的抑制剂在治疗或预防因诱导细胞因子-2受体可预防或减缓的疾病中的应用，其中所述细胞因子-1能够结合IL-18BP或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、或片段，和能够抑制所述细胞因子-2受体，该细胞因子-2是IL-1家族成员。
29.根据权利要求28所述细胞因子-1的抑制剂的应用，其特征在于，所述细胞因子-1属于IL-1家族。
30.根据权利要求29所述细胞因子-1的抑制剂的应用，其特征在于，所述细胞因子-1是IL-1F7b。
31.根据权利要求28至30中任何一项所述细胞因子-1的抑制剂的应用，其特征在于，所述细胞因子-2受体是IL-18R。
32.根据权利要求28至31中任何一项所述细胞因子-1的抑制剂的应用，其特征在于，所述细胞因子-1的抑制涉及细胞因子-1与细胞因子-2受体的信号传导链的结合。
33.根据权利要求28至32中任何一项所述细胞因子-1的抑制剂的应用，其特征在于，用于治疗或预防病毒性疾病。
34.根据权利要求28至32中任何一项所述的应用，其特征在于，用于治疗或预防癌症。
全文摘要
本发明涉及一种细胞因子－1或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段在制备治疗或预防因诱导所述细胞因子－2受体而引起或加重的疾病的药物中的应用，其中所述细胞因子－1优选来自IL－1家族，更好是IL－1F7b，能够结合IL－18BP或其突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段，和能够抑制细胞因子－2受体，该细胞因子－2是IL－1家族成员，优选IL－18。
文档编号C07K1/00GK1909926SQ200380104894
公开日2007年2月7日 申请日期2003年10月3日 优先权日2002年10月8日
发明者C·A·迪纳洛, 金修铉, P·布弗勒 申请人:阿雷斯贸易股份有限公司