专利名称：改变植物贮藏储备物含量的方法
技术领域：
本发明涉及通过使用表达豆血红蛋白和/或血红蛋白的经转化植物而改变植物贮藏储备物含量的方法、涉及对应植物并涉及它们的用途。
植物中的贮藏储备物充当储备物质，由植物组织形成，并沉积于胞内。贮藏储备物的实例是多糖(碳水化合物如地衣淀粉、淀粉、糖原、多聚果糖)、蛋白质、脂肪、多磷酸盐和多羟基链烷酸酯。如果需要，贮藏储备物可返回至新陈代谢和高能物质(energetics)，例如当缺乏营养时、在种子萌芽、生长和其它消耗能量的过程期间。
贮藏储备物是有价值的营养原料(谷类、坚果、水果、香料等)，构成许多人类食物的基础，并且也可提供工业脂肪和油类。由于其药理活性成分，一些贮藏储备物当作药物使用(来源CD Rmpp Chemie Lexikon-Version 1.0，Stuttgart/New YorkGeorg Thieme Verlag 1995)。
为了工业目的，贮藏储备物也日益用于可更新和生态上可接受的原料，例如通过使用淀粉而产生包装材料，或例如使用植物油作为燃料，如作为生物柴油(biodiesel)或润滑剂。
公知的植物次级代谢产物(也见新陈代谢)(例如色素、毒素、精油、生物碱、果酸)通常不属于贮藏储备物(来源Rmpp Lexikon Chemie-Version 2.0，Stuttgart/New YorkGeorg Thieme Verlag 1999“Reservestoffe”[贮藏物质])。
在植物中，贮藏储备物由种子或贮藏器官中的碳水化合物前体形成。蔗糖是碳和能量的主要来源，由叶输送至生长中的种子或贮藏器官。叶中的蔗糖从由光合作用获得的淀粉而形成。输送至生长中的种子的蔗糖不仅用于合成贮藏脂类的脂肪酸，而且合成贮藏蛋白质和贮藏淀粉。
例如，种子包含总共三个不同形式的贮藏储备物贮藏脂类、贮藏蛋白质和淀粉。三种贮藏储备物之间的比例根据植物的不同而有所改变。因此，例如，根据干物质，油料种子油菜(oilseed rape)品种包含约48％贮藏脂类、19％淀粉和21％贮藏蛋白质，而大豆包含22％脂类，12％淀粉和37％蛋白质(Biochemistry & Molecular Biology of the Plant，Buchanan，Gruissem，Jones编辑，2000，American Society of Plant Physiologists)。
从植物油(脂类)中获得的脂肪酸是特别令人感兴趣的。例如，它们可用于增塑剂、润滑剂、表面活性剂、化妆品等的原料，或者用于食品和饲料工业中的有价值原料。因此，既然有生产表面活性剂的特殊需要，例如，提供具有中链脂肪酸的菜籽油是特别有益的。
借助于重组方法，植物代谢途径的靶向调整可允许植物的新陈代谢有利地以某种方式得到改变，其中不管怎样，如果采用传统养育方法，这种方式仅可通过艰苦的步骤得到实现。因此，例如，稀有脂肪酸例如某些多不饱和脂肪酸仅在某些植物中合成或从不合成，并因此通过在转基因植物中表达所讨论的酶(例如Millar等，(2000)Trends Plant Sci 595-101)而以靶向的方式产生。
作为贮藏储备物，淀粉不仅贮藏于种子中，也贮藏于其它贮藏器官中。淀粉的重要贮藏器官是下胚轴和根。薄壁组织皮质细胞的增加和扩大产生块根，如马铃薯块茎；根颈的膨胀产生块根作物，如甜菜或薯蓣。
因此，例如淀粉是马铃薯干物质的主要成分。除了用作粮食外，因此马铃薯也用作饲料和获得淀粉和醇的原料。1988年，全球收获2.697亿吨马铃薯(来源CD Rmpp Chemie Lexikon-Version 1.0，Stuttgart/NewYorkGeorg Thieme Verlag 1995)。
专利US6,372,961、WO98/12913和WO00/00597描述了使用血红蛋白或结构上相关的蛋白质(肌红蛋白、细菌血红蛋白)以增加植物中氧气的同化作用。这旨在提高对应转基因植物的萌芽或高能物质，以及甚至在低氧条件下保证正常生长。也认为产生的次级代谢产物的量得到增加((WO 98/12913，第6页第24行)。贮藏储备物的产量增加在这些公开中并不明显。
因此，本发明的目的是增加植物贮藏器官中的贮藏储备物的含量，以实现较好地利用栽培、肥料等的区域，并且依靠植物获得更高的产量。特别地，用于提高或使生产淀粉或油成为可能。
根据本发明改变植物贮藏储备物含量的方法，通过采用表达豆血红蛋白的经转化植物，可实现本目的。通过表达豆血红蛋白的经转化植物和它们的应用，也可实现本目的。
令人惊讶的是，发现通过表达豆血红蛋白，可产生包含贮藏储备物的经转化植物，其中由于它们(更高的)的贮藏储备物含量，这些植物可更好地使用栽培、肥料等的区域，以及因此获得更高产量的贮藏储备物，特别是淀粉和油。因此，根据本发明，使用这些植物而在经济上获利是可能的。
豆血红蛋白属于血红蛋白蛋白质家族，其功能是氧气的可逆结合和供给。它起源于豆类植物(豆科植物)的根瘤，并且以红色物质的形式存在，其可得到分离，并与脊椎动物的肌红蛋白类似。与O2可逆结合的结果是，当根瘤菌固定氮时，豆血红蛋白可保证高氧需求。由植物细胞形成脱辅基蛋白质和由细菌形成血红素(来源CD Rmpp Chemie Lexikon-Version1.0，Stuttgart/New YorkGeorg Thieme Verlag 1995)。
在本发明进一步优选的形式中，根据本发明改变植物贮藏储备物含量的方法中，采用表达血红蛋白或豆血红蛋白的经转化植物。因此，本发明也涉及表达豆血红蛋白和/或血红蛋白的经转化植物和它们的应用。
根据本发明，将血红蛋白理解为原卟啉的铁(II)复合体。
在本申请中，表达理解为将起始DNA或RNA的遗传信息转移至基因产物(多肽或蛋白质，在本文中是豆血红蛋白或血红蛋白)，并且也意指包含术语过量表达，以便以更高的量产生外源蛋白质或天然存在的蛋白质，或在宿主细胞的总蛋白质含量中占大部分，其中的过量表达意为表达增加。
转化理解为将遗传信息转移至生物体，特别是植物。这意味着包括引入所有对熟练工作人员所公知信息的方法，例如显微注射、电穿孔、粒子轰击、农杆菌或化学介导的摄入(例如聚乙二醇介导的DNA摄入、或通过碳酸硅纤维技术)。遗传信息可引入细胞，例如以DNA、RNA、质粒或以任何其它方式，并且以通过重组掺入宿主基因组的方式，或以游离形态或独立地作为质粒存在。为了本发明的目的，因此转化植物是经遗传修饰的植物。
贮藏储备物理解为多糖，优选的是碳水化合物、蛋白质、脂肪、多磷酸盐和多羟基链烷酸酯，特别优选的是地衣淀粉、淀粉、糖原、多聚果糖。
在所提到的化合物中，碳水化合物和脂肪是非常特别地优选的。最优选的为贮藏储备物是淀粉和油。
淀粉是熟练工作人员所公知的，对进一步的信息，可参考RmppChemie Lexikon-CD Version 2.0，Stuttgart/New YorkGeorg ThiemeVerlag 1999。
对于本发明的目的，“油”包含中性和/或极性脂类以及这些的混合物。表1中提到的那些以实例的方式给出，而不用于限制。
表1植物脂类的分类
中性脂类优选地表示三酰甘油。不但中性脂类而且极性脂类也包含广谱的不同脂肪酸。表2中提到的脂肪酸以实例的方式给出，而不是用于限制。
表2多种脂肪酸的概述(选择)1链长度双键数目*植物中非天然存在的
对于进一步的信息，也可参考Rmpp Chemie Lexikon-CD Version2.0，Stuttgart/New YorkGeorg Thieme Verlag 1999。
根据本发明，所有植物适于执行根据本发明的方法。
“植物”包含所有一年生和多年生的单子叶和双子叶植物，并且以举例而非限制的方式包括南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、核桃属(Juglans)、草霉属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食豆属(Onobrychis)、车轴草属(Trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼佗罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)，太阳花属(Solarium)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、马郁兰属(Majorana)、菊苣属(Cichorium)，向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、稷属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛莨属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、Browaalia、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、玉米属(Zea)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、小麦属(Triticum)、高粱属(Sorghum)、云杉属(Picea)及杨属(Populus)。
优选的植物来自于下述科的植物苋科(Amaranthaceae)、菊科(Asteraceae)、芸苔科(Brassicaceae)、石竹科(Carophyllaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Compositae)、十字花科(Cruciferae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、唇形科(Labiatae)、豆科(Leguminosae)、蝶形花业科(Papilionoideae)、百合科(Liliaceae)、亚麻科(Linaceae)、锦葵科(Malvaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、茄科(Solanaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、番杏科(Tetragoniaceae)、山茶科(Theaceae)、伞形科(Umbelliferae)。
特别地，优选的单子叶植物从单子叶作物植物选择，如，禾本科(Graminae)如水稻、玉米、小麦、或其它谷类物种如大麦、小米和高梁、黑麦、黑小麦或燕麦，或甘蔗以及所有种类的草。本发明非常特别地更适宜应用于双子叶植物生物体。特别地，优选的双子叶植物从双子叶作物植物中选择，如，-菊科如向日葵、万寿菊属或金盏草等。
-菊科，尤其是莴苣属(Lactuca)，非常尤其是莴苣(Lactuca sativa)等。
-十字花科，尤其是芸苔属，非常特别的是欧洲油菜(Brassica napus)(油菜籽)、芸苔(Brassica campestris)(甜菜)、Brassica oleracea cv Tastie(甘蓝)、Brassica oleracea cv Snowball Y(花椰菜)和Brassica oleracea cvEmperor(嫩茎花椰菜)和其它甘蓝；以及拟南芥属，非常特别的是拟南芥菜和水芹或卡诺拉油菜(Canola)等。
-葫芦科，如甜瓜、南瓜或胡瓜等。
-豆科，特别是大豆属(Glycine)，非常特别的是Glycine max(大豆)、黄豆和苜蓿、豌豆、黄豆或花生等。
-茜草科，优选的是唇形亚纲(Lamiidae)，如小果咖啡(Coffeaarabica)或大果咖啡(Coffea liberica)等。
-茄科，特别是番茄属(Lycopersicon)，非常特别的是Lycopersiconesculentum(番茄)；茄属(Solanum)，非常特别的是Solanum tuberosum(马铃薯)和Solanum melongena(茄)、以及烟草或红辣椒等。
-梧桐科，优选的是五桠果亚纲(Dilleniidae)，如可可树等。
-山茶科，优选的是五桠果亚纲，如茶(Camellia sinensis或Theasinensis)等。
-伞形科，特别是胡萝卜属(非常特别的是胡萝卜)和芹菜(非常特别的是graveolens dulce(芹菜))等；和辣椒属，非常特别的是辣椒属(胡椒)等。
以及亚麻子、大豆、棉花、大麻、亚麻、黄瓜、菠菜、胡萝卜、甜菜和多种树、坚果和葡萄树物种，特别是香蕉和猕猴桃。
也包括装饰性植物、有用的或装饰性的树、花、切花、灌木或草皮。通过实例而不限制的所提到植物是被子植物、苔藓植物，例如苔类(苔类)和藓纲(苔藓)，蕨类植物如蕨、马尾和石松，裸子植物如针叶树、苏铁科植物、银杏和Gnetalae，蔷薇科(Rosaceae)如玫瑰，杜鹃花科(Ericaceae)如杜鹃花及azaleas，大戟属(Euphorbiaceae)如猩猩木及巴豆，石竹科(Caryophyllaceae)如康乃馨，茄科(Solanaceae)如牵牛花，苦苣台科(Gesneriaceae)如非洲堇、凤仙花科(Balsaminaceae)如勿碰我，兰科(Orchidaceae)如兰花，鸢尾科(Iridaceae)如洋葱(gladioli)、鸢尾、小苍兰及番红花，菊科(Compositae)如金盏草、牻牛儿苗科(Geraniaceae)如天竺葵，百合科(Liliaceae)如龙血树，桑科(Moraceae)如无花果，天南星科(Araceae)如喜林芋属(philodendron)等。
此外，为本发明之目的的植物生物体是更多具有光合作用活性的生物体，如藻类、蓝藻类细菌和苔藓。优选的藻类是绿藻如红球藻属(Haematococcus)、三角褐指藻(Phaedactylum tricornatum)、团藻(Volvox)或杜氏藻(Dunaliella)。特别优选的藻类是集胞藻属(Synechocystis)。
最优选的是油料植物，即已经具有天然高油含量和/或用于工业产油的植物。这些植物具有高油含量和/或具有工业利益的特定脂肪酸组分。优选的植物具有至少1％的脂类含量。油料植物包含例如Borago officinalis(琉璃苣)；芸苔属如芸苔、欧洲油菜、芫青(B.Rapa)(芥菜或油料种子油菜)；Cannabis sativa(大麻)；Carthamus tinctorius(红花)；Cocos nucifera(椰子)；Crambe abyssinica(海甘蓝)；萼距花属(Cuphea)(萼距花属物种提供中等链长脂肪酸，特别是用于工业应用)；Elaeis guinensis(非洲油棕)；Elaeis oleifera(美洲油棕)；Glycine max(大豆)；Gossypium hirsutum(美洲棉花)；Gossypium barbadense(埃及棉花)；Gossypium herbaceum(亚洲棉花)；Helianthus annuus(向日葵)；Linum usitatissimum(亚麻子或亚麻)；Oenothera biennis(月见草)；Olea europea(橄榄)；Oryza sativa(稻)；Ricinus communis(蓖麻)；Sesamum indicum(芝麻)；Glycine max(大豆)；小麦属物种(小麦)；Zea mays(玉米)和多种坚果物种如胡桃或杏仁。
如果使用的植物属于豆科属(豆类植物)的植物，本发明的范围包括外源蛋白质(豆血红蛋白、血红蛋白)即如共生生物一样非天然存在的血红蛋白和/或豆血红蛋白的表达，或以过量表达天然存在的豆血红蛋白的这种方式而修饰的植物。
最优选的是马铃薯、拟南芥和油料种子油菜。
上述植物有利地表达的豆血红蛋白和/或血红蛋白选自植物黄羽扇豆(Lupinus luteus)(LGB1_LUPLU，LGB2_LUPLU)、大豆(LGBA_SOYBN、LGB2_SOYBN、LGB3_SOYBN)、紫苜蓿(Medicagosativa)(LGB1-4_MEDSA)、Medicago trunculata(LGB1_MEDTR)、菜豆(Phaseolus vulgaris)(LGB1_PHAVU、LGB2_PHAVU)、蚕豆(Viciafaba)(LGB1_VICFA，LGB2_VICFA)、豌豆(Pisum sativum)(LGB1_PEA、LGB2_PEA)、豇豆(Vigna unguiculata)(LGB1_VIGUN)、日本百脉根(Lotus japonicus)(LGB_LOTJA)、四稜豆(Psophocarpus tetragonolobus)(LGB_PSOTE)、狗尾草(Sesbania rostrata)(LGB1_SESRO)、粗枝木麻黄(Casuarina glauca)(HBPA_CASGL)和Canvalaria lineata(HBP_CANLI)、Physcomitrella patens(HBL0_PHYPA)、拟南芥菜(HBL1_ARATH，HBL2_ARATH)、陆地棉(Gossypium hirsutum)(HBL1_GOSHI、HBL2_GOSHI)、紫苜蓿(Medicago sativa)(HBL1_MEDSA)、稻(Oryza sativa)(HBL1_ORYSA、HBL2_ORYSA、HBL3_ORYSA、HBL4_ORYSA)、欧洲油菜(Brassica napus)(HBL2_BRANA)、食用番茄(Lycopersicon esculentum)(HBL2_LYCES)、大麦(Hordeum vulgare)(HBL_HORVU)、玉米(Zea mays)(HBL_MAIZE)、Trema tomentosa(HBL_TRETO)、木麻黄(Casuarinaglauca)(HBP1_CASGL、HBP2_CASGL、HBPA_CASGL)、Parasponiarigida(HBPL_PARAD)的豆血红蛋白和/或血红蛋白。在括号内显示的是每一所述蛋白在Swiss-Prot数据库登录号。
特别有利的植物是那些包含编码豆血红蛋白的序列号1和/或编码血红蛋白的序列号3和/或5的植物。优选地采用来源于日本百脉根的豆血红蛋白和/或血红蛋白。现在，转化植物产生贮藏储备物的量增加。
为产生贮藏储备物，本发明也包括表达如序列号1所示豆血红蛋白和/或如序列号3和5所示血红蛋白的植物。
本发明优选的改变形式是采用以贮藏器官特异的方式表达豆血红蛋白和/或血红蛋白的植物的形式。
作为规则，上述植物在特异器官中沉积贮藏储备物。实例是鳞茎、块茎、种子、核、坚果、叶等。对于本发明的目的，贮藏器官也可理解为是指果实。果实是作为营养组织包围种子的植物器官的总称。不但要提到可食用的果实，特别是“果实”，而且要提到豆类、谷类、坚果、香料和药剂用药物(apothecary drugs)(参见fructus、种子)。当然，贮藏储备物的贮藏也出现于所有植物中。
豆血红蛋白和/或血红蛋白优选地以块茎特异或种子特异的方式得到表达。
适合的植物是所有上面提到的那些。下述植物是优选的马铃薯、拟南芥菜、油料种子油菜、大豆、花生、玉米、木薯、薯蓣、水稻、向日葵、黑麦、大麦、蛇麻草、燕麦、硬粒小麦和aestivum小麦、羽扇豆、豌豆、三叶草、甜菜、甘蓝、藤本植物等，它们可在Saatgutverkehrsgesetz的品种列表的导则中找到[German seed trading act](Blatt für PMZ[officialgazette for patents and trademark law]1986，p.3，last modified in Blatt fürPMZ 2002，p.68)。
特别优选的是产生块茎的植物，尤其是马铃薯植物，或产生种子的植物，特别是拟南芥菜、油料种子油菜或大豆。
例如通过使用组织特异启动子，可实现组织特异的表达。例如，此类组织特异的表达例如见US6,372,961 B1，第11卷第44行以及下列等等。
此外，本发明涉及如序列号1所示的核苷酸序列、对应的基因结构或载体、以及它们在本发明植物中转化的应用，其中所述的核苷酸序列编码植物使用的豆血红蛋白。
特别地，本发明也包括编码豆血红蛋白的下述核苷酸序列的用途，其序列与序列号1的同一性约70％，优选地是80％，特别优选地是85％、90％，尤其是91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
此外，本发明涉及如序列号3和5所示的核苷酸序列，和对应的基因结构或载体，以及它们在转化植物中的应用，其中所述的核苷酸序列编码植物使用的血红蛋白。尤其是，本发明也包括编码血红蛋白的下述核苷酸序列的用途，所述核苷酸序列与序列3和5的同一性约70％，优选地是80％，特别优选的是85％、90％，尤其是91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
术语“核苷酸序列”理解为所有的以下核苷酸序列，其序列(i)完全与所示序列相符；或(ii)在遗传密码简并性的限制下，包含至少一个与所示序列相符的核苷酸序列；或(iii)包含至少一个与核苷酸序列(i)或(ii)互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；并且，如果适当，(iiii)在(i)中包含功能中性的有意突变。在本文中，术语“功能中性的有意突变”表示化学上类似的氨基酸的替换，如以丙氨酸替换甘氨酸或以苏氨酸替换丝氨酸。
根据本发明，也包括的是编码区(结构基因)之前(5’或上游)和/或之后(3’或下游)的序列区。尤其是，这包括具有调节功能的序列区。它们可影响转录、RNA稳定性、RNA加工和翻译。调节序列的实例尤其是启动子、增强子、操纵子、终止子或翻译增强子。
所讨论的蛋白质(豆血红蛋白和/或血红蛋白)也包括同工型，其中所述的同工型可理解为具有相同或可比较的功能，但具有不同的一级结构。
根据本发明，经修饰的形式理解为在序列中包含修饰的蛋白质，例如在多肽的N-和/或C-末端，或在保守氨基酸的区域，然而，不会不利地影响蛋白质的功能。通过公知的方法，以氨基酸替换的形式可实现这些修饰。
参考下述实验，详细描述了本发明。
实施例1.模型生物利用马铃薯和拟南芥菜作为实验的模型生物。这两种植物物种代表高等植物(种子植物)的成员。由于它们的DNA序列或多肽序列的高度同源性，可利用它们作为其它植物物种的模型植物。
2.一般方法a)马铃薯或拟南芥植物的栽培拟南芥植物在添加有0.5％蔗糖的Murashige-Skoog培养基(Ogas等，1997 Science 27791-94)或堆肥(Focks & Benning，1998 Plant Physiology11891-101)上生长。为获得一致的萌芽和开花时间，首先将种子覆盖，或撒在堆肥上，然后在4℃保存2天。开花后，标记豆荚。然后，根据标记，在开花后6-20天收获豆荚。马铃薯植物按Dietze等，1995(基因转移至植物，Potrykus和Spangenberg主编，Springer实验室手册，柏林，海德尔堡，24-29)所述生长。
b)从植物中分离总RNA和poly-A+RNA为产生表达构建体，分离RNA和poly-A+RNA。从拟南芥豆荚或马铃薯块茎或日本百脉根的根中分离RNA，如说明书中所述，按以下步骤实施收获6-40天的植物材料，并在液氮中快速冰冻。材料贮藏于-80℃直至进一步的使用。在冷却的研钵中将75mg材料研磨成细粉，并用200μlAmbion RNAqueos试剂盒的裂解缓冲液处理。然后，按照制造商的说明书分离总RNA。用50μl洗脱缓冲液(Ambion)洗脱RNA，并使用光度计(Eppendorf)，在260nm以1∶100稀释溶液的吸光度为基础测定其浓度。40μg/ml RNA相当于吸光度为1。使用无RNAse水，将RNA溶液的浓度调整至1μg/μl。通过琼脂糖电泳检验其浓度。
为分离polyA+RNA，按照制造商的说明书使用Amersham Pharmacia的oligo(dT)纤维素。RNA和polyA+RNA贮藏于-70℃。
3.cDNA文库的构建为从日本百脉根和拟南芥菜RNA中构建cDNA文库，使用小鼠白血病病毒的逆转录酶(Clontech)和Oligo-d(T)引物实现第一链的合成，而通过与DNA聚合酶I、Klenow酶孵育，并利用RNAse H在12℃(2小时)、16℃(1小时)和22℃(1小时)切割，实现第二链的合成。通过在65℃孵育(10分钟)终止反应，随后转移至冰上。使用T4 DNA聚合酶(Roche，Mannheim)在37℃(30分钟)使双链DNA成为平端。通过酚/氯仿抽提和Sephadex G50离心柱移去核苷酸。利用T4 DNA连接酶，将EcoR I/NotI接头(Pharmacia，Freiburg，德国)连接至cDNA末端(Roche，12℃过夜)，使用Not I再切割，并通过与多核苷酸激酶孵育(Roche，37℃，30分钟)进行磷酸化。该混合物在低熔点琼脂糖凝胶上经过分离。使用制造商的材料，并按照它们的说明书，超过200碱基对的DNA分子从凝胶中洗脱、酚抽提、在Elutip D柱(Schleicher und Schüll，Dassel，德国)上浓缩、并连接至克隆载体pSPORT1(Invitrogen，Karlsruhe)。
4.DNA测序和计算机分析通过标准方法，尤其是使用ABI PRISM Big Dye Terminator CycleSequencing Ready Reaction试剂盒(Perkin-Elmer，Weiterstadt，德国)，通过链终止方法，将部分2中所述的cDNA文库用于DNA测序。通过体内大批切除和在琼脂平板上再转化DH5α，获得从cDNA文库中制备的预备质粒后，进行随机单克隆的测序(材料和说明书的细节来自Stratagene，Amsterdam，the Netherlands)。按照制造商的说明书，利用Qiagen DNA制备机器人从大肠杆菌(E.coli)的过夜培养物中制备质粒DNA，其中所述的大肠杆菌在添加氨苄青霉素的Luria肉汤中生长(见Sambrook等.(1989)(Cold Spring Harbor实验室出版社ISBN 0-87969-309-6))。
使用在商业上从Bio-Max(慕尼黑，德国)获得的标准软件包EST-MAX，对序列进行处理和注释。使用比较算法和序列查询，借助于BLAST程序执行同源基因的搜寻(Altschul等，(1997)“缺口BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白质数据库查询程序”，Nucleic Acids Res.253389-3402)。
5.在马铃薯中块茎特异性表达和在拟南芥中种子特异性表达的表达构建体的产生a)块茎特异性表达使用Not I和Kpn I从载体pSportI上切除豆血红蛋白基因Lljlb，通过与Klenow酶孵育使Not I切割位点平端化。为连接至载体pART33，将后者用BamH I消化，然后通过与Klenow酶孵育使切割位点平端化，随后将产物用Kpn I消化。pART33已经包含块茎特异表达的B33启动子(1459bp，Liu XJ，Prat S，Willmitzer L，Frommer WB(1990)，顺式调节元件指导嵌合型I类patatin启动子/GUS-基因融合产物的块茎特异性和蔗糖诱导的表达，Mol Gen Genet.223(3)401-6)和OCS终止子(766bp)。使用Not I从pART33切除全部构建体，并克隆至植物转化载体pART27。
b)种子特异性表达从载体pART33中将豆血红蛋白基因Lljlb再克隆至载体pBINUSP。为了这一目的，首先用Asp718I消化构建体pART33-LegHb，并用Klenow片段使突出端平端化。此后，用XbaI消化线性构建体，并将因此获得的基因在4℃过夜连接至XbaI/SmaI切割的pBINUSP。
从载体pART33中将血红蛋白基因1AtHb1再克隆至载体pBINUSP。为了这一目的，首先用Asp718I消化构建体pART33-AtHb1，并用Klenow片段使突出端平端化。此后，用XbaI消化线性构建体，并将因此获得的基因在4℃过夜连接至XbaI/SmaI切割的pBINUSP。
从载体pART33中将血红蛋白基因2AtHb2再克隆至载体pBINUSP。为了这一目的，首先用Asp718I消化构建体pART33-AtHb2，并用Klenow片段使突出端平端化。此后，用XbaI消化线性构建体，并将因此获得的基因在4℃过夜连接至XbaI/SmaI切割的pBINUSP。
6.植物转化质粒双元载体如pBIN可用于转化植物(Bevan，M.，Nucleic Acids Res.12(1984)，8711-8721)。通过将cDNA以有意或反义方向连接至T-DNA，可构建双元载体。cDNA5’端的植物启动子激活cDNA的转录。聚腺苷酸化序列位于cDNA的3’端。
使用组织特异性表达启动子，可实现组织特异性表达。例如，通过克隆cDNA5’端的napin或LeB4或USP启动子，可实现种子特异性表达。也可使用任何其它种子特异性启动子元件。CaMV 35S启动子可用于实现完整植物中的组成型表达。
7.农杆菌转化和植物转化例如使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101株(pMP90)(Konez和Schell，Mol.Gen.Genet.204(1986)383-396)或LBA4404(Clontech)，可实施农杆菌介导的植物转化。使用熟练工作人员所熟悉的标准转化技术，可转化细菌(Deblaere等，Nucl.Acids.Tes.13(1984)，4777-4788)。
通过熟练工作人员所公知的标准转化和再生技术(Gelvin、Stanton B、Schilperoort、Robert A，植物分子生物学手册，第二版，DordrechtKluwer学院出版社，1995，in Sect.，Ringbuch Zentrale SignaturBT11-P ISBN0-7923-2731-4；Glick，Bernard R.，Thompson，John E，植物分子生物学和生物技术方法，Boca RatonCRC出版社，1993，360 S.，ISBN0-8493-5164-2)，同样可实施农杆菌介导的植物自身转化。
通过Bechthold等，1993(C.R.Acad.Sci.Ser.III Sci.Vie.，316，1194-1199)的方法，借助农杆菌可实施拟南芥菜的转化。对该方法进行了改变，未采用真空浸润。
对于转化，将拟南芥菜Col0种子播种于潮湿的堆肥上，于4℃保存2天，并在短日照条件下(8小时光照，21℃)生长4-6周。为诱导开花，然后将植物转移至长日照条件(16小时光照，21℃)。约10天后，花序已足够大，可以浸没。花序浸没在MS溶液(Murashige和Skoog，见下文)pH5.7、5％蔗糖、44μM苄氨基嘌呤(Sigma)和0.03％Silwet L-77(LehleSeeds，USA)的农杆菌悬液中。农杆菌悬液在600nm的光密度应为0.8。细菌之前在YEB培养基(0.5％细菌用胰蛋白胨、0.5％细菌用蛋白胨、0.1％酵母抽提物、0.5％蔗糖和2mM MgCl2)中生长。
植物浸没后，将后者继续再润湿约3周。然后，终止灌溉，使植物干燥以获得种子。将获得的种子种于含MS溶液，pH5.7、50μg卡那霉素、250μg特美汀和0.8％琼脂的平板上。分别挑出抗性苗，种于堆肥中。
通过Dietze等，在Gene transfer to plants(I.Potrykus和G.Spangenberg编辑，Springer Lab Manual，1995，24-29页)一书中的方法，实施马铃薯(Solanum tuberosum L.)的转化。使用的起始材料是培育品种Desiree。
对于转化，将5-6片马铃薯品种Desiree的无菌苗培养物的叶在10ml添加2％蔗糖的2MS溶液(Murashige and Skoog的标准MS培养基，(1962)对烟草组织培养物迅速生长和生物合成的改良培养基，Physiol.Plant.，15，473-497)中仔细地平衡。从叶的中央静脉横向切下长度为1-2mm的切片，并置于新鲜的2MS培养基。将50μl已用T质粒pART27-JpLeg转化的农杆菌溶液加入该新鲜培养基。将农杆菌溶液分散在叶片上，并在暗处将平板在22-24℃孵育2天。2天后，将叶节转移至CIM培养基(添加1.5％葡萄糖、5mg/l NAA、0.1mg/l BAP、250mg/l头孢噻肟和50mg/l卡那霉素或潮霉素的MS培养基)，并孵育7天。然后将叶片转移至SIM培养基(添加2mg/l玉米素、0.02mg/l NAA、0.02mg/l GA3、250mg/l头孢噻肟和50mg/l卡那霉素或潮霉素的MS培养基)。1-2周后，然后可切下所得到的转基因苗(长度为1-1.5cm)，并转移至RIM培养基(添加250mg/l头孢噻肟的MS培养基)。3-4周后，苗已形成叶和根，并且可挑出植物种于堆肥中。
根据本发明，对每种所采用的叶，可获得2-3个独立的转基因品系。
例如Freeling和Walbot，“玉米手册”(1993)ISBN 3-540-97826-7，Springer Verlag New York)描述了使用粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄入或另一个备选的通过碳酸硅纤维技术进行的植物转化。
8.分析转化植物中豆血红蛋白和血红蛋白的表达在转录水平测量转化植物中豆血红蛋白的活性。
测定基因转录水平(表示基因翻译所采用的RNA的量)的合适方法是实施下文所述的Northern印迹(作为参考，见Ausubel等.(1988)CurrentProtocols in Molecular Biology，WileyNew York或上述的实施例部分)，其中与豆血红蛋白结合的引物用可检测的标签(通常是放射同位素或化学发光标签)标记，以便当抽提生物体培养物的总RNA、在凝胶上分离、转移至合适的基质和与该探针孵育时，本探针的结合和结合强度显示所探讨基因(豆血红蛋白或血红蛋白)的mRNA的存在以及也显示它的量。本信息显示转化基因的转录程度。使用均是本领域所公知的多种方法，如Bormann，E.R等。(1992)Mol.Microbiol.6317-326所述的方法，可从细胞、组织或器官中制备细胞总RNA。
Northern杂交对于RNA杂交，使用甲醛，在1.25％强度的琼脂糖凝胶中通过凝胶电泳分离20μg总RNA或1μg poly(A)+RNA，如Amasino(1986，Anal.Biochem.152，304)所述；使用10×SSC，通过毛细管吸引转移至带正电的尼龙膜(Hybond N+，Amersham，Braunschweig)；通过紫外线固定，并使用杂交缓冲液(10％(w/v)葡聚糖硫酸酯、1M NaCl、1％SDS、100mg鲱鱼精子DNA)在68℃预杂交3小时。使用α-32P-dCTP(Amersham Pharmacia，Braunschweig，德国)，在预杂交步骤利用Highprime DNA标记试剂盒(Roche，Mannheim，德国)对DNA探针进行标记。已加入标记的DNA探针后，在相同的缓冲液中于68℃过夜进行杂交。在68℃，使用2×SSC，洗涤步骤进行2次，15分钟，并且使用1×SSC、1％SDS，进行2次30分钟。密封滤器的曝光在-70℃进行1-14天。
9.分析重组豆血红蛋白对目的产物产生的影响通过使经修饰的微生物或经修饰的植物在合适条件下(如上文所述的那些)生长，并分析培养基和/或细胞成分中目的产物(即脂类或碳水化合物)的产量增加，可以测定植物、真菌、藻类、纤毛虫的遗传修饰对目的化合物(如脂肪酸)产生的影响。这些分析技术是熟练工作人员所公知的，并且包含光谱学、薄层层析、多种染色方法、酶学和微生物学技术以及分析型色谱法如高效液相色谱(见，例如Ullman，Encyclopedia of IndustrialChemistry，Vol.A2，89-90页和443-613页，VCHWeinheim(1985)、Fallon，A等，(1987)“HPLC在生物化学中的应用”在Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Vol.17、Rehm等.(1993)Biotechnology，Vol.3，Chapter III“产物回收和纯化”，469-714页，VCHWeinheim、Belter，P.A等.(1988)Bioseparationsdownstream processingfor Biotechnology，John Wiley and Sons、Kennedy，J.F和Cabral，J.M.S.(1992)Recovery processes for biological Materials，John Wiley and Sons、Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.(1988)生物化学分离，在Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry，Vol.B3；Chapter 11，1-27页，VCHWeinheim、以及Dechow，F.J.(1989)Separation and purificationtechniques in biotechnology，Noyes Publications)除上述方法外，如Cahoon等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(22)12935-12940和Browse等.(1986)Analytic Biochemistry 152141-145所述从植物材料中抽提植物脂类。Christie，William W.，Advances in LipidMethodology，Ayr/ScotlandOily Press(Oily Press Lipid Library；2)、Christie，William W.，Gas Chromatography and Lipids.A Practical Guide-Ayr，ScotlandOily Press，1989，Repr.1992，IX，307 S.(Oily Press LipidLibrary；1)、“Progress in Lipid Research，OxfordPergamon Press，1(1952)-16(1977)在题为Progress in the Chemistry of Fats and OtherLipids CODEN的一文中描述了脂类或脂肪酸的定性和定量分析。
为测定产生化合物的总效率，除了测量发酵终产物外，分析用于产生目的化合物的代谢途径的其它成分也是可能的，如中间体和次级产物。分析方法包含测量培养基中的营养物量(例如糖、碳氢化合物、氮源、磷酸盐和其它成分)、测量生物量组分和其生长、通过生物合成途径分析正常代谢产物的产量、以及测量发酵过程中所产生的气体。Applied MicrobialPhysiology；A Practical Approach，P.M.Rhodes和P.F.Stanbury编著，IRL Press，103-129；131-163和165-192页(ISBN0199635773)以及其中所引用的参考文献描述了这些测量的标准方法。
一个例子是脂肪酸的分析(缩写FAMEs，脂肪酸甲酯；GC-MS，气液色谱/质谱；TAG，三酰甘油；TLC，薄层层析)。
根据标准分析程序进行重组生物体的分析，可获得脂肪酸产物存在的明确证据，其中所述的标准分析程序是GC、GC-MS或TLC，如之前Christie和此处的参考文献(1997，在Advances on Lipid Methodology，第四版Christie，Oily Press，Dundee，119-169；1998，Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren[气相色谱/质谱法]，Lipide 33343-353)所述。
通过超声、玻璃研磨器、液氮中磨碎和研磨，或通过任何其它可应用的方法，可破坏所分析的材料。破坏后，将材料离心。将沉淀重悬于蒸馏水中、于100℃加热10分钟、冰上冷却、并再次离心、然后于90℃在含有0.5％硫酸和2％二甲氧基丙烷的甲醇中抽提1小时，这导致水解油和水解脂类化合物而产生转甲基脂类。在石油醚中抽提这些脂肪酸甲酯，并且最后使用毛细管柱(Chrompack，WCOT Fused Silica，CP-Wax-52 CB，25微米，0.32mm)，经过GC分析，温度梯度170℃-240℃20分钟和240℃5分钟。使用可从商业来源(即Sigma)获得的标准品定义所得到的脂肪酸甲酯的特性。
10.分析拟南芥成熟种子中百脉根豆血红蛋白、拟南芥血红蛋白1、拟南芥血红蛋白2的表达为证明来自拟南芥菜的转基因血红蛋白1和血红蛋白2(AtHb1和AtHb2)，以及来自日本百脉根的豆血红蛋白(LjLegHb)的表达，进行Northern印迹分析。为此目的，分离转基因植物和野生型植物成熟种子的总RNA，并通过电泳分开，以及使用洋地黄毒苷标记的探针检测转录体。对每种品系进行2-4次独立的分析。通过举例，
图1显示转基因拟南芥品系成熟T2种子表达分析的结果，其中所述的拟南芥品系表达百脉根血红蛋白(LjLegHb)、拟南芥血红蛋白1(AtHb1)或拟南芥血红蛋白2(AtHb2)。因为可检测到对应的mRNA，所以转化基因几乎在所有分析的品系中得到转录。相反，在对照中，未检测到转录本。
11.分析表达百脉根豆血红蛋白和拟南芥血红蛋白的经转化拟南芥植物的油含量通过对总脂肪酸定量，可间接测定表达百脉根豆血红蛋白、拟南芥血红蛋白1或拟南芥血红蛋白2的转基因拟南芥植物种子的油含量。下述方法用于本目的。
通过Blight & Dyer，1959Can.J.Biochem.Physiol.37911的方法，从种子中抽提脂类。对于每次测量，将5-10个种子转移至振荡的1.2ml Qiagen微型管(Qiagen，Hilden)，在Retsch粉碎机中粉碎(MM300，Retsch(Haan))，并通过加入500μl氯仿/甲醇(2∶1，含作为内标的十五酸(C15))抽提总脂类。加入500μl 50mM磷酸钾缓冲液pH7.5后，相得到分离。将有机相转移至Pyrex管，并蒸发至干燥。然后使用Benning & Sommerville，1992 J.Bacteriol.1746479-6487的方法，通过在80℃加入溶于甲醇的1N H2SO4和2％(v/v)二甲氧基丙烷1小时而衍生全部脂肪酸以产生脂肪酸甲酯。在石油醚中抽提这些脂肪酸甲酯，并最后使用毛细管柱(Chrompack，WCOTFused Silica，CP-Wax-52，25微米，0.32mm)，通过气相色谱进行分析。通过比较脂肪酸甲酯的信号面积和已知浓度内标的信号面积，对总脂肪酸定量。拟南芥菜中油含量的进一步的指示剂实际上是唯一发现于贮藏脂类中的脂肪酸二十碳烯酸(20∶1Δ11)。
拟南芥菜转化后，通过抗生素抗性对转基因品系进行选择。为此目的，转化的拟南芥植物的T1种子在含有潮霉素的选择平板上萌芽。为了定量测定油含量，在每一情况下对4个独立转基因品系的T2种子进行了分析。对每一品系进行了5-9次独立的测量，并计算对应的平均值。
通过表3和图2中的例子，显示测定表达百脉根豆血红蛋白的转基因植物成熟T2种子中的油含量。根据本发明，品系4和5中百脉根豆血红蛋白的表达导致油含量分别显著增加17.14％和17.54％。
通过表4和图3中的例子，显示测定表达拟南芥血红蛋白1的转基因植物成熟T2种子中的油含量。根据本发明，品系35、13和39中拟南芥血红蛋白1的表达导致油含量分别显著增加9.78％、12.22％和51.16％。
通过表5和图4中的例子，显示测定表达拟南芥血红蛋白2的转基因植物成熟T2种子中的油含量。根据本发明，品系2、10和11中拟南芥血红蛋白2的表达导致油含量分别显著增加16.25％、21.86％和23.80％。
12.测定表达百脉根豆血红蛋白的转化马铃薯植物中的淀粉含量采用如Schéele C.von，Svensson，G.和Rasmusson J.，Die Bestimmungdes Strkegehalts und der Trockensubstanz der Kartoffel mit Hilfe desspezifischen Gewichts[通过比重测定马铃薯的淀粉含量和干物质].Landw.Vers Sta.12767-96，1937所述的密度测量法，以测定马铃薯的淀粉含量和块茎。然后，转换密度测量值，并将结果用于估计淀粉含量。下述公式用于转换。
通过在空气和水中称重块茎，测定其比重，X是空气中的质量以及Y是水中的质量。然后，比重是x/(x-y)的结果。此外，计算560个测量样品的平均值，并且建立下述关系式(Burton W.G.(1989)The Potato.Longman，New York)％干物质＝24.182+[211.04*(比重-1.0988)]％淀粉＝17.546+[199.07*(比重-1.0988)]多种转基因品系和对照植物的不同大小的马铃薯块茎，可用于测量表达豆血红蛋白的植物和用于比较目的的对照植物。不同大小用作再现所有块茎大小中的观测结果。
通过熟练工作人员所熟悉的常规方法，从表达豆血红蛋白的马铃薯中进行淀粉的检查或回收，例如如美国专利申请2001/0041199 A1，第4页，
为测量表达豆血红蛋白的植物和为比较目的的对照植物的块茎中的淀粉含量，将植物同时在温室和polyhouse中生长。不同栽培方法用作再现不同气候条件下的观察结果。为再现所有块茎大小的观察结果，采用不同大小的马铃薯块茎用于测量。
通过举例，表6显示转基因品系与对照植物的比较数据，其中所有的植物已经在温室中生长。在每一情况下，显示一个品系不同块茎的6次测量值和所得到的平均值以及标准差。根据本发明，在转基因品系中，检测到淀粉含量显著增加40.77％。在更多的品系中获得类似的数值。
图5显示4个独立转基因品系与对照植物比较的平均淀粉含量，其中所有植物已在Golm的polyhouse中生长，时间为2003年3月至2003年9月。平均数据是以334个块茎(品系13)、358个块茎(品系57)、380个块茎(品系45)、384个块茎(品系54)和151个块茎(野生型)为根据的。根据本发明，在盛行于polyhouse的气候条件下，也观察到表达豆血红蛋白的经转化植物的块茎中淀粉含量显著增加，这证实了从温室中获得的结果。在培养期间，盛行于polyhouse的温度条件显示于图6中。
表3.与对照比较，表达LjLegHb的转基因拟南芥品系T2种子中的油含量。在每一情况下，对5-10个种子进行单独测量，并且对应的油含量以μg脂肪酸/种子表示。
表4.与对照比较，表达AtHb1的转基因拟南芥品系T2种子中的油含量。在每一情况下，对5-10个种子进行单独测量，并且对应的油含量以μg脂肪酸/种子表示。
表5.与对照比较，表达AtHb2的转基因拟南芥品系T2种子中的油含量。在每一情况下，对5-10个种子进行单独测量，并且对应的油含量以μg脂肪酸/种子表示。
表6.与对照植物比较，测定转基因品系的比重
序列表<110>马克思-普朗克科学促进协会公司<120>改变植物贮藏储备物含量的方法<130>NAE 737/02 PCT<150>DE 10260707.9<151>2002-12-23<160>6<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>444<212>DNA<213>日本百脉根(Lotus japonicus)<220>
<221>CDS<222>(1)..(444)<400>1atg ggt ttc act gcg cag caa gag gct cta gtg ggt agc tca tac gaa48Met Gly Phe Thr Ala Gln Gln Glu Ala Leu Val Gly Ser Ser Tyr Glu15 10 15aca ttc aag aaa aac ctt cct acc aac agt gtt ttg ttc tac acc gtt96Thr Phe Lys Lys Asn Leu Pro Thr Asn Ser Val Leu Phe Tyr Thr Val20 25 30ata ttg gag ata gca cca act gca aaa gac atg ttc tcc ttt cta aag144Ile Leu Glu Ile Ala Pro Thr Ala Lys Asp Met Phe Ser Phe Leu Lys35 40 45gag tct ggg cct aag cat agt cct cag ctc cag gcc cat gct gaa aag192
Glu Ser Gly Pro Lys His Ser Pro Gln Leu Gln Ala His Ala Glu Lys50 55 60gtt ttt gca ctg act cgt gat gct gcc act caa ctc gta gca aaa gga240Val Phe Ala Leu Thr Arg Asp Ala Ala Thr Gln Leu Val Ala Lys Gly65 70 75 80gaa gtg aca ctt gca gat gcc agc tta ggt gct gtc cac gtt cag aaa288Glu Val Thr Leu Ala Asp Ala Ser Leu Gly Ala Val His Val Gln Lys85 90 95gcc gtt act gat cct cat ttc gtg gtg gtt aaa gaa gcc ctg ctt caa336Ala Val Thr Asp Pro His Phe Val Val Val Lys Glu Ala Leu Leu Gln100 105 110aca gta aag gaa gca gtt ggg gcg gac gaa tgg agt gat gac ttg agc384Thr Val Lys Glu Ala Val Gly Ala Asp Glu Trp Ser Asp Asp Leu Ser115 120 125acc gct tgg gaa gga gca tat gat gga cta gca act gca att aag aag432Thr Ala Trp Glu Gly Ala Tyr Asp Gly Leu Ala Thr Ala Ile Lys Lys130 135 140gca atg ggt taa 444Ala Met Gly145<210>2<211>147<212>PRT<213>日本百脉根<400>2Met Gly Phe Thr Ala Gln Gln Glu Ala Leu Val Gly Ser Ser Tyr Glu15 10 15
Thr Phe Lys Lys Asn Leu Pro Thr Asn Ser Val Leu Phe Tyr Thr Val20 25 30Ile Leu Glu Ile Ala Pro Thr Ala Lys Asp Met Phe Ser Phe Leu Lys35 40 45Glu Ser Gly Pro Lys His Ser Pro Gln Leu Gln Ala His Ala Glu Lys50 55 60Val Phe Ala Leu Thr Arg Asp Ala Ala Thr Gln Leu Val Ala Lys Gly65 70 75 80Glu Val Thr Leu Ala Asp Ala Ser Leu Gly Ala Val His Val Gln Lys85 90 95Ala Val Thr Asp Pro His Phe Val Val Val Lys Glu Ala Leu Leu Gln100 105 110Thr Val Lys Glu Ala Val Gly Ala Asp Glu Trp Ser Asp Asp Leu Ser115 120 125Thr Ala Trp Glu Gly Ala Tyr Asp Gly Leu Ala Thr Ala Ile Lys Lys130 135 140Ala Met Gly145<210>3<211>483<212>DNA<213>拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)<220>
<221>CDS
<222>(1)..(483)<400>3atg gag agt gaa gga aag att gtg ttc aca gaa gag caa gag gct ctt48Met Glu Ser Glu Gly Lys Ile Val Phe Thr Glu Glu Gln Glu Ala Leu15 10 15gta gtg aag tct tgg agt gtc atg aag aaa aac tca gct gaa tta ggt96Val Val Lys Ser Trp Ser Val Met Lys Lys Asn Ser Ala Glu Leu Gly20 25 30ctc aaa ctc ttc atc aag atc ttt gag att gca cca aca acg aag aag144Leu Lys Leu Phe Ile Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Thr Thr Lys Lys35 40 45atg ttc tct ttc ttg aga gac tca cca att cct gct gag caa aat cca192Met Phe Ser Phe Leu Arg Asp Ser Pro Ile Pro Ala Glu Gln Asn Pro50 55 60aag ctc aag cct cac gca atg tct gtt ttt gtc atg tgt tgt gaa tca240Lys Leu Lys Pro His Ala Met Ser Val Phe Val Met Cys Cys Glu Ser65 70 75 80gca gta caa ctg agg aaa aca ggg aaa gtt acg gtg agg gag act act288Ala Val Gln Leu Arg Lys Thr Gly Lys Val Thr Val Arg Glu Thr Thr85 90 95ttg aag aga ctt gga gcc agc cat tct aaa tac ggt gtc gtt gac gaa336Leu Lys Arg Leu Gly Ala Ser His Ser Lys Tyr Gly Val Val Asp Glu100 105 110cac ttt gag gtg gcc aag tat gca ttg ttg gag acg ata aag gag gca384His Phe Glu Val Ala Lys Tyr Ala Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu Ala115 120 125gtg ccg gag atg tgg tca ccg gag atg aag gtg gct tgg ggt cag gct
432Val Pro Glu Met Trp Ser Pro Glu Met Lys Val Ala Trp Gly Gln Ala130 135 140tat gat cac ctt gtt gct gcc att aaa gct gaa atg aat ctt tcc aac480Tyr Asp His Leu Val Ala Ala Ile Lys Ala Glu Met Asn Leu Ser Asn145 150 155 160taa 483<210>4<211>160<212>PRT<213>拟南芥菜<400>4Met Glu Ser Glu Gly Lys Ile Val Phe Thr Glu Glu Gln Glu Ala Leu15 10 15Val Val Lys Ser Trp Ser Val Met Lys Lys Asn Ser Ala Glu Leu Gly20 25 30Leu Lys Leu Phe Ile Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Thr Thr Lys Lys35 40 45Met Phe Ser Phe Leu Arg Asp Ser Pro Ile Pro Ala Glu Gln Asn Pro50 55 60Lys Leu Lys Pro His Ala Met Ser Val Phe Val Met Cys Cys Glu Ser65 70 75 80Ala Val Gln Leu Arg Lys Thr Gly Lys Val Thr Val Arg Glu Thr Thr85 90 95Leu Lys Arg Leu Gly Ala Ser His Ser Lys Tyr Gly Val Val Asp Glu
100 105 110His Phe Glu Val Ala Lys Tyr Ala Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu Ala115 120 125Val Pro Glu Met Trp Ser Pro Glu Met Lys Val Ala Trp Gly Gln Ala130 135 140Tyr Asp His Leu Val Ala Ala Ile Lys Ala Glu Met Asn Leu Ser Asn145 150 155 160<210>5<211>477<212>DNA<213>拟南芥菜<220>
<221>CDS<222>(1)..(477)<400>5atg gga gag att ggg ttt aca gag aag caa gaa gct ttg gtg aag gaa48Met Gly Glu Ile Gly Phe Thr Glu Lys Gln Glu Ala Leu Val Lys Glu15 10 15tcg tgg gag ata ctg aaa caa gac atc ccc aaa tac agc ctt cac ttc96Ser Trp Glu Ile Leu Lys Gln Asp Ile Pro Lys Tyr Ser Leu His Phe20 25 30ttc tca cag ata ctg gag ata gca cca gca gca aaa ggc ttg ttc tct144Phe Ser Gln Ile Leu Glu Ile Ala Pro Ala Ala Lys Gly Leu Phe Ser35 40 45ttc cta aga gac tca gat gaa gtc cct cac aac aat cct aaa ctc aaa192Phe Leu Arg Asp Ser Asp Glu Val Pro His Asn Asn Pro Lys Leu Lys
50 55 60gct cat gct gtt aaa gtc ttc aag atg aca tgt gaa aca gct ata cag240Ala His Ala Val Lys Val Phe Lys Met Thr Cys Glu Thr Ala Ile Gln65 70 75 80ctg agg gag gaa gga aag gtg gta gtg gct gac aca acc ctc caa tat288Leu Arg Glu Glu Gly Lys Val Val Val Ala Asp Thr Thr Leu Gln Tyr85 90 95tta ggc tca att cat ctc aaa agc ggc gtt att gac cct cac ttc gag336Leu Gly Ser Ile His Leu Lys Ser Gly Val Ile Asp Pro His Phe Glu100 105 110gtg gtg aaa gaa gct ttg cta agg aca ttg aaa gag ggg ttg ggg gag384Val Val Lys Glu Ala Leu Leu Arg Thr Leu Lys Glu Gly Leu Gly Glu115 120 125aaa tac aat gaa gaa gtg gaa ggt gct tgg tct caa gct tat gat cac432Lys Tyr Asn Glu Glu Val Glu Gly Ala Trp Ser Gln Ala Tyr Asp His130 135 140ttg gct tta gcc atc aag acc gag atg aaa caa gaa gag tca taa 477Leu Ala Leu Ala Ile Lys Thr Glu Met Lys Gln Glu Glu Ser145 150 155<210>6<211>158<212>PRT<213>拟南芥菜<400>6Met Gly Glu Ile Gly Phe Thr Glu Lys Gln Glu Ala Leu Val Lys Glu15 10 15Ser Trp Glu Ile Leu Lys Gln Asp Ile Pro Lys Tyr Ser Leu His Phe
20 25 30Phe Ser Gln Ile Leu Glu Ile Ala Pro Ala Ala Lys Gly Leu Phe Ser35 40 45Phe Leu Arg Asp Ser Asp Glu Val Pro His Asn Asn Pro Lys Leu Lys50 55 60Ala His Ala Val Lys Val Phe Lys Met Thr Cys Glu Thr Ala Ile Gln65 70 75 80Leu Arg Glu Glu Gly Lys Val Val Val Ala Asp Thr Thr Leu Gln Tyr85 90 95Leu Gly Ser Ile His Leu Lys Ser Gly Val Ile Asp Pro His Phe Glu100 105 110Val Val Lys Glu Ala Leu Leu Arg Thr Leu Lys Glu Gly Leu Gly Glu115 120 125Lys Tyr Asn Glu Glu Val Glu Gly Ala Trp Ser Gln Ala Tyr Asp His130 135 140Leu Ala Leu Ala Ile Lys Thr Glu Met Lys Gln Glu Glu Ser145 150 15权利要求
1.经转化的植物，其表达至少一种豆血红蛋白。
2.根据权利要求1所述的经转化植物，其包含至少一个编码豆血红蛋白的序列号1。
3.根据权利要求2所述的经转化植物，其包含与序列号1具有约70％同一性的序列。
4.经转化植物，其表达至少一种血红蛋白或表达至少一种豆血红蛋白和至少一种血红蛋白。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的经转化植物，其中豆血红蛋白和/或血红蛋白选自植物黄羽扇豆(Lupinus luteus)、大豆(Glycine max)、紫苜蓿(Medicago sativa)、Medicago trunculata、菜豆(Phaseolusvulgaris)、蚕豆(Vicia faba)、豌豆(Pisum sativum)、豇豆(Vignaunguiculata)、日本百脉根(Lotus japonicus)、四棱豆(Psophocarpustetragonolobus)、狗尾草(Sesbania rostrata)、粗枝木麻黄(Casuarinaglauca)和Canvalaria lineata的豆血红蛋白和/或血红蛋白。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的经转化植物，其中豆血红蛋白和/或血红蛋白来源于日本百脉根和拟南芥菜。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的经转化植物，其以贮藏器官特异的方式表达豆血红蛋白和/或血红蛋白。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的经转化植物，其以块茎特异和/或种子特异的方式表达至少一种豆血红蛋白和/或血红蛋白。
9.根据权利要求4-8中任意一项所述的经转化植物，其包含至少一个编码血红蛋白的序列号3和5，或其包含至少一个编码豆血红蛋白的序列号1和至少一个编码血红蛋白的序列号3和5。
10.根据权利要求4-9中任意一项所述的经转化植物，其包含与序列号1、3和/或5具有约70％同一性的序列。
11.根据任一上述权利要求的经转化植物，其产生淀粉和/或油。
12.根据任一上述权利要求的经转化植物，其是单子叶作物植物，尤其是禾本科物种。
13.根据权利要求1-12中任意一项所述的经转化植物，其是双子叶作物植物，特别来自于菊科(Asteraceae)、芸苔科(Brassicaceae)、菊科(Compositae)、十字花科(Cruciferae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、豆科(Leguminosae)、茜草科(Rubiaceae)、茄科(Solanaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、山茶科(Theaceae)或伞形科(Umbelliferae)。
14.根据权利要求13所述的经转化植物，其是马铃薯、拟南芥菜、大豆或油料种子油菜。
15.编码豆血红蛋白的序列号1中所示的核苷酸序列，其用于根据权利要求1-14中任意一项所述的植物中。
16.包含至少一个根据权利要求15所述的核苷酸序列的基因结构。
17.载体，其包含至少一个或多个根据权利要求15所述的核苷酸序列，或其包含一个或多个根据权利要求16所述的基因结构。
18.根据权利要求1-14中任意一项所述的植物，其包含至少一个根据权利要求16所述的基因结构。
19.根据权利要求1-14中任意一项所述的植物，其包含至少一个根据权利要求17所述的载体。
20.编码血红蛋白的序列号3和5中所示的核苷酸序列，其用于根据权利要求4-14中任意一项所述的植物中。
21.包含至少一个根据权利要求20所述的核苷酸序列的基因结构。
22.载体，其包含至少一个或多个根据权利要求20所述的核苷酸序列，或其包含一个或多个根据权利要求21所述的基因结构。
23.根据权利要求4-14中任意一项所述的植物，其包含至少一个根据权利要求21所述的基因结构。
24.根据权利要求4-14中任意一项所述的植物，其包含至少一个根据权利要求24所述的载体。
25.改变植物中贮藏储备物含量的方法，所述方法包括转化植物，以使它们表达至少一种豆血红蛋白。
26.根据权利要求25所述的方法，其中植物以使它们包含至少一个编码豆血红蛋白的序列号1的方式转化。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中植物以使它们包含与序列号1具有约70％同一性的序列的方式转化。
28.改变植物中贮藏储备物含量的方法，其包括以使它们表达至少一种血红蛋白或表达至少一种豆血红蛋白和至少一种血红蛋白的方式转化植物。
29.根据权利要求25-28中任意一项所述的方法，其中豆血红蛋白和血红蛋白选自植物拟南芥菜、黄羽扇豆、大豆、紫苜蓿、Medicago trunculata、菜豆、蚕豆、豌豆、豇豆、日本百脉根、四棱豆、狗尾草、粗枝木麻黄和Canvalaria lineata的豆血红蛋白和血红蛋白。
30.根据权利要求25-29中任意一项所述的方法，其中豆血红蛋白和/或血红蛋白来源于日本百脉根和拟南芥菜。
31.根据权利要求25-30中任意一项所述的方法，其中植物以这种方式转化，所述方式使它们以贮藏器官特异的方式表达豆血红蛋白和血红蛋白。
32.根据权利要求25-31中任意一项所述的方法，其中植物以这种方式转化，所述方式使它们以块茎特异和/或种子特异的方式表达豆血红蛋白和血红蛋白。
33.根据权利要求25-32中任意一项所述的方法，其中植物以这种方式转化，所述方式使它们包含至少一个编码血红蛋白的序列号3和/或5，或包含至少一个编码豆血红蛋白的序列号1和至少一个编码血红蛋白的序列号3和/或5。
34.根据上述权利要求26-33中任意一项所述的方法，其中植物以这种方式转化，所述方式使它们包含与序列号1、3和/或5中的一个序列具有约70％同一性的序列。
35.根据权利要求26-34中任意一项所述的方法，其中植物以这种方式转化，所述方式使它们产生淀粉和/或油。
36.根据权利要求26-35中任意一项所述的方法，其中转化单子叶作物植物，特别是禾本科物种。
37.根据上述权利要求26-36中任意一项所述的方法，其中转化双子叶作物植物，特别是来自于菊科(Asteraceae)、芸苔科、菊科(Compositae)、十字花科、葫芦科、豆科、茜草科、茄科、梧桐科、山茶科或伞形科。
38.根据上述权利要求26-37中任意一项所述的方法，其中转化马铃薯、拟南芥菜、大豆或油料种子油菜。
39.根据上述权利要求26-38中任意一项所述的方法，其中至少一个根据权利要求15所述的核苷酸序列用于转化。
40.根据权利要求25-39中任意一项所述的方法，其中至少一个根据权利要求16所述的基因结构用于转化。
41.根据权利要求25-40中任意一项所述的方法，其中至少一个根据权利要求17所述的载体用于转化。
42.根据权利要求28-41中任意一项所述的方法，其中至少一个根据权利要求20所述的核苷酸序列用于转化。
43.根据权利要求28-42中任意一项所述的方法，其中至少一个根据权利要求21所述的基因结构用于转化。
44.根据权利要求28-43中任意一项所述的方法，其中至少一个根据权利要求22所述的载体用于转化。
45.根据权利要求1-14、18或19中任意一项所述的植物的用途，用于产生淀粉和/或油。
46.根据权利要求1-10、11-24中任意一项所述的植物的用途，用于产生淀粉和/或油。
全文摘要
本发明涉及改变植物中贮藏储备物含量的方法、对应的植物和它们的用途，其中采用的是表达豆血红蛋白和/或血红蛋白的经转化植物。
文档编号C07K14/805GK1732265SQ200380107352
公开日2006年2月8日 申请日期2003年12月23日 优先权日2002年12月23日
发明者P·盖根贝格尔, A·朗格, H·维格奥拉斯, M·施蒂特奈杰尔, T·J·范东恩, M·乌德沃尔迪 申请人:马克思-普朗克科学促进协会公司