专利名称：从宿主细胞纯化核酸的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及从细胞来源分离核酸的方法和组合物。更具体地，本发明涉及用有效的一步裂解组合物联合核酸捕获基质从粗制细胞裂解物直接分离低分子量核酸，例如，染色体外DNA的方法和组合物。
背景技术：
分离低分子量核酸，尤其从宿主细胞分离染色体外核酸的能力通常是分子生物学中许多方案所必要的，以及生物技术和临床研究中许多下游用途的基本要求。例如，通常的克隆方案预期从靶细胞的转化可得到质粒载体DNA。染色体外核酸的质量，例如，纯度和完整性水平通常决定克隆方法的成功，并且通常是完整方法的关键参数。此外，DNA测序、限制性消化反应，和随后的连接反应通常依赖于起始DNA材料的质量。同样，已经需要并且持续需要从宿主细胞纯化高质量低分子量核酸的可靠方法。
常规低分子量核酸纯化方案通常以或多或少两个阶段进行在第一个阶段，将含有靶核酸，即染色体外核酸的宿主细胞轻微裂解并将内含物溶解化；在第二个阶段，通过几种常用的化学或酶学方法之一将靶核酸与污染性蛋白质、RNA、高分子量核酸(即，染色体DNA)，和其他大分子分离。通常常规靶核酸纯化方案已经证明是费力和耗时的，然而产生高质量产物，或者相对快和省力的，但是产生相对低质量产物。
更具体地，分离靶核酸更常用的省时方法之一包括碱性裂解技术。碱性裂解方法通常顺序掺入NaOH/SDS裂解溶液与乙酸钾溶液组合，和离心步骤以优先将靶核酸释放和与其他污染性材料分离。用单独的离心或过滤步骤产生澄清裂解物。需要乙醇沉淀澄清的裂解物以沉淀核酸。尽管碱性裂解方法相当快，其耗费约30到45分钟，并且所得核酸的纯度比较好，即可用于限制性消化和其他更基本的检测型方法中，但是该方法不能提供高质量染色体外核酸。
在另一方法中，通过碱性裂解方法制备的澄清裂解物可以与离液序列高的物质，例如胍盐、脲和碘化钠组合，在DNA结合固相(例如，珠子或者其他结合基质)存在下纯化靶核酸。核酸在一步反应中结合固相，洗涤以除去残留的污染物并用低盐缓冲液洗脱核酸。尽管联合碱性裂解与离液剂结合/洗涤/洗脱步骤的方法可以提供更高质量核酸，但是它们仍然耗时，花费约25分钟，并且需要更多手工操作。
同样，本领域中持续需要简单和时间有效的方法，和相应的溶液，用以从宿主细胞纯化低分子量靶核酸，如染色体外DNA，还需要从宿主细胞纯化质粒DNA的方法和溶液。在该背景下开发了本发明。
发明概述本发明提供了使用一种溶液和核酸捕获基质从宿主细胞裂解并分离低分子量核酸的一步方法。在优选实施方案中，将裂解溶液预冷以增强核酸纯度。在另一优选实施方案中，核酸捕捉基质含有具有至少1μm孔隙大小的捕获基质材料。与现有技术方案相比，按照本文中描述的方法可以快速(约8到10分钟)和容易(需要很少试剂)地以高产率和纯度分离低分子量核酸。
优选地，按照本发明的方法和组合物分离的低分子量核酸具有约1.7到1.9的A260/280比率，和具有最小的蛋白质污染，如通过视觉，即光度检测方法，即，标准凝胶电泳和类似方法所测量的。更优选地，使用本发明的方法和组合物分离的低分子量核酸可以通常经测序为至少600个碱基，即每种样品具有600质量得分(q)≥20(CodonCode软件，PHRED Interphace)(600 PHRED q＞20分)。
本发明的一个实施方案提供了用于从宿主细胞纯化低分子量核酸的裂解组合物。该裂解组合物优选含有缓冲剂和去污剂。在尤其优选的实施方案中，该去污剂含有非离子去污剂或者两性离子去污剂，例如，正-癸基-N，N-二甲基-3-铵基(ammonio)-1-丙烷磺酸盐。在额外的实施方案中，裂解组合物还含有盐、聚乙二醇、溶菌酶和/或RNA酶。在进一步优选的实施方案中，裂解溶液在加入宿主细胞前预冷。
在本发明的另一实施方案中，提供了用于从宿主细胞纯化低分子量核酸的试剂盒。优选地，该试剂盒包括核酸捕获基质和含有缓冲剂、非离子或者两性离子去污剂，和任选地盐、聚乙二醇、溶菌酶和/或RNA酶的裂解组合物。在尤其优选的实施方案中，核酸捕获基质含有掺入自旋柱的捕获基质材料，该自旋柱的平均孔隙大小为至少约1μm，更优选地至少约3μm。
本发明的另一实施方案为从宿主细胞纯化低分子量核酸的方法。该方法包括向宿主细胞加入裂解组合物的步骤，其中裂解组合物含有0.2％到6％两性离子或者非离子去污剂并且优选在使用前预冷，将释放的低分子量核酸与核酸捕捉基质组合，并将捕获的低分子量核酸洗脱到捕获管中。在备选实施方案中，室温下将裂解组合物与宿主细胞孵育至少2分钟，更优选地至少3分钟，之后加入核酸捕获基质。
此外，本发明的方法和组合物可以经修饰，如下文中更详细描述，以优先分离溶解的蛋白质、RNA、BACs，和高分子量核酸。在这些其他实施方案中，用含有缓冲剂和两性离子去污剂的裂解溶液与用以高产率和高质量地纯化靶标大分子的适宜的成分联合，所述成分为例如，RNA酶、溶菌酶，或者DNA酶。
阅读下面的详细描述和参考所附权利要求书后，表征本发明的这些特征和多种其他特征以及优点将显而易见。
附图简述
图1A和1B阐明在染色的0.5％琼脂糖凝胶(1A)显示和图示(1B)分离的质粒DNA，其中在室温下将细胞与裂解溶液孵育不同的时间量。该图阐明了来自每种条件的浓度和A212吸收读数。
图2阐明在染色的0.5％琼脂糖凝胶上显色的质粒DNA，其中用于裂解缓冲液的去污剂类型对所纯化的质粒DNA的产率和质量具有显著影响。在玻璃纤维(second1-12)板上分离DNA。
图3阐明在染色的0.5％琼脂糖凝胶上显色的质粒DNA，其中细胞与室温裂解溶液、4℃裂解溶液，或者0℃裂解溶液孵育。
图4阐明NA捕获基质材料的类型和该基质的孔隙大小对所纯化的质粒DNA的产率和质量具有影响。分离的质粒DNA在染色的0.5％琼脂糖凝胶上显现。
图5阐明用于从不同类型的宿主细胞分离不同质粒载体的本发明的方法和Lysis裂解溶液。质粒DNA在染色的0.5％琼脂糖凝胶上显现。
图6阐明通过本发明的方法和Lysis裂解溶液分离的质粒DNA为PCR提供了足够模板DNA。PCR产物在染色的琼脂糖凝胶上显现。
图7A和7B阐明通过分光光度分析，裂解方法提供了极好的浓度和产率，它们与QIAgen、Invitrogen、BioRad或者Promega试剂盒相当或者更好。图7A显示了与QIAgen制备的DNA相当的裂解方法DNA(在凝胶上标记为FastPlasmid DNA)。图7B图示比较了从本发明的裂解方法制备的DNA的浓度与通过QIAgen、Invitrogen、BioRad和Promega制备的DNA的浓度。
图8阐明使用本发明的方法和Lysis裂解溶液分离的DNA的测序质量(通过测序追踪)。
图9阐明通过限制性核酸内切酶反应，与其他常用的DNA分离试剂盒相比使用本发明的方法和Lysis裂解溶液分离的DNA的质量。
图10A和B阐明PEG、盐和缓冲液的溶液可以驱使核酸结合二氧化硅颗粒。在A和B中，通过0.5％琼脂糖凝胶显现分离的质粒DNA。
图11阐明Lysis溶液可以直接加到液体细菌培养基和使用本发明的方法和材料分离的高质量质粒DNA。在染色的琼脂糖凝胶上显现分离的DNA样品。
发明详述定义提供下面的定义用以方便理解本文中所用的某些术语并且这些定义不限制本公开的范围。
“A260/280”指常用的核酸定量技术，其中测量受试样品在约260nm和280nm处的吸收。260与280处吸收的比率用以指示核酸纯度。蛋白质污染物倾向将该比率降低到约1.6，RNA污染物倾向将该比率升高到1.9-2.0以上。
“A212”指用于帮助含有核酸的样品中蛋白质污染物的检测的单一吸收读数。例如，具有高A212读数的样品可能在该样品中具有一定水平的蛋白质污染，其当与A260/280比率和凝胶琼脂糖分析联合时可以表明该样品的质量。对本发明来说，认为读数为10是高的。
“宿主细胞”指含有靶核酸分子，例如，异源核酸分子，如质粒或者其他低分子量核酸的细胞，在该情况中宿主细胞通常适于复制目标核酸分子。用于本发明的适宜的宿主细胞的实例包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。这些细胞的特定实例包括，SF9昆虫细胞(Summers和Smith，1987，Texas Agriculture Experiment StationBulletin，1555)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Puck等人，1958，ProcNatl Acad Sci USA 601275-1281)、大肠杆菌(E.Coli)DH5α细胞，以及多种其他细菌细胞来源，例如，大肠杆菌株系DH10b细胞、XL1Blue细胞、XL2Blue细胞、Top10细胞、HB101细胞，和DH12S细胞。
本文中所用“核酸”或者“NA”指脱氧核糖核酸和核糖核酸。本文中所用“核酸序列”指一条链上脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的顺序或者序列。它们可以是天然的或人工序列，尤其基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)、信使RNA(mRNA)、转移RNA(t RNA)、核糖体RNA(rRNA)、杂种序列或者合成的或半合成序列，经修饰的寡核苷酸，或其他。这些核酸可以来源于人、动物、植物、细菌或真菌等等。它们可以通过本领域中公知的任何技术得到，尤其通过文库筛选，通过化学合成或者通过包括文库筛选得到的序列的化学或酶促修饰的混合方法得到。它们可以经化学修饰，例如，它们可以是假核酸(PNA)、通过多种化学键修饰的寡核苷酸(例如，硫代磷酸酯或者膦酸甲酯)，或者备选地，经功能化，例如用具有不同特征性质的一种或多种分子偶联的寡核苷酸。
对于脱氧核糖核酸，它们可以是单链或双链的，以及短寡核苷酸或者更长序列。具体地，核酸有利地由质粒、载体、附加体、表达盒等组成。这些脱氧核糖核酸可以携带目的治疗基因、调节转录或复制的序列、经修饰的反义序列，或者用于结合其他细胞组分的区域，等等。
本文中所用“低分子量核酸”指核酸的异源染色体外片段，例如，质粒，所述片段的碱基长度为约2kb到20kb，在某些方面为2kb到8kb。在优选实施方案中，本发明的低分子量核酸含有质粒，其中该质粒具有复制原点或者复制子、选择标记和克隆位点。在某些情况中，低分子量核酸超螺旋化。用于本发明的实例质粒包括pUC19、pUC18、pBS2、pEGFP、pBR322，等等。此外，考虑低分子量核酸包括核酸的其他形式，例如，RNA。
本文中所用“高质量核酸”通常指与足够低水平的污染物结合的核酸，从而其可以通过适宜的限制性内切核酸酶消化并可以直接用于常规转化和转染方法，即，不需要该核酸的实质性处理。优选地，这种高质量核酸的A260/280比为约1.6到2.0，更优选地约1.7到1.9。备选地和/或额外地，使用标准测序方法，可以对这种高质量核酸测序长达至少400个碱基，更优选地长达600个碱基，通常具有PHRED得分q≥20。
对本发明来说，“分离的”和“纯化的”可以互换，并且指与细胞碎片，例如，高分子量DNA、RNA和蛋白质分离的多核苷酸，例如，低分子量核酸。这将包括与细胞碎片，包括DNA分离的分离的RNA样品。
“核酸捕获基质”指用于捕获本发明的低分子量核酸的介质或者材料，包括通常由二氧化硅、尼龙、羧基等等以及基于二氧化硅的珠子，包括二氧化硅包被的磁珠组成的捕获基质材料。通常，本发明的捕获基质材料含有孔隙大小大于1μm，更通常大于或等于3μm的纤维滤器。本发明的核酸捕获基质或者“NA捕获基质”可以还含有用于捕获低分子量核酸的一个或多个不同的捕获基质材料层。应该注意当使用多层基质材料时，在材料的每层内或者之间材料不必相同。在尤其优选的实施方案中，NA捕获基质由玻璃料(frit)支持并且掺入常规自旋柱或者类似装置中。
“PHRED”或者“PHRED得分”指用于测量DNA序列质量的软件程序。该软件从CodonCode Corporation公司购买，版本0.020425.c。对本发明来说，600的PHRED q20得分相当于约730个碱基处于＞98.5％准确度。
用于本发明的“聚乙二醇”或者“PEGs”为通过商业途径可获得的二元醇，其分子量为2,000到10,000道尔顿，更优选地约8,000道尔顿。具有其他分子量约束，例如高于10,000道尔顿的PEG也预期用于本发明的组合物和方法中，尽管可能在提供高产率/质量产物方面不那么有效。
本文中所用“去污剂”指具有插入生物膜和稳定它们的性质的任何两亲性分子。该性质来自于去污剂分子能够通过插入磷脂双层和通过溶解脂质和蛋白质使膜破裂(La Cellule，Ed.Vigot和Dearie，1988，581-583页)。
“两性离子”去污剂指显示出两性离子特征的去污剂，包括，例如以商标名Zwittergen tTM和Anzergen tTM出售的磺基三甲铵乙内酯。尤其适宜的去污剂如下N-十二基-N，N-二甲基铵基-3-丙烷磺酸盐或者相应的N-十四基或者N-十六基化合物(“Zwittergent”型Zwittergent 3-14，3-16)、N-十二基-N，N-二甲基-甘氨酸(Empigen BB.RTM.)、氨基氧化物、CHAPS、CHAPSO和α-卵磷脂(α-磷脂酰胆碱)或者α-溶血卵磷脂(α-溶血磷脂酰胆碱)。
本发明提供了用于裂解和溶解宿主细胞的方法和组合物。具体地，本发明提供了简单的3到5分钟方法，其利用单一溶液裂解和释放细胞的内容物和同时溶解大部分该细胞的蛋白质。本发明的实施方案包括用于从宿主细胞优先分离低分子量核酸，例如，染色体外DNA、RNA或者其他区域DNA，以及优先将蛋白质与宿主细胞的核酸分离的方法和溶液。
在一个优选实施方案中，提供了用于从靶标宿主细胞纯化低分子量核酸，例如，质粒DNA的方法和组合物。具体地，从宿主细菌细胞以高产率和高质量纯化可用于克隆方法、限制性消化反应，和测序反应中的质粒DNA。本发明的方法利用一种溶液裂解细菌细胞和结合核酸。低分子量核酸从宿主细胞释放并直接从粗制裂解物被捕获到核酸捕获基质上。将该基质用适宜的洗涤缓冲液洗涤并在最终用途条件下洗脱。整个过程可以在10分钟以内实施并且在优选实施方案中可以在约8分钟或更短时间内实施。
裂解溶液本发明基于含有缓冲成分和去污剂的裂解溶液。在优选实施方案中，去污剂为两性离子去污剂，尤其选自包括但不限于，正-十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-辛基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-癸基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-十二基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、等等的去污剂。注意两性离子去污剂，特别与上面列举的两性离子去污剂具有类似性质的那些两性离子去污剂在本发明的范围内。该溶液的实施方案能够裂解靶标宿主细胞并溶解大部分细胞蛋白。在更优选的实施方案中，本发明的裂解溶液可与其他核酸分离方法，例如，高浓度离液剂盐联合以驱使核酸结合到固态支持体基质。该溶液的优选的缓冲剂/去污剂实施方案包括溶菌酶和DNA酶或RNA酶。
在另外的实施方案中，还预期上述裂解溶液可以还含有螯合剂、盐、聚乙二醇、溶菌酶和RNA酶或DNA酶。如本领域中技术人员将理解的，用于除去DNA纯化步骤中RNA的RNA酶，或者用于除去RNA纯化步骤中DNA的DNA酶在使用本发明的方法纯化靶核酸的技术上不需要，但是通过包括这些成分显著提高了核酸产率和纯度。此外，包括溶菌酶对所得产率具有显著影响，并且尤其优选作为本发明裂解溶液的额外的成分。考虑包括这些组分用于根据本发明的核酸分离方法中。
在优选实施方案中，裂解溶液的缓冲组分为pH约8的Tris-Cl，尽管考虑其他缓冲化合物。通常，裂解溶液中Tris-Cl的终浓度为约0到约200mM，优选约15到75mM。注意到可以调整本发明的缓冲组分从而很少需要或者不需要改变最终溶液的pH。例如，缓冲组分可以是Tris-氨基和Tris-氨基盐酸盐的组合以提供pH约7.9到8.4的最终裂解溶液。一种阐明性组合是最终裂解溶液中包括约17mM Tris氨基与28mM Tris-氨基盐酸盐。可以用其他缓冲组合得到适宜的裂解溶液pH，其如上面提到的最适为7.9到8.4。
用于裂解溶液的优选的盐为用于核酸沉淀中的任何常用盐，例如，NaCl、NH4Cl、NH4SO4、MgCl2、等等。在优选实施方案中，盐为NaCl，部分是由于其可利用性和相对低成本。裂解溶液中盐的终浓度优选为200到800mM，更优选约400mM。
用于裂解溶液的优选螯合剂为EDTA，但是预期也可以使用EGTA。本发明的实施方案中可以使用的EDTA的终浓度为0到20mM，优选约9mM。
用于本发明的聚乙二醇(PEG)的优选分子量为约2,000到10,000道尔顿，更优选约8,000道尔顿。通常，裂解溶液中的最终PEG浓度为2到20％，优选2到8％。注意到使用本领域中公知的技术，例如，通过将加热到适宜的温度并过滤以除去微粒制备PEG。令人惊奇地，具有较高分子量的PEG对本发明的纯化的低分子量核酸的质量具有有害影响。
通常，裂解溶液的实施方案包括溶菌酶，例如，蛋清溶菌酶或者重组溶菌酶，终浓度为约300到2,000μg/ml，优选800到1,200μg/ml。此外，RNA酶(或者当纯化靶标为RNA时，DNA酶)，例如，RNA酶A、RNA酶1、RNA酶T1优选以约200到400μg/ml的浓度包括在裂解溶液中。在两种情况中，溶菌酶或者RNA酶以冻干粉末或者以溶液保存。例如，RNA酶通常保存在100mMNaCl、10mM Tris、和1mM EDTA溶液中。注意到溶菌酶和RNA酶分别是最优化产率，即，完全释放核酸和除去RNA污染物所需的，并且可以以高于上面所公开的浓度包含，但是该更高浓度对于增强产率和质量有限。溶菌酶、RNA酶和DNA酶可以通过商业途径得到。
裂解溶液还包括终浓度为约0.2％到6％，优选约2到4％的去污剂。注意到本发明的溶液中可以使用较低量的去污剂，尤其当被裂解和溶解的细胞的浓度很低时。此外，尽管考虑本发明中使用较高水平的去污剂，但是它们可能不增加额外的功能价值从而不优选。
通常，去污剂为离子去污剂、非离子去污剂，或者两性离子去污剂。用于本发明的典型的离子去污剂包括，但不限于脱氧胆酸。用于本发明的典型的非离子去污剂包括，但不限于，Triton X-100、Apo10、Apo12和NP40。典型的两性离子去污剂包括，但不限于，CHAPS和磺基三甲铵乙内酯，磺基三甲铵乙内酯去污剂分别以例如商标名ZwittergentTM和AnzergentTM出售。还注意到在某些情况中，还可以使用，但不优选非去污剂两性离子材料。
在本发明的优选实施方案中，去污剂为两性离子去污剂，例如，以商标名ZwittergentTM和AnzergentTM出售的两性离子去污剂，所述去污剂具有化学名正-十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-辛基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-癸基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-十二基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐。用于本发明的一种优选的去污剂为正-癸基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸。注意到本发明的去污剂可以以如下商标名购买，例如Anzergent 3-14，分析级；Anzergent3-8，分析级；Anzergent 3-10，分析级；Anzergent 3-12，分析级，或者zwittergent 3-8、zwittergent 3-10、zwittergent 3-12和zwittergent 3-14、CHAPS、CHAPSO、Apo10和Apo12。
注意到还考虑用于本发明的兼容去污剂可以混合在一起以提供用于裂解溶液中的必要的去污剂组合物(终浓度)。例如，在裂解溶液中终浓度为2％的去污剂可以由50∶50正-癸基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐∶正-十二基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐组成。
此外，预见裂解溶液的实施方案中可以包括其他成分，例如，浓度为50mM到6M，优选200mM到400mM的离液剂盐可以包括在溶液中以帮助蛋白质变性。此外，该溶液中可以包括0.5％到25％的醇，像异丙醇，以帮助低分子量核酸的沉淀。
在裂解溶液的制备期间，应该在溶液的其他组分已经使pH为7.9到8.4，优选约8.1的pH后加入溶菌酶、RNA酶(或者DNA酶)，和去污剂。当需要调节pH时，可以使用本领域中任何种类的熟知酸或者碱，例如，HCl或者NaOH。
还注意到如上讨论的，通过用缓冲溶液的适宜量和组成制备溶液，裂解溶液的pH应该相当接近可接受的范围。
裂解溶液优选保存在4℃，尽管还预见可以在室温保存。通常，溶液可以保存长达3个月。然而，还预见不存在RNA酶、DNA酶，和溶菌酶时该裂解溶液可以保存长达1到2年。当需要更长保存时间时，可以在使用时有利地加入从浓缩液或者如上述从冻干粉末制备的溶菌酶、RNA酶和DNA酶。
在尤其优选的实施方案中，加入靶标宿主细胞的裂解溶液的温度为约0到10℃，更优选1℃到8℃，最优选0℃到4℃，通常约2℃到6℃。本文中所用术语“预冷的”指本发明的裂解组合物在前面的温度范围内。同样的，当预计裂解步骤时，裂解溶液在用于宿主细胞前应该置于冰上足够的时间以实现必要的温度。
表1提供了用于本发明方法的阐明性裂解溶液。
表1阐明性裂解溶液
裂解和溶解方法使用上述裂解溶液的方案，用本发明的方法裂解和溶解靶标宿主细胞。为了裂解和溶解靶细胞，裂解溶液含有缓冲剂和去污剂，优选两性离子去污剂。在尤其优选的实施方案中，裂解溶液还含有溶菌酶。根据所裂解和溶解的材料的预期用途，该裂解溶液可以还包括如上述的其他任选成分。例如，当预期分离RNA时，包括DNA酶是有利的，或者当预期分离DNA质粒载体时，裂解溶液可以包括RNA酶。
在优选实施方案中，该方法包括将细胞用预冷的裂解溶液涡旋或者混合10到30秒，然后是1到10分钟，更优选3到5分钟室温孵育。本发明的该优选方法提供了碱性裂解方法的相容方法，花费少一半的时间，并且通常提供更高质量的产物，即，澄清的裂解物。
裂解方法和核酸纯化本发明的方法还包括对含有靶标低分子量核酸分子的宿主细胞实施一种溶液纯化方法。该方法导致直接从裂解的细胞，即，直接从粗制细胞裂解物分离低分子量核酸，例如，质粒DNA。通常，使用本发明的方法和组合物，从宿主细胞释放低分子量核酸，并通过本发明的组合物实施方案溶解宿主细胞蛋白质的相当大部分。所释放的低分子量核酸被核酸捕获基质从粗制细胞裂解物捕获，并用基于醇的缓冲液洗涤该基质。用适宜的缓冲液从捕获基质洗脱所得捕获的低分子量核酸，其通常为高产率和极好的质量。同样的，按照本发明的方法，用单一缓冲液裂解宿主细胞和在固态支持体，即核酸捕获基质上结合/捕获靶标低分子量核酸。该完整过程(如下文更完整描述)可以在约8到10分钟内进行，并且需要仅一种标准实验室设备。
更详细地，用靶标低分子量核酸转化细菌或者其他适宜的宿主细胞，如本领域中熟知的。宿主细胞生长到目标浓度(通常5×108到20×108个细胞/ml或者A600为1到4OD单位)，收获，旋转沉淀。从细胞沉淀倾出任何LB生长培养基或者细胞上的任何其他溶液)，将本发明的预冷裂解溶液(0℃到4℃)加入细胞沉淀中。通常，每1.5ml培养材料加入约400μl裂解溶液，尽管可以对其进行调整以对细胞浓度和裂解溶液组合物进行优化，例如，当处理更少数目的细胞时，裂解溶液中可以包括更低浓度的去污剂。注意在本发明的备选实施方案中，将裂解溶液直接加到细胞培养物中，即，在细胞被旋转沉淀和生长培养基从细胞沉淀倒出之前。通常，组合约2∶1到约1∶3比例的细胞裂解溶液，该比例取决于细胞浓度、裂解溶液的实施方案和其他类似参数。尽管向细胞直接加入裂解溶液取消了除去生长培养基所需的离心步骤，但是其可以稍微增加裂解纯化方法期间所分离核酸的蛋白质污染，这是由于起始材料中存在更高水平的潜在污染性材料。然而，当这些污染物意义较小或者时间很重要时，本发明使得可以进一步减少必要处理步骤。
裂解溶液的组成在下文中更详细讨论，该裂解溶液在宿主细胞上持续涡旋或者混合约10到30秒，更优选约20秒。重悬浮的细胞混合物接着在室温孵育1到10分钟，更优选地3到5分钟，最优选地约5分钟。室温孵育导致从宿主细胞大量释放低分子量核酸和溶解大部分宿主细胞蛋白质。注意更短的裂解溶液室温孵育可以与本发明一起使用，尽管低分子量核酸的产率相应较低。此外，可以使用更长的室温裂解孵育，但是5到10分钟的孵育后通常观察到低分子量核酸产率或者质量的很小提高。
宿主细胞上包括预冷的裂解缓冲液，和随后室温孵育提供了温度梯度，在该温度梯度期间宿主细胞蛋白质被裂解缓冲液溶解。不被理论所束缚，认为本发明的该方面利用了一系列温度(从0℃-4℃到室温)和某种程度上pH改变(由于缓冲液的温度改变)时不同的细胞蛋白质溶解度。然而，预见可以关于本发明的方法调整裂解缓冲液温度和宿主细胞孵育温度，对低分子量核酸的总的产率和纯度产生一定影响。
室温孵育后，将所释放的低分子量核酸和溶解的细胞碎片转移到自旋柱，其具有至少一层核酸(NA)捕获基质(优选的实施方案可以具有掺入到该自旋柱的第二和/或第三层NA捕获基质)。上面的混合物通过该自旋装置以约14,000RPM(20,000×G)旋转约30秒，使用小型或微型离心机(本领域中技术人员将认识到在本发明的背景中可以使用其他速度和时间，只要流体穿过自旋柱，如本领域中熟知的)。注意在该方面也可以使用其他方法，例如，真空过滤等等材料通过核酸捕获基质的方法。
在备选实施方案中，NA捕获基质材料直接包括在裂解缓冲液中并在室温裂解缓冲液/宿主细胞孵育期间直接加到宿主细胞。在这些情况中，裂解缓冲液/核酸捕获基质在加到宿主细胞沉淀之前必须完全混合从而基质完全重悬浮。
NA捕获基质结合到从细胞碎片，即粗制裂解物释放的低分子量核酸的部分。令人惊奇地，孔隙大小大于1-2μm的核酸捕获基质优选用于本发明，并且优选地，在低分子量核酸的捕获期间使用多层核酸捕获基质，每一层具有至少1-2μm的孔隙大小。注意还预期孔隙大小小于1-2μm的基质材料也用于本发明，但是表现出倾向于阻塞并且需要较大孔隙材料不必要的额外的处理。此外，优选用于此处的较大的孔隙材料倾向于提供更好的捕获特征，而较小的孔隙材料不能提供所述捕获特征。为了最大化捕获的低分子量核酸的纯度，对装载的核酸捕获基质实施一次或多次洗涤步骤。洗涤缓冲液通常为20mMTris-Cl，pH7.2，0.2M NaCl，和2mM EDTA，pH 8.0)/异丙醇溶液。通常，Tris缓冲液异丙醇的比例为约30-35∶70-65，优选约32.5∶67.5(注意可以用其他类似醇，例如乙醇代替异丙醇)。注意到本发明可以使用其他洗涤缓冲液组合物，只要它们比低分子量核酸优先从捕获基质解离污染物。该洗涤步骤除去来自装载的核酸捕获基质的松散结合的蛋白质和其他大分子。
最后，用10mM Tris，0.1mM EDTA溶液(pH约8.5)从NA捕获基质洗脱低分子量核酸。通常的洗脱参数包括使用更小的体积保持靶标低分子量核酸的较高浓度，和最小化洗脱缓冲液中EDTA或者其他酶抑制性组分的量。
如关于上面的洗脱缓冲液阐明的，可以在与最终用途应用相容的溶液中，例如，使用对聚合酶具有很小的抑制活性的洗脱缓冲液实施低分子量核酸的洗脱。同样地，可以对洗脱的样品直接实施最终用途应用而不必沉淀和在适宜的缓冲液中重悬浮该核酸。用于本发明的其他洗脱缓冲液包括水、TE缓冲液、10-50mM Tris缓冲液，等等。
核酸捕获基质许多不同的核酸捕获基质组合物可以与本发明的方法和组合物联用以捕获低分子量核酸。用于本发明的捕获基质组合物包括基于二氧化硅、尼龙和丙烯酸的材料。滤器捕获基质材料的通常的孔隙大小为1到25μm，优选1到5μm，最优选3到5μm。注意具有更大孔隙的基质材料可以与本发明连用，但是在捕获低分子量核酸中较不有效。此外，更小孔隙捕获基质材料，例如，小于1μm，也可以与本发明连用，但是倾向于在捕获过程期间堵塞(注意到具有1到2μm孔隙大小的基质材料也可以表现出一定水平的堵塞，这取决于基质层数和样品大小)。
在优选实施方案中，捕获基质材料的第一层掺入到如本领域中熟知的旋转装置中。捕获基质材料将在组成和孔隙大小上与前述参数相容，但是优选为孔隙大小为3到5μm的玻璃纤维。在某些实施方案中，旋转装置包括两层捕获基质材料，例如，第一(上)层材料的孔隙大小约5μm，第二层(下一层)捕获基质具有的孔隙大小约为3μm。额外的捕获基质材料为捕获靶标低分子量核酸提供了额外的表面区域/支持体。通常，这两层是不同的材料，尽管考虑这两层可以是相同材料。此外，层之间的孔隙大小通常是不同的，较大的孔隙大小材料在较小的孔隙大小材料之上。最后，可以加入额外的捕获基质材料，尽管滤器材料的堵塞可能变得更严重。
注意NA捕获基质中可以包括玻璃料，其在一层或多层捕获基质材料层之下用于支持。通常的玻璃料由惰性材料，例如聚乙烯组成，具有5到70μm的孔隙大小。
在备选实施方案中，一部分，例如350μl NA捕获基质浆液，例如，溶液中的二氧化硅颗粒直接沉积到裂解溶液/宿主细胞材料中并孵育短的时间段(通常使用涡旋或者其他混合技术)。如上旋转沉淀捕获基质浆液/裂解溶液混合物，并用适宜的洗涤缓冲液洗涤沉淀的基质。
如上文，用适宜的洗脱缓冲液释放捕获的低分子量核酸。此外，二氧化硅包被的磁珠可以用作NA捕获基质。这些珠子的使用和制备在美国专利号6,368,800中描述，将该专利并入作为参考。使用二氧化硅包被的磁珠避免了在靶标核酸的纯化期间需要离心步骤。
表2提供了代表性NA捕获基质材料与相应孔隙大小以及几种通过商业途径可获得的旋转装置。
表2NA捕获基质材料
裂解方法的自动化本发明的方法和组合物可用于在高通量应用中从靶标宿主细胞分离高产率和高质量的低分子量核酸。
使用标准实验室设备和人员可以一次对一个样品实施本发明的方法。然而，由于实施本发明的方法所需的有限数目的步骤和/组合物，和由于这些步骤复杂性的有限水平，预期这些方法可以用于高度自动化步骤以从许多分散处理的样品分离靶核酸样品。
具体地，本发明的组合物和方法可用于多孔，例如，96或384孔方案中。细胞生长于具体步骤所需的适宜数目的孔中。适宜的细胞生长后，用多孔板离心沉淀细胞。将多孔板中的每个细胞样品重悬浮在约400μl预冷的裂解溶液中。摇动平板，或者用多通道移液管或者96针头吹打每孔组分，以便完全重悬细胞。样品在室温下孵育约3到5分钟。使用多通道移液管或者96孔针头，将来自每管的裂解物转移到相应多孔滤器板中。滤液真空通过滤器基质(如上讨论的相同类型的捕获基质形式)以在捕获基质上捕获低分子量核酸。再次使用多通道移液管或者96孔针头，向滤器板的每孔加入约400μl洗涤缓冲液。洗涤缓冲液穿过捕获基质以除去残留的蛋白质和核酸，并抽真空直到多数残留的醇从捕获的低分子量核酸除去。制备适宜的板以接收洗脱的低分子量核酸，并对每种样品实施洗脱。也可以用离心实施该强行使液体穿过滤器板的方法。注意到在自动化方法期间应该避免离心，其中该方法在自动化工作站上进行。
最后，注意用二氧化硅包被的磁珠可以实施本发明的自动化方法。纯化步骤应该基本上和上面的相同，只是应该利用珠子的磁性性质将NA捕获基质与裂解物分离并且应该不需要离心步骤。
使用预先校准的设备，可以将该方法自动化成高通量方法。预见用于高通量操作的其他方法并且这些方法不限于96孔或者384孔板。同样的，本发明的方法对于许多离散的高质量低分子量核酸样品的自动化制备是理想的。
低分子量核酸纯化试剂盒本发明的实施方案提供了用于实施上述核酸纯化/分离方法的试剂盒。在本发明的一个实施方案中，该试剂盒包括裂解溶液和NA捕获基质材料(作为旋转柱或者基质浆液)。在优选实施方案中，该试剂盒还包括洗脱溶液和洗涤缓冲液。本发明的试剂盒还可以包括分子生物学级水、收集管、384孔板(任选装入NA捕获基质)、96孔板(任选装入NA捕获基质)、移液器头、微型离心机、保护性手套，等等。
为了最大稳定性，该试剂盒可以含有冻干的溶菌酶、RNA酶和/或DNA酶，它们可以在试剂盒第一次使用时加入裂解溶液中。在某些实施方案中，可以单独提供去污剂以仅在使用前加入到其他成分中。
最后，在某些试剂盒中，考虑还可以包括用于细胞培养的许多管，例如，Lid-Bac管(美国专利号5,958,778和6,503,455，并入本文作为参考)。这些管应该允许在单个管中培养靶细胞和处理、裂解和溶解那些相同的细胞(使用本发明的裂解溶液和方法)。然后通过加入核酸捕获基质浆液在该相同管或者在另一管，例如，其中直接装入一层核酸捕获基质的旋转装置中分离靶核酸。
结合溶液在根据本发明的备选实施方案中，用包含缓冲剂、PEG和盐的溶液优先将来自澄清的裂解物的核酸结合到二氧化硅纤维。优选的结合溶液包括分子量为2,000到10,000道尔顿的1到20％PEG；约100到2000mM盐，例如，NaCl；约10到200mM缓冲液，例如，Tris。与该结合缓冲液使用的NA捕获基质包括二氧化硅珠和纤维。优选的二氧化硅纤维具有1到20μm，更优选约3到5μm的孔隙。
已经一般性描述了本发明，通过参考下面的实施例将更容易理解本发明，这些实施例仅为了阐明而提供，并且不打算作为限制。
实施例实施例1制备裂解溶液表3提供了本发明的一种潜在的裂解溶液的组合物。每种组分的浓度是按照每升溶液组分的重量来计。
表3.裂解溶液
实施例2室温孵育增加了高质量质粒DNA的回收下面的实施例阐明裂解缓冲液与含有质粒的细菌细胞3到10分钟室温孵育，优选5分钟室温孵育对于高质量质粒DNA的高产率回收是有益的。
如本领域中熟知的，将细菌宿主细胞用pUC19质粒转化在96孔板中过夜生长。将平板在室温解冻15分钟，并向板的每孔加入前面描述的裂解缓冲液约400μl。注意裂解缓冲液在加到细菌培养物之前预冷到0℃。
培养物经立即旋转沉淀，或者在平板振荡器上重悬浮，并在室温孵育不同的时间量。除去具有0到10分钟室温孵育的每种裂解物并将其转移到基于二氧化硅的NA捕获基质并以14000转/分钟旋转沉淀1分钟。从每孔除去所得滤液，并用洗涤缓冲液(20mM Tris-Cl pH 7.2，0.2M NaCl，2mM EDTA pH 8，75％异丙醇)洗涤NA捕获基质。以14000转/分钟旋转洗涤缓冲液1分钟。用50μl洗脱缓冲液(10mM Tris-Cl和0.1mM EDTA)从NA捕获基质洗脱捕获的pUC19，并检查每种洗脱样品的pUC19产率和蛋白质污染。
参考图1A，在0.5％琼脂糖凝胶上运行来自每种孵育条件的分离的质粒DNA。溴化乙锭染色的凝胶表明所有孵育条件提供了质粒DNA的良好产率，包括立即旋转条件。图1B和表4提供了关于孵育时间的每种样品浓度和A212值的图示和列表阐明。注意随着室温孵育期的进行，样品中蛋白质污染降低直到约3分钟，此时样品中蛋白质和核酸浓度稳定。一并考虑，图1A和1B阐明裂解缓冲液对靶细胞的室温孵育减少了分离的pUC19的蛋白质污染而没有不利地影响质粒的产率。该实施例表明裂解溶液对宿主细胞的3到10分钟，优选5分钟室温孵育可用于最大化所得低分子量核酸的产率和纯度。此外，使用本发明的溶液和方法，更短的孵育，0到2分钟，似乎不能完全允许污染物与靶核酸分离。注意短孵育时间的DNA的高浓度(如通过吸收读数确定)由于污染而增加并不代表实际浓度。对于大于或者等于3分钟的孵育时间所示的浓度代表所分离DNA的真实浓度。
表4使用不同室温孵育的质粒产率和蛋白质污类
实施例3去污剂类型和浓度对于裂解缓冲液有效性是关键的用于用核酸转化细菌宿主细胞的方法和溶液与生长转化的细胞用于分离所述核酸是本领域中熟知的。此外，用于从细菌宿主细胞纯化质粒DNA的发明性方法与上面实施例2中所示基本上相同，只是改变裂解缓冲液中去污剂类型以确定哪种类型的去污剂在该背景中最有用。
关于用于该实施例中的裂解缓冲液条件，所制备的标准裂解缓冲液具有50mM Tris-Cl(pH-8)；10mM EDTA(pH-8)；350μg/ml RNA酶；1200μg/ml溶菌酶；7.5％PEG-8000；1％去污剂(根据样品改变类型)；50μl/ml玻璃基质珠；和0.75M NaCl。
使用上面的该基本组合物制备了一系列12种不同的裂解缓冲液，每一种具有加到1％的终浓度的不同类型的去污剂。具体地，去污剂为(1)N，N′，N′-聚氧乙烯(10)-N-牛脂-1，3-二氨基丙烷(N，N，N-PTD)，(2)NDSB-195，(3)NDSB-201，(4)NDSB-256，(5)Apo-10，(6)Apo-12，(7)CHAPS，(8)正-辛基-B-D-吡喃葡萄糖苷，(9)De-Oxcholic Acid，(10)SDS，(11)Triton X-100与SDS混合(50∶50)，和(12)Triton X-100。注意在缺少RNA酶、溶菌酶和去污剂时可以使裂解缓冲液达到pH 8.5。如图2中所示，用于裂解缓冲液中的去污剂类型对纯化的质粒DNA的产率和质量都具有显著影响。例如，包括N，N，N-PTD去污剂导致高产率/高质量一步质粒制备，而在完全相同的条件下，包括De-oxcholic Acid提供了质粒DNA的足够产率，但是降低了所纯化的质粒DNA的质量。同样的，去污剂类型对所得产率和质量具有深远影响。
用两性离子去污剂实施一系列实验以确定它们用于裂解缓冲液中的有效性。通常，两性离子(zw)去污剂以1到4％的浓度使用以确定所有或者特定类型的两性离子去污剂在本发明的方法中有效。有趣地，两性离子去污剂正-辛基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐(zw-8)、正-癸基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐(zw-10)、正-十二基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐(zw-12)、正-十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐(zw-14)都显示出足够(zw-8)或者良好的结果(zw-10、zw-12和zw-14)(数据未显示)。
为了进一步限定两性离子去污剂在裂解溶液中的有效性，将去污剂单独或者混合以约1％到4％的终浓度掺入相同的裂解溶液(zw-10、zw-12和zw-14)中。表5阐明这些结果的概述，表明1到4％的两性离子去污剂对于宿主细胞高产率和纯度地分离低分子量核酸是极佳的。包括使用NP40或者Qiagen试剂盒纯化的DNA的数据用于比较。
表5两性离子去污剂浓度和类型影响靶核酸的产率和纯度
该数据阐明了在本发明的裂解溶液和方法的背景中使用两性离子去污剂的有效性。
实施例4预冷的裂解溶液增强所纯化核酸的质量本发明的裂解方法和溶液用于评估向pUC19转化的DH5α细胞加入不同温度的裂解溶液的效果。如上确定分离的pUC19的质量。
用于用pUC19转化细胞，和生长转化细胞以分离pUC19的方法和溶液是本领域中熟知的。制备如上面实施例中描述的裂解溶液，其含有由3％zw 3-10、3％zw 3-12、或3％zw 3-14组成的去污剂。每种去污剂条件的裂解溶液在加入细胞前在室温放置、冷却到4℃或者冷却到约0℃。表6和图3中的结果表明用冷却的裂解溶液(4℃和0℃)分离的DNA比用室温裂解溶液分离的DNA具有更高质量的分离DNA。图3中的泳道3-18表明在每种温度下来自每种去污剂类型的产率大约相同(每泳道运行2μl每种样品)，相反地，来自相同样品的吸收读数表明不管去污剂类型，使用室温裂解溶液分离的pUC19具有更高水平的蛋白质污染(见表6)。
表6裂解溶液的温度影响NA质量
该数据一般地阐明与在室温加入细胞的裂解溶液相比，预冷的相同裂解溶液提供了更高质量的分离的质粒DNA。然而，注意在室温加入的裂解溶液不提供分离的质粒DNA，并且分离的质粒DNA具有相当好的质量。
实施例5核酸捕获基质的基质材料和孔隙大小对于高产率和质量分离是关键的本发明的裂解方法用于评估具有不同组成和孔隙大小的许多滤膜物质分离高质量低分子量核酸的有效性。研究了滤器类型和孔隙大小分离高产率和高质量低分子量核酸的有效性。
从靶标宿主细胞释放低分子量核酸的方法如上文描述。简言之，在96孔培养板中靶标宿主细胞中增殖靶标低分子量核酸。宿主细胞生长到预定浓度，旋转沉淀细胞并除去生长培养基。向每孔加入约240μl预冷的裂解溶液并将细胞在调节到7的平板振荡器上重悬浮2分钟。
改变过滤板的孔中的过滤条件，其中每个板的孔具有6种过滤组合之一，如下制备这些过滤组合样品1包括两层NA捕获基质；层1(上层)为玻璃纤维层(1.2μm孔隙大小)，层2(中间)为玻璃纤维(0.8μm)，玻璃料为聚乙烯；样品2包括与样品1相同的组合，只是玻璃料为疏水的；样品3包括两层，第一层为23μm玻璃纤维滤器，其在孔隙大小为25μm的玻璃料上面；样品4包括11μm玻璃纤维滤器/聚丙烯25-30μm组合；样品5包括聚丙烯25-30μm上20μm/11μm玻璃纤维滤器组合；样品6包括聚丙烯25-30μm上7μm玻璃纤维滤器组合。
表7中的结果表明，不像常规分离技术，本发明提供了用孔隙大小通常大于约1μm的捕获基质提供了最佳结果。用样品3和5中基质组合看到了本实施例的最好结果，表明11μm玻璃纤维滤器和23μm玻璃纤维滤器上的20μm玻璃纤维滤器提供了用于本发明的良好的低分子量核酸捕获和释放特征。
表7NA捕获基质结果
使用在1.5ml宿主细胞培养液和400μl裂解预冷的溶液实施第二系列实验。样品与室温下的裂解溶液孵育5分钟。如下试验14种不同的捕获基质组合(1)Pallflex U100z Med.(粗糙的面向上)；(2)S&S GF#25；(3)Pallflex 2500-S 2608G(平滑的面向上)；(4)Pallflex 2500-S2608G(粗糙的面向上)；(5)Pallflex 2500 AE53009M(平滑的面向上)；(6)Pallflex 2500 AE 53009M(粗糙的面向上)；(7)Whatman GMF 934AH；(8)Whatman GMF 150 2μm(相同孔隙大小的两层)；(9)Wha tman 150 2μm(仅顶层)；(10)20μm PE玻璃料与5μm GF层；(11)一层5μm GF；(12)S&S GF号24(平滑的面向上)；(13)23μm玻璃纤维滤器(Ciro)和(14)23μm玻璃纤维滤器(Ciro)与标准缓冲液。
试验所分离的质粒DNA的浓度和质量以及用于测序反应中。(见表8和9)。结果表明玻璃纤维和较大孔隙大小样品是核酸捕获基质的良好候选者。
表8NA捕获基质浓度、A260/280、和A212结果
表9分离的低分子量核酸的测序质量
第三个系列实验在表10和图4中显示，其中试验了NA捕获基质材料和孔隙大小从细菌宿主细胞来源分离质粒DNA的能力。收获含有XL1Blue/pBS2的细菌宿主细胞并如上面实施例中在前描述的用裂解溶液处理。相似处理的样品与尼龙、PVDF或者玻璃纤维滤器接触，这些滤器具有如下描述的孔隙大小(1)0.45μm尼龙纤维，(2)1.2μm尼龙纤维，(3)5.0μm尼龙纤维，(4)PallflexEmfab纤维与70μm玻璃料，(5)0.45μm PVDF，(6)1.0μm玻璃纤维滤器，(7)两层1.2μm玻璃纤维滤器，(8)23μm玻璃纤维滤器，(9)20μm玻璃料上为3μm玻璃纤维滤器，再上面为5μm玻璃纤维滤器。
图4表明尽管用尼龙或者Pallflex分离质粒DNA产生了合适的结果，玻璃纤维材料，尤其样品9中两层玻璃纤维材料在本发明背景中提供了极好的NA捕获基质。如表10中所示，所分离的质粒DNA的质量显示出良好的A260/A280比例和A212读数，特别对于具有孔隙大小为4/μm的第一层和孔隙大小为3μm的第二层的两层玻璃纤维捕获基质的样品9。
表10质粒DNA质量
实施例6本发明的方法和组合物可用于许多不同的宿主细胞和靶标低分子量核酸下面的实例中的数据阐明所述裂解溶液可用于从几种不同的宿主细胞分离不同大小的质粒DNA。宿主细胞/载体组合在LB/amp培养基中过夜生长14到16小时。每种细胞条件由1.5ml沉淀的培养物组成，将该沉淀的培养物用400μl裂解溶液(见实施例1)处理。表11和图5中数据表明本发明的方法和组合物可用于许多不同的宿主细胞和不同的质粒。
表11来自不同宿主细胞的质粒DNA
实施例7所纯化的低分子量核酸可以直接用于PCR反应用本发明的方法和组合物从宿主细胞回收后，所纯化的低分子量核酸可直接在PCR反应中扩增。用本发明的方法和溶液处理含有来自小鼠cDNA文库的pGEM克隆的细菌细胞，并将分离的pGEM直接用于PCR反应中，即从本发明的NA捕获基质洗脱pGEM后，不对其实施额外的步骤。PCR反应掺入T7和Sp6引物并且用本领域中熟知的PCR方法实施该PCR反应。
如图6中所示，用本发明的方法和组合物分离的pGEM DNA是PCR的极好的模板。该数据表明本发明提供了可以直接用于PCR的质量DNA，重要的是，该DNA在用于这些反应中时不需要额外的操作。
实施例8用本发明的方法和组合物可以以96孔形式分离质粒DNA在96孔板中生长含有pUC19质粒的细菌宿主细胞以确定本发明的方法和组合物是否可应用于高通量应用。
如上述生长和旋转沉淀细胞，只是细胞生长在96孔板的孔中并且用平板离心机沉淀。向每孔加入约400μl预冷的裂解溶液。将板振荡、涡旋或者每孔单独上下吹打以完全混合裂解溶液中的细胞。然后室温孵育5分钟并洗脱和分析DNA。如表12中所示，从96孔板生长的宿主细胞分离的质粒DNA显示出良好的质量和产率。注意质粒DNA在96孔滤器板中捕获，该板中每孔具有一对玻璃纤维层，它们的孔隙大小为5μm和3μm，NA捕获基质在7μm玻璃料上。
该实施例中的数据表明本发明的方法和组合物适用于高通量应用，例如，96孔形式板。此外，所述数据还表明通过在平板振荡器上振荡平板，在平板涡旋器上涡旋该平板，或者用96孔针头吹打每孔的内含物可以完成细胞与裂解溶液的混合。
表12来自96孔板的48个孔的数据
实施例9使用本发明的方法和组合物纯化的质粒DNA的质量与其他常规质粒DNA纯化方法相当来自划线LB琼脂板的2到5毫升培养物(Top10细胞/pSV-β-gal)过夜生长达到所希望的细胞密度。在15ml锥形管中实施生长。收获约1.5ml细胞并沉淀和根据本发明中描述的方法和组合物或者根据生产商的建议(Qiagen、Invitrogen、Biorad或者Promega)处理(见实施例1-8)。具体地，使用裂解溶液分离的质粒DNA的质量与用Qiagenprep Miniprep试剂盒、WizardPlus SV Minipreps DNA纯化系统(Promega)、AurumPlasmid Mini试剂盒(BioRad)、S.N.A.PMiniPrep试剂盒(Invitrogen)分离的质粒DNA的质量进行比较。对每种方法使用相似数量的起始细胞和洗脱体积。
通过琼脂糖凝胶分析、分光光度法分析、DNA测序和限制酶消化比较纯化的质粒DNA。
琼脂糖凝胶电泳分析将用QIAgen方法和本文中描述的裂解方法分离的约4％质粒DNA加到含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶中。注意在加入凝胶前向每个样品加入1.5×Orange II染料。此外，加入100ng和200ng pUC19质粒DNA作为对照。如图7A中所示，根据本发明分离的质粒DNA提供了与QIAgen分离的质粒DNA相当的产率。
分光光度分析用SPECTRAmax微板分光光度计(MolecularDevices Corp.)分析来自每种纯化方法的样品以确定DNA浓度和纯度。将样品在UV-Star 96孔板(Greiner bio-one Corp.)中稀释20倍。在下面的波长采集吸收读数260、280和212nm。每种样品一式两份地进行。将浓度和A260/280比率平均以确定图7B中给出的值。图7B中的数据阐明本裂解方法提供了极佳的浓度和产率，与QIAgen、Invitrogen、BioRad或者Promega试剂盒相当或者更好。
DNA测序通过ABI BigDyeTM终止子化学在ABI 3700测序仪上测序进一步分析每种方法的样品。对质粒DNA实施测序并且一式两份地进行。将模板DNA加入反应物并且模板DNA根据载体和沉淀的起始材料而变。将200ng到300ng模板DNA等分到96孔板(Genemate-ISC Bioexpress)中，总体积为4μl。测序参数如下步骤1-94℃2分钟；步骤2-94℃10秒；步骤3-50℃5秒；步骤4-70℃4分钟；步骤5-返回步骤2并重复25次，步骤6-10℃保持。
在装入ABI 3700 DNA测序仪前实施测序清除。向每孔加入约15微升99％异丙醇并使用Expender Heat Sealer热封，然后快速涡旋。将样品在室温孵育15分钟并以1900×g离心30分钟。离心后，除去热封并将板倒置在纸巾上然后倒转返回到离心板载体。将该板以500×g旋转1分钟。将该板从离心机除去并将DNA重悬浮在10微升1/10×TE中并装入测序仪。用基于PHRED的软件版本0.020425.c(CodonCorporation)实施质量得分。100质量得分≥20的那些样品为合格的结果。
如表13中所示，所有5种试剂盒都提供了合格的测序得分。此外，图8提供了每种试剂盒的DNA的阐明性测序追踪。该数据表明本裂解和纯化方法和组合物提供了与使用其他试剂盒厂商的试剂盒分离的DNA相当质量的DNA。注意到本发明，包括洗脱步骤，在约14分钟内进行，而QIAgen花费约28分钟，Invitrogen花费约31分钟，Promega花费约36分钟。BioRad Aurum试剂盒花费约23分钟。该数据阐明本文提供的裂解溶液和方法的改良的实用性。
表13合格测序得分
限制酶消化用EcoRI、HindIII和Ned I对pSV-β-gal载体实施限制性消化。对250ng质粒DNA和1单位每种内切酶实施限制性消化。缓冲液条件如酶生产商描述。如图9中所示，本裂解分离的DNA为限制性内切酶提供了与其他常规分离方法相当的模板DNA。
实施例10PEG和盐结合溶液驱使NA结合二氧化硅纤维下面的实施例中的数据阐明PEG和盐的溶液可用于迫使低分子量核酸结合基于玻璃纤维的NA捕获基质。用如本领域中熟知的碱性裂解方法处理含有pUC19的宿主细胞。将澄清的裂解物置于本发明的基于二氧化硅的旋转装置上并确定所分离的pUC19的产率和A260/280读数。备选地，将澄清的裂解物与8.5％PEG/850mM NaCl溶液组合并与上面的澄清裂解物基本上相同地处理。
如图10B中所示，PEG和盐驱使澄清裂解物中的pUC19结合基于二氧化硅的滤器(泳道1-4)。相比，不加入PEG和盐的澄清裂解物不能提供任何可检测的pUC19与目标基于二氧化硅的捕获基质的结合(泳道5-8)。如图10A中所示，当本发明的裂解溶液与本发明的NA捕获基质连用时得到最佳结果-其中该裂解溶液包括先前描述的浓度的PEG和盐(如泳道4-6和7-9中所示)。注意到当本发明的裂解溶液不含有PEG或者盐时，泳道1-3不显示出质粒DNA的纯化。
实施例11在本发明的核酸纯化方法期间可以向细胞培养物直接加入裂解溶液下面的实施例中的数据阐明本文中描述的裂解溶液甚至当直接加入液体细菌培养物(细胞未沉淀)时也在本发明的方法中有效。如实施例1中描述的制备裂解溶液。将样品加入多层玻璃纤维(5μm和3μm)滤器装置或者单层Whatman 23μm玻璃滤器装置。
将约1.5ml pUC19/XL1blue转化的细胞培养物与2.25ml冷却的裂解溶液混合并将细胞涡旋30秒。允许细胞在室温孵育3分钟并除去约930μl裂解物并将其加到多层或单层旋转装置以分离pUC19。注意到将每种培养物分成4份样品，导致产率为从1.5ml培养物通常预期的产率的1/4。裂解物在旋转装置中旋转沉淀并用约500μl洗涤缓冲液洗涤滤器。如前面描述的实施质粒洗脱。如上述实施吸收读数和凝胶电泳。
如表14和图11中所示，从液体培养物提取质粒DNA导致提取和纯化高质量DNA。结果显示几乎没有蛋白质或者RNA污染(见图11中A260/280读数和质粒带)。这些结果表明本发明的方法和溶液可以并入不需要在加入裂解溶液前沉淀细胞的方法中。这是有较大意义的结果-允许本发明的方法和溶液用于进一步减小从目标起始材料分离高质量核酸的复杂性和所需时间。
表14来自液体培养物与裂解溶液直接混合的数据(所有读数进行两次)
将清楚本发明适于实现本文中提到的目标和优点以及内在的那些优点。尽管为了公开的目的描述了当前优选的实施方案，但是可以进行多种改变和修饰，它们是本领域中技术人员容易联想的并且包括在本文中公开的本发明和如所述权利要求书定义的精神内。
将本文中引用的所有出版物并入作为参考。
权利要求
1.用于裂解宿主细胞的裂解组合物，其含有缓冲剂；和两性离子去污剂；其中宿主细胞中的至少一部分蛋白质被该两性离子去污剂溶解。
2.权利要求1的组合物，其还含有溶菌酶。
3.权利要求2的组合物，其还含有RNA酶。
4.权利要求2的组合物，其还含有DNA酶。
5.权利要求2的组合物，其还含有聚乙二醇。
6.权利要求1的组合物，其中所述两性离子去污剂选自正-辛基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-癸基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-十二基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-十六基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐，和它们的混合物。
7.权利要求6的组合物，其中所述两性离子去污剂的终浓度为约1％到约5％。
8.权利要求1的组合物，其还含有离液序列高的盐。
9.权利要求1的组合物，其中所述组合物的最终pH为约7.9到约8.4。
10.用于从宿主细胞纯化低分子量核酸的试剂盒，该试剂盒含有用于从宿主细胞纯化低分子量核酸的裂解溶液，该裂解溶液含有缓冲剂和两性离子去污剂；和捕获低分子量核酸的核酸捕获基质。
11.权利要求10的试剂盒，其中所述核酸捕获基质包含旋转柱，所述旋转柱含有捕获基质材料。
12.权利要求11的试剂盒，其中所述捕获基质材料含有平均孔隙大小为至少1μm的玻璃纤维。
13.权利要求11的试剂盒，其中所述捕获基质材料含有平均孔隙大小为至少3μm的玻璃纤维。
14.权利要求13的试剂盒，其还含有用于支持捕获基质材料的玻璃料。
15.权利要求10的试剂盒，其还含有用于从捕获的低分子量核酸除去污染物的洗涤缓冲液；和用于从核酸捕获基质洗脱捕获的低分子量核酸的洗脱缓冲液。
16.权利要求10的试剂盒，其中所述两性离子去污剂选自正-辛基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-癸基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-十二基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-十六基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐，和它们的混合物。
17.权利要求16的试剂盒，其中所述两性离子去污剂的终浓度为约0.2％到约6％。
18.权利要求10的试剂盒，其还含有溶菌酶。
19.权利要求10的试剂盒，其还含有RNA酶。
20.权利要求10的试剂盒，其还含有DNA酶。
21.权利要求10的试剂盒，其还含有用于培养细胞的管。
22.权利要求21的试剂盒，其中所述用于培养细胞的管为lid-bac管。
23.权利要求10的试剂盒，其中所述核酸捕获基质整合到96孔板的至少一孔中，其中该96孔板包括在试剂盒中。
24.用于从宿主细胞纯化低分子量核酸的方法，该方法包括向宿主细胞加入裂解量的裂解溶液以从宿主细胞释放低分子量核酸，所述裂解溶液含有两性离子去污剂；将用该裂解溶液处理的宿主细胞与核酸捕获基质组合，该核酸捕获基质具有平均孔隙大小为至少1μm的至少一层捕获基质材料用于捕获低分子量核酸；和从该核酸捕获基质洗脱低分子量核酸。
25.权利要求24的方法，其中所述裂解溶液中所述两性离子去污剂为约0.2％到约6％。
26.权利要求25的方法，其中所述裂解溶液中所述两性离子去污剂为约1％到约5％。
27.权利要求24的方法，其中所述裂解溶液中所述两性离子去污剂选自正-辛基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-癸基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-十二基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-十六基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐，和它们的混合物。
28.权利要求24的方法，其中所述裂解溶液在加入宿主细胞前冷却到低于室温的温度。
29.权利要求28的方法，其还包括将裂解溶液与宿主细胞在室温孵育至少3分钟后与所述核酸捕获基质组合。
30.权利要求29的方法，其中所述孵育为至少5分钟。
31.权利要求24的方法，其还包括洗脱前将具有捕获的低分子量核酸的核酸捕获基质用洗涤缓冲液洗涤。
32.权利要求24的方法，其中所述裂解溶液还含有聚乙二醇。
33.权利要求32的方法，其中所述聚乙二醇的终浓度为约2％到约20％。
34.权利要求24的方法，其中所述裂解溶液还含有溶菌酶。
35.权利要求24的方法，其中所述裂解溶液还含有RNA酶。
36.权利要求24的方法，其中所述裂解溶液还含有DNA酶。
37.权利要求24的方法，其中所述裂解溶液还含有离液序列高的盐。
38.权利要求24的方法，其中所述低分子量核酸含有质粒DNA。
39.用于从宿主细胞释放染色体外DNA的组合物，其含有具有约0.2％到约6％两性离子去污剂的溶液。
40.权利要求39的组合物，其中所述两性离子去污剂选自正-辛基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-癸基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-十二基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-十六基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐，和它们的混合物。
41.权利要求40的组合物，其还含有溶菌酶。
42.权利要求41的组合物，其还含有RNA酶。
43.权利要求41的组合物，其还含有聚乙二醇。
44.权利要求41的组合物，其还含有离液序列高的盐。
45.用于在分离细胞蛋白质与核酸期间溶解细胞蛋白质的组合物，其含有选自正-辛基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-癸基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-十二基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、正-十六基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐，和它们的混合物的去污剂。
46.权利要求45的组合物，其中所述去污剂的终浓度为约0.2％到约6％。
47.权利要求46的组合物，其中所述去污剂的终浓度为约1％到约5％。
48.用于从澄清的裂解物分离核酸的裂解组合物，其含有缓冲剂；聚乙二醇；和盐；其中将裂解组合物加入澄清的裂解物，和将澄清的裂解物和裂解组合物的组合加入二氧化硅纤维以在该二氧化硅纤维上捕获该核酸。
49.从细胞培养物中的宿主细胞纯化低分子量核酸的方法，该方法包括向细胞培养物加入裂解量的裂解溶液以从宿主细胞释放低分子量核酸；合并用裂解溶液处理的宿主细胞与核酸捕获基质，该核酸捕获基质具有平均孔隙大小至少1μm的至少一层捕获基质材料用于捕获低分子量核酸；和从核酸捕获基质洗脱低分子量核酸。
50.权利要求49的方法，其中以裂解溶液与细胞培养物体积的比为约1∶2到约3∶1的比例将所述裂解溶液加入该细胞培养物。
全文摘要
提供了用于温和裂解和溶解细胞的方法和组合物。还提供了用于从宿主细胞快速纯化高质量低分子量核酸的方法和组合物。将靶细胞用含有两性离子去污剂，例如，正－十二基－N，N－二甲基－3－铵基－1－丙烷磺酸盐的预冷的裂解溶液处理，并短暂室温孵育。当需要核酸纯化时，将裂解溶液处理的细胞与平均孔隙大小至少1μm的核酸捕获基质接触。
文档编号C07H21/00GK1768265SQ200380110142
公开日2006年5月3日 申请日期2003年12月16日 优先权日2003年3月12日
发明者M·J·多曼尼科, M·迈尔斯, K·基恩, L·R·布劳恩, T·科尔曹 申请人:伊彭多夫公司