专利名称：一种聚酰胺大环多胺化合物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种化合物及其制备方法与应用，特别涉及一种聚酰胺大环多胺化合物及其制备方法与以其金属配合物为活性成分的核酸切割试剂。
背景技术：
设计、合成定点核酸切割试剂是当前化学和分子生物学研究的一个十分活跃的领域。含有N-甲基吡咯的寡聚酰胺能够穿透细胞膜与特定的碱基序列高亲和力地结合，并控制基因表达，是一类十分重要的化学物质(Blasko A，Browne KA，BruiceTC.J.Am.Chem.Soc.1994；1163726；2.Gottesfeld JM，Neely L，Trauger JW，Baird EE，Dervan PB.Nature 1997；387202)。因此，对寡聚酰胺类化合物的设计、合成及其生物活性的研究以及提高其分子亲合性、序列选择性和切割效率具有重要意义。
合成核酸酶是化学生物学发展迅速的一个具有挑战性的新领域，大环多胺和它的金属配合物也被合成作为仿酶催化剂(R.S.Dickins，J.A.K.Howard，C.W.Lehmann，J.Moloney，D.Parker，R.D.Peacock，Angew.Chem.1997，109，541-543；Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1997，36，521-523；S.Aime，M.Botta，S.G.Crich，B.G.Giovenzana，G.Jommi，R.Pagliarin，M.Sisti，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.1995，1885-1886；S.Aoki，M.Shiro，T.Koike，E.Kimura，J.Am.Chem.Soc.2000，122，576-584；B.Knig，M.Pelka，H.Zieg，T.Ritter，H.Bouas-Laurent，R.Bonneau，J.-P.Desvergne，J.Am.Chem.Soc.1999，121，1681-1687；E.Kikuta，T.Koike，E.Kimura，J.Inorg.Biochem.2000，79，253-259)。
发明创造内容本发明的目的是提供一种聚酰胺大环多胺化合物。
本发明所提供的聚酰胺大环多胺化合物，是具有下述式(I)结构的N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷 式(I)。
该聚酰胺大环多胺化合物的分子式为C36H49N13O7。
本发明的第二个目的是提供一种制备上述聚酰胺大环多胺化合物的方法。
本发明所提供的制备上述聚酰胺大环多胺化合物的方法，包括以下步骤1)制备4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸；2)将步骤1)中制备的4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸溶于DMF中，再分别加入1倍于所述4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸的物质量的1-羟基苯并三氮唑(HOBt)和N，N二环己基亚胺(DCC)，室温反应14-18小时；然后过滤除去二环己基脲(DCU)；3)在步骤2)所得滤液中，加入1-1.5倍于步骤1)所述4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸的物质量的4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷，室温反应24-36小时，过滤，残余物用硅胶H柱层析分离得淡黄色非晶形固体；4)在步骤3)所述淡黄色非晶形固体中加入4.0-5.0倍于步骤1)所述4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸的物质量的HBr室温解析，脱除叔丁氧羰酰，再在NaOH中解析得到产物N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷。
在上述方法中，步骤1)中所述4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸可按下述步骤制备1)N-甲基吡咯与其1-1.2倍物质的量的CCl3COCl于室温进行酰化反应，得到N-甲基-2-三氯己酰基吡咯；2)N-甲基-2-三氯己酰基吡咯与分别是其1.1和0.09倍物质的量的HNO3和H2SO4在-10℃进行硝化反应，得到4-硝基-2-三氯己酰基-N-甲基吡咯；3)4-硝基-2-三氯己酰基-N-甲基吡咯与其0.8-1.2倍物质的量的NH2CH2CH2CH2CO2Et室温进行反应，得到4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰氨基丁酸己酯；4)4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰基氨基丁酸己酯在10％的钯碳催化下于与H2室温进行氢化反应，得到4-胺基-N-甲基吡咯-2-己酰氨基丁酸己酯，所述钯碳的物质的量是4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰基氨基丁酸己酯的0.05-0.15倍；5)4-胺基-N-甲基吡咯-2-己酰氨基丁酸己酯与其0.8-1.0倍物质的量的N-甲基-2-三氯己酰基-4-硝基吡咯于0℃反应，得到4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸己酯；6)4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸己酯在10％的钯碳催化下于与H2室温进行氢化反应，得到4-(4-氨基--N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸己酯，所述钯碳的物质的量是4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸己酯的0.10-0.15倍；然后再分别与其1-1.2、1-1.2和1-1.4倍物质的量的PyPyCOOH、HOBT和DCC室温反应，得到4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸己酯。
在上述方法中，步骤2)中的4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸在DMF中的浓度可为0.05-0.15M，优选为0.1M；所述1-羟基苯并氮三唑和二环己基碳二亚胺的物质的量均与4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸的物质量相等。
在上述方法中，步骤3)中加入的4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷可先溶于DMF中，其浓度可为0.2M；所述4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷的物质的量与步骤1)所述4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸的物质量相等；所述硅胶H柱层析分离的洗脱液为CHCl3∶CH3OH＝4∶1。
本发明的第三个目的是提供一种核酸切割试剂。
本发明所提供的核酸切割试剂，其活性成分是具有上述式(I)结构的N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷的金属配合物。
其中，在上述核酸切割试剂中，所述金属配合物的中心离子可为Zn2+、Cu2+、La2+等其它金属离子。
本发明的N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷具有核酸切割系统和识别系统，切割系统由大环多胺构成，识别系统由寡聚酰胺组成。本发明为进-步合成DNA定点识别及切割试剂提供了良好的基础和有效的途径，具有重要的意义。
图1为N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷的制备过程示意2为反应10min时的电泳图谱图3为反应20min时的电泳图谱图4为反应40min时的电泳图谱图5为反应60min时的电泳图谱具体实施方式
实施例1、N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷的制备N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷的合成过程如图1所示，具体包括以下步骤1、合成4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸1)1mol的N-甲基吡咯与1mol的CCl3COCl于室温进行酰化反应，得到N-甲基-2-三氯己酰基吡咯；2)1mmol N-甲基-2-三氯己酰基吡咯与1mol的HNO3和0.09mmol的H2SO4-10℃进行硝化反应，得到；4-硝基-2-三氯己酰基-N-甲基吡咯3)1mol4-硝基-2-三氯己酰基-N-甲基吡咯与1mol的NH2CH2CH2CH2CO2Et室温反应，得到4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰氨基丁酸己酯；4)1mmol4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰氨基丁酸己酯在10％的钯碳催化下于与H2室温进行氢化反应，得到4-氨基-基-N-甲基吡咯-2-己酰氨基丁酸己酯，所述钯碳的物质的量是4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰基氨基丁酸己酯的0.05-0.15倍；5)1mmol4-氨基-基-N-甲基吡咯-2-己酰氨基丁酸己酯与1mmol的4-硝基-2-三氯己酰基-N-甲基吡咯室温反应，得到4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸己酯；
6)1mmol4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸己酯在10％的钯碳催化下于与H2室温进行氢化反应，得到4-(4-氨基--N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸己酯，所述钯碳的物质的量是4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸己酯的0.10-0.15倍；然后再分别与1mmol的PyPyCOOH、1mmol的HOBT和1mol的DCC于室温反应，得到4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸己酯2、合成N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷1)将步骤1中制备的4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸(1mmol)溶于10mlDMF中，HOBT0.135g(1mmol)和DCC0.206g(1mmol)依次加入体系，室温搅拌反应26-30小时；然后利用Celite过滤除去二环己基脲(DCU)；2)所得滤液直接倾入4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷0.472g(1mmol，溶于5Ml DMF反应液)，室温搅拌反应36-40小时，过滤，过滤后，减压蒸出DMF，残余物用硅胶H柱层析分离(洗脱液CHCl3∶CH3OH＝4∶1)得淡黄色固体；3)将步骤2)中得到的淡黄色固体加入4.5mmol HBr室温解析脱除叔丁氧羰酰，10mmol NaOH中解析而得到产物N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷(C36H49N13O7)。
3、化合物的表征按常规方法对N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷(C36H49N13O7)进行了核磁共振氢谱和质谱分析。结果如下氢谱1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ10.28(s，1H)，9.98(s，1H)，9.88(s，1H)，8.18(s，1H)，8.00(s，H)，7.59(s，1H)，7.27(s，1H)，7.25(s，1H)，7.17(s，1H)，7.05(s，2H)，6.08(s，H)，4.07(s，3H)，4.04(s，3H)，4.02(s，3H)，3.99(s，3H)，3.53(b，16H)，3.16(d，2H)，2.31(t，2H)，1.76(t，2H)。
质谱ESI-MS776(M++1)熔点115-116℃元素分析(理论值)C 55.70(55.73)；H 6.37(6.365)；N 23.74(23.47)。
实施例2、N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷与Zn2+的配合物切割pBR3221)N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷与Zn2+配合物的制备将1mmol N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷溶于3ml的无水甲醇中，将1mmol的高氯酸锌(溶于2ml的无水甲醇)滴加到上述溶液中，生成白色沉淀，过滤干燥得到目标化合物。
2)切割pBR322将1.664mg N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷与Zn2+配合物加入200μL高纯水中，得到8mM的切割试剂200μL。取0.4μL切割试剂(浓度为8mM)，2μL pBR322(浓度为μg/μL)，Tris-HCl缓冲液(Tris-HCl缓冲液的pH分别为7.22，7.40，7.60，7.80，8.00)37.6μL混合得到含切割试剂(浓度为0.08mM)的切割体系。切割温度为38-40℃，切割时间分别为10min、20min、40min和60min，反应完成后，进行0.6％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果分别如图2、图3、图4和图5所示，结果表明N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷与Zn2+配合物对质粒DNA(pBR322)的切割效果极好。在切割试剂浓度为80μM时，切割时间为10就表现出明显的切割效果，此切割试剂是目前世界上最好的切割试剂之一。图2、图3、图4和图5中，泳道1为对照实验，不含切割试剂，pH为8.00，泳道2-9分别为pH7.22，7.40，7.60，7.80，8.00的Tris-HCl缓冲液。
权利要求
1.一种聚酰胺大环多胺化合物，是具有下述式(I)结构的N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷 式(I)。
2.一种制备N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷的方法，包括以下步骤1)制备4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸；2)将步骤1中制备的4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸溶于DMF中，再分别加入1-1.2倍于所述4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸的物质量的1-羟基苯并三唑和二环己基碳二亚胺，室温反应26-30小时；然后过滤除去二环己基脲；3)在步骤2)所得滤液中，加入0.5-1.5倍于步骤1)所述4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸的物质量的4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷，室温反应36-40小时，过滤，残余物用硅胶H柱层析分离得淡黄色固体；4)在步骤3)所述无色淡黄色固体中加入4.0-5.0倍于步骤1)所述4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸的物质量的HBr，室温解析脱除叔丁氧羰酰，再在NaOH中解析得到产物N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤1)中所述4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸按下述步骤制备(请补充确认以下步骤)1)N-甲基吡咯与其1-1.2倍物质的量的CCl3COCl于室温进行酰化反应，得到N-甲基-2-三氯己酰基吡咯；2)N-甲基-2-三氯己酰基吡咯与分别是其1.1和0.09倍物质的量的HNO3和H2SO4在-10℃进行硝化反应，得到4-硝基-2-三氯己酰基-N-甲基吡咯；3)4-硝基-2-三氯己酰基-N-甲基吡咯与其0.8-1.2倍物质的量的NH2CH2CH2CH2CO2Et室温进行反应，得到4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰氨基丁酸己酯；4)4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰基氨基丁酸己酯在10％的钯碳催化下于与H2室温进行氢化反应，得到4-胺基-N-甲基吡咯-2-己酰氨基丁酸己酯，所述钯碳的物质的量是4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰基氨基丁酸己酯的0.05-0.15倍；5)4-胺基-N-甲基吡咯-2-己酰氨基丁酸己酯与其0.8-1.0倍物质的量的N-甲基-2-三氯己酰基-4-硝基吡咯于0℃反应，得到4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸己酯；6)4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸己酯在10％的钯碳催化下于与H2室温进行氢化反应，得到4-(4-氨基--N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸己酯，所述钯碳的物质的量是4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸己酯的0.10-0.15倍；然后再分别与其1-1.2、1-1.2和1-1.4倍物质的量的PyPyCOOH、HOBT和DCC室温反应，得到4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸己酯。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸在DMF中的浓度为0.05-0.15M。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸在DMF中的浓度为0.1M。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤2)中所述1-羟基苯并三氮唑和二环己基碳二亚胺的物质的量均与4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸的物质量相等。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤3)中加入的所述4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷先溶于DMF中，其浓度为0.2M；所述4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷的物质的量与步骤1)所述4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸的物质量相等。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤3)中所述硅胶H柱层析分离的洗脱液为CHCl3∶CH3OH＝4∶1。
9.一种核酸切割试剂，其活性成分是N-(-(4-(4-(4-(N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基丁酸-1，4，7，10-四氮杂环十二烷的金属配合物。
10.根据权利要求9所述的试剂，其特征在于所述金属配合物的中心离子为Zn2+、Cu2+、La2+等金属离子。
全文摘要
本发明公开了一种聚酰胺大环多胺化合物及其制备方法与应用，其目的是提供一种聚酰胺大环多胺化合物及其制备方法与以其金属配合物为活性成分的核酸切割试剂。本发明提供的聚酰胺大环多胺化合物，是具有上述式(I)结构的N－(－(4－(4－(4－(N－甲基吡咯－2－酰基)氨基－N－甲基吡咯－2－酰基)氨基－N－甲基吡咯－2－酰基)氨基－N－甲基吡咯－2－酰基)氨基丁酸－1，4，7，10－四氮杂环十二烷。本发明还提供了制备上述聚酰胺大环多胺化合物的方法和一种以N－(－(4－(4－(4－(N－甲基吡咯－2－酰基)氨基－N－甲基吡咯－2－酰基)氨基－N－甲基吡咯－2－酰基)氨基－N－甲基吡咯－2－酰基)氨基丁酸－1，4，7，10－四氮杂环十二烷的金属配合物为活性成分的核酸切割试剂。本发明为进一步合成DNA定点识别及切割试剂提供了良好的基础和有效的途径，具有重要意义。
文档编号C07F3/06GK1560053SQ20041000453
公开日2005年1月5日 申请日期2004年2月20日 优先权日2004年2月20日
发明者赵玉芬, 乔仁忠, 余孝其, 夏传琴 申请人:清华大学