专利名称：抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY的制备方法及其组合制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防和治疗萨奇病病毒性心肌炎的药物，更具体地说，涉及一种抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY(鸡蛋黄免疫球蛋白)的制备方法及其组合制剂。
背景技术：
1899年，Fiedler(菲德勒)首次报道了因发热、呼吸困难、抽搐、昏迷死亡的3例病毒性心肌炎临床病例。在此后的一百多年间，随着医学微生物学和有关科学技术的发展，对该病的病因、发病机理及免疫等研究有了很大的突破，但治疗方面仍无大进展。
20世纪70年代后，病毒性心肌炎发病日趋增多，特别是在儿童中不但发病率高，而且后果严重，1/3的患者不能完全恢复正常的心脏功能，1/3发展为慢性心肌炎和心脏功能紊乱，1/3最终进展为慢性心脏功能衰竭而死亡或需要心脏移植[1]。根据国内外的流行病学调查资料，人群中病毒性心肌炎的患病率为2.3-5％。病毒流行期间感染人群的发病率达12-33％，婴儿中发病率可达50％。我国湖北、云南等地曾发生病毒性心肌炎的爆发流行，期间当地发病率达26.8-50％，病死率高达23.6％[2，3]。对医学界来说，病毒性心肌炎的诊断和治疗是其面临的严重挑战。
很多病毒可以引起心肌炎，迄今已明确的有十余种病毒，但肠道病毒和腺病毒最常见。特别肠道病毒中的柯萨奇B组病毒(以下简称CVB)，在急慢性病毒性心肌炎患者中约有50％以上可以检测到其IgM和中和抗体。在病毒性心肌炎的活检和尸检组织中，有相当多的标本可以检查到CVB的抗原和核酸。此外用CVB病毒感染小鼠，可使其心肌产生类似人病毒性心肌炎样的病理变化。总而言之，目前普遍认为CVB是引起病毒性心肌炎的最主要病毒[4]。CVB分6型，其中1-5型均可引起心肌病变。另外，腺病毒、柯萨奇A组病毒、ECHO病毒、疱疹病毒等也可引起病毒性心肌炎。
通过对病毒性心肌炎动物模型的研究，该病的发病机理已基本明确。病毒的直接作用和机体的免疫反应是主要机制。在急性和亚急性期，大量病毒在心脏组织中复制、增殖和播散，直接造成心肌细胞的溶解和坏死。随后，巨噬细胞、NK细胞和T细胞先后浸润心肌，其介导的细胞毒作用在溶解病毒感染心肌细胞，杀灭病毒同时，也损伤了心肌细胞，特别是在T细胞免疫被IL-2等炎症因子过度激活和心脏反应性自身抗体产生的情况下，损伤更为严重。在慢性期，主要表现为病毒在心肌细胞中长期的低水平的复制，可直接损伤心肌结构和功能，也可持续激活免疫反应和自身免疫反应而致心肌间接损伤，最终导致扩张性心肌病。因此，病毒性心肌炎的治疗在急性期以抗病毒为主，而在急性后期和慢性期抑制过度的炎症反应和自身免疫反应更为重要[5]。
目前对病毒性心肌炎的治疗仍无特效的方法。临床以减轻心脏负担、抗心律失常和免疫调节等对症治疗为主。近年来有报道用人免疫球蛋白治疗由CVB和EMV(小鼠脑心肌炎病毒)引起的小鼠病毒性心肌炎，取得了很好的疗效。不管免疫球蛋白与病毒同时接种小鼠，还是在病毒感染2周后使用，心肌细胞的坏死和炎症细胞的浸润均明显减少；炎症相关的细胞因子下降；小鼠的生存时间明显延长。特别是前者免疫球蛋白几乎完全抑制了病毒对心肌的损害，在实验过程中没有小鼠死亡。对于免疫球蛋白治疗病毒性和自身免疫性疾病的机理并不十分清楚，目前认为与以下几点有关(1)免疫球蛋白中存在有一定的中和抗体；(2)大量抗体通过注射进入机体后，使保护IgG免受分解代谢的Fc受体饱和，从而促进自身抗体的分解；(3)免疫球蛋白在血浆中象各补体成分污水池，减少了血中的补体，减轻炎症反应；(4)抑制了炎症有关的细胞因子的释放，减少了T细胞的增殖和浸润[6，7]。
用人类高效免疫血清和免疫球蛋白来防治病毒性疾病，近现代一直在使用，特别是对一些病毒的紧急预防如HBV，目前最有效仍是高效价的人抗HBV免疫球蛋白。在抗SARS(非典型肺炎)感染中，解放军总院姜素春教授用康复者血清成功治疗了自身SARS感染，是近期引人注目的例子。但是这些治疗方法存在种种限制和潜在不安全因素。首先人类高效免疫血清和免疫球蛋白来源困难，只有在人群感染较多情况下才有足够的血清可供选择。其次血制品安全一直是一个没有解决的问题。而且由于哺乳动物的抗体IgG能激活人类的补体系统，且会与血清、类风湿因子反应，干扰人体IgG，造成交叉免疫学反应，因此在很多方面限制了其应用。
鉴于以上种种原因，本发明申请人在这方面做了开创性的研究，发现雌性禽类对人类各种抗原有非常良好的免疫应答性，以少量抗原免疫即可产生大量持久性IgG，再从血清传至卵黄，经分离提取纯化可得到大量卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin of Yolk，以下简称IgY)。
由于禽类在系统发生上与哺乳类相差甚远，因此IgY不会与哺乳类发生血清交叉反应和类风湿因子结合，也不会激活人体补体系统，不会干扰人类IgG，完全避免了抗生素和化学合成药物的毒副作用和耐药菌产生。而且生产、提取、分离完全对环境无污染。防治过程中，只对病原体进行损伤，对人类有益菌无任何作用，从而维护了局部微生态平衡。特异性IgY已在抗龋齿，抵抗幽门螺杆菌、沙门菌和轮状病毒感染的实验研究取得了成功[8，9]。
IgY属IgG--类免疫球蛋白，具有中和抗体的作用，它能与相应抗原发生特异性结合，从而改变其相应的抗原表面，如病毒表面的构型，阻止病毒吸附于易感细胞；另外，IgY与其相应的病毒结合后，可形成免疫复合物，易被巨噬细胞所吞噬掉。
申请人在IgY的分离、提取、纯化方面有自己独有的专利核心技术(JasonMedical Holdings Inc.USA)，并在全球首次将特异性复合IgY制备的漱口液和口腔喷雾剂试用于人体防治疾病和预防保健[10]。
申请人一直从事柯萨奇病毒性心肌炎的治疗和预防的研究工作。对柯萨奇病毒的DNA疫苗和口服基因疫苗进行了研究，发现这两种疫苗均能刺激机体产生一定的免疫反应，对同型的病毒感染有一定的保护能力，但体液免疫的抗体滴度低，特异性细胞也不够强大，特别是对其他型别的柯萨奇病毒和肠道病毒没有有效的交叉保护作用，这些限制了其运用价值。
发明内容
本发明要解决现有技术中用于防治心肌炎的药物比较单一且效果不太理想的问题，以开拓柯萨奇病毒性心肌炎防治研究的新途径。
为解决上述技术问题，本发明提供一种抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY(以下简称抗CVMD-IgY)的制备方法，其中包括下列步骤(1)制备引起柯萨奇病毒性心肌炎的抗原；(2)用所述抗原免疫家禽，并检取所述家禽所产的免疫蛋；(3)从所述免疫蛋中提取抗CVMD-IgY粗提物；(4)对所述IgY粗提物进行纯化，得到抗CVMD-IgY纯品。
在本发明所述方法的第(1)步中，可通过以下步骤制备CVB1-5型抗原病毒的培养，取Hela细胞分别培养柯萨奇B组1-5(CVB1-5)型病毒；病毒的纯化，采用终末稀释传代方法，最末稀释度出现CPE的管作为纯化的毒株；采用福尔马林进行灭活处理；最后与福氏佐剂混合，制备成CVB1-5型抗原。
在本发明所述方法的第(2)步中，可按以下具体步骤制备免疫蛋用所述CVB1-5型抗原对产蛋禽类进行注射免疫，每隔二周再强化注射一次，共计免疫三次；在第一次免疫20天后，检取免疫后的禽类所产免疫蛋。
在本发明所述方法的第(2)步中，还包括以下优选具有高免疫应答能力的良种产蛋禽类的步骤用所述CVB1-5型抗原分别免疫多只产蛋禽类，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些产蛋禽类所产的蛋分别标记后，再按常规方法分别提取其中的IgY；以酶联免疫吸附实验(ELISA)法分别检测所制得的IgY的效价，如果某只产蛋禽类所产的蛋制成的IgY的效价大于256，则选出该只产蛋禽类；再用所选出的产蛋禽类所产的蛋孵出优良产蛋禽类品种，待其长大至2-3个月，即可作为优选的高免疫应答能力的特种产蛋禽类。其中，所述产蛋禽类可以是母鸡、母鸭、母鹅、火鸡、或鸵鸟中的一种或多种。
在本发明所述方法的第(2)步中，在用所述CVB1-5型抗原对产蛋禽类进行注射免疫时，采用皮下注射与翅静脉注射相结合的强化免疫法如果所述产蛋禽类是母鸡，则每只鸡每次注射量为1-2ml；如果所述产蛋禽类是母鸭，则每次注射量为1-2ml；如果所述产蛋禽类是母鹅，则每次注射量为5-10ml；如果所述产蛋禽类是母鸵鸟，则每次注射量为10-20ml。
在本发明所述方法的第(3)步中，按以下具体步骤提取抗CVMD-IgY粗提物清洗所述免疫蛋，打碎，滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；按蛋黄体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用1.0N HCl溶液调pH至5.5-6.0；将调好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将上述稀释液于10000rpm条件下，离心20分钟；取分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍；加入2.0％海藻酸钠溶液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊沉淀，再加入2.0％ CaCl2溶液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，并于4℃条件下过夜；于8000rpm条件下离心20分钟，取上清，再用0.45μm膜过滤除菌；再进行冷冻干燥，制得抗CVMD-IgY粗提物。
在本发明所述方法的第(4)步中，将所述抗CVMD-IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸盐缓冲液)，再先后过离子交换柱、凝胶层析柱，继而采用美国Pall膜除菌过滤器和除病毒过滤器去除细菌和病毒，最后得到纯化的抗CVMD-IgY成品。所述离子交换柱为DEAE-SephadexA50离子交换柱，所述凝胶层析柱为SephadexG200凝胶层析柱。
另外，本发明还提供用上述抗CVMD-IgY所制成的喷雾剂，其中抗CVMD-IgY的浓度为0.15％。根据本发明的优选方案中，所述抗CVMD-IgY喷雾剂中，按重量比例含有抗CVMD-IgY 0.15％，阿斯巴甜0.15％，香橙香精0.03％，水蜜桃香精0.02％，薄荷香精0.02％；上述组分溶解于蒸馏水至100ml。
具体配制所述制剂为喷雾剂时，先取约90ml蒸馏水，然后加入阿斯巴甜和所述各种香精，搅拌均匀后，再边搅拌边缓缓加入所述抗CVMD-IgY，并充分搅拌均匀；再加蒸馏水至100ml，搅拌均匀；用0.1N NaOH调pH至6.5-7.5，0.22μm膜过滤除菌，无菌瓶灌装，得到瓶装抗CVMD-IgY喷雾剂。
本发明的所述抗CVMD-IgY制剂还可以是结肠溶胶囊，每1000粒结肠溶胶囊中含有抗CVMD-IgY 5克，脱乙酰壳多糖148克，低取代羟丙基纤维素(L-HPC)15克，乳糖30克，以及，硬脂酸镁适量。
具体配制所述结肠溶胶囊时，先取脱乙酰壳多糖、低取代羟丙基纤维和乳糖充分混合均匀，于80℃下进行干燥，再冷却至室温，然后按等量递加法与所述抗CVMD-IgY混匀，过80目筛，再加入适量硬脂酸镁混匀；上全自动胶囊填充机，填充2号壳聚糖胶囊，每粒0.2克，含有抗CVMD-IgY 0.5毫克；再用HPMCP结肠溶包衣密封。
本发明的所述抗CVMD-IgY制剂还可以是肌肉注射剂，其中含有抗CVMD-IgY 3克，Pluronic 5克，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)5克，PEG400，66克，聚山梨醇酯-80，11克，以及，注射用水加至1000ml。
具体配制所述肌肉注射剂时，(1)先取注射用水800ml，加入Pluronic和聚乙烯吡咯烷酮，加热溶解；另取聚山梨醇酯-80，加入PEG400混匀，再加入前述溶液，搅拌均匀；加入0.1％针用活性炭，60℃下搅拌15分钟，再脱炭过滤；再密闭加热，100℃，30分钟，然后冷却至室温备用；(2)另取经活性炭处理过的注射用水，在灭菌容器中加入抗CVMD-IgY，继续搅拌下，呈细流加于上述第(1)步的混合液中，用脱炭注射用水补足含量；(3)用美国Pall膜除菌过滤器和除病毒过滤器去除细菌和病毒，于无菌灌封机中灌封于无菌容器中，每支2.0ml，含抗CVMD-IgY 6.0毫克。
另外，还可制成各种临床可接受的剂型，鼻喷剂、滴鼻剂、喷喉剂、口喷剂、口含片、注射剂等剂型，用于预防和治疗病毒性心肌炎。
由于本发明制备的特异性IgY最大特点是直接针对引起病毒性心肌炎的病原体发生特异性失活作用，因而可治本断源，效果显著。本发明所制备的抗CVMD-IgY是一种独特的纯天然生物制剂，使用十分安全，无任何毒副作用。
无附图。
具体实施例方式
实施例1抗CVMD-IgY1、制备CVB 1-5型抗原具体包括以下步骤病毒的培养，取Hela细胞分别培养柯萨奇B组1-5(CVB1-5)型病毒；病毒的纯化，采用终末稀释传代方法，最末稀释度出现CPE的管作为纯化的毒株；采用福尔马林进行灭活处理；最后与福氏佐剂混合，制备成CVB1-5型抗原。
2、制备免疫蛋(1)、优选具有高免疫应答能力的良种母鸭用所述CVB1-5型抗原分别免疫100产蛋母鸭，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些产蛋母鸭所产的蛋分别标记后，再按常规方法分别提取其中的IgY；以酶联免疫吸附实验(ELISA)法分别检测所制得的IgY的效价，如果某只母鸭所产蛋制成的IgY的效价大于256，则选出该只母鸭；再用所选出母鸭所产的蛋孵出优良鸭种；待其长大至2-3个月，作为优选的高免疫应答能力的特种母鸭。
另外，还可用母鸡、母鹅、火鸡、或鸵鸟来代替上述步骤中的母鸭。
(2)、分别对优选的特种母鸭进行强化免疫用所制备的CVB1-5型抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种母鸭进行免疫，每只母鸭每次注射量达到1-2ml抗原，每隔二周再强化注射一次，内共免疫三次；第一次免疫20天后，检取母鸭所产免疫蛋。本步骤中，如果选取的产蛋禽类是母鸡，则每次注射量为1-2ml；如果所述产蛋禽类是母鹅，则每次注射量为5-10ml；如果所述产蛋禽类是母鸵鸟，则每次注射量为10-20ml。
3、制备抗CVMD-IgY的粗提物用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒；然后用打蛋机将免疫蛋打碎，蛋黄筛滤去蛋清，留下蛋黄并搅拌均匀；清洗所述免疫蛋，打碎，滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；按蛋黄体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用1.0N HCl溶液调pH至5.5-6.0；将调好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将上述稀释液于10000rpm条件下，离心20分钟；取分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩15倍；加入2.0％海藻酸钠溶液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊沉淀，再加入2.0％CaCl2溶液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，并于4℃条件下过夜；于8000rpm条件下离心20分钟，取上清，再用0.45μm膜过滤除菌；再进行冷冻干燥，即制得抗CVMD-IgY粗提物干粉。
4、提纯将所述抗CVMD-IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸盐缓冲液)，再先后过离子交换柱、凝胶层析柱，再用美国Pall膜除菌过滤器和除病毒过滤器去除细菌和病毒，得到纯化的抗CVMD-IgY成品。
本发明的抗柯萨奇病毒特异性复合IgY属r-球蛋白类，其平均分子量为178Kda。将本发明的IgY用于肠道时，必须避开胃中的酸液和小肠液中的酶的降解，制成结肠定位释药系统(DDS)则可保持IgY的活性。
肺部干粉吸入剂需将IgY与辅料在低温下无菌粉碎成1-6μm的颗粒，借助氮气压力将干粉喷入呼吸道，从肺气管表面毛细血管吸入血液，再达到全身治疗。所有吸入辅料有甘露醇、山梨醇、木糖醇、蔗糖醇、葡萄糖醇等。
肺部流体吸入剂需用无菌注射用水加少量分散剂制成IgY溶液，如PVP系列，PLURONIC系列，聚山梨酸酯系列20、40、60、80，甘油，PEG，丙二醇等。
对于IgY结肠溶胶囊，需要在胃、小肠中不崩解释药，而在无消化酶的结肠中崩解释药，所用辅料有脱乙酰壳多糖，葡聚糖，果胶钙β-环糊精，海藻酸钠等，也可用结肠溶专用胶囊如日本Aicello Chemical CO.，Ltd.的产品，或广东潮州胶囊厂的结肠溶胶囊等，有的则需要在外面包肠溶衣密封。
也可制成结肠定位释放片剂，按时滞5-6小时和pH 7.0左右崩解释药，设计时滞型和pH敏感型结肠DDS系统。所用的辅料有聚丙酸水II号树脂，Eudragil S100，乙基纤维素EC以及EC与丙烯酸树脂不同比例的包衣料，控制一定衣膜厚度(增重)，所制成片剂在胃中3小时不崩解释药，在小肠中3小时释放不超过20％，6小时左右到达结肠，10小时以上基本释药完全。
IgY注射剂，是将IgY溶于无菌后含有分散剂、等渗调节剂、表面活性剂等的水溶液中，成澄清药液，pH符合人体要求，IgY稳定不降解。辅料有Poloxamer系列，PVP系列，PEG系列，失水聚山梨醇酯类，pH稳定剂，醋酸盐缓冲液，PBS液，HCl与醋酸盐缓冲隅等。
实施例2 IgY肺部干粉吸入剂配方IgY冻干粉300克，注射用山梨醇3000克，高纯氮气适量，制成1000支。
制备工艺将山梨醇于洁净烘箱中，90℃干燥4小时，冷至室温后与IgY冻干粉于洁净区灭菌容器中混匀，再于消毒过的冷冻粉碎机中粉碎成1-6μm的细粉，再用粉剂灌装机充液氮灌装于喷瓶中，每支3.3克，200喷。用于治疗病毒性心肌炎，每次2-4喷，每日3-4次或遵医嘱。
实施例3 IgY液体吸入剂配方IgY冻干粉1.5克，PVPK-305克，Pluronic 3克，甘油20克，聚山梨醇酯10克，高纯氮适量，以及再加灭菌注射用水至1000ml。
制备工艺1)取PVPK-30，Pluronic，甘油，聚山梨醇酯溶于80％的注射用水中，加热至沸腾，再冷至室温备用；2)取另20％的注射用水，无菌冷至室温，加入IgY使其溶解；3)一边搅拌，一边将第2)项之溶液加入到第1)项之溶液中，继续搅拌15分钟，然后用喷瓶灌装机，充氮灌装即得。每支20ml，用于肺部吸入，每次2-4喷，每日4-6次或遵医嘱。
实施例4 IgY结肠溶胶囊配方IgY冻干粉5克，脱乙酰壳多糖148克，低取代羟丙基纤维素(L-HPC)15克，乳糖30克，硬脂酸镁适量，制成1000粒。
制备工艺
1)取脱乙酰壳多糖，低取代羟丙基纤维素和乳糖充分混合均匀，80℃干燥2小时，冷至室温，按等量递加法与IgY混匀，过80目筛，加硬脂酸镁混匀；2)用全自动胶囊填充机，填充2号壳聚糖胶囊(日本Aicello Chemical公司产)，每粒0.2克，含IgY 5毫克，再用HPMCP肠溶包衣液密封；3)包衣液配方HPMCP 50克溶解于丙酮-乙醇(1∶1)1000ml，然后喷包上述胶囊剂。检验其果显示，其在人工胃液中2小时内不释放，在小肠液中3小时崩解释药小于20％，在结肠中5-6小时释放达100％。
实施例5 IgY结肠定位释放胶囊配方IgY冻干粉10克，蔗糖粉88克，微晶纤维素(MCC)58克，甘露醇29克，淀粉14克，二氧化硅3克，硬脂酸镁2克，制成1000粒。
制备工艺1)取蔗糖粉，微晶纤维素，甘露醇，淀粉混合均匀，80℃干燥2小时，按等量迭加法与IgY混匀，过80目筛加二氧化硅和硬脂酸镁混匀；2)用全自动胶囊填充机，填充广东潮州产结肠溶2号胶囊，每粒0.2克，含IgY 10毫克。
实施例6 IgY结肠定位释放片剂配方IgY冻干粉20克，微晶纤维素(MCC)200克，低取代羟丙基纤维素27克，乳糖50克，5％PVPK-3050％乙醇液适量，硬脂酸镁3克，制成1000片。
制备工艺1)取微晶纤维素，乳糖混匀，过80目筛，加5％PVPK-3050％乙醇液为粘合剂，制成适宜软材。16目尼龙筛制粒，温度50-60℃，通风干燥，控制颗粒水分3-5％，14目不锈钢筛网整粒，加低取代羟丙基纤维素，IgY冻干粉混匀，筛出适量细粉加硬脂酸镁拌均匀，再与颗粒混合均匀，压片，每片含IgY 20毫克。
2)包衣液制备取II聚丙烯酸树酯(或Eudragil S100)与乙基纤维素按7∶3制成6％乙醇-丙酮(1∶1)包衣液，包衣液体积10％加鄰苯二甲酸二乙酯，并搅拌均匀即得。
3)取片芯筛去细粉，置包衣锅中转动，使片床温度在39-41℃，调整转速为45转每分，空气压力196-392千帕，热力40-50℃温度，开启喷枪喷雾包衣，直至片芯增重达10％，停止包衣，将包衣片于干燥器中放置4小时以上，包装即得。
该包衣片在人工胃液中10小时内崩解释药，在人工小肠液中3小时崩解释药小于20％，释药时滞时间6小时，时滞过后立即突释，此时恰在结肠中，12小时后释药达95％以上。
实施例7 IgY注射剂配方IgY冻干粉3克，Pluronic 5克，聚乙烯吡咯烷酮5克，PEG400 66克，聚山梨醇酯-88 11克，注射用水加至1000ml。
制备工艺1)取注射用水800ml加Pluronic和聚乙烯吡咯烷酮加热溶解，另取聚山梨醇酯-80加PEG400混匀，在搅拌下加入上述混合液中，再加0.1％针用活性炭，60℃下搅拌15分钟，脱炭过滤，再将滤液密封加热至100℃，30分钟；然后冷却至室温备用。
2)另取用针用活性炭吸附，脱炭，煮沸，并冷至室温的注射用水剩余量，于无菌容器中加入IgY冻干粉溶解，继续搅拌下，呈细注加入第1)项之溶液中，用脱炭无菌注射用水补足全量。
3)用美国Pall膜除菌过滤器和除病毒过滤器去除细菌和病毒，于无菌灌装机中灌装于无菌容器中，每支2ml，含IgY 6毫克，印字，包装即得。
实验例1按1∶1∶1∶1∶1的比例，取引起病毒性心肌炎的CVB1、CVB2、CVB3、CCVB4、CVB5病毒。再按实施例1的方法，制作抗原，用此抗原免疫母鸡，最后制成抗CVMD-IgY提纯物。然后，分别以CVB1、CVB2、CVB3、CCVB4、CVB5病毒作为检测抗原，用“ELISA”检测所制得的抗CVMD-IgY的抗体效价。结果如下表
实验例2按1∶1∶1∶1∶1的比例，取引起病毒性心肌炎的CVB1、CVB2、CVB3、CCVB4、CVB5病毒。再按实施例1的方法，制作抗原，用此抗原分别免疫母鸡、母鸭、母鹅、火鸡及鸵鸟，最后分别制成鸡、鸭、鹅、火鸡、鸵鸟的抗CVMD-IgY提纯物。然后，分别以CVB1、CVB2、CVB3、CCVB4、CVB5病毒作为检测抗原，用“ELISA”检测所制得的抗CVMD-IgY的抗体效价。结果如下表
从以上试验结果可以看出，采用本发明的方法制作抗原，用免疫激活方法免疫产蛋母鸡、母鸭、母鹅、火鸡或鸵鸟，再采用本发明的方法分别制得抗CVMD-鸡IgY、抗CVMD-鸭IgY、抗CVMD-鹅IgY、抗CVMD-火鸡IgY、抗CVMD-鸵鸟IgY五种不同的IgY，虽然免疫的禽类不同，但是所制得的特异性IgY对引致病毒性心肌炎的VCB1-5型均有较高的抗体活性，这表明它们均有较高的失活病毒作用。虽然免疫产蛋鸵鸟和产蛋火鸡所制得的IgY抗体效价从检测数据看稍微低了一些，但是，由于鸵鸟和火鸡蛋个体特别大，每个免疫蛋所能提取得到的IgY比鸡免疫蛋和鸭免疫蛋以及鹅免疫蛋都多得多，这点对于工业化大规模生产，也是十分可取的。
实验例3小鼠试验用CVB感染小鼠，并同时用实施例3中的喷雾剂让小鼠喷食，用实施例6中的注射剂对小鼠进行注射。
或者在用CVB感染小鼠2周后，用实施例3中的喷雾剂让小鼠喷食，用实施例6中的注射剂对小鼠进行注射。
观察结果显示，不管是在病毒感染的同时、还是在病毒感染后使用本发明的抗CVMD-IgY，小鼠心肌细胞的坏死和炎症细胞的浸润均明显减少；炎症相关的细胞因子下降；小鼠的生存时间明显延长。特别是前者免疫球蛋白几乎完全抑制了病毒对心肌的损害，在实验过程中没有小鼠死亡。
本发明的“抗CVMD-IgY”能够有的放矢地直接针对引致病毒性心肌炎的CVB1-5型致病病毒起有效作用，是从发病根源上解决问题；另一方面，IgY是天然产品，来源广，制备简单，成本低，又无任何副作用，因此，为预防和治疗病毒性心肌炎开辟了一条崭新的途径。
本发明背景技术部分所引用的参考文献[1]Wheeler DS，Kooy NW.A formidable challengethe diagnosis and treatment of viral myocarditis inchildren.Crit Care Clin.2003 Jul；19(3)365-91.(艰难的挑战儿童病毒性心肌炎的诊断与治疗)[2]白登云，施华芳，李中恒，等一次急性心肌炎暴发与病因学初步探讨。云南医药，1995，6109-111[3]湖北沙市卫生防疫站，一次急性心肌炎暴发流行。中华医学杂志，1980，203(4)203[4]Hingorani AD.Post infectious myocarditis.BMJ，1992，3041676-1678[5]杨英珍，《病毒性心脏病》，上海科技出版社，2001，1027-41[6]Takada H，Kishimoto C and Hiraoka Y.Therapy with immunoglobulin suppresses myocarditis in amurine coxsackievirus B3 model.Antiviral and anti-inflammatory effects.Circulation.1995 921604-1611[7]Kishimoto C，Takada H，Kawamata H，et al.Immunoglobulin treatment prevents congestive heartfailure in murine encephalomyocarditis viral myocarditis associated with reduction of inflammatory cytokines.Jpharmacol Exp Ther.2001 Nov；299(2)645-51. Lee EN，Sunwoo HH，Menninen K，et al.In vitro studies of chicken egg yolk antibody(IgY)againstSalmonella enteritidis and Salmonella typhimurium.Poult Sci 2002 May；81(5)623-41[9]Daniel J，Smith，William F，et al.Passive transfer of immunoglobulin Y antibody to Streotococcusmutans glucan binding protein B can confer protection against experimental dental caries.Infection andImmunity 2001，p3135-3142[10]史俊南，杨荣鉴，王捍国。龋病抗体研制动态和奥丽汀键齿露的研究2001，11(4)296-27权利要求
1.一种抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY的制备方法，其特征在于，包括下列步骤(1)制备引起柯萨奇病毒性心肌炎的抗原；(2)用所述抗原免疫家禽，并检取所述家禽所产的免疫蛋；(3)从所述免疫蛋中提取抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY粗提物；(4)对所述IgY粗提物进行纯化，得到抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述第(1)步中，具体包括以下步骤病毒的培养，取Hela细胞分别培养柯萨奇B组1-5(CVB1-5)型病毒；病毒的纯化，采用终末稀释传代方法，最末稀释度出现CPE的管作为纯化的毒株；采用福尔马林进行灭活处理；最后与福氏佐剂混合，制备成CVB1-5型抗原。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述第(2)步中，按以下具体步骤制备免疫蛋用所述CVB1-5型抗原对产蛋禽类进行注射免疫，每隔二周再强化注射一次，共计免疫三次；在第一次免疫20天后，检取免疫后的禽类所产免疫蛋。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述第(2)步中，还包括以下优选具有高免疫应答能力的良种产蛋禽类的步骤用所述CVB1-5型抗原分别免疫多只产蛋禽类，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些产蛋禽类所产的蛋分别标记后，再按常规方法分别提取其中的IgY；以酶联免疫吸附实验(ELISA)法分别检测所制得的IgY的效价，如果某只产蛋禽类所产的蛋制成的IgY的效价大于256，则选出该只产蛋禽类；再用所选出的产蛋禽类所产的蛋孵出优良产蛋禽类品种，待其长大至2-3个月，即可作为优选的高免疫应答能力的特种产蛋禽类。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述产蛋禽类可以是母鸡、母鸭、母鹅、火鸡、或鸵鸟中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在用所述CVB1-5型抗原对产蛋禽类进行注射免疫时，采用皮下注射与翅静脉注射相结合的强化免疫法如果所述产蛋禽类是母鸡，则每只鸡每次注射量为1-2ml；如果所述产蛋禽类是母鸭，则每次注射量为1-2ml；如果所述产蛋禽类是母鹅，则每次注射量为5-10ml；如果所述产蛋禽类是母鸵鸟，则每次注射量为10-20ml。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，在所述第(3)步中，按以下具体步骤提取抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY粗提物清洗所述免疫蛋，打碎，滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；按蛋黄体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用1.0N HCl溶液调pH至5.5-6.0；将调好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将上述稀释液于10000rpm条件下，离心20分钟；取分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍；加入2.0％海藻酸钠溶液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊沉淀，再加入2.0％CaCl2溶液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，并于4℃条件下过夜；于8000rpm条件下离心20分钟，取上清，再用0.45μm膜过滤除菌；再进行冷冻干燥，制得抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY粗提物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述第(4)步中，将所述抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸盐缓冲液)，再先后过离子交换柱、凝胶层析柱，再采用美国Pall膜除菌过滤器和除病毒过滤器去除细菌和病毒，得到纯化的抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY成品。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述离子交换柱为DEAE-SephadexA50离子交换柱，所述凝胶层析柱为SephadexG200凝胶层析柱。
10.用权利要求1-9中任一项的抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY所制成的制剂，其特征在于，所述制剂为喷雾剂，其中抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY的浓度为0.15％。
11.根据权利要求10所述的抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY制剂，其特征在于，在所述IgY喷雾剂中，按重量比例含有抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY0.15％，阿斯巴甜0.15％，香橙香精0.03％，水蜜桃香精0.02％，薄荷香精0.02％；上述组分溶解于蒸馏水至100ml。
12.根据权利要求11所述的抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY制剂，其特征在于，具体配制所述制剂为喷雾剂时，先取约90ml蒸馏水，然后加入阿斯巴甜和所述各种香精，搅拌均匀后，再边搅拌边缓缓加入所述抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY，并充分搅拌均匀；再加蒸馏水至100ml，搅拌均匀；用0.1N NaOH调pH至6.5-7.5，0.22μm膜过滤除菌，无菌瓶灌装，得到瓶装抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY喷雾剂。
13.用权利要求1-9中任一项的抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY所制成的制剂，其特征在于，所述制剂为结肠溶胶囊，每1000粒结肠溶胶囊中含有抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY5克，脱乙酰壳多糖148克，低取代羟丙基纤维素(L-HPC)15克，乳糖30克，以及，硬脂酸镁适量。
14.根据权利要求13所述的抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY制剂，其特征在于，具体配制所述结肠溶胶囊时，先取脱乙酰壳多糖、低取代羟丙基纤维和乳糖充分混合均匀，于80℃下进行干燥，再冷却至室温，然后按等量递加法与所述抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY混匀，过80目筛，再加入适量硬脂酸镁混匀；上全自动胶囊填充机，填充2号壳聚糖胶囊，每粒0.2克，含有抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY0.5毫克；再用HPMCP结肠溶包衣密封。
15.用权利要求1-9中任一项的抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY所制成的制剂，其特征在于，所述制剂为肌肉注射剂，其中含有抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY3克，Pluronic5克，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)5克，PEG400，66克，聚山梨醇酯-80，11克，以及，注射用水加至1000ml。
16.根据权利要求15所述的抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY制剂，其特征在于，具体配制所述肌肉注射剂时，(1)先取注射用水800ml，加入Pluronic和聚乙烯吡咯烷酮，加热溶解；另取聚山梨醇酯-80，加入PEG400混匀，再加入前述溶液，搅拌均匀；加入0.1％针用活性炭，60℃下搅拌15分钟，再脱炭过滤；再密闭加热，100℃，30分钟，然后冷却至室温备用；(2)另取经活性炭处理过的注射用水，在灭菌容器中加入抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY，继续搅拌下，呈细流加于上述第(1)步的混合液中，用脱炭注射用水补足含量；(3)采用美国Pall膜除菌过滤器和除病毒过滤器去除细菌和病毒，于无菌灌封机中灌封于无菌容器中，每支2.0ml，含抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合IgY6.0毫克。
全文摘要
本发明涉及抗柯萨奇病毒性心肌炎的特异性复合鸡蛋黄免疫球蛋白(简称抗CVMD－IgY)的制备方法及其组合制剂，为解决因柯萨奇病毒引起的心肌炎尚没有特效治疗药物的问题，本发明中过下列步骤制备抗CVMD－IgY(1)在细胞中扩增柯萨奇病毒1－5型，并纯化，灭活，制备抗原；(2)用所述柯萨奇病毒抗原免疫家禽，得到免疫蛋；(3)从所述免疫蛋中提取抗CVMD－IgY粗提物；(4)对所述IgY粗提物进行纯化，得到抗CVMD－IgY纯品。本发明还提供由上述抗CVMD－IgY所制成的多种组合制剂，例如喷雾剂、肠溶片、注射剂等，用于预防和治疗病毒性心肌炎，具有特效、安全、使用方便的特点。
文档编号C07K16/08GK1657541SQ20041000579
公开日2005年8月24日 申请日期2004年2月18日 优先权日2004年2月18日
发明者杨荣鑑, 陈洪, 刘晶星, 包晟, 胡国柱, 聂荣庆, 李同森, 蔡婷英 申请人:雅臣药业集团(远东)有限公司