结合肝素的拮抗剂在缓激肽释放的抑制中的应用的制作方法

专利名称：结合肝素的拮抗剂在缓激肽释放的抑制中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于治疗或预防由哺乳动物体内缓激肽释放导致的疾病的方法，所述哺乳动物特别是一种产生肝素结合蛋白的哺乳动物，这种肝素结合蛋白与肝素结合蛋白拮抗剂结合，该方法包括对所述哺乳动物给予有效减少哺乳动物体内缓激肽释放的用量的肝素结合蛋白拮抗剂。此外，本发明涉及用于测定哺乳动物是否产生与肝素结合蛋白拮抗剂结合的肝素结合蛋白的方法和试剂盒以及一种用于检测肝素结合蛋白拮抗剂的方法。
背景技术：
炎症急性炎症反应由几个特征组成，包括血管管径和紧张性的改变以及导致富含蛋白质之渗出物形成的血管通透性的增加(Lewis在《炎症中的介质》(Mediators of Inflammation)中所述，Wright，Bristol，U.K.，1986)。一旦中性粒细胞(PMN)接受了趋化信号，它们就移近血管内皮细胞并通过在内皮和中性粒细胞表面上合成的特异性粘附分子与所述内皮细胞粘附。在中性粒细胞结合在内皮细胞上之后，存在诱导血管通透性并使中性粒细胞迁移入间质组织空间的内皮裂隙通道。
接触相(contact phase)系统包括三种酶因子因子XI(F XI)、因子XII(FXII)和血浆前激肽释放酶(pre-kallekrein)(PK)和分别与F XI和PK形成等摩尔复合物的非酶辅因子H-激肽原(HK)。接触相存在于单核细胞、成纤维细胞和中性粒细胞上。由内皮细胞和诸如高岭土等非细胞性荷负电表面暴露的特异性结合位点统称“接触相”，它们允许在局部装配关键成分。酶原F XII向活性酶F XIIa的转化激活接触相系统自身(Colman等，1986，《标准肿瘤学和血液学综述》(Crit.Rev.Oncol.Hematol.)557-85)。表面结合的FXII和通过HK锚定该表面的PK的相互激活会产生FXIIa和PKa，由此放大起始信号。然后因子XIIa激活因子XI且启动凝固的固有途径。已知PK还水解HK而产生有效力的九肽、即缓激肽(Kaplan和Silverberg，1987，《血液》(Blood)701-15)。据认为激肽是产生疼痛的炎性过程的主要介质、它们诱发血管舒张并因直接对内皮细胞的作用而增加血管通透性，从而使内皮细胞回缩并使中性粒细胞迁移和血浆成分渗出成为可能(Oyvin等，1970，Experentia 26843-844)。还有文献提及局部产生前列腺素和一氧化氮NO(Hall，1992，《药理疗法》(Pharmacol.Ther)56131-190)。因此，激活接触相系统可以产生多种有害影响，例如炎症、败血性休克、成人呼吸窘迫综合征、弥漫性血管内凝血、因心血管外科手术导致的手术后出血。
特别地，当中性粒细胞与内皮细胞结合时，通过内毒素的存在并通过细菌感染可以激活接触相系统(Colman等在1997《血液)》(Blood)903819-3843中综述)。例如，已经发现在脓毒病中，激活因子XII和前激肽释放酶可产生裂解，这种裂解会使它们活化成与Cl-抑制剂快速反应而形成因子XIIa-Cl-抑制剂和激肽释放酶-Cl-抑制剂复合物的酶。在模拟的心肺分流术中观察到激肽释放酶-Cl-抑制剂复合物的形成显著增加。
有人发现抑酶肽(一种纤溶酶和血浆激肽释放酶的抑制剂)可在心脏手术后减少出血并减少手术后增加的出血时间。特别地，发现抑酶肽可减少模拟的体外分流模型中的激肽释放酶-Cl-抑制剂和Cl-Cl-抑制剂复合物(Wachtfogel等，1993，《胸腔心血管手术杂志》(J.Thorac.CardiovascSurg.)1061)。当将抑酶肽加入到灌注了肝素抗凝的全血的心肺分流回路中时，抑酶肽确实补充了肝素的作用(Bannan等，1998，《英国血液学杂志》(Brit.J.Haem.)101455-461)。因此，抑酶肽对那些被发现具有肝素结合回路的出血具有附加的止血有利作用。
当将内皮细胞储存在器官保护溶液中时抑酶肽还可以提高内皮细胞在含氧量低的冷储存条件下的存活力并改善在完整器官模型中对肺和心肌的保存(Sunamori等，1991，《胸腔手术年鉴》(Ann.Thor.Surg.)52971-978和Roberts等，1998，《胸腔手术年鉴》66225-230)。此外，尽管发现缓激肽可增加血管通透性，但是抑酶肽降低了这种通透性和中性粒细胞计数(O’Brien等，1997，《加拿大生理学与药理学杂志》(Can.J.Physiol.Pharmacol.)75741-749和Dwenger等，1995，《欧洲临床化学和临床生物化学杂志》(Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.)34207-214)。
肝素结合蛋白近来已经确定了分离自人和猪的外周中性粒细胞的两种极为相关蛋白质的共价结构(参见H.Flodgaard等，1991，《欧洲生物化学杂志》(Eur.J.Biochem.)197535-547；J.Pohl等，1990，《FEBS通讯》(FEBS Lett.)272200ff)。这两种蛋白质表现出与中性粒细胞弹性蛋白酶的高度相似性，但由于195位活性丝氨酸和57位活性组氨酸的选择性突变(胰凝乳蛋白酶编号方式(B.S.Hartley“丝氨酸蛋白酶中的同源性”(Homologies in Serine-Proteinases)-Phil.Trans.Roy.Soc.)系列257，1970，p.77ff))，这些蛋白质缺乏蛋白酶活性。已经将这些蛋白质根据其对肝素的高度亲合性而分别命名为人肝素结合蛋白(hHBP)和猪肝素结合蛋白(pHBP)。
Schafer等(Schafer等，1984，《感染性免疫》(Infect.Immun.)53651)已经根据抗菌活性命名了蛋白质阳离子抗微生物蛋白质(CAP37)。HBP与LPS的类脂A成分以及内毒素强力结合(Kass＝0.8×109M-1)。已经提示HBP的杀菌作用是由于结合类脂A所导致的(Petersen等，1993，《欧洲生物化学杂志》B214271-279；Flodgaard等，1994，《细胞生物化学杂志》(J.Cell.Biochem.)增刊18A摘要E505；Pereira等，1993，《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)904733-4737)。推定的天然HBP的类脂A/LPS结合位点是定位在HBP上碱性与酸性区(patch)之间的不带电区，其包括20-26位和41-43位的残基。在类脂A/LPS结合位点上，Phe25、Cys26、Cys42和Phe43形成一种适合于结合脂肪酸链或类脂A的葡糖胺基糖环的疏水袋。紧接此袋的是离子袋和亲水袋(Asn20、Gln21和Arg23)，这种离子袋和亲水袋很适合于结合类脂A中葡糖胺基连接的磷酸基(Iversen等，1997，《天然结构生物学》(Nature Struct.Biology)4265-268)。
此外，在粪便性腹膜炎的动物模型中，已经证实HBP治疗可以挽救小鼠免受致命损伤(Mercer-Jones等，1996，在《外科手术论坛》中所述，pp.105-108；和Wickel等，1997，第4届创伤休克和脓毒病的免疫后果的国际讨论会-(4thInternational Congress on the Immune Consequences of Trauma，Shock and Sepsis)，Munich，Germany，pp.413-416)。已经有人提出可以将肝素结合蛋白或其结合LPS的部分用于治疗败血性休克(WO95/28949，美国专利号5,458,874，5,607,916和5,650,392)。
HBP最初是因其抗生素特性和LPS结合特性而被研究(Gabay等，1989，美国国家科学院学报865610-5614和Pereira等，1993，美国国家科学院学报904733-7)。然而，目前累积的证据支持了HBP除其抗菌作用外还因其对补充和激活单核细胞的影响(Pereira等，1990，《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)851468-1476和Rasmussen等，1996，FEBS通讯390109-112)、对补充T细胞的影响(Chertov等，1996，《(生物化学杂志》(J.Bio.Chem.)2712935-2940)而参与炎症的进展。
已经发现HBP可诱发内皮细胞和成纤维细胞收缩(φstergaard和Flodgaard，1992，《白细胞生物学杂志》(J.Leuk.Biol.)51316-323)。在这方面，WO 93/05396中公开了一种通过使HBP或产生HBP的细胞与疑为HBP抑制剂的物质及能够与HBP发生相互作用的组织或细胞一起保温来筛选HBP抑制剂的方法；相互作用减少(例如内皮细胞收缩)表明该物质是一种HBP抑制剂。
WO99/26647号申请中公开了肝素结合蛋白在调节或预防哺乳动物细胞凋亡中的用途。该申请还公开了HBP可以使大鼠胰岛瘤细胞从IL-1诱发的凋亡中获救。
还发现人肝素结合蛋白而非猪肝素结合蛋白可与抑酶肽(BPTI)结合(Petersen等，欧洲生物化学杂志214271-279)。特别地，BPTI仍然能够以Kd＝0.1×10-6M结合HBP(Petersen等，1993，欧洲生物化学杂志B214271-279)。已经将HBP的P1特异性确定为主要是Lys或Leu(Kiczak等，1999，《生物化学》(Biol.Chem.)380101-105)。已经提示HBP中影响BPTI结合的最主要残基是Gly169、Gly175、Ser192和Asp201，相当于胰蛋白酶中的Asp189、Ser195、Gly216和Asp226(Petersen等，1993，欧洲生物化学杂志B214271-279)。Kiczak等1999，生物化学380101-106使用噬菌体展示法构建了抑酶肽P1侧链上的突变体的文库。他们发现HBP对P1 Lys和对不带电的P1氨基酸Leu、Thr、Met、Gln表现出强亲和力。
发明简述已经令人意外地发现肝素结合蛋白(HBP)可作为中性粒细胞诱发的血管渗漏和伴有缓激肽形成的接触相系统的活化中的信号连接，且它特别在PK介导的HK裂解中起作用从而获得缓激肽序列。另外，已经发现HBP拮抗剂可降低内皮细胞的通透性。本文所定义的“HBP拮抗剂”是与肝素结合蛋白结合并抑制肝素结合蛋白的作用的物质。
本发明涉及一种用于治疗或预防由哺乳动物、特别是人类患者、特别是产生与HBP拮抗剂结合的HBP的哺乳动物体内缓激肽释放所导致的疾病的方法，该方法包括对有相应需要的所述哺乳动物给予有效调节或减少所述哺乳动物体内缓激肽释放的用量的哺乳动物肝素结合蛋白拮抗剂。所述疾病包括但不限于系统性炎性应答综合征、局部缺血再灌注(ischemiareperfusion)、过敏反应和同种异体移植物排斥。这类疾病还包括成人呼吸窘迫综合征、即系统性炎性应答综合征的一种副作用。过敏反应可以因心肺分流术、肺部外科手术、头部外伤和严重整体外伤过程中PMN的不适宜活化而发生。通过防止HBP与内皮细胞和/或与接触相系统接触可以调节或减少缓激肽的释放。在一个具体实施方案中，HBP拮抗剂调节或减少激肽释放酶介导的H-激肽原的裂解，该裂解获得缓激肽序列。本发明进一步涉及HBP拮抗剂在制备用于治疗带有与HBP拮抗剂结合的HBP的患者体内系统性炎性应答综合征、局部缺血再灌注(ischemia reperfusion)、过敏反应和同种异体移植物排斥的药剂中的应用。可以将HBP拮抗剂进一步用于治疗系统性炎性应答综合征并发症、即成人呼吸窘迫综合征或制备用于治疗该病的药剂。
在一个具体实施方案中，本发明涉及一种用于预防由哺乳动物、特别是人类患者、特别是产生与HBP拮抗剂结合的HBP的哺乳动物体内缓激肽释放所导致的疾病的方法，该方法包括对有相应需要的所述哺乳动物给予有效调节或减少所述哺乳动物体内缓激肽释放的用量的结合HBP的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域或其类似物或其衍生物。
在另一个具体实施方案中，本发明涉及一种用于治疗或预防由哺乳动物、特别是人类患者、特别是产生与结合HBP上至少一种表位的单克隆抗体结合的HBP的哺乳动物体内缓激肽释放所导致的疾病的方法，其中所述表位结合前激肽释放酶-H-激肽原复合物并激活缓激肽的释放；该方法包括对有相应需要的所述哺乳动物给予有效调节或减少所述哺乳动物体内缓激肽释放的用量的结合HBP上至少一种表位的单克隆抗体，其中所述表位结合前激肽释放酶-H-激肽原复合物并激活缓激肽。
本发明还涉及用于检测HBP拮抗剂的方法。在一个实施方案中，所述方法包括下列步骤(a)在有HBP存在以及有和没有疑为所述拮抗剂的物质存在的情况下培养内皮细胞；和(b)检测所述物质对内皮细胞通透性的任何影响；其中所述内皮细胞的通透性与当在有HBP而没有所述物质存在的情况下培养时所述细胞的通透性相比降低表明所述物质是一种拮抗剂。在另一个实施方案中，所述方法包括下列步骤(a)使HBP与能与HBP发生相互作用的第一种物质和疑为HBP拮抗剂的第二种物质一起保温；和(b)检测疑为拮抗剂的所述第二种物质对HBP与所述第一种物质的相互作用的任何影响。
在一个具体实施方案中，本发明涉及一种鉴定与HBP、特别是人HBP的至少一种表位结合的单克隆抗体的方法，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽的释放。在一个实施方案中，所述方法包括下列步骤(a)在有HBP存在以及有和没有怀疑与HBP、特别是人HBP的至少一种表位结合的单克隆抗体存在的情况下培养内皮细胞，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽的释放；和(b)检测所述物质对内皮细胞通透性的任何影响；其中所述内皮细胞的通透性与当在有HBP而没有所述抗体存在的情况下培养时所述细胞的通透性相比降低表明所述抗体是与HBP上至少一种表位结合的单克隆抗体，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽的释放。在另一个实施方案中，所述方法包括下列步骤(a)在有HBP存在以及有和没有怀疑与HBP、特别是人HBP上至少一种表位结合的单克隆抗体存在的情况下培养前激肽释放酶-H-激肽原复合物，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽的释放；和(b)检测所述抗体对缓激肽释放的任何影响，缓激肽释放减少表明所述抗体与HBP上的至少一种所述表位结合。
本发明还涉及用于测定哺乳动物是否产生与HBP拮抗剂结合的HBP的方法和试剂盒。所述方法包括下列步骤(a)从所述哺乳动物、特别是人类患者体内分离HBP或产生HBP的细胞或组织；(b)使与HBP发生相互作用的物质、组织、细胞或其成分及所述HBP拮抗剂与所述HBP或产生HBP的细胞或组织一起保温；和(c)检测所述肝素结合拮抗剂对HBP与所述物质、组织、细胞或其成分的相互作用的影响；相互作用减少表明所述HBP与所述HBP拮抗剂结合。检测试剂盒包括(a)HBP拮抗剂；(b)天然HBP；和(c)与HBP发生相互作用的物质、组织、细胞或其成分。
在一个具体实施方案中，本发明还涉及用于测定哺乳动物、特别是人类患者是否产生与结合天然HBP、特别是人HBP上至少一种(on)表位的单克隆抗体结合的HBP的方法和试剂盒，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽的释放；所述方法包括下列步骤(a)从所述哺乳动物体内分离HBP或产生HBP的细胞或组织；(b)在有或没有所述抗体存在的情况下使所述HBP或产生HBP的细胞或组织与内皮细胞一起培养；和(c)检测所述抗体对内皮细胞通透性的任何影响，通透性降低表明所述HBP与所述抗体结合。在另一个实施方案中，所述方法包括下列步骤(a)从所述哺乳动物体内分离HBP或产生HBP的细胞或组织；(b)在有或没有所述抗体存在的情况下使所述HBP或产生HBP的细胞或组织与前激肽释放酶-H-激肽原复合物一起保温；和(c)检测所述HBP对缓激肽从前激肽释放酶-H-激肽原复合物中释放的任何影响，缓激肽释放减少表明所述HBP与所述抗体结合。本发明的试剂盒包括(a)与天然HBP、特别是人HBP上的至少一种表位结合的单克隆抗体，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽的释放；(b)天然人HBP；和(c)与固体支持物结合的前激肽释放酶-H-激肽原复合物。
更具体地，本发明涉及以下方面1.一种用于预防或治疗由哺乳动物中缓激肽释放导致的疾病的方法，其中所述哺乳动物产生与HBP拮抗剂结合的HBP，所述方法包括对有相应需要的所述哺乳动物给予有效减少所述哺乳动物中缓激肽释放的用量的哺乳动物HBP拮抗剂。
2.项1所述方法，其中所述HBP拮抗剂的用量为约10mg-约1g/单位剂型。
3.项1所述方法，其中所述HBP拮抗剂的用量为约0.1-100mg/kg体重。
4.项1所述方法，其中所述HBP拮抗剂的用量为约0.5-50mg/kg体重。
5.项1所述方法，其中所述HBP拮抗剂的用量为约1-25mg/kg体重。
6.项1所述方法，其中所述疾病选自系统性炎性应答综合征、局部缺血再灌注、过敏反应和同种异体移植物排斥。
7.项1所述方法，其中所述疾病是成人呼吸窘迫综合征。
8.哺乳动物HBP拮抗剂在制备用于预防或治疗由哺乳动物中缓激肽释放导致的疾病的药剂中的用途，其中所述哺乳动物产生能与HBP拮抗剂结合的HBP。
9.项8所述用途，其中所述HBP拮抗剂的用量为约10mg-约1g/单位剂型。
10.项8所述用途，其中所述HBP拮抗剂的用量为约0.1-100mg/kg体重。
11.项8所述用途，其中所述HBP拮抗剂的用量为约0.5-50mg/kg体重。
12.项8所述用途，其中所述HBP拮抗剂的用量为约1-25mg/kg体重。
13.项8所述用途，其中所述疾病选自系统性炎性应答综合征、局部缺血再灌注、过敏反应和同种异体移植物排斥。
14.项8所述用途，其中所述疾病是成人呼吸窘迫综合征。
15.一种用于治疗或预防由哺乳动物中缓激肽释放导致的疾病的方法，其中所述哺乳动物产生与抑酶肽或其类似物结合的HBP，所述方法包括对有相应需要的所述哺乳动物给予有效减少所述哺乳动物中缓激肽释放的用量的抑酶肽或其类似物。
16.项15所述方法，其中所述抑酶肽类似物是在15-19位上含有至少一个突变的抑酶肽变体。
17.项15所述方法，其中所述疾病选自系统性炎性应答综合征、局部缺血再灌注、过敏反应和同种异体移植物排斥。
18.项15所述方法，其中所述疾病是成人呼吸窘迫综合征。
19.抑酶肽或其类似物在制备用于减少哺乳动物中缓激肽释放的药剂中的用途，其中所述哺乳动物产生能与抑酶肽或其类似物结合的HBP。
20.项19所述用途，其中所述抑酶肽类似物是在15-19位上含有至少一个突变的抑酶肽变体。
21.抑酶肽或其类似物在制备用于治疗带有能与抑酶肽或其类似物结合的HBP的患者体内的系统性炎性应答综合征、局部缺血再灌注、过敏反应和同种异体移植物排斥的药剂中的用途。
22.抑酶肽或其类似物在制备用于治疗带有能与抑酶肽或其类似物结合的HBP的患者体内的成人呼吸窘迫综合征的药剂中的用途。
23.一种用于预防或治疗由哺乳动物中缓激肽释放导致的疾病的方法，其中所述哺乳动物能产生与结合至少一种HBP表位的单克隆抗体结合的HBP，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽的释放，所述方法包括对有相应需要的所述哺乳动物给予能结合至少一种HBP表位的单克隆抗体，其中所述表位以有效减少所述哺乳动物中缓激肽释放的量与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽的释放。
24.项23所述方法，其中所述哺乳动物是人类患者且所述HBP是人HBP。
25.项23所述方法，其中所述单克隆抗体是人单克隆抗体。
26.结合至少一种HBP表位的单克隆抗体在制备用于预防或治疗由哺乳动物中缓激肽释放导致的疾病的药剂中的用途，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽；其中所述哺乳动物产生能与结合至少一种HBP表位的所述单克隆抗体结合的HBP，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽。
27.项26所述用途，其中所述哺乳动物是人类患者且所述HBP是人HBP。
28.项26所述用途，其中所述单克隆抗体是人单克隆抗体。
29.项26所述用途，其用于制备可有效治疗系统性炎性应答综合征、局部缺血再灌注、过敏反应和同种异体移植物排斥的药剂。
30.项26所述用途，其用于制备可有效治疗成人呼吸窘迫综合征的药剂。
31.一种鉴定HBP拮抗剂的方法，所述方法包括下列步骤(a)在有HBP存在以及有和没有疑为所述拮抗剂的物质存在的情况下培养内皮细胞；和(b)检测所述物质对内皮细胞通透性的任何影响；其中所述内皮细胞的通透性与当在有HBP而没有所述物质存在的情况下培养时所述细胞的通透性相比降低，则表明所述物质是一种拮抗剂。
32.项31所述方法，其中在步骤(a)中，内皮细胞首先在有HBP存在的情况下培养并测定所述细胞的通透性，然后在有所述物质存在的情况下培养所述细胞。
33.项31所述方法，其中在步骤(a)中，首先在有所述物质的情况下培养内皮细胞，然后在有所述HBP存在的情况下培养所述细胞。
34.项31所述方法，其中在有HBP的情况下培养一种内皮细胞样品，然后在有HBP和所述物质存在的情况下培养第二种样品。
35.项31所述方法，其中所述哺乳动物HBP是人HBP。
36.一种用于鉴定HBP拮抗剂的方法，该方法包括下列步骤(a)使HBP与那些能与HBP发生相互作用的第一种物质和疑为HBP拮抗剂的第二种物质一起培养；和(b)检测疑为拮抗剂的所述第二种物质对HBP与所述第一种物质相互作用的任何影响；其中所述HBP与所述第一种物质之间相互作用的减弱指示所述第二种物质是HBP拮抗剂。
37.一种鉴定与天然HBP上至少一种表位结合的单克隆抗体的方法，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽的释放；所述方法包括下列步骤(a)在有HBP存在以及有和没有疑为所述拮抗剂的物质存在的情况下培养内皮细胞；和(b)检测所述物质对内皮细胞通透性的任何影响；其中所述内皮细胞的通透性与当在有HBP而没有所述物质存在的情况下培养时所述细胞的通透性相比降低，表明所述单克隆抗体与所述HBP上的至少一种表位结合。
38.项37所述方法，其中所述天然HBP是人HBP。
39.一种鉴定与天然HBP上至少一种表位结合的单克隆抗体的方法，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽的释放；所述方法包括下列步骤(a)在有HBP存在以及有和没有怀疑与所述HBP上至少一种表位结合的单克隆抗体存在的情况下保温前激肽释放酶-H-激肽原复合物；和(b)检测所述抗体对缓激肽释放的任何影响；缓激肽释放的减少表明所述抗体与所述HBP上的至少一种表位结合。
40.项39所述方法，其中所述前激肽释放酶-H-激肽原复合物与固体支持物结合。
41.项39所述方法，进一步包括在有内皮细胞存在的情况下培养步骤(a)中的混合物。
42.项39所述方法，进一步包括在有血小板存在的情况下培养步骤(a)中的混合物。
43.权利要求39所述方法，其中所述天然HBP是天然人HBP。
44.项39所述方法，其中缓激肽的释放使用一种免疫测定法来检测。
45.一种用于测定哺乳动物是否产生与HBP拮抗剂结合的HBP的方法，该方法包括下列步骤(a)从患者体内分离HBP或产生HBP的细胞或组织；(b)使与HBP发生相互作用的物质、组织、细胞或其成分和所述HBP拮抗剂与所述HBP或产生HBP的细胞或组织一起保温；和(c)检测所述HBP拮抗剂对HBP与所述物质、组织、细胞或其成分的相互作用的影响；相互作用减弱表明所述HBP与所述HBP拮抗剂结合。
46.项45所述方法，其中所述HBP首先与所述拮抗剂一起保温，然后与能与HBP发生相互作用的物质、组织、细胞或其成分一起保温。
47.项45所述方法，其中所述HBP首先与能与HBP发生相互作用的物质、组织、细胞或其成分一起保温，然后与所述拮抗剂一起保温。
48.一种试剂盒，它包括(a)HBP拮抗剂；(b)HBP或产生HBP的细胞；和(c)一种与HBP发生相互作用的物质、组织、细胞或其成分。
49.项48所述检测试剂盒，其中所述HBP被标记。
50.项48所述检测试剂盒，其中所述检测试剂盒包括与HBP发生相互作用的一种物质。
51.项50所述检测试剂盒，其中所述物质是H-激肽原。
52.项50所述检测试剂盒，其中所述物质被标记。
53.项50所述检测试剂盒，进一步包括珠。
54.一种用于测定哺乳动物是否产生与结合天然HBP上至少一种表位的单克隆抗体结合的HBP的方法，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽的释放；该方法包括下列步骤(a)从所述哺乳动物体内分离HBP或产生HBP的细胞或组织；(b)在有或没有所述抗体存在的情况下使所述HBP或产生HBP的细胞或组织与内皮细胞一起培养；和(c)检测所述抗体对内皮细胞通透性的任何影响；通透性降低表明所述HBP与所述抗体结合。
55.项54所述方法，其中所述哺乳动物是人类患者。
56.项54所述方法，其中所述天然HBP是天然的人HBP。
57.一种用于测定哺乳动物是否产生与结合天然HBP上至少一种表位的单克隆抗体结合的HBP的方法，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽的释放；该方法包括下列步骤(a)从所述哺乳动物体内分离HBP或产生HBP的细胞或组织；(b)使所述HBP或产生HBP的细胞或组织与前激肽释放酶-激肽原复合物一起培养；和(c)检测所述HBP对缓激肽从前激肽释放酶-H-激肽原复合物中释放的任何影响；缓激肽释放减少表明所述HBP与所述抗体结合。
58.一种检测试剂盒，它包括(a)与HBP表位结合的单克隆抗体；(b)天然人HBP；和(c)与固体支持物结合的前激肽释放酶-H-激肽原复合物。
附图简述

图1表示与第二抗体山羊抗小鼠F(ab)2交联的CD18的影响。
图2表示HBP(25-75μg/ml)对单层内皮细胞的通透性的剂量依赖性效应。
图3显示使用HBP多克隆抗血清对HBP诱发的EC通透性增加的抑制作用。
图4显示抗HBP抗体在PMN分泌对内皮细胞屏障功能的作用中的影响。
图5显示使用针对缓激肽的单克隆抗体MBK3对缓激肽诱导型和HBP诱导型EC通透性增加的抑制作用。在0时对与mAb MBK3(40μg/ml)一起预温的EC单层的薄层侧给予缓激肽(100nM；图5a)或HBP(75μg/ml；图5b)。
图6表示使用针对血浆激肽释放酶的单克隆抗体PKH4对HBP诱发的EC通透性增加的抑制作用。HBP(75μg/ml；实心符号)或缓激肽(100nM；空心符号)。
图7表示肽HKH20处理对HBP诱发的EC通透性增加的抑制作用。
图8表示肽SDD31处理对HBP诱发的EC通透性增加的抑制作用。
图9表示抑酶肽处理对HBP诱发的EC通透性增加的抑制作用。
图10人单核细胞的I1-6释放。在有图中所示量的LPS和/或天然HBP/[R23S，F25E]HBP/[G175Q]HBP存在的情况下将所述单核细胞在1ml不含血清的培养基中培养24小时。
图11(A)使用3H-LPS饱和天然HBP、[R23S，F25E]HBP和[G175Q]HBP和(B)使用固定的、浓度递增的未标记BPTI竞争对125I-BPTI的结合。(C)以％0nM未标记BPTI表示的125I-BPTI的浓度。HBP与[R23S，F25E]HBP之间在结合上的表观差异在“结果”部分讨论。条形(bar)表示标准差。
发明详述肝素结合蛋白在本文的上下文中，术语“肝素结合蛋白”(“HBP”)指(i)蛋白水解失活的；(ii)储存在多形核白细胞嗜天青颗粒中；和(iii)可作为单核细胞化学引诱物和/或激活单核细胞的蛋白质。优选HBP来自哺乳动物、特别是人。特别地，HBP是一种成熟人HBP，它与表示为SEQ ID NO1的氨基酸序列具有至少约80％的同一性、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％，最优选至少约97％(下文的“同源多肽”)，它们定性地保留了所述HBP的活性。
SEQ ID NO1Ile Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu Ala Ser Ile Gln Asn Gln Gly ArgHis Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr Ala Ala Ser Cys Phe Gln SerGln Asn Pro Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln SerArg Gln Thr Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Gln Asn Leu Asn AspLeu Met Leu Leu Gln Leu Asp Arg Glu Ala Asn Leu Thr Ser Ser Val Thr lle Leu Pro Leu ProLeu Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val Ala Gly Trp Gly Ser Gln Arg SerGly Gly Arg Leu Ser Arg Phe Pro Arg Phe Val Asn Val Thr Val Thr Pro Glu Asp Gln Cys ArgPro Asn Asn Val Cys Thr Gly Val Leu Thr Arg Arg Gly Gly Ile Cys Asn Gly Asp Gly Gly ThrPro Leu Val Cys Glu Gly Leu Ala His Gly Val Ala Ser Phe Ser Leu Gly Pro Cys Gly Arg GlyPro Asp Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu Phe Arg Asp Trp Ile Asp Gly Val Leu Asn Asn Pro GlyPro Gly Pro Ala所述同源多肽的氨基酸序列因插入或缺失了一个或多个氨基酸残基和/或用不同氨基酸残基取代了一个或多个氨基酸残基而不同于表示为SEQ IDNO1的氨基酸序列。优选氨基酸的改变属于最小性质上的改变，其为不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，一般为1-约30个氨基酸的缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，诸如氨基末端的甲硫氨酸残基；最高约达20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一种功能而有利于纯化的小的延伸，诸如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域。
保守取代的实例是在碱性氨基酸(诸如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(诸如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(诸如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(诸如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(诸如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(诸如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的各组范围。那些通常不改变比活性的氨基酸取代在本领域中是公知的且由例如H.Neurath和R.L.Hill在1979蛋白质，Academic Press，New York中描述。最常见互换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Iys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly以及它们的反向互换。
该术语特别用来包括HBP的肽片段、特别是具有与天然HBP相似的趋化作用的片段。此外，在本发明方法中使用的HBP与诸如抑酶肽和/或针对天然人HBP的单克隆抗体等HBP拮抗剂结合。成熟形式的天然人HBP具有表示为SEQ ID NO1的氨基酸序列且另外它是(i)蛋白水解失活的；(ii)储存在多形核白细胞的嗜天青颗粒中；并(iii)可作为单核细胞的化学引诱物和/或激活单核细胞的蛋白。
HBP可以分离自血小板，使用美国专利号5,814,602中所述方法可以从人血液中获得。更具体地说，所述蛋白质可通过对血小板提取物的分级分离而产生。使用肝素-Sepharose进行的柱层析可以方便地达到这一目的。这类层析方法包括首先将血小板提取物上样至该柱，再用0.5M一3M NaCl进行梯度洗脱，产生两个洗脱峰。第一个在1.2M NaCl前后的峰可以在280nm测定为较大蛋白质峰，公知它本身是血小板因子(PF4)。在1.8M NaCl前后，蛋白质的量低于所用系统的检测极限，但该区域中的级分具有血管生成活性。另外通过C4柱上的微内径反相HPLC来纯化活性级分，可以在214nm处测到一个完全纯的蛋白质峰，该蛋白质与现有的、用不同类型血小板所得猪或人的HBP相同。
如果将HBP用于检测HBP拮抗剂，那么它应优选通过如下的重组DNA方法获得。编码HBP的核酸序列可以通过现有标准方法如，S.L Beaucage和M.H.Caruthers，1981，四面体通讯(Tetrahedron Letters)221859-1869所述膦酰胺法；或Matthes等，1984，欧洲分子生物学组织杂志(EMBO Journal)3；801-805所述方法来合成。根据膦酰胺(phosphoamidite)法，在例如自动DNA合成仪中合成寡核苷酸、将其纯化、退火、连接并克隆入合适的载体。
用于分离或克隆编码本发明方法中使用的肝素结合蛋白的核酸序列的技术在本领域中是公知的，包括从基因组DNA中分离、由cDNA制备或其组合。由这类基因组DNA克隆本发明的核酸序列可以通过如下方式实现，例如使用众所周知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆的DNA片段。参见，例如Innis等，1990，方法与应用指南(A Guide to Methods and Application)，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法，诸如连接酶链反应(LCR)、连接活化转录(LAT)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。
然后将核酸序列插入重组表达载体中，这种重组表达载体可以是可便利地进行重组DNA过程的任意载体。对载体的选择通常依赖于它将被引入的宿主细胞。因此，该载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体形式存在的载体，其复制与染色体的复制无关，例如质粒。另一方面，载体可以是当引入宿主细胞时，整合入宿主细胞基因组并与它所整合入的染色体一起复制的一种载体。
编码SEQ ID NO1、SEQ ID NO2的核酸序列可以可操作地与编码异源原序列(pro)和/或信号序列的核酸连接。另一方面，可以将分别编码SEQID NOS4(信号序列+成熟HBP)和6(信号序列+原序列+成熟HBP)、SEQID NOS3和5的核酸插入重组载体中。
SEQ ID NO2atcgttggcg gccggaaggc gaggccccgc cagttcccgt tcctggcctc cattcagaat caaggcaggc acttctgcgggggtgccctg atccatgccc gcttcgtgat gaccgcggcc agctgcttcc aaagccagaa ccccggggtt agcaccgtggtgctgggtgc ctatgacctg aggcggcggg agaggcagtc ccgccagacg ttttccatca gcagcatgag cga-gaatggc tacgaccccc agcagaacct gaacgacctg atgctgcttc agctggaccg tgaggccaacctcaccagca gcgtgacgat actgccactg cctctgcaga acgccacggt ggaagccggc accagatgccaggtggccgg ctgggggagc cagcgcagtg gggggcgtct ctcccgtttt cccaggttcg tcaacgtgac tgtgacccccgaggaccagt gtcgccccaa caacgtgtgc accggtgtgc tcacccgccg cggtggcatc tgcaatgggg ac-gggggcac ccccctcgtc tgcgagggcc tggcccacgg cgtggcctcc ttttccctgg ggccctgtgg ccgaggccctgacttcttca cccgagtggc gctcttccga gactggatcg atggcgtttt aaacaatccg ggaccggggc cagcctag
SEQ ID NO3ggctccagcc cccttttgga catcgttggc ggccggaagg cgaggccccg ccagttcccg tcctggcct ccattcagaatcaaggcagg cacttctgcg ggggtgccct gatccatgcc cgcttcgtga tgaccgcggc cagctgcttc caaagccagaaccccggggt tagcaccgtg gtgctgggtg cctatgacct gaggcggcgg gagaggcagt cccgccagac gttttccatcagcagcatga gcgagaatgg ctacgacccc cagcagaacc tgaacgacct gatgctgcttcagctggacc gtgaggccaa cctcaccagc agcgtgacga tactgccact gcctctgcag aacgccacggtggaagccgg caccagatgc caggtggccg gctgggggag ccagcgcagt ggggggcgtc tctcccgttttcccaggttc gtcaacgtga ctgtgacccc cgaggaccag tgtcgcccca acaacgtgtg caccggtgtg ctcacccgccgcggtggcat ctgcaatggg gacgggggca cccccctcgt ctgcgagggc ctggcccacg gcgtggcctc cttttccctggggccctgtg gccgaggccc tgacttcttc acccgagtgg cgctcttccg agactggatc gatggcgttt taaaacaatccgggaccgggg ccagcctagSEQ ID NO4Gly Ser Ser Pro Leu Leu Asp Ile Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe LeuAla Ser Ile Gln Asn Gln Gly Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met ThrAla Ala Ser Cys Phe Gln Ser Gln Asr Pro Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp LeuArg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly Tyr AspPro Gln Gln Asn Leu Asn Asp Leu Met Leu Leu Gln Leu Asp Arg Glu Ala Asn Leu Thr SerSer Val Thr Ile Leu Pro Leu Pro Leu Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val AlaGly Trp Gly Ser Gln Arg Ser Gly Gly Arg Leu Ser Arg Phe Pro Arg Phe Val Asn Val Thr ValThr Pro Glu Asp Gln Cys Arg Pro Asr Asn Val Cys Thr Gly Val Leu Thr Arg Arg Gly Gly IleCys Asn Gly Asp Gly Gly Thr Pro Leu Val Cys Glu Gly Leu Ala His Gly Val Ala Ser Phe SerLeu Gly Pro Cys Gly Arg Gly Pro Asp Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu Phe Arg Asp Trp Ile AspGly Val Leu Asn Asn Pro Gly Pro Gly Pro AlaSEQ ID NO5atgacccggc tgacagtcct ggccctgctg gctggtctgc tggcgtcctc gagggccggc tccagccccc ttttggacatcgttggcggc cggaaggcga ggccccgcca gttcccgttc ctggcctcca ttcagaatca aggcaggcac ttctgcgggggtgccctgat ccatgcccgc ttcgtgatga ccgcggccag ctgcttccaa agccagaacc ccggggttag caccgtggtgctgggtgcct atgacctgag gcggcgggag aggcagtccc gccagacgtt ttccatcagc agcatgagcgagaatggcta cgacccccag cagaacctga acgacctgat gctgcttcag ctggaccgtg aggccaacct caccag-cagc gtgacgatac tgccactgcc tctgcagaac gccacggtgg aagccggcac cagatgccag gtggccggctgggggagcca gcgcagtggg gggcgtctct cccgttttcc caggttcgtc aacgtgactg tgacccccga ggaccagtgtcgccccaaca acgtgtgcac cggtgtgctc acccgccgcg gtggcatctg caatggggac gggggcacccccctcgtctg cgagggcctg gcccacggcg tggcctcctt ttccctgggg ccctgtggcc gaggccctga cttcttcacccgagtggcgc tcttccgaga ctggatcgat ggcgttttaa acaatccggg accggggcca gcctag
SEQ ID NO6Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala-Gly Leu Leu Ala Ser Ser Arg Ala Gly Ser SerPro Leu Leu Asp Ile Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu Ala Ser IleGln Asn Gln Gly Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr Ala AlaSer Cys Phe Gln Ser Gln Asn Pro Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg ArgArg Glu Arg Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly Tyr Asp Pro GlnGln Asn Leu Asn Asp Leu Met Leu Leu Gln Leu Asp Arg Glu Ala Asn Leu Thr Ser Ser ValThr Ile Leu Pro Leu Pro Leu Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val Ala GlyTrp Gly Ser Gln Arg Ser Gly Gly Arg Leu Ser Arg Phe Pro Arg Phe Val Asn Val Thr Val ThrPro Glu Asp Gln Cys Arg Pro Asn Asn Val Cys Thr Gly Val Leu Thr Arg Arg Gly Gly Ile CysAsn Gly Asp Gly Gly Thr Pro Leu Val Cys Glu Gly Leu Ala His Gly Val Ala Ser Phe Ser LeuGly Pro Cys Gly Arg Gly Pro Asp Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu Phe Arg Asp Trp Ile Asp GlyVal Leu Asn Asr Pro Gly Pro Gly Pro Ala编码HBP的核酸序列也可以可操作地连接合适的终止子，诸如人生长激素终止子(Palmiter等，出处同上)。载体可以进一步包括其它元件。这些元件包括据聚腺苷酸化信号(例如来自SV 40或腺病毒5 E1b区)、转录增强子序列(例如SV 40增强子)和翻译增强子序列(例如编码腺病毒VA RNA的序列)。重组表达载体还可以包括使载体在所选宿主细胞中复制的DNA序列。所述载体还可以包括选择标记，例如一种基因、其产物补充宿主细胞中的缺陷，诸如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或产生耐药性的基因，所述药物例如是新霉素、遗传霉素、氨苄青霉素或潮霉素。
在一个具体实施方案中，HBP可如下生成，在允许表达HBP的条件下，将含有编码成熟HBP及其之前的N-末端延伸的DNA序列的宿主细胞在合适培养基中培养，并从所述培养基中回收N-末端延伸型的HBP。
N-末端延伸可以是约5-约25个氨基酸残基、特别是约8-约15个氨基酸残基的序列。N-末端序列中氨基酸残基的性质并不关键。
为了有利于生产成熟HBP，一般优选编码N-末端延伸型HBP的DNA序列包括编码蛋白酶切割位点的DNA序列，所述蛋白酶切割位点位于编码N-末端延伸的DNA序列与编码成熟HBP的DNA序列之间。合适的蛋白酶切割位点的实例是带有所述氨基酸序列的肠激酶切割位点、带有所述氨基酸序列的因子Xa切割位点。
另一方面，可以在允许表达HBP的条件下于合适培养基中培养含有编码成熟HBP及其之前的信号序列的DNA的宿主细胞，并从所述培养基中回收成熟HBP。
用于连接分别编码HBP或N-末端延伸型HBP、Δpro-HBP(信号+成熟HBP)、启动子和终止子的核酸序列并使它们插入含有复制所必需信息的合适载体的方法对在本领域技术人员来说是众所周知的(参见，例如Sambrook等，出处同上)。
引入了表达载体的宿主细胞可以是能够产生HBP的任意细胞且优选是真核细胞，诸如无脊椎动物(昆虫)细胞或脊椎动物细胞、例如哺乳动物细胞、特别是昆虫和哺乳动物细胞。一个优选的实施方案中，所述哺乳动物细胞是可以在用编码哺乳动物HBP的核酸转染后在厌氧条件下培养的细胞。在一个更为优选的实施方案中，所述哺乳动物细胞是腺病毒转化的细胞或来源于胚胎细胞的细胞。正如本文所定义的，来源于胚胎细胞的细胞是获自胚胎细胞原代培养物的细胞或来自胚胎细胞原代培养物原始传代的细胞系的细胞。这类腺病毒转化的细胞或来源于胚胎的细胞的实例是人胚胎肾(HEK)细胞、特别是HEK 293细胞。所述昆虫细胞可以是例如，鳞翘目或果蝇属的细胞。
用于转染哺乳动物细胞和表达引入所述细胞的DNA序列的方法描述在下列文献中例如Kaufman和Sharp，1982，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)159601-621；Southern和Bergm，1982，分子应用遗传学杂志(J.Mol.Appl.Genet.)1327-341；Loyter等，1982，美国国家科学院学报(79422-426；wigler等，1978，细胞14725；Corsaro和Pearson，1981，体细胞遗传学(Somatic CellGenetics)7603；Graham和van der Eb，1973，病毒学(Virology)52456；Fraley等，1980，JBC 22510431；Capecchi，1980，细胞22479；Wiberg等，1983，NAR 117287；和Neumann等，1982，欧洲分子生物学组织杂志1；841-845。可以如美国专利号4,745,051中所述用杆状病毒载体适当转染昆虫细胞。
用于培养所述细胞的培养基可以是适合于使哺乳动物细胞生长的任意常用培养基，诸如含血清或不含血清而含有适当添加物的培养基或适合于使哺乳动物细胞生长的培养基。合适的培养基可获自商品供应商或可以按照公开的配方(参见美国典型培养物保藏中心的目录)制备。然后筛选这些细胞的抗生素抗性。随后，用诸如趋化试验等本领域中公知的试验和分析单核细胞的细胞因子释放的试验来分析所选克隆的HBP活性(例如，参见Rasmussen等，1996，FEBS通讯390109-112)。
由所述细胞产生的HBP然后可以通过常规方法从培养基中回收，其包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞；用硫酸铵等盐类沉淀上清液或滤液中的蛋白质成分；用各种层析方法如离子交换层析、亲和层析等进行纯化。
如果HBP是N-末端延伸型HBP，在从培养基中回收后，用适当蛋白酶裂解N-末端延伸型HBP有利于产生成熟(和有活性的)HBP。适当酶的实例包括但不限于肠激酶和因子Xa。
HBP拮抗剂HBP拮抗剂可以是抗HBP的多克隆或单克隆抗体。可以将下列方法用于获得抗HBP多克隆抗体。为了生产抗体，可以用HBP、优选人HBP注射使各种宿主动物被免疫，这些动物包括但不限于家兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。在一个实施方案中，HBP可以与牛血清清蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)等免疫原性载体偶联。根据宿主的不同种类，可以使用各种佐剂来增强免疫应答，所述佐剂包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐剂；矿物胶如氢氧化铝；表面活性物质，诸如溶血卵磷脂、多聚醇类(pluronicpolyol)、聚阴离子；肽类；油乳剂；匙孔血蓝蛋白；二硝基苯酚；和BCG(卡介苗)和小棒杆菌等强效人类佐剂。
下列方法可用于获得与HBP、特别是人HBP的至少一种表位结合的单克隆抗体，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽的释放。在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体是人单克隆抗体。
可以使用通过传代细胞系培养而生产抗体分子的任意技术。这些技术包括但不限于最初由Kohler和Milstein开发的杂交瘤技术(1975，自然256495-497)以及trioma技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，今日免疫学(Immunology Today)472)和生产人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等，1985，在单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and CancerTherapy)中所述，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。在本发明的另一个实施方案中，可以应用目前的技术在转基因动物中产生单克隆抗体(PCT/US90/02545；Green，1999，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)23111-23和美国专利号5,625,126和5,633,425)。根据本发明，可以使用人抗体且可以通过使用人杂交瘤(Cole等，1983，美国国家科学院学报802026-2030)或通过在体外用EBV转化人B细胞(Cole等，1985，在单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96中所述)获得人抗体。
根据本发明，产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)适于生产HBP特异性单链抗体。本发明的另一个实施方案应用构建Fab表达文库的技术(Huse等，1989，科学2461275-1281)快速而简便地鉴定具有所需HBP特异性的单克隆Fab片段。
可以通过公知技术生产含有抗体分子独特型的抗体片段。例如，这类片段包括但不限于可以通过用胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab’).sub.2片段；可以通过还原F(ab’).sub.2片段的二硫键而产生的Fab’片段；和可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段。
在抗体的生产中，对所需抗体的筛选可以通过本领域公知的技术来完成，如放射免疫分析；ELISA(酶联免疫吸附试验)；“夹心”免疫分析；放射免疫测量试验；凝胶扩散沉淀素反应；免疫扩散试验；原位免疫测定法(例如，使用胶体金、酶或放射性同位素标记)；蛋白质印迹；沉淀反应；凝集试验(例如，凝胶凝集试验、血凝试验)；补体固定试验；免疫荧光分析；蛋白A试验；和免疫电泳试验等。在一个实施方案中，通过检测第一抗体上的标记来检测抗体结合。在另一个实施方案中，通过检测第二抗体或试剂与第一抗体的结合来检测第一抗体。在进一步的实施方案中，对所述第二抗体进行标记。用于在免疫分析中检测结合的许多方式在本领域中是公知的且它们属于本发明的范围。
另一方面，可以使用噬菌体展示技术产生抗HBP抗体的文库(例如，参见Koscienlska等，1998，Acta Biochimica Polinica 45705-720)。可以对该文库进行筛选并可以将最强的结合者用作HBP拮抗剂。
HBP拮抗剂还可以是含有与HBP结合的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域的多肽。包括Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域的肽一般含有约60个残基并在二硫键中有6个特殊间隔的半胱氨酸。在一个具体实施方案中，如果HBP是人HBP，那么Kunitz型抑制剂可以是也称作BPTI的与HBP结合的抑酶肽或其类似物。在一个优选的实施方案中，所述抑酶肽类似物在12-19位和34-39位上带有突变，特别优选突变发生在15-19位上。
可以使用的其它类似物公开在下列参考文献中美国专利5,162,498、5,316,923、5,395,922、5,514,585、5,510,249、5,591,603、5,618,915、5,621,074、5,673,090、5,618,696和5,576,294。在一个最具体的实施方案中，所述突变是A16H、K15A、I18M、I19S、R17T。
可以使用各种方法获得包括Kunitz型结构域的多肽的较大文库(107-109)。例如，可以对各个使用易错聚合酶链反应(Saiki等，1988，科学93487-491)。当Taq聚合酶在扩增时引入错误的核苷酸时，在这种条件下运行的PCR反应将会在每种相应Kunitz型结构域中随机引入不正确的核苷酸。可以在噬菌体颗粒上展示该文库以便筛选与HBP的最佳结合者。
另一方面，可以通过应用简并寡核苷酸使特异性环发生突变(Schier等，1996，基因169147-153)。在PCR反应中将合成的随机寡核苷酸引入Kunitz型结构域，可生成在特定的环中带有变体的文库。
在另一方法中，可以通过DNA改组产生文库(Stemmer等，1994，自然370389-391)。可以将这种方法用于同源Kunitz型结构域之间的重组。简言之，将编码每种变体的DNA混合并切割成小片段。然后将这些片段在常规PCR反应中重新装配。在该反应过程中，这些小片段因为它们彼此互补而彼此连接，致使所包含的基因发生重组。
检测方法通过测定疑为HBP拮抗剂的物质是否与HBP结合可以检测肝素结合蛋白(HBP)拮抗剂，其通过(a)使与HBP发生相互作用的第一种物质和疑为HBP拮抗剂的第二种物质与HBP一起保温；和(b)检测疑为拮抗剂的所述第二种物质对HBP与所述第一种物质的相互作用的任何影响；其中HBP与第一种物质的相互作用减少表示第二种物质是HBP拮抗剂。
可以标记HBP或第一种物质。该标记优选自酶、着色或发荧光的物质、放射性同位素和复合试剂。
用作标记物质的酶的实例是过氧化物酶类(诸如辣根过氧化物酶)、磷酸酶类(诸如酸性或碱性磷酸酶)、B-半乳糖苷酶、尿素酶、葡糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、b-葡糖苷酶、蛋白酶类、丙酮酸脱羧酶、酯酶类、萤光素酶等。
酶自身不可检测，必须与底物结合以催化反应，其终产物是可检测到的。可以用于本发明方法中的底物的实例包括过氧化氢/四甲基联苯胺或氯萘酚或邻苯二胺(o-phehylenediamine)或3-(对羟苯基)丙酸或鲁米诺、羟基吲哚磷酸酯(indoxyl phosphate)、对硝基苯基磷酸酯、硝基苯基半乳糖、4-甲基伞形基(umbelliferyl)-D-吡喃半乳糖苷或萤光素。
另一方面，被标记的物质可以包括着色或发荧光的物质(包括金颗粒)、着色或发荧光的胶乳颗粒、染料颗粒、荧光素、藻红蛋白或藻蓝蛋白。
可以用于本目的的放射性同位素可以选自125I、131I、111In、3H、32p、14C和35S。可以用γ-计数器或闪烁计数器按照本领域中公知的方式测定这些同位素发出的放射活性。
可以用于本目的的复合试剂可以选自生物素(与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白形成复合体)、抗生物素蛋白(与生物素形成复合体)、蛋白A(与免疫球蛋白形成复合体)和凝集素(与碳水化合物受体形成复合体)。由于所述复合物并不可以直接被检测到，所以必须标记与复合试剂一起形成复合体的物质。标记可以使用上述用于(fro)标记酶的标记物质中的任意一种来进行。
在一个具体实施方案中，可以通过使用例如Amersham PharmaciaBiotech的SPA技术来检测HBP拮抗剂与HBP的结合。简单地说，来自脐静脉内皮细胞(HUVEC)的生物素化胞质膜与链霉抗生物素蛋白偶联的PVTSPA珠结合。这些珠可以获自Amersham Pharmacia Biotech。将标记的人激肽原(例如3H、125I)加入到所述膜上，直到激肽原的结合位点饱和为止。以不断增加的浓度加入HBP以便置换标记的激肽原并测定所掺入的标记的减少。绘制标准置换曲线。测试HBP拮抗剂抑制HBP介导的置换胞质膜上放射性激肽原的能力。特别地，用高达过量摩尔的各种浓度的HBP拮抗剂与HBP一起保温并测定HBP抑制HBP介导的从所述膜中置换标记型激肽原的能力。
另一方面，可以通过在有HBP存在和有和没有疑为拮抗剂的物质存在的情况下培养内皮细胞来检测HBP拮抗剂。在一个具体实施方案中，所述拮抗剂是一种与HBP、优选人HBP的至少一种表位结合的单克隆抗体，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽的释放，在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体是一种人单克隆抗体。在一个实施方案中，在37℃下先将所述抗体和HBP预保温约10分钟，再与内皮细胞一起保温。通过如下文实施例中所述测定跨内皮电阻或测定清蛋白清除量来测定所述物质对内皮细胞通透性的影响。通透性降低表明所述物质确实起HBP拮抗剂的作用。
在一个具体实施方案中，可以通过将抗体与HBP和前激肽释放酶-H-激肽原复合物一起保温来检测与HBP的至少一种表位结合的单克隆抗体，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽的释放。正如在实施例章节进一步详述的，HBP与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合，由此刺激缓激肽的释放。与HBP的至少一种表位结合的单克隆抗体会减少或阻止缓激肽释放。使用例如免疫分析等本领域中公知的方法可以检测缓激肽的释放。
在一个实施方案中，包被缓冲液含有0.05％吐温、15.9mM碳酸钠、35mM碳酸氢钠，pH 9.6。加入H-激肽原并在4℃下保温过夜。除去包被缓冲液并用含有约50M锌的Tris缓冲液(pH 7.4)洗涤平板。然后加入前激肽释放酶并在室温下将该混合物保温1小时。随后加入HBP的Tris缓冲液溶液，约5分钟后，开始每间隔约10分钟取样、持续约1小时，并分析缓激肽的释放。在一个实施方案中，可以使用市售ELISA试验(MARKIT-M Bradykin，Dainippon Pharmaceutical Co.Ltd.)检测缓激肽的释放。在这类试验中，使样品中的缓激肽和过氧化物酶标记的缓激肽与由微条孔上包被的抗家兔IgG抗体(山羊)俘获的抗BK抗体(家兔)发生竞争性反应。根据与抗缓激肽抗体结合的过氧化物酶标记型缓激肽的酶活性来确定缓激肽的浓度。
另一方面，可以将前激肽释放酶和H-激肽原按等摩尔量加入到单层内皮细胞中并在37℃下保温1小时。随后加入HBP，约5分钟后开始每间隔约10分钟取样、持续约1小时，且从加入HBP后的并使用上述方法检测缓激肽的释放。
在另一个实施方案中，可以将前激肽释放酶和H-激肽原按等摩尔量加入到含有ACE(血管紧张素转化酶)抑制剂的血浆溶液中并在37℃下保温1小时。随后加入HBP，约5分钟后，开始每间隔约10分钟取样、持续约1小时并使用上述方法检测缓激肽的释放。
治疗方法本发明的组合物包括水溶液的一部分。该溶液优选是生理上可接受的，使得除将所需的构建体输送给患者外，该溶液也不会对患者的电解质和容量平衡产生不利影响。用于该组合物的含水介质由此可以包括、例如pH7-7.4的生理盐水(0.9％NaCl，0.15M)或它的其它可药用盐。有效溶液可以通过制药领域熟在的任何方法制备，例如《Remington氏药物科学》(Remington，sPharmaceutical Science)(Gennaro，A.编辑)，Mack Pub.，1990中所述。
HBP拮抗剂的浓度范围很宽，即从低于约0.5％(诸如从1％开始)到高至15-20％(重量比)。所述组合物的单位剂量一般可以含有约10mg-约1g的HBP拮抗剂。可以通过体外或体内方法测定治疗有效剂量。
可通过局部、皮下或通过静脉注射来给予HBP拮抗剂。临床医师会根据具体病情和所治疗的具体个体开据处方剂量。根据由临床主管医师确定的参数来谨慎采用和调整剂量以及给药频率。优选的给药途径例如可以是经腹膜内注射。腹膜内静脉注射HBP拮抗剂可以每24小时进行一次，剂量范围在0.1-100mg/kg体重、尤其是0.5-50mg/kg体重、特别是1-25mg/kg体重。可以每24小时给予1-4次剂量或通过导管连续给药。另一方面，可以通过在外科手术过程中连续静脉输注来给予治疗，然后在手术后继续治疗1-4天。
仅将HBP拮抗剂给予那些产生与HBP拮抗剂结合的HBP的患者。为了确定患者是否产生了这类HBP，使用上述方法从患者血液的血小板中分离患者的HBP。可以使用上述方法来检测HBP与HBP拮抗剂(例如一种单克隆抗体)的结合或HBP对内皮细胞通透性的影响，并将它们与天然HBP的影响进行比较。另一方面，还可以使用WO93/05396中所述方法测定在有或没有HBP拮抗剂存在的情况下，HBP对内皮细胞或成纤维细胞收缩或单核细胞凝集的影响。细胞收缩或凝集程度下降表明存在HBP与HBP拮抗剂的相互作用。可以用于测定患者是否产生这类HBP的检测试剂盒包括(a)HBP拮抗剂；(b)HBP或产生HBP的细胞；和(c)与HBP发生相互作用的物质、组织、细胞或其成分。
在一个具体实施方案中，HBP或产生HBP的细胞或组织分离自患者。使HBP或产生所述HBP的细胞或组织与内皮细胞一起保温，在有或没有与HBP的至少一种表位结合的单克隆抗体存在的情况下测定对通透性的影响，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽的释放。将这种影响与天然人HBP的影响进行比较。在一个具体实施方案中，天然人HBP可以是与这类单克隆抗体结合的重组HBP。另一方面，在有前激肽释放酶-H-激肽原复合物存在和有单克隆抗体存在的情况下培养HBP或产生HBP的细胞或组织。测定单克隆抗体对缓激肽释放的影响。在有抗体存在的情况下缓激肽释放减少表示患者产生了与所述抗体结合的HBP。在这类情况中，检测试剂盒包括(a)与HBP上的至少一种表位结合的单克隆抗体，其中所述表位与前激肽释放酶-H-激肽原复合物结合并激活缓激肽的释放；(b)天然人HBP；和(c)与固体支持物结合的前激肽释放酶-H-激肽原复合物。
实施例实施例1活化的中性粒细胞通过经β2整联蛋白的信号传输引发内皮屏障功能的改变材料和方法试剂培养基-199、RPMI-1640(含有L-谷氨酰胺)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶-EDTA、磷酸缓冲盐水(PBS)和Hanks平衡盐溶液(HBSS)均来自LifeTechnologies(Gaithersburg，MD，USA)。明胶、胶原酶、青霉素、链霉素、过氧化氢酶、牛血清清蛋白(BSA)、N-甲酰基-甲硫氨基-亮氨酰基-苯丙氨酸(fMLP)、Evans蓝染料、十六烷基三甲基溴化铵和四甲基联苯胺获自SigmaChemical Co.(St.Louis.MO，USA)。H2O2获自E.Meck(Darmstadt，Germany)。生物基质I获自Biomedical Technologies Inc.(Stoughton，MA，USA)，而葡聚糖70(Macrodex)和Ficoll-Paque来自Pharmacia Biotech AB(Uppsala，Sweden)。基础培养基由M-199和的1∶1混合物组成，其中补充了20％的加热失活的FBS、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。针对β2-整联蛋白共有β-链(CD18)的单克隆抗体IB4由Rockefeller大学的Samuel D.Wright博士赠送给Pharmacia&Upjohn(Uppsala，Sweden)的Claes Lundberg博士提供，识别整联蛋白αm链(CD11b)的mAb 60.1由Karolinska Institutet的ManuelPatarroyo博士提供，mAb DREG 200(抗-L-选择蛋白)是Stanford大学EugeneButcher所赠，mAb SK11(抗-L-选择蛋白)来自Becton Dickson(San José，CA)，mAb G44-26(抗-CD44)获自PharMingen(San Diego，CA)。山羊抗小鼠IgG的F(ab’)2获自Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.(West Grove，PA)，家兔抗小鼠IgG的FITC-偶联型F(ab’)2片段来自Dako/A/S(Glostrup，丹麦)。
内皮细胞分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和牛主动脉内皮细胞(BAEC)并如文献所述进行培养(Gautam等，1998，英国药物学杂志(Brit.J.Pharm.)1251109-1114)。通过短暂(2分钟)的胰蛋白酶-EDTA处理(0.25％胰蛋白酶/0.01％EDTA)使第一至第五代HUVEC或BAEC脱附并将其重新铺在0.2μm孔径大小的Anopore无机膜或3.0μm孔径大小的聚碳酸酯膜(Tissue Cultureinserts，10mm；NUNC，Roskilde，丹麦)上。为了促进细胞分化并促进内皮细胞(EC)的粘附，将膜用50μl生物基质I(167μg/ml)预处理并风干。以2×105个细胞/膜的密度接种EC并在37℃和含5％CO2的潮湿空气下于培养基中培养。每日显微镜观察，EC生长至铺满单层，测量通过单层的电阻(Gautam等，1998，英国药物学杂志1251109-1114)。
EC屏障功能的测定用两种不同方法评估刺激诱导的EC通透性的改变。为了测定跨内皮电阻(TEER)，将插入有EC的膜转入电阻测定室(具体内容参见Gautam等，1998，英国药物学杂志1251109-1114)。将分别充入2ml和400μl培养基的测定室(下部/内腔(luminal)隔室)及膜插入物(上部/内腔隔室)置于细胞培养箱内。在37℃下用准确置于每一隔室内彼此相关联并与单层细胞相关联的位置的电极测定穿过EC单层的电阻。通过扣除在接种内皮细胞前测定的包被了生物基质的相应裸膜的电阻可获得各EC单层的电阻。
在独立的实验中，将Evans蓝染料偶联的清蛋白(EBA)用作EC单层的大分子通透性的标记。在刺激EC前，将上部隔室内的培养基换成含有EBA的培养基(培养基含有混合了终浓度为0.67mg/ml的Evans蓝染料的4％BSA)。按照分光光度法测定620nm处光吸收值来确定上部和下部隔室的液体样品中的EBA浓度(Titertek Multiskan MCC；Flow Laboratories，Solna，Sweden)。按照下列关系式计算清蛋白的清除V1＝A2×V2×1/A1，其中V1是清除体积(即内腔培养基因清蛋白扩散至内腔以外(abluminal)隔室中而清除了清蛋白之后的理论体积)，V2是内腔以外体积，而A1和A2分别是内腔培养基及内腔以外培养基的吸收值。从应答各自特异性刺激而获得的清除体积中扣除无任何刺激时的基线清除体积(平均0.08±0.03μl/分钟)。
PMN的制备和定量人PMN如所述(Gautam等，1998，英国药物学杂志1251109-1114)分离自富含白细胞的血浆，以2-5×107个细胞/ml的浓度将其重新悬浮于培养基中。PMN的纯度＞98％，通过台盼蓝染色排除法测定的其存活率＞95％。PMN在加入到EC单层前，与抗细胞表面分子的单克隆抗体一起保温30分钟，所述单抗随后与第二mAb交联(参见实验方法)。
在某些实验中，通过PMN在应用前的温度转变可上调CD11b/CD18的细胞表面表达。在4℃和有抗CD18 mAb IB4存在的情况下将PMN保温10分钟、转至37℃下10分钟，然后回到4℃下再10分钟，随后洗涤两次。按照相同方案但使用载体而非抗体制备不经抗体处理的PMN。
PMN对EC的粘附和跨内皮细胞的迁移通过检测PMN特异性酶髓过氧化物酶(MPO)来进行定量。简言之，使PMN在0.5％十六烷基三甲基溴化铵中裂解并离心，用分光光度法将上清液中的酶活性测定为MPO催化的H2O2-四甲基联苯胺氧化还原反应中发生的650nm处吸收值的改变(Suzuki等，1983，生物化学年鉴(Anal.Biochem.)132345-352)。粘附和迁移的PMN的MPO活性分别与加入到EC单层中的PMN总数的MPO活性相关。
实验步骤在将膜插入物转入电阻测定室(保持在37℃下)前，用补充了10mMHepes的新鲜培养基(37℃)取代插入物和室内的培养基。在某些实验中，将EC单层在刺激前与10μg/ml除莠霉素A于37℃一起保温15分钟并洗涤两次。将含有或不含与细胞表面分子结合的单克隆抗体的PMN(2×106)加入到上部隔室内(PMN∶EC之比＝10∶1)并使之在EC单层上沉淀10分钟。用加入到下部隔室的fMLP(10-7M)或通过第二抗体，即山羊抗小鼠IgG F(ab’)2片段与细胞表面分子的抗体交联来诱导PMN的活化。在刺激开始前和刺激开始后的每分钟测定跨内皮电阻，直到达到电阻变化的平台期，然后每间隔5分钟测定一次。在研究跨过EC单层的清蛋白通透性和PMN迁移的实验中，插入物中的培养基含有EBA。攻击后，每隔5-10分钟将膜插入物转入含有新鲜培养基的新孔中。所有保温均在37℃下进行。在实验结束时，在4℃下以425g将下部的孔离心20分钟并分析上清液中的EBA含量。通过分析孔中剩余沉淀的MPO活性来对已经迁移过单层的PMN进行定量。抽吸膜插入物中的培养基以便对未粘附的PMN进行定量，从插入物中取出含有EC的膜以便对粘附的PMN级分进行定量。
在独立的实验中，在37℃下，将用抗CD18 mAb IB4(6μg/2×106个细胞)预处理30分钟的纯化型PMN用含或不含山羊抗小鼠F(ab’)2的培养基培养10分钟。通过在室温下以300×g离心15分钟使PMN沉淀，滗析含有PMN分泌产物的不含细胞的上清液以便用于体内实验(参见下文)或与EC单层一起使用。在后一种设定中，将膜/EC插入物中的培养基换成含有PMN分泌物的培养基，如上所述记录对TEER和清蛋白通透性的影响。在某些情况中，含有PMN分泌物的培养基在应用前进行加热培养(80℃、15分钟)。
EC胞内[Ca2+]和f-肌动蛋白形成的测定用Ca2+敏感性荧光探针fluo-3/AM(Molecular Probes Europe BV，Leiden，荷兰)测定EC胞内游离Ca2+的改变。在37℃下用加入到顶部和基底外侧部表面的fluo-3/AM(含有2％FCS和10mM HEPES的HBSS溶液3μM)将膜上铺满的BAEC单层培养30分钟。将所述单层洗涤3次并用新鲜HBSS室温避光培养20分钟以使染料酯完全水解。将抗CD18或抗-L-选择蛋白处理的PMN加入到EC中，如上所述用第二抗体mAb诱导受体交联。在独立的实验中，用含有PMN分泌物的培养基(见上文)在无PMN时刺激EC。用激光扫描共焦成象系统(Insight Plus；Meridian Instruments Inc.，Okemon，Michigan)连续记录荧光强度，从而测定应答这些刺激时EC[Ca2+]的改变。
为了分析EC中应答PMN活化所致的f-肌动蛋白形成，将在生物基质包被的盖玻片上长满的EC单层与进行了CD18抗体交联的PMN或与等同于上述方法的含PMN分泌物的培养基于37℃培养15分钟。用IB4-处理的PMN所培养的EC作对照。在室温下将所述单层在3.7％甲醛的PBS溶液中固定10分钟、洗涤两次，用0.2％Triton x-100的PBS溶液渗透(4℃下1分钟)。将细胞洗涤两次，37℃下用FITC-偶联型鬼笔环肽对肌动蛋白纤丝染色20分钟。再进行3次洗涤后，用激光扫描共焦成象系统(Insight Plus；Meridian Instruments Inc.，Okemon，Michigan)观测内皮细胞。
体内实验为了研究PMN分泌产物对体内微血管通透性的作用，对仓鼠颊囊微循环进行活体显微镜检。如文献详述(Raud&Lindbom，1994，微循环免疫学(Immunology of the Microcirculation)，Academic Press，1994，第7章)，使已麻醉的叙利亚(Syrian)金黄仓鼠的左颊囊外翻，以备在用保持生理温度、pH和气压的碳酸氢盐缓冲液连续过量灌注的情况下进行显微镜观察。静脉注射(250mg/kg体重)FITC-偶联型葡聚糖(分子量150000)作为血浆示踪物以观察对大分子的血管通透性改变。使用Leitz Orthoplan显微镜在低放大倍数的荧光下观察暴露的颊囊中的微脉管系统并将其记录在图像(Video)中。通过监控记录，停止过量灌注并将37℃下含有CD18交联诱发的PMN分泌的1ml培养基局部施用在所述颊囊上。在平行实验中，使用不进行交联但抗CD18处理的PMN培养基。
结果将用抗CD18 mAb(IB4)预处理的PMN(2×106)加入到EC/膜插入物(EC的内腔侧/电阻室上部隔室)中，静置10分钟。与第二抗体山羊抗小鼠F(ab)2交联的CD18引发TEER的显著降低，其在1分钟内显现，在15分钟后到其最大值(对照值为36±13)且在整个观察期内保持这一水平(图1)。单独用IB4处理PMN或在没有IB4存在的情况下用第二抗体mAb处理PMN均没有使TEER发生任何改变。
在另外的实验中研究在导致跨EC单层之大分子通量和PMN迁移的增加中CD18交联的量。将用饱和浓度的IB4预处理的PMN加入到EC/膜插入物中并使之在含有EBA的培养基中静置10分钟。以类似方式用山羊抗小鼠F(ab)2诱导CD18交联，按有规律的间隔将含有PMN/EBA的膜插入物转移至含有新鲜培养基的新孔中。在没有第二抗体存在的情况下，存在微小而连续的清蛋白清除，0.08±0.03μl.分钟-1(平均值±SD，n＝13)，它不会随时间发生改变且实际上与在含有未处理的PMN的膜插入物中发现的自发性清除率相当。相反，CD18交联所激发的PMN活化引起清蛋白清除率增加，它随时间逐步增加(图1)。清蛋白清除量的净增从第一个5分钟期间的0.5±0.1μl提高至60分钟后的20.0±4.5μl(平均值±SD，n＝10)的总量。不同于增加的清蛋白清除量，CD18交联没有产生可测定的PMN对EC的粘附或跨内皮细胞的迁移(图1)。对CD18交联后60分钟时不同隔室内的MPO活性的分析显示，所加入的PMN 91±6％(平均值±SD，n＝9)回收在上部隔室内的培养基中，而在EC膜单元或下部隔室内的培养基中没有检测到显著的MPO活性。对本实验结束时洗涤的透明(transparent)膜的直接镜检证实不存在与EC单层粘附的PMN。
用Ca2+敏感性荧光团fiuo-3标记单层内皮细胞并通过共聚焦激光扫描显微镜检监测受刺激诱发的EC[Ca2+]改变。向EC单层中加入抗CD18处理的PMN没有导致EC[Ca2+]发生改变。然而，CD18与第二抗体mAb的交联引起EC中胞质游离[Ca2+]快速增加，这种增加在约100秒后到达最高点且然后缓慢下降。抗体以相同方式与L-选择蛋白交联不能诱导EC[Ca2+]发生任何改变，而用fMLP刺激未处理的PMN后观察到与由CD18交联诱导的类似的Ca2+-应答(参见，Gautam等，1998，英国药物学杂志1251109-1114)。胞内Ca2+-活性改变与EC对PMN活化的功能性应答之间的因果关系通过用钙螯合剂BAPTA AM预处理内皮细胞的实验来证实。这种处理完全抑制了EC细胞内游离Ca2+的升高和应答CD18交联所导致的TEER改变。
在进一步的实验中，EC单层与PMN一起培养且然后用FITC-偶联的鬼笔环肽对肌动蛋白纤丝染色。共聚焦激光扫描显微镜检显示在没有第二抗体存在的情况下用IB4-处理的PMN所培养的内皮细胞显示极少的应力纤维和沿该细胞与相邻细胞直接接触之边缘的肌动蛋白薄带。另一方面，用进行了CD18交联的PMN培养的内皮细胞显示出f-肌动蛋白含量以及应力纤维的数量和密度的显著增加。
为了研究由PMN分泌的因子是否可以控制最终导致EC通透性增加的那些应答，用山羊抗小鼠F(ab’)2将用抗CD18 mAb IB4预处理并经洗涤已除去未结合抗体的PMN(2×106)保温30分钟且然后通过温和离心使之沉降。向EC单层中添加不含细胞的上清液引起TEER下降和清蛋白清除的增加，两者具有等同于加至EC的PMN中发生CD18交联后的变化幅度和耗时。此外，所述上清液使EC[Ca2+]和f-肌动蛋白含量与分布发生改变。此外，对仓鼠颊囊的体内制备物局部给予含有PMN分泌物的上清液引起血浆从后毛细血管和小静脉中迅速渗漏。在施用后1.5分钟内即可观察到渗漏点且在约5分钟后显示出最大的反应。在用缓冲液洗涤组织后，渗漏缓慢减少。
这种对微血管通透性的作用在加热处理PMN-衍生的分泌物后消失，表明是一种热敏感因子负责其通透性增加活性。对颊囊施用不进行交联但经IB4-处理的PMN不会产生任何可观察到的血浆渗漏。
讨论多形核白细胞在急性炎症中粘附至内皮细胞的内表面并回到血管外组织中关键依赖于β2整联蛋白的功能。大分子的血管通透性的增加伴随此细胞应答而被诱导，导致血浆渗出和水肿形成。上述实验结果已经为活化型PMN内经由β2整联蛋白的跨膜(外-内)信号传输与这些细胞诱导EC屏障功能障碍的能力之间的因果关系提供了证据。已证实抗体诱导的β2整联蛋白的连接与聚集引起与在化学引诱物刺激PMN后观察到的相似的EC通透性增加。这种细胞通讯在没有PMN与EC的物理性结合的情况下发生，从而表明PMN粘附和结构连接本身不会将信号直接转入EC，由此介导通透性应答。而是，β2整联蛋白的配体结合通过胞内信号级联启动PMN的分泌和化学信使的释放，这一过程能够使EC通透性发生PMN-依赖性改变。此外，已证实通过该途径诱导的血管通透性改变是EC的涉及细胞骨架重排和可逆性胞间隙形成的活性酪氨酸激酶依赖性应答的结果，表明PMN-衍生因子在这一方面的非裂解性功能。
为了更具体地研究该过程中活化PMN可以将信号转入EC的机理，通过CD11/CD18的抗体交联来模拟PMN/EC相互作用和β2整联蛋白的粘附依赖性接合(engagement)。通过β2整联蛋白的抗体交联、避免化学引诱物诱导的细胞活化，已经证实β2整联蛋白受体本身通过胞内信号传输而接合和聚集可引起EC通透性增加。由于这种应答在不考虑PMN与EC粘附的情况下发生，所以PMN与EC之间的信号转移并非归因于CD11/CD18与EC表面上对应受体之间的相互作用，而是必须通过释放PMN-衍生的信使分子来完成。在PMN悬浮液中发生CD18交联后获得的不含细胞的上清液诱导EC超通透性的能力可进一步支持所述理论。
实施例2将中性粒细胞衍生的HBP(HBP)鉴定为中性粒细胞诱导的血管血浆渗漏中的信号连接物在实施例1中，经由β-2整联蛋白的PMN粘附是PMN诱导的对内皮细胞通透性之影响的先决条件且Ca2+依赖性跨膜信号通过这种粘附激活β-2整联蛋白诱导的可溶性因子的分泌，其直接引发EC屏障功能的改变。
正如本文实施例2中所述，将该可溶性因子确定为人HBP。实施例2还描述了HBP与接触相系统的相互作用的特征。
材料和方法试剂培养基-199、RPMI-1640(含有L-谷氨酰胺)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶-EDTA、磷酸缓冲盐水(PBS)和Hanks平衡盐溶液来自LifeTechnologies(Gaithersburg，MD，USA)。明胶、胶原酶、青霉素、链霉素、牛血清清蛋白(BSA)、Evans蓝染料和FITC-偶联型鬼笔环肽获自SigmaChemical Co.(St.Louis.MO，USA)。Fluo-3/AM获自Molecular Probes(Eugene，OR，USA)。生物基质I来自Biomedical Technologies Inc.(Stoughton，MA，USA)。葡聚糖70(Macrodex)和Ficoll-Paque来自Pharmacia BiotechAB(Uppsala，Sweden)。基础培养基由M-199和RPMI-1640的1∶1混合物组成，其中RPMI-1640补充了20％的加热失活的FBS、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。针对β2-整联蛋白中共有β-链(CD18)的单克隆抗体IB4由Rockefeller大学的Samuel D.Claes博士赠送给的Pharmacia&Upjohn(Uppsala，Sweden)的Claes Lundberg博士提供。山羊抗小鼠IgG的F(ab’)2获自Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.(West Grove，PA)。
按照下列步骤制备多克隆HBP抗体。给新西兰自家兔皮下注射50μg用弗氏完全佐剂(FCA)乳化的人肝素结合蛋白(HBP)，随后加强注射3次50μg用弗氏不完全佐剂(FIA)乳化的人HBP、每隔两周一次。在最后一次注射后10天，对动物取血并分离血清。
按照下列步骤制备单克隆HBP抗体。通过皮下注射20μg纯化的人HBP的FCA溶液、随后注射两次20μg的人HBP的FIA溶液使RBF小鼠来免疫。给高反应者小鼠通过静脉内加强注射20μg的HBP并在3天后采集脾。使脾细胞与骨髓瘤细胞Fox细胞系融合。在HBP特异性ELISA中筛选产生抗HBP抗体的上清液。通过标准FACS方法筛选与巨噬细胞胞内部分结合的阳性细胞系。克隆阳性细胞系并在上述两种试验中再次测试。通过蛋白A亲和层析来纯化单克隆抗体。
内皮细胞如Jaffe等在1973临床研究杂志522745-2756中所述从新鲜脐带中分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，用Booyse等在1975，血栓素质性出血(Thromb.Diath.Haemmorrh.)24825-839中所述方法略加改良来分离牛主动脉内皮细胞(BAEC)。简单地说，用0.25％胶原酶溶液将脐静脉或牛主动脉的内腔培养10分钟，用PBS洗去未脱壁的内皮细胞。使采集的细胞沉淀并重新悬浮于培养基中、接种在组织培养瓶内并在标准条件下培养。每隔48小时换一次培养基，直到培养物长满为止(3-5天)。将第一至第五代中的HUVEC或BAEC用于本实验。EC的鉴定和纯度测定基于圆石形态和因子VIII/vWf抗原的鉴定(Booyse等，1975，血栓素质性出血24825-839)。细胞中的因子VIII/vWf染色均匀。
在通透膜上的接种通过短暂(2分钟)的胰蛋白酶-EDTA处理(0.25％胰蛋白酶/0.01％EDTA)使培养的EC脱壁，将其重新铺在0.2μm孔径的Anopore无机膜或3.0μm孔径的聚碳酸酯膜(Tissue Calture inserts，10mm；NUNC，Roskilde，丹麦)上。
为了促进细胞分化并促进EC的粘附，将膜用50μl生物基质I(167μg/ml)处理并使之风干。以2×105个细胞/膜的密度接种EC并在37℃和含5％CO2的潮湿空气中于培养基中培养。EC长成铺满的单层细胞，如每日显微镜观察并测定跨单层的电阻所估计的。
跨内皮电阻(TEER)的测定为了测定跨EC单层的电阻，将膜插入物转入电阻测定室(ENDOHM-12；World Precision Instruments，Sarasota，FL，USA)，该电阻测定室已被改变以便确保在重复测量期间将电极准确置于彼此相关并与膜插入物相关的位置。该室(下部隔室)和膜插入物(上部隔室)分别充有2ml和400μl培养基。在37℃下使用置于细胞培养箱中的仪器进行全部测定。使用与电阻室中电极连接的欧姆计(EVOM；World Precision Instruments，Sarasota，FL，USA)直接读取电阻。通过扣除在接种内皮细胞前测定的包被了生物基质的相应裸膜的电阻可获得各EC单层的电阻。
清蛋白清除的测定将Evans蓝染料偶联型清蛋白(EBA)用作EC单层的大分子通透性标记。将终浓度为0.67mg/ml的该染料与含有4％BSA的培养基混合。在分析清蛋白通透性的实验中，将上部隔室内的培养基换成含有EBA的培养基。通过按照分光光度法测定620nm处的吸收值来确定上部和下部隔室的液体样品中的EBA浓度(Titertek Multiskan MCC；Flow Laboratories，Solna，Sweden)。
按照下列关系式计算清蛋白的清除V1＝A2×V2×1/A1，其中V1是清除体积(即上部培养基因白蛋白扩散至基底外侧隔室而具有的理论体积)，V2是基底外侧体积，而A1和A2分别是上部和基底外侧培养基的吸收值。从应答各自特异性刺激而获得的清除体积中扣除在没有任何刺激的情况下的基线清除体积0.08±0.01μl/分钟。
PMN的分离与活化使通过葡聚糖沉淀从人全血中获得的白细胞丰富的血浆小心置于Ficoll-Paque上层并以400g离心30分钟。将含有PMN的沉淀重新悬浮并用冰冷的PBS洗涤两次(400g，7分钟)。以2-5×106个细胞/ml的终浓度将PMN重新悬浮于培养基中。PMN的纯度＞98％且通过台盼蓝排除法测定的存活率＞95％。
如上所述诱导中性粒细胞表面上CD18分子的抗体交联。简言之，用10μg/ml的抗CD18 mAb IB4的HBSS溶液将纯化的PMN(5×106/ml)培养30分钟。在培养期间，使温度从4℃转变到37℃以便增加CD11/CD18的表面表达。将所述细胞洗涤两次，通过添加山羊抗小鼠IgG的F(ab’)2片段(按1∶20稀释)完成CD18的交联。通过在室温下以300g离心15分钟使PMN沉淀，收集不含细胞的上清液。在独立的实验中，在将用mAb IB4预培养的PMN加入到EC单层中后诱导CD18的抗体交联(参见下文)。
实验步骤在将膜插入物转入电阻测定室(保持在37℃下)前，用补充了10mMHepes的新鲜培养基(37℃)取代插入物和所述室内的培养基。将HBP(25-100μg/ml)或PMN分泌产物加入到上部或下部隔室，每分钟测定一次跨内皮电阻，直到达到平台期，然后每隔5分钟测定一次。在独立的实验中，将用mAb IB4(10μg/ml)预培养的PMN(2×106)加入到上部隔室中(PMN∶EC之比＝10∶1)并使之沉淀10分钟。通过经加入按1∶20稀释的山羊抗小鼠IgGF(ab’)2使白细胞CD18进行抗体交联从而诱导PMN的活化。在研究跨EC单层的清蛋白通透性的实验中，插入物中的培养基含有EBA。在本实验过程中，每隔5-10分钟将膜插入物转入含有新鲜培养基的新孔中。所有的培养均在37℃下进行。在本实验后，抽吸下部孔中的培养基并分析EBA含量。
EC胞内Ca2+和F-肌动蛋白分布的测定用Ca2+敏感性荧光探针fluo-3/AM测定EC细胞内游离Ca2+的改变。在37℃下，用加入到上部和基底外侧表面的fluo-3/AM溶液(含有2％FCS和10μM HEPES的3μM HBSS溶液)将在生物基质I包被的膜上长满的HUVEC或BAEC单层培养30分钟。将该单层洗涤3次，在使染料酯完全水解成其钙敏感性游离酸形式前，将其用新鲜的HBSS室温避光培养20分钟。用加入到上部表面的HBP刺激EC。通过使用激光扫描共焦成象系统(Insight Plus；Meridian Instruments Inc.，Okemon，Michigan)连续记录荧光强度来测定应答HBP刺激所致的EC[Ca2+]改变。
为了分析应答PMN所致的EC中f-肌动蛋白的分布，在37℃下用HBP或只用载体将在生物基质包被的盖玻片上长满的EC单层培养15分钟。将所述单层用培养基洗涤两次并在室温下于3.7％甲醛的PBS溶液中固定。EC用0.2％Triton x-100的PBS溶液渗透(4℃下1分钟)、洗涤两次并在37℃下用FITC-偶联型鬼笔环肽对肌动蛋白纤丝染色20分钟。将内皮细胞再用PBS洗涤3次并用激光扫描共焦成象系统观测。
蛋白质印迹分析将纯化的HBP或PMN分泌物的样品加入到SDS样品缓冲液中并煮沸5分钟。将所述样品加入到SDS聚丙烯酰胺梯度凝胶(3-10％)上进行电泳。将蛋白质电泳式转到硝酸纤维素膜上(Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA)以便进行免疫印迹分析。通过在牛奶中将硝酸纤维素膜保温2小时来封闭其它结合位点。使用蛋白质印迹分析来检测HBP。
结果活化的PMN释放HBP通过CD18的抗体交联来活化混悬液中的PMN。将PMN离心，收集上清液，进行SDS-PAGE。使用直接针对HBP的抗体进行蛋白质印迹分析可在PMN分泌物中鉴别出27kD的一条明显带。使用家兔IgG对照没有发现特异性带。
HBP增加EC单层的通透性向上部隔室加入HBP(75μl/ml)引起跨内皮电阻显著降低，其在1分钟内显现，在15分钟后达到其最大值(对照的30％±3％)，且在整个观察期间均保持不变(图2)。用HBP攻击还导致EC大分子通透性的增加，其表现为清蛋白清除的进行性增强，在60分钟内产生20.4±3.4μl的净清除体积(图2)。EC对HBP刺激的应答显然是剂量依赖性的，正如通过用25和50μg/ml HBP使稳态TEER不明显降低所例示(图2)。然而，所述应答中发生改变的速率就所有HBP剂量而言是相同的。
用来自单层细胞基底外侧的HBP刺激EC(将HBP加入到下部隔室中)引起与上部刺激类似的EC通透性改变，不过，这种情况是在稍高的浓度下发生。
HBP的中和作用减弱PMN诱导的EC通透性的增加用抗HBP的家兔抗血清纯化型IgG中和所述蛋白质的活性。在用HBP(75μl/ml)刺激前，向EC单层中添加HBP抗体(50μl/ml)明显减弱了TEER中被诱发的改变和对大分子的通透性。TEER改变的发生有一定的潜伏期，可达到对照的75％±5％(图3)，显著抑制HBP所诱导系的应答至约65％。类似地，清蛋白的流出量被抑制了约60％，在60分钟内净清除体积达到8.64±1.74μl(图3)。用非特异性家兔IgG(50μl/ml)处理对HBP诱导的TEER降低没有影响，在15分钟后达到对照的31％±5％。
测定HBP抗体是否也能抑制由活化PMN引发的EC屏障功能的改变。
通过白细胞CD18的抗体交联来活化悬浮液中的PMN并将它们离心。将含有PMN分泌产物的上清液(参见材料和方法章节)转至EC单层。在有抗HBP抗体时，TEER的降低和大分子通透性的增加与无抗HBP时对PMW分泌物刺激的应答相比明显受到抑制(图4)。当将PMN加至EC单层并因此使PMN分泌产物直接接触EC单层后诱导CD18的抗体交联时，获得了几乎相同的作用。
HBP的刺激可增加EC细胞内游离Ca2+用激光扫描共焦显微镜术测定是否EC通过胞质Ca2+增加来应答HBP刺激。向载有Ca2+敏感性荧光团fluo-3/AM的长满的HUVEC或BAEC单层中添加HBP(75μl/ml)可诱发荧光强度的快速增加，其在1分钟内达到最大值，然后逐步下降到基线水平。这种胞内Ca2+转移清楚地表明了EC对HBP刺激的活性应答。
HBP的刺激可诱导对EC微丝的识别用FITC-偶联型鬼笔环肽对用HBP(75μl/ml)或仅用培养基培养15分钟的已长满的EC单层染色肌动蛋白微丝，用激光扫描共焦显微镜观测。与显示出低密度F-肌动蛋白应力纤维和沿细胞边缘显著密集的外周带的未处理之EC相比，在F-肌动蛋白含量和HBP刺激型EC的分布方面存在明显改变。跨越细胞的F-肌动蛋白应力纤维的密度增加和外周带破裂表明HBP刺激导致EC细胞骨架的重排。
HBP可增加体内血管通透性给仓鼠颊囊微脉管局部施用HBP(75μl/ml)，可在2分钟内产生后毛细血管和较大的小静脉中荧光示踪物的可视渗漏斑点。在攻击后的7-10分钟时观察到了最大渗漏反应。然后渗漏缓慢下降并在30分钟内完全消失。
用针对缓激肽的单克隆抗体MBK3抑制缓激肽诱导型和HRP诱导型EC通透性增加在0时对已用抗缓激肽单抗MBK3(40μg/ml)预培养的EC单层细胞内腔侧给予缓激肽(100nM；图5a)或HBP(75μg/ml；图5b)(Haasemann等，1991，免疫学杂志1473882-3982)。MBK3完全阻止了由缓激肽或HBP诱导的EC通透性增加。通过对组胺诱导型通透性改变的抑制作用的缺乏证明mAb作用的特异性(在用缓激肽或HBP刺激后15分钟时给予组胺)，N＝6。
用针对血浆激肽释放酶的单克隆抗体PKH4抑制HBP诱导型EC通透性增加在0时对已用mAb PKH4(40μg/ml)预培养的EC单层细胞内腔侧给予HBP(75μg/ml；实心符号)或缓激肽(100nM；空心符号)。结果如图6示。PKH4阻止了由HBP诱导的EC通透性增加，但没有阻止由缓激肽诱导的通透性改变。PKH4-处理不影响由组胺诱导的通透性改变(在用HBP刺激后15分钟时给予组胺)，N＝6。
通过肽HKH20处理来抑制HBP诱导型EC通透性增加用HKH20(3μg/ml)将EC单层培养30分钟，这种处理可替换表面结合型H-激肽原。在洗涤后，在0时对EC细胞内腔侧给予HBP(75μg/ml)、15分钟后给予缓激肽(100nM)。使HK通过结构域5和6锚定EC表面，其中结构域5最为重要。在结构域5中对人HK与EC结合所必需的最小氨基酸序列由具有下列序列的20个氨基酸肽(HKH20)来代表HKHGHGHHKKNKGKKNGKH(SEQ ID NO7)(人H-激肽原479-498)。这种肽抑制HK与EC的结合(Hasan等，1995，生物化学杂志27019256-19261；和Herwald等，1996，生物化学杂志27113040-13047)。结果如图7中所示。EC经HKH20处理可阻止HBP诱导型EC通透性增加，但不能阻止由随后给予缓激肽诱导的通透性改变，N＝6。
通过肽SDD31处理来抑制HBP诱导型EC通透性增加用SDD31(3μg/ml)将EC单层培养30分钟。SDD31也称作HK31，它是一种来源于人H-激肽原(HK)结构域6的肽，它阻断HK与血浆激肽释放酶和因子XII的结合(Tait等，1986，生物化学杂志26115396-15401；和Vogel等，1990，生物化学杂志26512494-12502)。它具有序列SDDDWIPDIQTDPNGLSFNPISDFPDTTSPK(SEQ ID NO8)(人H-激肽原565-595)。洗涤后，在0时对EC内腔侧给予HBP(75μg/ml)、15分钟后给予缓激肽(100nM)。结果如图8中所示。EC经SDD31处理大大阻止了HBP诱导的EC通透性增加，EC对缓激肽直接刺激的应答在SDD31处理后可以持续下去，N＝6。
通过抑酶肽处理来抑制HBP诱导的EC通透性增加在0时对已用抑酶肽预培养(100μg/ml；30分钟)的EC单层细胞内腔侧给予HBP(75μg/ml)。结果如图9中所示。抑酶肽处理大大阻止了HBP诱导的EC通透性增加，但对随后给予缓激肽(100nM)所诱导的通透性改变没有阻止作用，N＝6。
HBP突变体(G175N)因突变而不能结合抑酶肽，但其三维结构和特异性表面电荷分布没有改变。当在渗漏模型中进行测试时，这种突变体诱导缓激肽的释放并增加EC通透性。然而，添加抑酶肽无抑制作用。使用猪HBP获得了相似的结果，所述猪HBP与人HBP极为同源但因已退化的催化裂隙中R的存在而不能与抑酶肽结合。
实施例3肝素结合蛋白的两种突变体已经生产了两种人HBP突变体[R23S，F25E]HBP和[G175Q]HBP以便研究推定型类脂A/LPS结合位点和BPTI(牛胰腺胰蛋白酶抑制剂)结合位点上残基的结构-功能关系。G175Q突变不改变该蛋白质的结构，但结合BPTI的能力已消除，且该突变体对脂多糖(LPS)诱导的细胞因子从人单核细胞中的释放仅介导极为有限的刺激作用。类脂A/LPS结合特性与天然HBP的结合特性相当。R23S、F25E突变不会影响类脂A/LPS和BPTI的结合或脂多糖(LPS)诱导的细胞因子从人单核细胞中的释放。
材料和方法突变蛋白的构建Pwo DNA聚合酶来自Boehringer Mannheim，BamH1和T4 DNA连接酶来自New England Biolabs，草地夜蛾(sf9)细胞和pVL1393转移质粒来自Invitrogen，TC100和SE900-II产于Novo Nordisk A/S，胎(Foetal)牛血清(FCS)来自GibcoBRL。所有其它化学品均属于可获得的最精细(finest)级。HBP突变体使用PCR重叠延伸技术构建[R23S，F25E]HBP突变体(Ho，S.N.Hunt，H.D.，Horton，R.M.，Pullen，J.K.和Pease，L R.(1989)基因(Amst.)7751-59)。通过使用寡核苷酸1+2和3+6经PCR制备两种部分重叠的突变片段，使用寡核苷酸1+6连接所得片段(表1)。将天然人HBP cDNA用作PCR反应的模板。所得的cDNA编码19个氨基酸的原肽、222个氨基酸的成熟部分和3个氨基酸的C-末端延伸部分。将BamH1位点引入突变cDNA的每一侧以备克隆。将突变的片段连入pVL1393转移质粒(Invitrogen)。使用Qiagen中型制备(midiprep)试剂盒制备用于转染的DNA。在纯化后，对所述插入片段进行测序。
表1用于构建[R23S，F25E]HBP和[G175Q]HBP突变体的寡核苷酸序号 序列1. 5’-CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCTGG-3’(SEQ ID NO9)2. 5’-GGCACCCCCGCACTCGTGGCTGCCTTGATTCTG-3’(SEQ ID NO10)3. 5’-CAGAATCAAGGCAGCCACGAGTGCGGGGGTGCC-3’(SEQ ID NO11)4. 5’-GAGGGGGGTGCCCTGGTCCCCATTGCA-3’(SEQ ID NO12)5. 5’-TGCAATGGGGACCAGGGCACCCCCCTC-3’(SEQ ID NO13)6. 5’-CCGGGGATCCAACTAGGCTGGCCCCGGTCCCGG-3’(SEQ ID NO14)「G175Q]HBP突变体一般如上所述构建该构建体。通过使用寡核苷酸1+4和5+6经PCR制备两种部分重叠的突变片段，使用寡核苷酸1+6连接所得的片段(表1)。
表达和纯化将sf9昆虫细胞维持在补充了10％FCS的TC 100培养基中。在感染前，将该培养基换成不含血清的SF900-II。如文献中对天然人HBP所述在不含血清的培养基中表达两种突变体，并从培养物上清液中纯化突变体(Rasmussen，P.B.，Bjφrn，S.，Hastrup，S.，Nielsen，P.F.，Norris，K.，Thim，L.，Wiberg，F.C.，和Flodgaard，H.(1996)，FEBS通讯390109-112)。
测定LPS诱导的IL-6从单核细胞中的释放分离人单核细胞并如所述处理(Rasmussen，P.B.，Bjφrn，S.，Hastrup，S.，Nielsen，P.F.，Norris，K.，Thirn，L，Wiberg，F.C.，和Flodgaard，H.(1996)，FEBS通讯390109-112)，但不包括从培养基中除去1％的非必需氨基酸。
测定3H-LPS与HBP的结合通过如(Linde，V.，Bjφrn，S.，Kastrup，J.S.，和Flodgaard，H.，2000，生物技术(Biotechniques)28；218-222)所述的闪烁近似性分析技术测定对脂多糖(3H-LPS)的亲和力。将全部样品重复进行测试、一式三份。
对3I-BPTI与HBP结合的测定使用基本上如对LPS分析所述的SPA试验评价对BPTI的亲和力(Linde，V.，Bjφrn，S.，Kastrup，J.S.，和Flodgaard，H.，2000，生物技术28；218-222)但试验方法略有改动。将3H-LPS交换成3I-BPTI(由Novo Nordisk A/S制备)并将缓冲液改变成包括0.05％BSA和0.05％Triton x-100的PBS(20mM磷酸盐pH 7.4和150mM NaCl)。通过用固定的浓度增加的未标记BPTI进行竞争性研究来测定HBP和突变体的相对亲和力。
结果生物学鉴定比较两种突变体与天然HBP的生物活性中，以剂量依赖性方式促进体外LPS-诱导的11-6从人单核细胞中释放的能力。用闪烁近似性试验(SPA)测定两种突变体和HBP的LPS亲和力(Linde，V.，Biφrn，S.，Kastrup，J.S.，和Flodgaard，H.，2000，生物技术28；218-222)。两种突变体以饱和方式结合3H-LPS，它们的表观Kd(约0.7g/mL)与天然HBP中所见相似(图11a)。此外，按照相似的闪烁近似性试验测定两种突变体和天然HBP对BPTI的亲和力，其中将3I-BPTI用作HBP的配体。[R23S，F25E]HBP突变体和[G175Q]HBP结合BPTI，而[G175Q]HBP突变体未见结合(图11b)。通过添加固定的浓度增加的未标记BPTI所进行的竞争性研究表明3I-BPTI以约7nM的相似表观IC50值结合HBP和[R23S，F25E]HBP。如图11c所示，[R23S，F25E]HBP显然具有比HBP更大的结合能力。这种差异可能是由于[R23S，F25E]HBP结合所用不同形式的碘化BPTI的能力所造成的。然而，较大的结合能力没有影响3I-BPTI的亲和力。此外，已经通过竞争性实验研究了3H-LPS置换结合天然HBP的3I-BPTI及反向置换的能力通过添加多达5μg/mL的未标记LPS来竞争对3I-BPTI的结合。通过添加多达50mM的未标记BPTI来竞争对3H-LPS的结合。在两种情况中均没有观察到抑制作用，这表明LPS和BPTI结合位点定位在HBP分子的不同部分上。
体外生物活性试验数据证实与[R23S，F25E]HBP和天然HBP相反，[G175Q]HBP对脂多糖(LPS)诱导的细胞因子从人单核细胞中的释放仅介导极有限的刺激作用(图10)。
本文所述和要求保护的本发明并不局限于本文所公开的特殊实施方案的范围，因为这些实施方案用来解释本发明的几个方面。任何相同的实施方案均属于本发明的范围。实际上，可以根据上述描述对包括本文表明和描述的实施方案在内的本发明作各种修改，这对本领域技术人员来说是显而易见的。这类修改也属于所附权利要求的范围。
本文引入了各种参考文献，将其全部公开内容引入作为参考。
序列表<110> NOVO NORDISK A/S<120> 结合肝素的拮抗剂在缓激肽释放的抑制中的应用<130> 5694-WO，JWKi<150> 60/132,748<151> 1999-04-29<150> PA 1999 00613<151> 1999-05-06<150> 60/157,384<151> 1999-10-01<150> PA 1999 01402<151> 1999-10-01<160> 14<170> FastSEQ for Windows Version 3.0<210> 1<211> 225<212> PRT<213> 人<400> 1Ile Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu Ala1 5 10 15Ser Ile Gln Asn Gln Gly Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His20 25 30Ala Arg Phe Val Met Thr Ala Ala Ser Cys Phe Gln Ser Gln Asn Pro35 40 45Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu50 55 60Arg Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly65 70 75 80Tyr Asp Pro Gln Gln Asn Leu Asn Asp Leu Met Leu Leu Gln Leu Asp85 90 95Arg Glu Ala Asn Leu Thr Ser Ser Val Thr Ile Leu Pro Leu Pro Leu100 105 110Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val Ala Gly Trp115 120 125
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<223> pcr引物<400> 10ggcacccccg cactcgtggc tgccttgatt ctg 33<210> 11<211> 33<212> DNA
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<223> pcr引物<400> 14ccggggatcc aactaggctg gccccggtcc cgg3权利要求
1.哺乳动物HBP拮抗剂在制备用于预防或治疗由哺乳动物中缓激肽释放导致的疾病的药剂中的用途，其中所述哺乳动物产生能与HBP拮抗剂结合的HBP。
2.根据权利要求1所述用途，其中所述HBP拮抗剂的用量为约10mg-约1g/单位剂型。
3.根据权利要求1所述用途，其中所述HBP拮抗剂的用量为约0.1-100mg/kg体重。
4.根据权利要求1所述用途，其中所述HBP拮抗剂的用量为约0.5-50mg/kg体重。
5.根据权利要求1所述用途，其中所述HBP拮抗剂的用量为约1-25mg/kg体重。
6.根据权利要求1所述用途，其中所述疾病选自系统性炎性应答综合征、局部缺血再灌注、过敏反应和同种异体移植物排斥。
7.根据权利要求1所述用途，其中所述疾病是成人呼吸窘迫综合征。
全文摘要
本发明涉及治疗或预防由所述哺乳动物，尤其可产生HBP的哺乳动物体内缓激肽释放所致疾病的方法，其中该HBP可与HBP拮抗剂、例如结合至少一种人HBP表位的单克隆抗体结合，该方法包括对所述哺乳动物给予有效减少哺乳动物体内缓激肽释放的用量的HBP拮抗剂。此外，本发明涉及用于测定哺乳动物是否产生与HBP拮抗剂、例如结合至少一种人HBP表位的单克隆抗体结合的HBP的方法和试剂盒以及一种检测HBP拮抗剂的方法。
文档编号C07K14/47GK1550235SQ200410008028
公开日2004年12月1日 申请日期2000年4月28日 优先权日1999年4月29日
发明者汉斯·J·弗洛德加德, 汉斯 J 弗洛德加德, 林德博姆, 伦纳特·林德博姆, 比约恩, 索伦·比约恩 申请人:诺沃挪第克公司