专利名称：一种癌症基因及其医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新基因及其用途，具体地说是人体1号染色体短臂36区(1p36)的新基因及其医药用途。
背景技术：
现代生物学研究表明，癌的发生是一种多因子多步骤的复杂事件，是多种癌基因激活或抑癌基因失活的结果。目前，癌基因医学研究主要包括三个方面(1)寻找具有治疗意义的目的基因。(2)建立有效的向靶细胞转移目的基因的载体系统。(3)使目的基因在靶细胞中表达，发挥生物学效应。因此，寻找癌基因或抑癌基因是目前癌症研究中的重中之重。
人体1p36的杂合性缺失和染色体获得已有报道(reviewed by Schwab et al.1996 Kraggerud et al.，2000；Loveday et al.，2000；Stock et al.，2000；Alvarez et al.，2001；Zielenska et al.，2001)。这些研究结果提示，在此区存在癌基因或抑癌基因。
发明内容
本发明的目的就是筛选并分离出1p36.13区域中出现的新的与癌相关的基因及转录物，并开发其具有的医药用途。
本发明的目的是这样实现的本发明人利用克隆筛选技术，在人类(homo sapiens)第1号染色体上，找到了一个新的癌基因。该基因在人类多种癌组织中(卵巢癌，乳腺癌，胰腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，脑癌，胃癌，肝癌，子宫癌等)都有过表达，PCR定量显示，其高出正常组织数百至数千倍。进一步研究证实，该基因与增殖及磷酸化有关。将该基因导入细胞接种于裸鼠皮下，经过一个月的观察，可长出肿瘤。另外，该基因与非常著名的MAPK经路有关。其能够刺激RAS过表达和MEK，ERK2磷酸化。用干扰RNA(RNAi)的方式，阻断该基因的表达，可以减少磷酸化和PCNA的表达。在细胞水平和活体均已证实能够抑制癌细胞的生长。
本发明人命名该基因为PPO基因(Phosphorylation and ProliferationOncogene)。
由PPO的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。其DNA长度约36-kb，cDNA长度6022碱基。
PPO的cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO.1)推断的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。其具有编码SEQ ID NO.2所示的993个氨基酸残基的可读框的基因。
本发明的PPO基因编码的氨基酸分子量为100kD。
该核苷酸序列的编码区代表密码子的组合的例子，所述密码子针对SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中的各自氨基酸残基。
本发明基因中密码子的组合不限于SEQ ID NO1中所示的例子。密码子的任意组合可用于各自的氨基酸残基。密码子的选择可以采用常规方式进行。
本发明基因的生产方法是从其中表达本发明基因的适当来源中以常规程序制备cDNA文库或直接购得，并且使用适当的探针或特异于本发明基因的抗体从该文库中筛选所需的克隆。
适用作cDNA来源的是例如表达本发明基因的各种细胞和组织以及从中衍生的培养细胞。
来自这种来源的总RNA的分离，mRNA的分离和纯化以及cDNA的获取和克隆可以按常规方式进行。
市售的cDNA文库如购于Clontech(PaloAltocA)公司的各种cDNA文库可用于本发明基因的生产。
从cDNA文库生产的本发明基因，其筛选方法没有特别的限制，可采用常规的方法。
筛选方法的例子，包括使用针对由cDNA所产生的蛋白的特异抗体来筛选相应cDNA克隆免疫筛选方法，使用探针选择性地与目的DNA序列结合的方法，如噬菌斑杂交方法或菌落杂交方法，以及这些方法的组合。
作用于上述方法的探针，一般可使用依据本发明基因的核苷酸序列的信息而化学合成的DNA。已获得的本发明基因或其片段也可用于探针。
依据本发明基因的核苷酸序列的信息而设计的有义引物和反义引物可用作筛选的探针。
在获得本发明基因中，可通过PCR的DNA/RNA扩增。特别是可采用RNACE方法获得全长的cDNA。
用于这些PCR方法中的引物可参考本发明基因的核苷酸序列信息进行合理设计，也可通过常规程序合成。
本发明基因可通过常规程序进行检测，如PCR方法。
当选择PCR方法用于检测时，有待使用的引物可以是仅能导致本发明基因选择性扩增的任何引物。
本发明PPO基因的筛选、分离、确定、克隆、核苷酸序列的确定是按下列方法进行的。
cDNA文库筛选胎肝，胎脑，胰腺和肾脏cDNA文库购于Clontech(Palo Alto，CA)。大肠，肺，肝，卵巢和纤维母细胞的cDNA文库购于Stratagene.(La Jolla，CA)。设计10组引物，用来筛选cDNA文库，通过cDNA文库筛选，最终确定EST Hs.154797并克隆全长cDNA。精确定位PPO于1p36.13并测定DNA序列用自己所做的1p36叠连群(contig)，通过DNA印迹杂交(SouthernBlotting)杂交的方式找到BAC克隆b203I24，b140B13，b81G11，and b57B11，精确定位于1p36.13并测定DNA序列。
指出外显子序列利用GenScan program(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)(Burge andKarlin，1997)指出外显子及内含子序列。利用RACE方法找到5’端的序列。利用5’SMART RACE试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)，自肾癌细胞株ACHN找到5’端的序列。
引物如下R1，5’-AACCAACTTCTTGGATCCAGGGGA-3’.
R2，5’-TTGGAATTCAATCAAACTTGCCCACCTG-3.
细胞培养OVK18，OVK18#102(Uehara et al.，1984)，OVCAR3(Hamilton et al.，1984)，CoLoTC(Quinn et al.，1979)，Lu65(Hirohashi et al.，1989)，HT1(Tsuchiya et al.，1982)，HCT15(Dexter et al.，1979)，HEC1A(Kuramotoet al.，1972)，ACHN(Giard et al.，1973)，U251N(Hirohashi et al.，1978)，SUN5(Brattain et al.，1981)，LK-2(Yoshioka et al.，1989)和NIH/3T3(Aaronson SA et al)PK1，PK8 and PK9，(Kobari et al.，1986)，所用细胞均来自东北大学加龄医学研究所。LNCaP(Gibas et al.，1983)，HEK 293(Graham et al.，1977)and U87(Beckma.et al.，1971)购于美国ATCC(Manassas，VA).并严格按照说明培养。
反转录PCRRNA自冷冻组织或细胞株中提取。通过翻转录变成cDNA后，PCR条件如下94℃ 5分，94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒，40个循环。72℃ 7分。
引物如下F，5’-TTTGATTGGAGACAGCAATATG-3’。
R，5’-CTGCGATGTACCTTACAGAC-3’。
定量反转录PCR定量PCR机器用ABI PRISM 7000 Sequence Detection System(AppliedBiosystems，Foster City，CA).
引物如下F，5’-GCTTTTCGGAGAAGTCTAGTTCAAAG-3’.(从1117th nt到1142nd nt).
R，5’-TCTCCACGAGGTATAGGTTAATGGT-3’.(从1197th nt到1173rd nt).
探针，5’-CTTGCTTCAATCAGACCTA-3’.(从1153rd nt到1171st nt).
β2-microglobulin基因作为控制基因。
引物如下F，5’-GTGACTTTGTCACAGCCCAAGA-3’.(从373rd nt到394th nt).
R，5’-AACCTCCATGATGCTGCTTACA-3’.(从437th nt到416th nt)探针，5’-AGTTAAGTGGGATCGAGAC-3’.(从396th nt到414th nt)结果用标准曲线法测量。
质粒的构建质粒的构建分两步，首先自KpnI位点至EcoRI位点，然后从EcoRI位点至XbaI位点，先用KpnI和EcoRI酶分别处理载体和PCR产物，再用连接酶连接。测序证明没有突变后再大量培养，然后用EcoRI和XbaI酶分别处理载体和PCR产物，再用连接酶连接，测序证明没有突变后再大量培养后转染NIH/3T3细胞株并获得稳定表达。全长3000个碱基对。装入表达载体为pcDNA3.1/V5His(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
蛋白印迹杂交(Western Blotting)分析细胞培养回收后，方法详见参考文献(Kondo et al.，1999)，抗体V5，PCNA，Phospho-MAPK，anti-beta actin购于(Sigma，St Louis，MO)。ERK2购于(BDBioscience，Palo Alto，CA)，RAS(Oncogen，Boston，MA)，MEK1/2 andPhospho-MEK1/2购于(Cell Signaling Beverly，MA)细胞免疫染色质粒转染NIH/3T3细胞株并获得稳定表达细胞回收后涂片，经过PBS缓冲液的处理，V5作为一抗，1％FITC作为二抗染色，4，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)染核。显示该基因的蛋白质在细胞中存在的位置。
MTT分析细胞培养用96孔培养皿，每24小时检测一次，共6天。用MTT染色，MTT购于(Sigma，St Louis，MO)，VERSA max microplate reader机器检测溶液的透光性，机器购于日本(Molecular Devices，Tokyo，Japan)。
软琼脂上的集落形成能力分析用6孔板培养皿，1％软琼脂(DIFCO LABORATORIES，Detroit，MI)，将1×104个细胞种植于每孔中，4周后，用MTT染色检查，看细胞的增殖情况。
通过本发明基因通过常规遗传工程技术，可以稳定而大量地生产其表达产物或含有同样表达产物的蛋白。
本发明蛋白及其生产方法本发明PPO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明蛋白还包括其任何同系物。所述同系物可以是具有相同的氨基酸序列并保留PPO活性的蛋白。
本发明蛋白的同系物包括有同衍生自人、马、羊、犬、猿、猫和其他哺乳动物物种以及啮齿动物如大鼠、小鼠和兔的具有同SEQ IP NO2所示的氨基酸序列的具有相同活性或功能的蛋白。
从表2也可以看出，在其他生物中，存在PPO基因的同型基因，包括老鼠、果蝇、蚊子、线虫和酵母。
本发明蛋白可通过常规重组DNA技术，依据本发明公开的PPO基因核苷酸序列信息来制备。
如构建质粒，允许在宿主细胞中编码目的蛋白基因的表达，通过向其中转导载体转化宿主细胞；使所得的转化因子生长，从培液中收集蛋白。
宿主细胞可以是任何原核细胞和真核细胞。
当原核细胞用作宿主细胞时，表达质粒的构建方法是使用宿主细胞中可复制的载体，并在本发明基因的上游添加启动子和SD(Shine和Dalgqrno)序列，以使该基因可在其中表述。
作为本发明基因的表达载体，可利用任何常规融合蛋白表达载体(如pcDNA3.1)。
将所述表达载体导入宿主细胞中的方法以及相关的转化方法可采用常规方法进行。所得的转化子可以采用常规方式培养。
如此获得的本发明重组蛋白可通过常规技术进行分离、纯化。这些技术包括重建处理、蛋白沉淀、离心、超滤、吸附层析、离子交换、亲和层析和高效液相层析等等。
本发明蛋白或其片段可以作为制备特异抗体的抗原，使用该抗原可以制备出所需的多克隆抗体和单克隆抗体。
制备该抗体的方法，可采用免疫学中常规的制备方法。
该抗体可用于本发明蛋白的纯化及其测定或鉴定。
本发明基因如前所述在多种癌组织中都有高于正常组织数百至数千倍的表达，因此，该抗体可用于癌症的诊断。其医药用途为以该抗体为活性成分用于制备癌症诊断剂或试剂盒。
本发明癌症诊断剂或试剂盒至少包括PPO基因或片段的活性成份或其互补核苷酸序列的活性成份。可任选含有其他组分，如标记介质和PCR试剂。
标记介质可以是放射性同们素或化学修饰物如黄光物质。
试剂盒可以含有适当的反应稀释剂、标准抗体、缓冲液、反应终止液等等。
本发明PPO基因的另一个医药用途是以PPO基因被分离的DNA的表达产物的抗体为活性成分，与合适的药物载体制备成癌症治疗药物制剂或稀释剂。
本发明治疗药物制剂，可以根据不同的制剂载体制备成各种剂型(如液体制剂、固体制剂)。
制剂载体可选用药学制剂中常用的载体，如稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、等渗剂、稳定剂(如人血清的蛋白、L-氨基酸、糖类以及纤维素衍生物)等等。
包含在药物制剂中的本发明活性成份的含量，没有特别的限定，一般可依据治疗需要以及给药方法、疗程以及患者的年龄因素进行选择。
就一般情况而言，常用剂量为成人每公斤体重约0.01μg～10mg/天。每日1-3次。
本发明PPO基因的又一个的医药用途是以PPO基因的反义核苷酸转移载体或用其反义核苷酸转化/转染的细胞系作为活性成分以药物有效量与合适的药物载体或稀释剂制备成药物制剂。
该药物制剂具有抑制PPO基因在细胞中PPO基因的翻译和表达，从而达到抑制癌细胞的增殖。
向目的基因引入目的基因的起始载体或起源载体是本领域的公知技术。
以反义核苷酸转移载体或用其反义核苷酸/转化转染的系作为活性成份所制备的药物制剂，其活性成分的剂量不受特别的限定。
通常情况下，其剂量可根据反转录病录效价每kg体重每天约1×102pfu.～1×1010pfu.。
在本说明书中，本发明的基因(DNA)分子称为PPO或KIAA0090，由该基因编码的蛋白成为PPO蛋白，以及次蛋白的功能活性称为PPO蛋白活性。
基于上述研究结果所开发的本发明提供了下列主题1)包括下列多核苷酸中的一种被分离的DNA分子a)编码由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸。
b)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列比较具有至少95％同源性的多核苷酸。
c)在严格条件下能与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。
d)与上述a或b互补的多核苷酸。
2)如上1)所述的被分离的DNA分子，其编码由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸序列。
3)如2)所属的被分离DNA分子，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
4)包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列表达产物。
5)包含如上1)或3)所属的被分离的DNA分子的重组表达载体。
6)内含如上5)所述的重组表达载体的宿主细胞为NIH/3T39。
7)一种PPO检测用探针，其具有包含来自SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸序列。
8)如7)所述的PPO检测用探针，其具有包含来自SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的至少30个连续核苷酸序列。
9)癌症诊断剂，其包括如上7)或8)所属的探针或引物。
10)癌症诊断试剂盒，其包括如上(7)或(8)所属的探针或引物。
11)抗体或抗体片断，其能与如上1)所属的被分离的DNA分子的表达产物结合。
12)诊断癌症的方法其包括下列步骤制备生物样制品，制备如上11)所述的抗体或其片断，以及将上述样品与上述抗体或片断进行免疫反应并且检测样品中的免疫反应产物。
13)癌症的治疗方法。其包括下列步骤制备生物样制品，制备如上11)所述的抗体或其片断，以及将上述样品与上述抗体或片断进行免疫反应以及利用RNA干扰技术或反义基因治疗手段所进行的治疗方法。
14)一种序列的反义核苷酸，该序列包含来自SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
15)如上14)所述的反义核苷酸，其反义与一种序列，该序列包含来自于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的至少30个连续核苷酸。
16)基因治疗药物制剂，其包含如上14)或15)所述的反义核苷酸作为活性成分。
17)筛选一种或多种物质(激动剂和/或拮抗剂或干扰剂)的方法，所述一种或多种物质如上1)所述的被分离的DNA分子的表达产物相互作用，所述方法包含下列步骤在含有待选的测试物质的培养基中对含有如上1)所述的被分离的DNA分子的宿主细胞进行培养，然后定量如上1)所述的被分离的DNA分子的表达产物。
18)用于癌症治疗药物剂，其包含有效量的如上11)所述的抗体或其片断以及可药用的载体或基因本身的RNA干扰剂。
说明书中氨基酸，肽，核苷酸序列，核酸等以缩写表示，按《核苷酸和或氨基酸序列表电子标准文件》(中华人民共和国知识产权行业标准ZC003-2001)的规则撰写。
SEQ ID NO.1PPO的cDNA核苷酸序列。
SEQ ID NO.2PPO的氨基酸序列。
图1SEQ ID NO.1所示核苷酸序列其中的EST Hs.154797在人体不同组织中的表达情况。
图2反转录PCR显示。
图中的beta2-MG是内在控制基因。
图3克隆的部分PPO基因的核苷酸序列。
图4PPO基因的结构示意。
图5A、图5B是RNA印迹杂交结果。
从图中可以看出该基因在不同组织中的表达情况。
图5A中1心脏、2脑、3胎盘、4肺、6骨骼肌、7肾脏、8胰脏图5B中1脾脏、2甲状腺、3前列腺、4睾丸、5卵巢、6小肠、7大肠、8周围血白细胞图6人和鼠的功能域分析比较。
其中蓝色字母代表B.cAMP-和cGMP-依赖蛋白激酶磷酸化点，红色盒子代表C.蛋白磷酸化点，绿色盒子代表酪蛋白激酶II磷酸化点。深蓝色盒子代表酪氨酸激酶磷酸化点。
图7、图8人的基因和其它物种比较。
图9A-B定量PCR显示。
图9A定量PCR显示，该基因在多种癌组织和细胞株中有过表达。其中1和5是正常的卵巢组织，2是卵巢细胞株VK18、3是卵巢细胞株VK18#102、4是卵巢细胞株OVCAR-3。自6-14是卵巢癌组织标本。15是正常的子宫体标本，16-19是子宫体癌，20是子宫体癌细胞株HEC1A。21是正常的肾脏组织，22是正常的细胞株293，23是肾脏癌细胞株ACHN，24-27是肾脏癌组织标本，28及29是正常的肝脏组织，30-34是肝癌组织标本，35是正常乳腺组织，36-39是乳腺癌组织标本，40是正常结肠组织，41-44是结肠癌的细胞株。45是正常胃组织，46-49是胃癌组织标本，50-51是正常脑组织，52和53是脑胶质瘤的细胞株，54是正常胰脏组织，55-57是胰脏的细胞株，58是胰脏癌组织标本，59-60是正常肺脏组织，62-63是肺脏的细胞株，64是正常前列腺标本，65是前列腺癌细胞株。
图9B表达量的分析。
图10细胞免疫染色显示结果。
A表示细胞质，B表示细胞核，C表示重叠后的图像。
图11MTT分析。
其中A表示基因导入后的质粒转染NIH/3T3。
B表示空白载体转染NIH/3T3。
图12 PPO基因与磷酸化有关的表现。
图12A表示ERK2磷酸化蛋白在稳定表达克隆明显增加。
图12B表示MEK1/2磷酸化蛋白在稳定表达克隆明显增加。
由图12A与图12B相比较可以看出PPO基因与磷酸化有关。
图12C表示细胞核增殖抗原PCNA明显增加。
图12D表示BRAF没有改变，RAS有过表达。
图12E免疫沉淀表示该基因可能和RAS有关。
图12FPPO蛋白质的长度。
图13软琼脂上的集落形成能力实验分析图13中的A和B为正常3T3细胞在软琼脂上的表现。
图13中的C和D为PPO基因导入载体的细胞在软琼脂上的表现。如图所示该基因导入细胞能够形成大的集落群。
图13中的E和F是正常细胞和空白载体导入细胞集落群大小的比较。从图中可以看出，集落群大小是不同的。
图13的G是正常细胞和空白载体导入细胞集落群数量的比较，从图中可以看出，集落群的数量也有明显的差别。
图13的H空白载体导入细胞不能够形成细胞叠加现象。
图13的I该基因导入细胞能够形成细胞叠加现象。
这些结果表示PPO基因导入载体转染的细胞具有癌细胞的特点。
图14活体分析显示图。
图14A显示该基因导入后的3T3细胞能够在老鼠身上刺激细胞生长。
图14B显示该基因导入后，自老鼠身上解剖下的肿瘤比较。
图14C生长曲线图，○连线为基因导入后转染细胞的生长曲线，*连线为对照组的生长曲线。
从图中可以看出，该基因导入后能够明显刺激细胞生长并具有致瘤性。
图15A.定量PCR的结果。
由图可以看出，用RNA干扰后，PPO在2个卵巢癌细胞株中，该基因的表达量减少。
图15.B-C.D.蛋白印迹杂交显示结果。由图可以看出蛋白印迹杂交显示磷酸化和增殖指标减少。在细胞水平抑制癌细胞的生长。
图15.B是卵巢癌细胞株OVK18。
图15C是卵巢癌细胞株OVCAR-3，。
图15D是PPO转染后的3T3细胞株。蛋白印迹杂交显示磷酸化和增殖指标均减少。
图16.该基因在MAPK通路中的作用示意图。由此可推测该基因可能在MAPK通路中的作用。刺激RAS过表达和MEK1/2及MAPK的磷酸化。
图17-19.为将RNAi试剂注射于荷瘤鼠的实验结果。
图17A将RNAi试剂注射子荷瘤鼠及注射21天后的表现。
图17B两侧肿瘤的比较。
图17C生长曲线，绿色代表对照基因Lamin，左侧，红色代表PPO基因。
由图可以看出，将RNAi试剂注射于荷瘤鼠能够明显抑制癌症的生长。
图18为重复试验条件和结果与图17一样。
图19为生长曲线。
RNA干扰在活体实验证明能够抑制癌症的生长。
图20A所用载体和克隆方法示意图。
图20B为具体的序列，自起始子前3个核苷酸开始。
图20C到EcoRI酶切点为前半部分。
图20D自EcoRI酶切点开始到终止子为后半部分，终止子TAA被XbaI酶切点所替代继续编码V5蛋白。
图21是PPO基因转染的正常NIH/3T3。
图22A用于RNA干扰技术的RNA序列。
图22B用于诊断试剂盒的引物和探针。
表1外显子和内含子的连接部位符合ag-gt规则以及外显子和内含子的长度。
表2表示在其它生物中，PPO基因的同型基因，包括老鼠、果蝇、蚊子、线虫、和酵母。
表3表示在生物进化中最保守的氨基酸。而这些氨基酸和磷酸化有关。
具体实施例方式
实施例cDNA文库的筛选胎肝，胎脑，胰腺和肾脏cDNA文库购于Clontech(Palo Alto，CA)。大肠，肺，肝，卵巢和纤维母细胞的cDNA文库购于Stratagene.(La Jolla，CA)。设计多组引物，用来筛选cDNA文库，通过cDNA文库筛选，最终确定EST Hs.154797并克隆全长cDNA，6022碱基对，双链螺旋结构。
如图1所示，1个EST Hs.154797能够在cDNA文库中有明确的产物。其在胎脑，肾组织，肝组织及胰腺组织中有表达。在卵巢组织，大肠组织及肺脏中没有表达。
精确定位KIAA0090于1p36.13并测定DNA序列用自己所做的1p36叠连群(contig)，通过DNA印迹杂交(Southern Blotting)杂交的方式找到BAC克隆b203I24，b140B13，b81G11，and b57B11，精确定位于1p36.13并测定DNA序列。
如图SEQ ID NO.1所示本发明的PPO基因其DNA长度约36-kb，cDNA长度6022碱基。
PPO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
指出外显子序列利用GenScan program(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)(Burge andKarlin，1997)指出外显子及内含子序列。
利用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法找到5’端的序列。
利用5’SMART RACE试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)，首先自肾癌细胞株ACHN提取RNA按SuperScript IIRT Kit(GIBCO，BRL)(Rockville，MD)操作程序合成第一链cDNA。合成后反应体积稀释至120μl，1μl约含8ng总RNA，反转录后得到的第一链cDNA。RACE的反应条件如下cDNA 2μlAdaptor Pimer 0.25μl10mMdNTP 0.25μl10XPCR Buffer 1.25μl50XPolymerase Mix 0.25μlGene-specific Primer(10pmol/μl0.25μlH2O7.75μlTotal 12μl基因特异的引物如下R1，5’-AACCAACTTCTTGGATCCAGGGGA-3’.
R2，5’-TTGGAATTCAATCAAACTTGCCCACCTG-3’RACE产物直接测序，条件严格按照试剂盒要求操作。找到5’端的序列。
如图3所示利用SMART RACE试剂盒，克隆了起始子和非编码区共28个碱基以及EST Hs.154797的一部分。自斜体字母开始是KIAA0090cDNA的一部分。
如图4所示PPO基因含有25个外显子，起始密码位于第一个外显子，终止密码位于第23个外显子。
外显子和内含子的连接部位符合ag-gt规则以及外显子和内含子的长度(见表1)。
细胞培养OVK18，OVK18#102(Uehara et al.，1984)，OVCAR3(Hamilton et al.，1984)，CoLoTC(Quinn et al.，1979)，Lu65(Hirohashi et al.，1989)，HT1(Tsuchiya et al.，1982)，HCT15(Dexter et al.，1979)，HEC1A(Kuramotoet al.，1972)，ACHN(Giard et al.，1973)，U251N(Hirohashi et al.，1978)，SUN5(Brattain et al.，1981)，LK-2(Yoshioka et al.，1989)和NIH/3T3(Aaronson SA et al)PK1，PK8 and PK9，(Kobari et al.，1986)，所用细胞均来自东北大学加龄医学研究所。LNCaP(Gibas et al.，1983)，HEK 293(Graham et al.，1977)和U87(Beckma.et al.，1971)购于美国ATCC(Manassas，VA).并严格按照说明培养。
反转录PCR反转录用Trizol提取细胞和冷冻组织中的RNA，取总RNAlμg，总反应体积20μl按SuperScript IIRT Kit(GIBCO，BRL)(Rockville，MD)操作程序合成第一链cDNA。合成后反应体积稀释至120μl，1μl约含8ng总RNA，反转录后得到的第一链cDNA。
PCR反应依次加入下列试剂反转录单链cDNA 1μl(稀释后)10XPCR缓冲液1.5μl2nMdNTP 1.5μl上游引物F 1.5μL下游引物R 1.5μlTaq酶(promaga 0.5u/μl) 1.5μl水 6.5总体积 15μl反转录PCR条件如下；94℃ 5分，94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒，40个循环。72℃ 7分。
引物如下F，5’-TTTGATTGGAGACAGCAATATG-3’.
R，5’-CTGCGATGTACCTTACAGAC-3’.
如图2所示，反转录显示PPO基因在卵巢癌中有过表达。
定量反转录PCR在反转录PCR的基础上，利用同样的cDNA作为模版，做定量PCR机器用ABI PRISM 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems，Foster City，CA).引物如下Forward primer，5’-GCTTTTCGGAGAAGTCTAGTTCAAAG-3’.(from 1117th nt to1142nd nt).
Reverse primer，5’-TCTCCACGAGGTATAGGTTAATGGT-3’.(from 1197th nt to1173rd nt).
Probe，5’-CTTGCTTCAATCAGACCTA-3’.(from 1153rd nt to 1171st nt).
β2-microglobulin基因作为控制基因，引物如下Forward primer，5’-GTGACTTTGTCACAGCCCAAGA-3’.(from 373rd nt to 394thnt).
Reverse primer，5’-AACCTCCATGATGCTGCTTACA-3’.(from 437th nt to 416thnt)Probe，5’-AGTTAAGTGGGATCGAGAC-3’.(from 396th nt to 414th nt)结果用标准曲线法测量。
所有试剂均购于Applied Biosystems公司并严格按照说明操作。具体而言，我们按照说明准备反应溶液，两个基因的标准曲线制作，PPO和β2-microglobulin的cDNA按cDNA 5倍倍比稀释，(8×10-2ng，1.6×10-2ng，3.2×10-3ng，6.4×10-4ng，1.28×10-4ng，2.56×10-5ng和阴性对照).每份标本准备两分样品，机器自动计算其平均值，人类的基因组DNA作为阴性对照。标准曲线的相关系数在0.98和0.99之间。为确保结果，相同试验重复三次以上，求出平均值和标准曲线。
如图9A和9B所示该基因在多种癌组织(如卵巢癌，乳腺癌，胰腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，脑癌，胃癌，肝癌，子宫癌等)和细胞株中有过表达。
质粒的构建质粒的构建分两步，首先cDNA文库自己制备，自肾癌细胞株ACHN中提取RNA后，反转录为cDNA，如上所述，利用此cDNA为模版，设计的引物分别包括KpnI位点和EcoRI位点，Forward primer，5’-CATGGTACCGCATCATGGCGGCTGAGTG-3’.
Reverse primer，5’-CAGCTCAGTGGTGAGATCCT-3’.
PCR产物经KpnI和EcoRI酶分别处理，同时，表达载体pcDNA3.1/V5His(Invitrogen，Carlsbad，CA)也经KpnI和EcoRI酶分别处理，再用连接酶连接。如图20A、B、C、D所示。这样，约1.5kb的cDNA被装入载体，用DNA印迹法(Southern blotting)确认是否成功导入，并测序加以证实。并以此为新的载体，同样，利用自己合成的cDNA为模版，设计的引物分别包括EcoRI位点和XbaI位点，Forward primer，5’-ATGAGATCAACATTGACACC-3’.
Reverse primer，5’-CCCTCTAGATCGCCAGGCCC-3’.
PCR产物经EcoRI和XbaI酶分别处理，并且新的载体也经EcoRI和XbaI酶分别处理后，再用连接酶连接。这样约1.5kb的cDNA被装入新的载体。共装入pcDNA3.1/V5His载体的cDNA约3.0kb。包括所有的编码蛋白的序列。并且拥有pcDNA3.1/V5His载体的特点，对新霉素耐药，并且产生的蛋白可被V5单克隆抗体所识别。测序证明没有突变后质粒转染大肠杆菌，经LB培养后，氯化铯超速离心分离出质粒，酒精和醋酸沉淀并提纯质粒，详细方法按分子克隆(美J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis.金冬雁，黎孟枫等译。1992年第二版，科学出版社)书中提取质粒的方法制备。测序证明没有突变后转染NIH/3T3细胞株并获得稳定表达。用蛋白印迹杂交法确认稳定表达的单克隆细胞。最后，有两株细胞被确定获得稳定表达而做进一步的研究。
稳定表达克隆的筛选空白对照载体和基因导入新构建质粒分别转染3对NIH/3T3细胞株培养皿，转染方法严格按照LIPOFECTAMINE PLUS Reagent(Invitrogen公司)试剂盒说明。第一对培养皿用来验证是否转染成功。另外两对培养皿加入新霉素筛选，耐药株能够生存，最后，得到30个克隆，用蛋白印迹杂交方法去验证是否能够表达V5抗体，只有表达V5抗体，才能证明转染成功。最后，获得2株稳定表达克隆。
蛋白印迹杂交(Western Blotting)蛋白印迹杂交的抗体V5，PCNA，Phospho-MAPK，anti-beta actin购于(Sigma，St Louis，MO)。ERK2购于(BD Bioscience，Palo Alto，CA)，RAS(Oncogen，Boston，MA)，MEK1/2 and Phospho-MEK1/2购于(Cell SignalingBeverly，MA)。稳定表达的细胞株经DMEM培养基，同时加入10％的小牛血清和500μg/ml G418，培养48小时后收集，细胞经PBS冲洗后溶解于3％SDS中。蛋白的浓度用BSA试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA).测定。具体方法参见参考文献(Kondo et al.，1999)。制备10-20％积层胶和SDS-聚丙烯酰胺分离胶，取各组细胞浆蛋白40μg，与等体积上样缓冲液(0.05mol Tris-HClpH6.8，2％SDS，10％beta-巯基乙醇，20％甘油，0.1％溴酚兰)混合均匀，沸水浴5分，自然冷却后上样于凝胶加样孔内，按积层胶8V/cm及分离胶15V/cm的条件进行恒压电泳，电泳缓冲液为Tris-甘氨酸-SDS缓冲液，溴酚兰移动至胶底部中止电泳。将蛋白转至Clear blot membrane-P膜(ATTO，Tokyo，Japan)。膜的封闭条件按照厂家的说明，将膜置于2.5％脱脂奶粉中封闭1个小时。加入过夜4℃，用PBST(含有0.05％Tween20的PBS)洗膜3×10分，加入二抗，37℃孵育1小时，用PBST洗膜3×10分钟，信号观察用ECL Detection Reagent(AmershamBiosciences，Buckinghamshire，U.K.)分析用LAS 1000 Plus with a ScienceLab 99 Image Gauge(Fuji Photo Film，Minamiashigara，Japan).
细胞免疫染色质粒转染NIH/3T3细胞株并获得稳定表达细胞回收后涂片，经过PBS缓冲液的处理，V5作为一抗，1％FITC作为二抗染色，4，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)染核。如图10显示，该基因的蛋白质位于在细胞质内。
MTT还原法(MTT assay)检测细胞增殖将稳定表达的细胞株接种在96孔培养板内(1×104个细胞种植于每孔中)，每24小时检测一次，共6天。用MTT染色，细胞溶解于100％酒精，摇动10分钟使之混匀，选择490nm波长，计算百分比加以比较。MTT购于(Sigma，St Louis，MO)，VERSA max microplate reader机器检测溶液的透光性，机器购于日本(Molecular Devices，Tokyo，Japan)从图11中可以看出，空载体和该基因转染细胞株在生长速度上没有明显的差别。
免疫沉淀试验Immunoprecipitation(IP)这种方法详见(Kondo，E.，1999)，简而言之，稳定表达的细胞株经过培养收集后，经PBS冲洗，溶解于500μl的Brij97细胞提取液缓冲液(20mM Tris-HClpH7.4，75mM NaCl，1mM EDTA，1mM Na3VO4，1％ Brij 97，1mM phenylmethylsulfonyl fluoride，20μg/ml aprotinin)(Higuchi，M.，1996).蛋白质的表达量检测与蛋白印迹杂交(Western Blotting)相同。结果如图12E所示，该基因可能与RAS有关。
为进一步证实PPO基因具有致瘤性，本发明人进行了软琼脂上的集落形成能力分析。
方法为空白对照表达载体的细胞株和PPO新构建质粒表达载体的细胞株分别种植于6孔板培养皿，1％软琼脂(DIFCO LABORATORIES，Detroit，MI)放入培养皿中为底层，0.5％agar/DMEM为第2层，0.3％agar/DMEM为第3层，将1×104个细胞种植于每孔中，每周更换一次培养液，4周后，用3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)染色检查，看细胞的增殖情况。以上试验严格按照厂家说明操作。
实验结果如图13A、B、C、D、、E、F所示。
如图13A、B所示，其正常3T3细胞在软琼脂不能够形成大的集落群。
如图13中的C、D所示该基因导入载体的细胞能够形成大的集落群。
从图13中的E和F中可以看出，正常细胞和空白载体导入细胞集落群大小是不同的。
从图13的G中可以看出正常细胞和空白载体导入细胞集落群的数量有明显的差别。
从图13的H中可以看出空白载体导入细胞不能够形成细胞叠加现象。
从图13的I中可以看出该基因导入细胞能够形成细胞叠加现象。
以上结果表示PPO基因导入载体转染的细胞具有癌细胞的特点。
为了证明PPO基因与MAPK通路有关，按照常规方法，进行了基因磷酸化实验。如图6；图12A、B、D、E；图15B、图15C、图15D；图16所示本发明基因位于细胞质内并有多个磷酸化点，进一步研究显示其具有磷酸化功能，能够使MEK和ERK2磷酸化，位于MAPK通路中。
由图6可以看出，该基因有很多磷酸化点，可能与磷酸化有关。
由图12A可以看出，ERK2磷酸化蛋白在稳定表达克隆明显增加。
由图12B可以看出，MEK1/2磷酸化蛋白在稳定表达克隆明显增加。
由图12A.与图12B相比较可以看出，PPO基因与磷酸化有关。
由图12D可以看出，BRAF没有改变，RAS有过表达。
由图12E可以看出，免疫沉淀表示该基因可能与RAS有关。
本发明的基因可调节各种细胞或在其中的增殖，分化，肿瘤发生以及转录激活等(如图12C；图13A、B、C、D、E、F、G、H、I；图14A、B、C所示)，该基因能够明显刺激细胞生长并具有致瘤性。依据这些活性，其可用于与这些活性相关的疾病如恶性肿瘤的病理学解释，诊断和治疗。
本发明的PPO基因编码的氨基酸分子量为100kDa(如图12F所示)。
本发明基因的全部或部分可用于生产能够与基因表达产物(蛋白)结合的抗体或其片断。所得的抗体或其片断可用于诊断本发明基因参与其中的上述疾病。如图22B所示的引物和探针可用于制备诊断盒或试剂盒。
本发明基因的反义片断或RNA干扰技术或其表达产物可用于控制上述疾病(如肿瘤的生长)的发作。
本说明书中，术语“PPO基因(DNA分子)”不仅包括双链DNA而且包括其组成的单链DNA，不管是有义的还是无义的以及其片断。因此，除非另有说明，术语“PPO基因(DNA分子)”包括含有人基因组DNA的双链DNA，包括cDNA的单链DNA(有义链)，具有与有义链互补的序列的单链DNA(反义链)以及它们的片断。
本发明基因可含有前导序列，编码区，外显子和内含子。如图4和表1所示其含有25个外显子，起始密码位于第一个外显子，终止密码位于第23个外显子。
本发明基因多核苷酸包括RNA和DNA。所述DNA包括cDNA，基因组DNA以及合成DNA。多肽包括其片断，同源物和突变体。
人的基因与其它物种相比较，从进化的角度上看有些氨基酸序列非常保守(如图7、图8所示)。
活体分析具体如下裸鼠购于(Japan Clea，Tokyo，Japan)公司，5周龄，每只裸鼠，左侧种植空白对照表达载体的细胞株，右侧种植PPO新构建质粒表达载体的细胞株，每侧种植细胞5×106个，每4天测量肿瘤大小一次，共4周。该试验共进行两次，结果相同。老鼠喂养于东北大学医学部附属动物实验中心。条件符合国际标准并且不会带来致病性。
实验结果如图14A、B、C所示，该基因导入后能够明显刺激细胞生长并具有致瘤性。
活体实验表明该基因与增殖及磷酸化有关。
用RNA干扰方法，从反面得到同样的结果如图15A所示，用RNA干扰后，PPO基因在2个卵巢癌细胞株中，该基因的表达量减少。蛋白印迹杂交显示磷酸化和增殖指标减少(如图15B、C、D所示)。将RNAi试剂注射于荷瘤鼠能够明显抑制癌细胞的生长(如图17所示)。重复试验表明，其结果相同。实验表明用单链RNA干扰剂，也可以达到部分抑制卵巢癌细胞生长的作用(如图17所示)。
RNA干扰(RNAi)细胞分析，方法
RNAi试剂购于Japan Bioservice(Asaka，Japan)序列如下正义RNA，5’-UAUGUUGGGAAGGUCAAGUdTdT-3’；反义RNA，5’-ACUUGACCUUCCCAACAUAdTdT-3’.
Lamin是控制基因，序列如下正义RNA，5’-CUGGACUUCCAGAAGAACAdTdT-3’；反义RNA，5’-UGUUCUUCUGGAAGUCCAGdTdT-3’.
RNA干扰方法按照厂商提供的方法，简而言之，等分子量的正义RNA和反义RNA经退火变性后形成双股RNA后转染OVK18，OVCAR-3和KIAA0090转染3T3细胞株，转染用oligofectamine试剂购于(Invitrogen，Carlsbad，CA)并按照厂家说明操作。培养72小时后回收细胞并进行蛋白印迹杂交和定量PCR检查。
从图15A、B、C、D可以看出，在细胞水平，用干扰RNA(RNAi)的方式，阻断该基因的表达，可以减少磷酸化和PCNA的表达。
RNA干扰(RNAi)活体分析卵巢癌细胞株OVCAR-3，裸鼠的每侧种植细胞5×106个，每3天测量肿瘤大小一次，第9天时，肿瘤大小为9mm3，然后，双侧注射RNA干扰剂，左侧为控制基因Lamin，右侧为PPO基因，量为3000pmol，然后每3天测量一次，第12天，重新双侧注射RNA干扰剂1000pmol，21天后处死老鼠，测量肿瘤的大小。
实验结果如图17；图18；图19所示。
图17A为RNAi试剂注射于荷瘤鼠及注射21天后的表现。
图17B两侧肿瘤的比较。
图17C生长曲线，绿色代表对照基因Lamin，左侧，红色代表PPO基因。
由图可以看出，将RNAi试剂注射于荷瘤鼠能够明显抑制癌症的生长。
图18为重复试验条件和结果与图17一样。
图19同图17C一样，均为生长曲线。
以上实验表明，用干扰RNA(RNAi)的方式，阻断该基因的表达，活体水平能够抑制癌细胞的生长。
表1.PPO基因的外显子和内含子exon size intron sequences exon sequences intron sequencesintron size1148gtggtcccgcggaggcggagCCCGCGGCGGAGTTTGATTGgtgcgtacgtgtggaacata 163842125ctgtactctttttttctcagGAGACAGCAAGGGGAGATCTgtgagtgaactgagaactgt 2890366 ctaactttcatgtctctcagTGTGGCGCCACACGGACAGGgtaagcagagtcctcccgtg 3242494 cacgatcttttcttttccagATGTGATCACACAGTGGCAGgtaggggagaaactggattt 411405129caacctgtacttgtgttcagTTTCCAGGCATCCCAGAAAGgtaaggctgcctgctcacag 512026127tttcttcttccctctcttagTGACAGCATCTGTTCAGCAGgtacaggagggtgacaggag 65967150taacgatgacttttctgtagGTTAGGGTTTCCCACTGCAGgtgagaggctgccactgctt 73118168tcctccttcttgccttccagTCTCTCGACTCTTCCCACAGgtaactgcaggcaacatggt 8515972 atgccttgcttttcccccagACTGCCCTAGGAATGAAGTGgtgagtattgagaacaacag 937310 63 tgtccttctctttctcatagCAGAAAAGTATAGTTCAAAGgtatggtgtggcactgggca 10 65511 123cgtgctgtctgtactcctagGACTCTCTGGGCCTGAGCGGgtaaggcagagcctttcttt 11 77812 97 gtcttgactgtggcttatagCTGTATATCCCAGCAGTTGGgtaagtagacctcattcaac 12 189213 120aaaaatgtttcctgtagcagGGAAGGTGGTAAAAAGGCAGgtatgaacctaagaggttgg 13 199414 200ttacttttcctttacaccagATGGCTTGCTCTCAGGCAAGgtgagtggggtttaagctcc 14 16215 150agtatttgtttatcttgcagCTTTTTGGCAGAAGGACAAGgtgaggcatccagctctgac 15 120116 162tgacagtttgctcattttagGAGTCGGGAATGAATACAAGgtactgtcttcagaggggat 16 29717 120ggctctctgggtttttcaagGTCACAGCTTGCTTCGAAAGgtaggaaggcatgtcctggc 17 339318 138cttttttgcccctgccctagGATCTCACCAGCTCTACAAGgtacatacagccagctgtct 18 374319 174ggttttctctctctctccagAGCCTGAACCGAACTGGGTGgtggtaagcggtcactacca 19 56120 211gccacctcctatccctgcagTACCAGTACTCACCTGCTGAgtgagtgactggggagcctc 20 177521 85 attcacttcctcctgtgtagTTGGACTACCAACAAAGCAGgtgagaccctcatgggcagt 21 106522 130tcccggctggtgttttgcagAGAGGAGAACCACTTGTTTGgtgagtagagcccacagctg 22 8623 1949 ttattccatctgccttccagGTTGTGGCCTCTCAAAGCAGgtgctttttttttttttgag 23 81524 908agcctgggcaacagagtgagACCCTGGCTCGTAATCCCAGctacttgggaggctgtgagg 24 91625 310aagcgaattctctgcctcagCCTCCCGAGTGGTAGACAACatcctgtgctctttcatttt
表2.PPO的同源基因speciesgenechromosomesize(aa) similarityregion ％human PPO 1p36 993mouse ha35234 9971-997 93.1DrosophiliaCG29433R915363-91544.4Anopheles agCP7856 shortgun 943378-94342.9gambiaCaenorhabditis CE27186 2 946378-94630.0elegansmelanogasteSaccharomyces Ycl045cp 3 700423-56530.9cerevisia
表3.同源基因中保守氨基酸Function domainSequenceLocation in KIAA0090Protein kinase C phosphorylation siteTEK 58-60TER 853-855TSR 858-860TKR 979-981Casein kinase II phosphorylation siteSREESLAE 443-450SSLD 824-827SAME 845-848SGLE 927-930cAMP-and cGMP-dependent protein KRSS 712-715kinase phosphorlation siteEFTVLELYEGTEQY804-817Tyrosine sulfation site VLKDDYDYVLISSV954-968
权利要求
1.一种人体基因，位于lp36.13区，其cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。
2.一种人体基因，位于lp36.13区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。.
3.包括权利要求1的cDNA的表达产物。
4.一种PPO基因检测用探针，其具有包含来自SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的序列。
5.PPO基因的医药用途，其特征在于以PPO基因为活性成份制备成癌症诊断剂或试剂盒。
6.PPO基因的医药学用途，其特征在于以权力要求1所述的被分离的DNA的表达产物的抗体为活性成分，与合适的药物载体制备成药学制剂或稀释剂。
7.PPO基因的医药用途，其特征在于以PPO基因的反义核苷酸转移载体或用其反义核苷酸转化/转染的细胞系作为活性成分以药物有效量与合适的药物载体或稀释剂制备成药物制剂。
全文摘要
本发明公开了一种癌症基因及其医药用涂。本发明人命名该基因为PPO基因，其cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。其DNA长度约36－kb，cDNA长度6022碱基。PPO的氨基酸序列具有编码SEQ ID NO.2所示的993个氨基酸残基的可读框的基因。该基因在人类多种癌组织中(卵巢癌，乳腺癌，胰腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，脑癌，胃癌，肝癌，子宫癌等)都有过表达。活性成份可制备成癌症诊断剂或试剂盒。其表达产物的抗体为活性以及其反义核苷酸转移载体或用其反义核苷酸转化/转染的细胞系作为活性成分可制备成药学制剂。
文档编号C07H21/04GK1704426SQ20041001230
公开日2005年12月7日 申请日期2004年5月26日 优先权日2004年5月26日
发明者刘思源, 张玉想 申请人:刘思源, 张玉想