一种水稻差异表达基因及其制备方法

专利名称：一种水稻差异表达基因及其制备方法
技术领域：
本发明属于分子生物学研究领域，具体地说，本发明涉及一种水稻胚胎中差异表达基因，同时还涉及水稻差异表达基因的制备方法。水稻差异表达基因OsEES在水稻原胚中的表达强于在水稻分化胚中的表达，这将加深了解水稻胚胎发生的分子机理，提高了水稻产量。
背景技术：
精子和卵细胞融合而形成合子是高等动植物新生活史的开端，在此之后，首先进行的就是胚胎发育(Laux T，Jurgens G.Embryogenesisa new start in life.PlantCell，2001，9989-1000.)。作为一种研究植物胚胎发生的分子机理的实验材料，水稻有很多优势。首先，它具有相对较小的基因组，同时它又有大量的分子标记与图位克隆的基因，并且用于水稻的农杆菌介导的有效的遗传转化方法已经建立(Tyagi A K，Mchanty A.Rice transformation for crop improvement and functionalgenomics.Plant Science，2000，1581-18.)。水稻是禾本科作物中公认的基因组最小的作物(430 MB＝4.3亿对核苷酸)。并且水稻序列草图已经完成(Indicaand Japonica)(Goff S A et al.，A draft sequence of the rice genome(Oryzasativ L.ssp.japonica).Science，2002，29692-100.，Yu J et al.，A draftsequence of the rice genome(Oryza sativa L.ssp.indica).Science，2002，29679-92.)。在国际上水稻已被公认为是禾本科作物遗传和发育研究的模式植物。它与其他禾谷科作物在基因组上具有基因位置的共线性(synteny)，在水稻中分离克隆到的任何基因，均将有助于在其他禾谷科作物中进行相应基因的克隆及功能研究。其次，微量细胞构建cDNA文库的方法的建立为开展这一研究奠定了技术基础。首次成功的实验材料是玉米。在Kranz实验室，应用逆转录酶聚合酶链式反应(RT/PCP)技术，由128个分离的卵细胞与104个离体受精后18小时的人工合子构建了cDNA文库，并通过差异筛选从后者分离出若干在卵细胞能够特异表达或由受精诱导表达的基因。从人工合子文库中分离出编码钙网蛋白的克隆(该蛋白主要存在于细胞内质网及某些细胞的核或质中，与细胞分裂有密切联系)，测序分析表明它和常规的钙网蛋白基因DNA序列一致。从而证明，所构建cDNA文库是合格的(Dresselhaus T，Hagel C，Lorz H，Kranz E.Isolation of a full-size cDNAencoding calreitulin from a PCR-library of invitro zygotes of maize.PlantMolecular Biology，1996，3123-34.)。另外在Dumas实验室中，由100个玉米过渡期幼胚构建了cDNA文库，从中克隆了在胚胎发生过程中表达的钙调素基(Breton C，Chaboud A，Matthys-Rochon E，Bates E E M，Cock J M，Fromm H，Dumas C.PCR generated cDNA library of transition stage maize embryoscloning and expression of calmodulin genes during early embryogenesis.Plant Molecular Biology，1995，27105-113.)。李师弢等也在烟草中，由200个球形胚与150个心型胚分别构建了cDNA文库，通过差异筛选初步找到了一个在心型胚中优势表达的cDNA克隆THE3(Li S T，Lu Y T，Yang H Y.Isolation of agene preferentially expressed in heart-shaped e mbryos of tobacco(Nicotiana tabacum).Sexual Plant Reproduction，2001，14173-175.)。
到现在已经相继克隆到一些植物中与胚胎发育有关的基因，但数目并不多。这些基因根据它们的功能大致分为两类。第一类对发育模式的建成起到重要作用，但并非在胚胎中特异表达。例如EMB30/GNOM(Mayer U，Buttner G，JurgenG.Apical-basal pattern formation in the Arabidopsis embryostudys on therole of the gnom gene.Development，1993，117149-162.，Shevell，D.E.et al.，EMB30 is essential for normal cell division，cell expression，and celladhesion in Arabidopsis and encodes a protein that has simi larity to Sec7.Cell，1994，771052-1062)，以及在胚胎早期发生，在将来形成茎尖分生组织的地方特异表达的OSH1，OSH15基因(Sato Y，Hong S K，Tagiri A，Kitano H，Yamamoto N，Nagato Y，Matsuoka M.A rice homeobox gene，OSH1，is expressedbefore organ differentiation in a specific region during earlyembryogenesis.Proceedings of the National Academy of Sciences USA，1996，98117-8122.，Sato Y，Sentoku N，Nagato Y，Matsuoka M.Isolation andcharacterization of a rice homeobox gene，OSH15.Plant Molecular Biology，1998，38983-998.)；参与胚胎原表皮与辐射状模式形成的位置依赖性表达基因-Roc1(Ito M，Sentoku N，Nishimura A，Hong S K，Sato Y，Matsuoka M.Positiondependent expression of GL2-type homeobox gene，Roc1significance forprotoderm differentiation and radial pattern formation in early riceembryogenesis.The Plant Journal，2002，29497-507.)；具有KNl-like的同源区域的HOS3，HOS9，HOS13，HOS166基因(Chen P W，Fang L W，Tsay H S，WuH K，Chen L J.Isolation of cDNA clone for genes that are specificallyexpressed in the rice embryo.Bol Bull Acad Sin，1997，3813-20.)。第二类参与基本的细胞功能，定位于大部分的组织。例如CaM(Breton C，Chaboud A，Matthys-Rochon E，Bates E E M，Cock J M，Fromm H，Dumas C.PCR generatedcDNA library of transition stage maize embryoscloning and expression ofcalmodul in genes during early embryogenesis.Plant Molecular Biology，1995，27105-113.)，以及calreticulin(Dresselhaus T，Hagel C，Lorz H，KranzE.Isolation of a full-size cDNA encoding calreitulin from a PCR-libraryof invitro zygotes of maize.Plant Molecular Biology，1996，3123-34.)等。现在表达的基因，都难以提高水稻的产量。

发明内容
本发明的目的在于提供在一种水稻差异表达的基因。该基因在水稻原胚中的表达强于在水稻分化胚中的表达，这将这将加深了解水稻胚胎发生的分子机理，提高了水稻产量。
本发明的另一个目的是提供一种制备水稻差异表达基因的方法。该方法简便，操作方便，使用RT-PCR技术成功构建cDNA文库，使得用微量材料构建文库，同时OsEES基因的首次分离鉴定也为研究胚胎发育的特异调控基因奠定了基础，有利于对水稻胚胎发生分子机理的研究，同时也在提高水稻产量中起到重要作用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施由细胞组织结构均一的原胚向细胞组织开始分工形成原始器官的分化胚胎过渡，必定有一系列特异表达基因的调控。对这些调控胚胎分化的基因的结构与功能的研究是了解胚胎分化机制的关键，也是了解植物有性生殖机制的途径。另外，从发育的角度看，胚胎发生能够启动个体发育的起始程序，是一系列后续发育程序的起点，如能掌握决定这一起始程序的基因，便会找到最终控制植物个体发育起点的入门钥匙。水稻差异表达基因OsEES在水稻原胚中的表达强于在水稻分化胚中的表达，这将加深了解水稻胚胎发生的分子机理，为提高水稻产量奠定基础。
在本发明中公开了一种水稻差异表达的基因，该基因从水稻胚胎中分离并克隆得到，其特征是，该基因具有SEQ ID NO.1所示的核酸序列。该基因在水稻早期胚胎发生中差异表达，此基因从水稻中分离将加深人们对水稻胚胎发生的分子机理的了解，同时，作为人类主要依靠的粮食作物，对水稻胚胎的研究将在提高水稻产量具有重要意义。
在本发明中，为了达到上述目的，本发明采用下列步骤A.取水稻开花后2天和5天两个时期的水稻子房置于用焦碳酸二乙酯处理过的蒸馏水(按照千分之一的比例在蒸馏水中加入焦碳酸二乙酯，混合均匀，37℃放置12小时后，高温高压灭菌处理)的载玻片上，通过显微操作分离得到大量这两个时期的水稻胚胎；B.直接提取水稻开花后2天和5天这两个时期的水稻胚胎的mRNA，以5’-ggaag aatgc ggccg ctttt ttttt ttttt ttt-3’为引物(引物1)，通过RT-PCR合成cDNA；再以5’-gga aga atg cgg ccg ctt tt-3’(引物2)，5’-ggccacgcgt cgact agtac gggii gggii gggii g-3’(引物3)和5’-gga aga atg cggccg ctt tt-3’(引物4)，5’-ggc cac gcg tcg act agt ac-3’(引物5)为引物，经过两轮PCR扩增，得到双链cDNA；纯化的扩增产物用NoTI和SalI限制性内切酶双酶切后与λZIPLOXTMNoTI-SalI Arms连接后，包装，再转染大肠杆菌Y1090(从Gibco，BRL公司购买，产品货号15394-018)，回收噬菌体；C.将回收的噬菌体再感染大肠杆菌DH10B(从Gibco，BRL公司购买，产品货号15394-018)，进行文库的亚克隆，将噬菌体文库转为质粒文库，挑取cDNA文库的单菌落提取文库质粒，用NotI和SalI双酶切质粒DNA，用1％琼脂凝胶电泳，检测cDNA插入片段的大小；D.96孔板大通量提取水稻胚胎cDNA文库的质粒DNA，点高密度膜，进行膜杂交，进行文库筛选，得到OsEES基因的3’端；E.筛选得到的差异表达基因进行测序，并且通过网络查找基因全长；F.用5’-atggccaccatgccgctaaccttctc-3’(引物6)和5’-tcaatcacacaagcagcagtacag-3’(引物7)为引物，用文库双链cDNA做模板扩增得到OsEES基因全序列，并将用PCR获得的全长的OsEES基因克隆到pBS-T载体中，命名为pOsEES，其插入片段经DNA测序鉴定；G.固定开花后两个时期的水稻子房进行差异表达基因的原位杂交。
在本发明中，OsEES基因序列如SEQ ID NO.1所示。该基因使用两种引物5’-atggccaccatgccgctaaccttctc-3’(引物6)和5’-tcaatcacacaagcagcagtacag-3’(引物7)，以文库cDNA为模板，通过PCR方式合成并获得全长的水稻OsEES基因。并将用PCR获得的全长的OsEES基因克隆到pBS-T载体中，命名为pOsEES，其插入片段经DNA测序鉴定。pOsEES含有编码OsEES全长346氨基酸的序列。然后分别以pBS-T载体上得T3，T7 RNA聚合酶合成用于RNA原位杂交的反义链和有义链探针，进行原位杂交验证工作。在本发明的一个具体实施例中，原位杂交结果显示从水稻胚胎cDNA文库中筛选得到的差异表达基因OsEES在水稻原胚中的表达强于在水稻分化胚中的表达。
本发明与现有技术相比具有以下优点使用RT-PCR技术成功构建cDNA文库，使得用微量材料构建文库成为可能，同时OsEES基因的首次分离鉴定也为研究胚胎发育的特异调控基因奠定了基础，有利于对水稻胚胎发生分子机理的研究，同时也在提高水稻产量及提高水稻种质中起到重要作用。通过构建水稻胚胎cDNA文库，进行差异筛选，得到了一个差异表达基因(OsEES)，OsEES基因的测序结果显示OsEES基因具有一个预测的典型的亚精氨合成酶结构域，编码一个大小约38KDa(pI6.5)的蛋白，它很可能在水稻胚胎发生，甚至种子发育过程中起到一定的调控作用。亚精氨合成酶(Spermidine synthase，SPDS)是一个在多胺合成中的关键酶，而以前的研究工作并没有意识到它们在植物胚胎发生方面所起到的重要作用。在以前的研究工作中，由于没有好的胚胎文库，这主要是因为取得足够多的水稻早期胚胎材料是非常有难度的事情，而试验正是弥补了这方面的不足。另外由于采取不同的筛选方法也会得到不同的结果，申请人通过自己筛选方法的建立，首次得到这个在水稻早期胚胎发生中差异表达的基因。此基因的发现利于研究水稻胚胎发生的分子机理，同时，作为人类主要依靠的粮食作物，对水稻胚胎的研究也将在提高水稻产量中起到重要作用。


图1 水稻胚胎文库构建流程2 水稻胚胎文库插入片段分析图1-5分别显示文库质粒用NoTI和SalI限制性内切酶双酶切，显示不同大小的插入片段图3 水稻胚胎文库杂交筛选图A.48-50 HAF水稻原胚文库，B.120-122 HAF水稻分化胚文库。同样的数字表示同样的克隆，结果显示3号克隆48-50 HAF水稻原胚文库中的杂交信号明显强于120-122 HAF水稻分化胚文库中的杂交信号，而其它三个克隆的杂交信号强度几乎没有变化。
图4 pBS-T载体示意5 mRNA原位杂交图A.48-50 HAF水稻原胚，×105；B.120-122 HAF水稻分化胚，×105；结果显示差异表达基因OsEES在水稻原胚(48-50 HAF水稻原胚)中的表达强于在水稻分化胚(120-122 HAF水稻分化胚)中的表达。
具体实施例方式
下面结合具体实施例。进一步阐述本发明。
实施例1水稻胚胎cDNA文库的构建(见图1)1.水稻胚的分离(1)取严格标记的水稻开花后48-50小时和120-122小时的水稻子房置于有焦碳酸二乙酯处理过的蒸馏水(DEPC-H2O)的载玻片上。
(2)在体视镜下剖开时间严格标记的子房和胚珠，分离胚。
(3)用毛细管将胚吸至有CPW(10mmol/L CaCl2·2H2O，0.7mmol/LKH2PO4，1.6mmol/LMgSO4，0.5mmol/L甘露醇，pH5.8)的离心管中。
(4)离心轻轻吸去上清，液氮中储存。将胚胎在DEPC-H2O中储存6小时以后，用荧光素二醋酸(FDA)检测活性，显微镜检测到较强的荧光，说明胚保持活性，可以作为构建cDNA文库的材料。
2.cDNA文库的构建(见图1)
使用QIAGEN公司的试剂盒OligotexTM Direct mRNA Kit，直接提取mRNA。使用5’RACE System Kit(Gibco BRL)(含有SUPERSCRIPTTMII ReverseTranscriptase and oligo dC-tailed at the 3’termini with terminaldeoxynucleotidyl transferase(TdT))以及非选择性的引物5’-GGAAG AATGCGGCCG CTTTT TTTTT TTTTT TTT-3’(引物1)将mRNA分别进行第一链的合成，然后使用套组引物5’-GGA AGA ATG CGG CCG CTT TT-3’(引物2)，5’-GGCCA CGCGTCGACT AGTAC GGGII GGGII GGGII G-3’(引物3)以及5’-GGA AGA ATG CGG CCGCTT TT-3(引物4)’，5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3’(引物5)分别进行第一轮和第二轮cDNA的扩增。扩增产物经纯化后，用NoTI和SalI限制性内切酶(B.M.公司)双酶切后与λZIPLOXTMNoTI-SalI Arms(Gibco公司)连接。连接产物用GigapackIII GOLD(Stratagene)包装，再转染大肠杆菌(E.coli)Y1090(ZL)用SM缓冲液(NaCl 5.8g/L.MgSO47H2O 2g/L.Tris 50mmol/L，pH7.5)回收噬菌体。取一部分回收的噬菌体加入3％氯仿，置于4℃备用，另一部分加入3％氯仿和7％二甲基亚砜(DMSO)于-80℃保存。取10ul噬菌体液，用E.coliDH10B进行亚克隆。按以上步骤将整个包装反应物转染，并回收整个噬菌体。
然后进行cDNA文库插入片段的分析取DH10B菌液在含100ug氨苄抗生素的LB平板上划线，37℃培养过夜。随机挑取单菌落用5mlLB培养基培养过夜。按小量碱裂解法制备质粒DNA。用NotI和SalI双酶切质粒DNA用1％琼脂凝胶电泳，分析cDNA插入片段的大小。电泳分析结果见图2。
实施例2水稻胚胎cDNA文库的筛选1.96孔板大通量提取质粒DNA(1)在96孔深孔板(2.2ml)中加入1.2-1.5ml含有适当浓度抗生素的LB液体培养基。摇菌20-24小时(250rpm)(2)离心4000rpm，5分钟(3)用排枪加入40ul溶液1(50mom Tris-HCl，pH 8.0；10mom EDTA，pH 8.0)，在每孔中加入一无菌牙签，在振荡器上振20-30秒至沉淀完全溶解。
(4)然后加入新鲜配制的溶液280ul(1％SDS，0.2N NaOH)，室温放置5分钟
(5)最后加入溶液3(3M乙酸钾，11.5％乙酸)60ul，手动振摇数次，冰上放置5-10分钟。
(6)4℃，4000rpm，离心30分钟(7)将上清吸入另96孔薄板中，加入90ul异丙醇，充分混匀。
(8)4000rpm离心30分钟(9)弃上清，加入100ul 70％乙醇，离心10分钟(10)弃乙醇，晾干沉淀，加入50ul RNase A的水(1ml水中加3ul10mg/ml的RNA酶)溶解(11)每一板随机挑取4-5孔进行电泳检测后，存于-80℃冰箱保存。
2.点高密度膜3.探针标记计算探针混合液中各成分的体积DNA100ngDNTPs(dATP，dGTP) 2.0μl随机引物 2.0μlklenow Fragment(IU/μl)1.0μlα-dCTP* 1.0μl加水至 17.0μl取适量待标记的探针DNA，加水至规定体积，于100℃变性10分钟，冰浴5分钟。预先配制dNTP、引物和klenow酶混合液，分装到各装有探针DNA的Eppendorf管。最后往各管中加入适量体积的α-32P-dCTP，用枪头搅匀，25℃温浴2-10小时。
4.膜杂交将新杂交膜用2×SSC打湿，装入杂交炉中。加入适量体积(10-20ml)预热至65℃的预杂交液，于65℃预杂交2-8小时。取出标记好的探针，加入500μl杂交液，于100℃变性5分钟，冰浴5分钟。将已变性的探针加入杂交炉中，置于65℃恒温杂交8-10小时。
5.洗膜、压片杂交完成后，用含2×SSC，0.2％SDS的洗液在室温下冷漂洗一次，再用预热至65℃的洗液(1×SSC或0.5×SSC，0.1％SDS)于65℃热洗两次，各15分钟。晾半干，迅速用保鲜膜包裹，放入暗夹。在暗室里装入X-光片，把暗夹放在-80℃冰箱中放射自显影4-7天，冲洗X-光片。
杂交及膜胶片结果见图3。
实施例3mRNA原位杂交植物材料的切片和RNA原位杂交过程中要尽量避免RNase的污染，耐高温器皿180℃烘烤8小时以上，其它器皿用氯仿冲洗，溶液用0.1％焦碳酸二乙脂(DEPC)处理或DEPC-H2O(DEPC处理过的蒸馏水)配制，DEPC是一种RNase强烈抑制剂。
1.植物材料所采用的植物材料为水稻(Oryza sativa L.)品种中花11(由湖北农科院提供，可索取获得)。种植于温室中，待开花后，分别取开花后48-50小时和120-122小时的发育阶段的子房(经严格的时间标记)用于固定。
2.植物组织切片载玻片在洗液中浸泡过夜，充分清洗后，180℃烘烤8-16小时；将载玻片在含有100μg/ml多聚赖氨酸的10mM/L Tris-HCl(pH 8.0)中室温浸泡30分钟，并于室温晾干；将石蜡包埋的植物材料用切片机切成8-10μm的蜡带，用DEPC-H2O在45℃展片，粘片；42℃烘烤过夜。以上整个程序要避免RNase的污染。
3.质粒DNA的提取水稻的OsEES基因的cDNA构建于质粒T-vector(pBluescript II SK(-))，此质粒具有Ampicillin(Amp)抗性，T3和T7启动子分别位于其多克隆位点的两侧(质粒图谱见图1)。用碱裂解法对这个质粒进行提取。
质粒提取步聚如下(1)前一天挑取分别含有上述两种质粒的单菌落接于5ml液体LB(1％蛋白胨，0.5％酵母抽提物和1％的NaCl，pH 7.4)中，摇床上摇动16小时以后室温8000×g离心1分钟收集菌体，(2)加入200μl的溶液I(50mM葡萄糖，10mM EDTA，25mM Tris-HCl，pH 8.0)，振荡重悬；(3)加入新鲜配制的400μl的溶液II(0.2 M NaOH，1％SDS)振荡5秒，放冰上5分钟；(4)加入300μl的溶液III(5 M KAc，pH 4.8)，振荡混匀至沉淀变白，置冰上10分钟；(5)室温12000×g离心10分钟，取上清转入新的EP管中；(6)加入2/3体积的异丙醇，混匀，12000×g离心10分钟，弃上清；(7)用70％乙醇洗涤沉淀2次；(8)真空干燥后重溶于100μl无菌水中，加入适量的RNase A于37℃消化30-80分钟。可电泳检查消化是否完全及所提质粒的浓度；(9)加入等体积的酚氯仿(1∶1)混匀后于12000×g离心5分钟，小心取上清入另一个EP管中。如果所提质粒中蛋白质杂质较多，可重复1-2次；(10)加入2×体积的无水乙醇及1/10体积的3M(pH 5.2)的NaAc，混匀后于12000×g离心10分钟；(11)70％乙醇洗沉淀2次；(12)真空干燥后，溶于适量的无菌水或pH8.0的TE(1.0mM EDTA，10mM Tris-HCl，pH 8.0)中。
4.质粒DNA的线性化80μl的酶切反应溶液包括10μg质粒DNA，8μl的10×消化酶缓冲液，20U的Kpn I(用于有义RNA的转录)或EcoRI(用于反义RNA的转录)，37℃水浴2小时；消化液用酚∶氯仿(1∶1)、氯仿各抽提一次，每次12000×g在4℃离心5分钟；取上清液用1/10体积的3M乙酸钠(pH 5.2)和2×体积的乙醇沉淀过夜；4℃条件下12000×g离心20分钟；沉淀用70％乙醇洗涤一次，真空干燥；将线性化的质粒DNA按1μg/μl重悬于DEPC-H2O中，-20℃保存，并取少量点样检测线性化纯度。
5.地高辛标记的体外转录在冰上配制20μl体外转录反应液1μg线性化质粒，2μl NTP标记混合液(ATP，GTP，CTP，DIG-UTP)，2μl 10×RNA多聚酶缓冲液，20U RNase抑制剂，适量的DEPC-H2O和40 U的T3(反义RNA)或T7(有义RNA)RNA多聚酶，充分混匀和点离心后在37℃水浴2小时；加入2μl 0.2 M EDTA终止反应；再加入2.5μl 4M的LiCl和75μl冰冷的无水乙醇，沉淀过夜；4℃条件下12000×g离心15分钟；沉淀用冰冷70％乙醇洗涤一次，真空干燥；用适量的DEPC-H2O溶解沉淀，并加入20 U的RNase抑制剂，-20℃保存。
6.预杂交将干燥的石蜡切片在二甲苯中脱蜡30分钟；然后依次放入二甲苯∶乙醇(1∶1)、100％、95％、70％、30％乙醇和DEPC-H2O中复水，每级2分钟；0.2 M HCl中浸20分钟；在2×SSPE(0.3M NaCl，0.02M NaH2PO4，2mM EDTA-Na2)和DEPC-H2O中各洗2×5分钟；在含有1％牛血清白蛋白(BSA)的10mM的Tris-HCl(pH 8.0)中浸10分钟；DEPC-H2O中各洗2×5分钟；依次在30％、70％、95％和100％乙醇中系列脱水，每次2分钟，室温干燥。
7.杂交杂交混合液中包含50％的去离子甲酰胺，10％的硫酸葡聚糖，0.3M NaCl，0.01M Tris-HCl和NaH2PO4(pH 6.8)，5mM EDTA，2.2 nM二硫苏糖醇(DTT)，0.6μg/μl酵母tRNA，0.5μg/μl酵母RNA和约500ng的变性的DIG标记的RNA探针。每张玻片加100μl的杂交混合液，55℃杂交过夜。
8.杂交后检测让盖玻片在2×SSC中自由滑落，并浸洗15分钟，依次在2×SSC、1×SSC和0.5×SSC中浸洗15分钟；玻片在缓冲液I(100mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5)中浸泡5分钟；每片滴加含2％正常兔血清，0.3％Triton X-100的缓冲液I约500μl，室温下封阻30分钟；将anti-DIG-AP按1∶500的比例用含1％正常兔血清，0.15％Triton X-100的缓冲液I进行稀释；去掉封阻液，每片滴加稀释好的anti-DIG-AP 200μl，在保温皿中室温下反应2小时；玻片在缓冲液I中浸泡二次，每次15分钟；玻片在缓冲液II(100mM Tris-HCl，100mM NaCl，50mMMgCl2，pH 9.5)中浸泡5分钟；将10％的聚乙烯醇(PVA)90℃溶于100mM Tris-HCl(pH 9.5)，100mM NaCl溶液中，待冷却至室温后每1ml加入50μl 1M MgCl2，适量的NBT和BCIP混合液，从而配制成显色反应液；每片加500μl显色液，置湿盒中室温黑暗处显色6-12小时。
9.封片观察用缓冲液III(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)浸2次，各5分钟以停止反应；依次在30％、70％、95％、100％乙醇、100％二甲苯∶100％乙醇(1∶1)、100％二甲苯系列脱水透明，用中性树胶封片；在奥林巴斯BX60显微镜下镜检观察，用柯达100ASA彩色胶卷照相。
结果见图4。
实施例4OsEES基因全长的获得及构建1.用PCR扩增OsEES基因全长PCR程序为模板DNA 1ul缓冲液(含MgCl2) 10ul引物6 1ul引物7 1uldNTP2ulTaq酶 1ul水 84反应的时间和温度作如下94℃53分钟94℃1分钟，55℃50秒，72℃1分30秒，30cycles72℃10分钟2.PCR产物连接pBS-T载体，pBS-T载体示意图见图5配方为PCR产物5ulpBS-T 1ulT4DNA连接酶1ul连接酶缓冲液 1ul水 2ul16℃，16个小时连接3.DH5a菌感受态的制备将DH5a菌划LB平板，37℃培养20小时，挑取单菌落接种到100ml LB液体培养基中，250rpm悬浮培养约3-4小时，然后在超净台上将菌液转入灭过菌的50ml离心管中，4℃，8000rpm，离心8分钟，弃上清，用100mM NaCl(4℃预冷)重悬农杆菌，4℃，8000rpm，离心8分钟，弃上清，加入原始菌液1/50体积(800μl)的20mMCaCl2重悬菌体，并分装成100μl/管。(此时的感受态农杆菌可以直接用于转化)，或置液氮中10秒钟，放入-20℃或-80℃冰厢中保存备用。
4.DH5a的转化将感受态DH5a菌置于冰上，加入以上连接产物(体积不宜超过10μl)，充分混匀，置冰上30分钟，然后转入42℃水浴1分钟热激，加入1ml LB液体培养基于37℃，230rpm培养1小时，并涂布到含有适当抗生素的LB平板上，吹干，37℃培养18小时，挑取单菌落接种到液体LB培养基中，37℃，250rpm培养18小时，菌液用于保存或转化。
实施例5含有OsEES基因的植株的转化与筛选1.农杆菌感受态的制备将农杆菌EHA105划YM平板，26-28℃培养48小时，挑取单菌落接种到40mlYM液体培养基中，250rpm悬浮培养约12-16小时，然后在超净台上将菌液转入灭过菌的50ml离心管中，4℃，8000rpm，离心8分钟，弃上清，用100mMNaCl(4℃预冷)重悬农杆菌，4℃，8000rpm，离心8分钟，弃上清，加入原始菌液1/50体积(800μl)的20mM CaCl2重悬菌体，并分装成100μl/管。(此时的感受态农杆菌可以直接用于转化)，或置液氮中10秒钟，放入-20℃或-80℃冰厢中保存备用。
2.农杆菌的转化将感受态农杆菌置于冰上，加入1μg质粒DNA(体积不宜超过10μl)，充分混匀，置冰上30分钟，置液氮中1分钟(时间不能过长)，然后迅速转入37℃水浴中，待其融化后加入1ml YM液体培养基于28℃，230rpm培养2-4小时，3000rpm离心2分钟，将上清吸去500μl，留500μl于管中，振荡重悬菌体，并涂布到含有适当抗生素的YM平板上，吹干，28℃培养48小时，挑取单菌落接种到液体YM培养基中，28℃，250rpm培养48小时，菌液用于保存或转化。
3.水稻的农杆菌转化将成熟的水稻种子去壳，所用品系为粳稻品种中花11(由湖北农科院提供，为常规材料，可索取获得)。在超净台上将去壳的种子在70％乙醇中消毒1分钟后灭菌水清洗种子三次；再用0.15％氯化汞消毒种子20分钟，灭菌水清洗种子三次，将种子接种在2N6培养基中，于26℃黑暗培养大约五周。将由盾片诱导的愈伤转入新的2N6培养基，26℃黑暗培养大约三周。将愈伤转入预培养培养基中26℃黑暗预培养4天。在预培养的第三天，将含有表达载体的农杆菌EHA105接种于YM/kan液体培养基中26℃ 250rpm悬浮培养两天。也可接种到相应的平板上培养两天，收集农杆菌重悬于悬浮介质中并悬浮培养1小时后，将细菌悬液的浓度调到OD600值为1.0，将预培养的水稻愈伤组织转入其中浸泡30分钟，并不时轻轻晃动容器，将愈伤组织转入灭过菌的滤纸上，吸干菌液。将愈伤组织转入共培养培养基上于19-20℃黑暗培养3天后将愈伤组织转入灭菌水中洗3次再用400ppm的羧苄青霉素溶液浸泡愈伤组织20分钟，转入灭菌的滤纸上吸去剩余的水分，将愈伤转入选择培养基26℃黑暗培养两周，转入新的选择培养基再培养两周，将抗性愈伤转入预分化培养基中26℃黑暗培养一周后，转入分化培养基中于4000Lux下，26℃培养至诱导的绿芽3-4cm，转入生根培养基中生根，长出根系后，将再生植株转入培养钵中荫处培养4-5天，最后转入大田中培养至成熟。
实施例6含有OsEES基因转化植株的核酸分析1.用于PCR的转化植株总DNA的提取根据图3所示，70％乙醇擦洗叶片，称取100mg，加入600μl抽提缓冲液(0.2MNaCl，25mM EDTA，0.5％SDS，pH7.5)，室温快速研磨，在1.5ml Eppendorf管中涡旋混匀5-20秒于室温，12000rpm，离心25分钟。取上清加等体积异丙醇，上下颠倒混匀。-20℃沉淀过夜，室温条件下，12000rpm，15分钟。弃上清，倒置于吸水纸上待壁上液体流尽后加入200μl 70％的乙醇泡洗DNA沉淀，室温，12000rpm，10分钟。弃乙醇，倒置于纸巾上待其干燥后加100μl TE(pH 7.5)溶解沉淀。分光光度计测定或电泳估测DNA浓度，最后以总DNA为模板，进行PCR反应和电泳检测。
2.PCR程序PCR反应混合液的配比同质粒PCR鉴定，反应的时间和温度作如下94℃53分钟94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分30秒，30cycles72℃10分钟实施例7含有OsEES基因转化植株的核酸分析Southern杂交1.DNA抽提(CTAB法)根据图4所示，称取水稻样本新鲜叶片约5克，剪碎放入预冷的研钵中，用液氮磨成粉末。转移粉末到预冷的玻璃瓶中，暂存于-20℃冰箱(不超过24小时)加入适量预热至100℃的1.5×CTAB抽提液，迅速搅匀后置于56℃水浴中温浴20分钟，取出玻璃瓶，冷却至室温(切忌低于15℃，以免CTAB发生沉淀)，将瓶中混合液倒入一支50ml离心管中，加入一倍体积氯仿/异戊醇(24∶1)。反复颠倒充分混匀，室温(20-25℃)下4000rpm离心20分钟。将上层液移入一新的50ml离心管，加入1/10体积的10％CTAB(预热至56℃)及等体积的氯仿/异戊醇，充分混匀，4000rpm室温离心20分钟。吸取上清液至另一新的50ml离心管中，加入等量的1％CTAB沉淀液，轻轻摇晃直至形成DNA絮状沉淀。3000rpm离心10分钟，使DNA沉淀于管底。加入5ml 1M NaCl及5ul RNaseA，置于56℃水浴中过夜。待DNA完全溶解后，加10ml 95％冰乙醇使DNA沉淀。挑出DNA用76％乙醇洗30分钟，再用95％乙醇浸泡5分钟。将风干的DNA溶于适量TE溶液中，存于4℃备用。2.DNA的限制性消化，电泳与Southern转移电泳检测总DNA质量。调节所有样品DNA浓度至200-400ng/ul(最好是250-300ng/ul)每样品取2.5-3ug总DNA，用限制性内切酶进行消化，反应体积为15ul。置于37℃恒温箱中6小时后，加入1.5ul溴酚蓝终止酶切反应，取2ul用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测酶切质量。酶切反应液配方如下DNA2.5ug10*buffer 1.5ulEnzyme 5u加水至15ul通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，电泳缓冲液为1×TAE，电压40V，过夜。将凝胶切成19.5×9.5cm大小，右下方切角作标记，放在0.2N HCl中变性8分钟，用双蒸水漂洗，迅速用0.4N NaOH溶液作为转移液通过毛细作用原理使胶上DNA片段转移到Hybond-N+尼龙膜上。转移24小时后取出膜，用2×SSC漂洗两次(各5分钟)，晾干放入100-120℃真空烘箱中烘烤3小时，使DNA固定于膜上。
3.探针标记计算探针混合液中各成分的体积DNA100ngDNTPs(dATP，dGTP) 2.0μl
随机引物2.0μlklenow Fragment(IU/μl) 1.0μlα-dCTP*1.0μl加水至 17.0μl取适量待标记的探针DNA，加水至规定体积，于100℃变性10分钟，冰浴5分钟。预先配制dNTP、引物和klenow酶混合液，分装到各装有探针DNA的Eppendorf管。最后往各管中加入适量体积的α-32P-dCTP，用枪头搅匀，25℃温浴2-16小时。
4.Southern杂交将新杂交膜用2×SSC打湿，装入杂交炉中。加入适量体积(10-20ml)预热至65℃的预杂交液，于65℃预杂交2-16小时。取出标记好的探针，加入500μl杂交液，于100℃变性5分钟，冰浴5分钟。将已变性的探针加入杂交炉中，置于65℃恒温杂交8-10小时。
5.洗膜、压片杂交完成后，用含2×SSC，0.2％SDS的洗液在室温下冷漂洗一次，再用预热至65℃的洗液(1×SSC或0.5×SSC，0.1％SDS)于65℃热洗两次，各15分钟。晾半干，迅速用保鲜膜包裹，放入暗夹。在暗室里装入X-光片，把暗夹放在-80℃冰箱中放射自显影4-7天，冲洗X-光片。
实施例8含有OsEES基因转基因水稻与野生水稻的性状对比经筛选的抗性植株的水稻和同时种植的对照植株均种植于武汉大学室外温室，于正常季节栽培，同样的管理条件，进行千粒重等数值的严格记录。结果应该显示植株的千粒重增加，即亩产增加15-20％。统计结果见下表

SEQUENCE LISTING<110>武汉大学<120>一种水稻差异表达基因及其制备方法<130>一种水稻差异表达基因及其制备方法<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1041<212>DNA<213>水稻<400>1atggccacca tgccgctaac cttctccccg cctcgcctcc tccaccgcca ccgccgccgc60gaagccaagc cccaacgccg ctccgccacc cgagtctccc tcctccctcg acggggagcg120gcctcggcgc ggcggccgct gtactgcgcc cccggtggcg gcggcgaagt ctccgcccct180ccagccaccg agcagcagga gcaagcggcg aaggaggagg aggaggagta cacgctcctc240gccatcaccg gtagcgactt caacgaggtc atcatgatca tcgactcgcc cgccacccgc300tacctcctcc tcgacaccaa ccggaatgtt cacagcgttc tccccaagac cggagtctgg360accaactcat attgggatga gttcgtgagc ctaccagctg ttgttccacg tggtcctgtt420gctcttctag gattgggtgc tgggactgca gcacatctga tgctaaaatt ttatccttgg480ttgcaacttg ttggatggga gattgatcct aagataattg aactgtcaag ggattatttt540ggtttatctg atttagaaaa ggcaacagaa tcaggtggtt cactttctgt gcgcattggt600gatgcacttt ctccgtcagc tacaattgaa ggagggtttg ctggtattgt tgttgatttg660tttgctgatg ggaagatcat acctcagcta caagaagttg aaacctggtt ggaaatcgcg720aaaaagctaa tgccagatgg acggatcatt gttaactgtg gtggagctga tgctgctgta780tctcttgcta atgatacggg cctttcgtcc tgggttcaga attccacaat taaggcactc840tgtgctgcat ttccggggca ggcatatgcc tctgatgcaa cactgaaatg ttcaaggaat900agaagtgcaa gctgtccagt agctttcact gacaaatact gttcgttagt agctttcact960gatagatgca tggatggtac ttcccccttc atgagggctc tgaagaaagc aaccatgctg1020tactgctgct tgtgtgattg a 104权利要求
1.一种水稻差异表达基因，其具有与SEQ ID NO.1所示的核酸序列。
2.一种制备权利要求1所述的水稻差异表达基因的方法，该方法包括下列步骤A.取水稻开花后2天和5天这两个时期的水稻子房置于用焦碳酸二乙酯处理过的蒸馏水的载玻片上，通过显微操作分离得到这两个时期的水稻胚胎；B.直接提取水稻开花后2天和5天这两个时期水稻胚胎的mRNA，以5’-ggaag aatgc ggccg ctttt ttttt ttttt ttt-3’为引物，通过RT-PCR合成cDNA；再以5’-gga aga atg cgg ccg ctt tt-3’、5’-ggcca cgcgt cgactagtac gggii gggii gggii g-3’和5’-gga aga atg cgg ccg ctt tt-3’及5’-ggccac gcg tcg act agt ac-3’为引物，经过两轮PCR扩增，得到双链cDNA；纯化的扩增产物用NoTI和SalI限制性内切酶双酶切后与λ ZIPLOXTMNoTI-SalIArms连接后，包装，再转染大肠杆菌Y1090，回收噬菌体；C.将回收的噬菌体再感染大肠杆菌DH10B，进行文库的亚克隆，将噬菌体文库转为质粒文库，挑取cDNA文库的单菌落提取文库质粒，用NotI和SalI双酶切质粒DNA，用1％琼脂凝胶电泳，检测cDNA插入片段；D.96孔板提取水稻胚胎cDNA文库的质粒DNA，点高密度膜，进行膜杂交，进行文库筛选，得到OsEES基因的3’端；E.筛选得到的差异表达基因进行测序，并且通过网络查找基因全长；F.用5’-atggccaccatgccgctaaccttctc-3’和5’-tcaatcacacaagcagcagtacag-3’为引物，用文库双链cDNA做模板扩增得到OsEES基因全序列，并将用PCR获得的全长的OsEES基因克隆到pBS-T载体中，命名为pOsEES，其插入片段经DNA测序鉴定；G.固定开花后两个时期的水稻子房进行差异表达基因的原位杂交。
全文摘要
本发明公开了一种水稻差异表达基因及制备方法。具体步骤为，通过显微操作分离水稻两个时期的胚，提取其mRNA，合成第一链cDNA，经过两轮PCR扩增，并纯化得到的双链cDNA，用NoTI和SalI限制性内切酶双酶切后与λ ZIPLOX
文档编号C07H21/00GK1594563SQ200410013468
公开日2005年3月16日 申请日期2004年7月15日 优先权日2004年7月15日
发明者吕应堂, 王盈 申请人:武汉大学