专利名称：枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离提纯方法
技术领域：
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离提纯方法。
背景技术：
抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有抗菌活性的小分子多肽(相对分子质量通常在1×104D以下)，广泛存在于细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物乃至人类中。具有广谱的杀菌、抑菌活性，不仅作用于革兰氏阳性细菌，而且也作用于真菌、昆虫和某些病毒和肿瘤。由于抗菌肽具有普通抗生素所不具有的一系列的优点如靶菌株不易产生抗性突变，含有D-型氨基酸的环肽可以抵抗机体蛋白酶的降解作用，因此成为现代学术和应用研究的一个热点；同时由于它在生物防御体制中起着十分重要的作用而成为新药的新的来源。
枯草芽孢杆菌目前也有作为微生物农药使用，其成份为枯草芽孢杆菌发酵液的粗提物，由于杂质较多，限制了其使用范围。
发明内容
本发明涉及一种快速高效分离纯化枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌肽的方法，其制备工艺合理简单、回收率高、操作条件温和，并且确定了提取的抗菌肽的分子构成。
枯草芽孢杆菌是一种能分泌对多种农作物有害病原真菌具有抑制杀伤作用的抗菌肽的土壤微生物。这类抗菌肽具有热稳定性高，耐受蛋白酶水解的能力，且微生物不易对其产生耐药性。由于此类抗菌肽通常以多种结构类似物的形式共同存在于枯草芽孢杆菌的发酵液中，并且有环状结构和脂类侧链。根据以上的特点，优选本发明的分离分离提纯工艺为1、枯草芽孢杆菌发酵液的粗提液的制备是是利用超过滤的装置对发酵液进行浓缩和纯化，截留分子量在1000D以上的物质。
更确切的说是将枯草芽孢杆菌JA的发酵液经Millipore公司的切向流超滤系统超滤浓缩后(截留分子量为1000D)6000r/min离心取上清液得到。
2、DEAE-Sepharose FF柱层析将粗提液用A缓冲液(20mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液)充分透析，8000r/min离心收集上清液，过A缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱，用B缓冲液(含1.0mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液，这一浓度也是充分考虑到分离纯化的目的既保证将所有抗菌肽都从柱上洗脱，又避免引入过多杂蛋白))与A缓冲液在线混合进行线性梯度洗脱，收集对黑曲霉、小麦赤霉和水稻纹枯病菌均有抑菌作用的活性峰，并将收集的活性洗脱液经Millipore公司的Stirred Cells 8050超滤杯浓缩(截留分子量为3000D)。
3、SOURCE 15PHE柱层析将阴离子柱收集的活性组份上B缓冲液预平衡的SOURCE 15PHE柱，B缓冲液淋洗至基线，再用A缓冲液进行淋洗，最后用蒸馏水洗脱得到活性峰，收集合并后浓缩。
4、Sephacryl S-200HR柱层析浓缩后的样品过含0.5mol/L(NH4)2SO4(此处(NH4)2SO4的浓度在0.15-0.5mol/L之间即可，选用0.5的浓度是为了尽量避免抗菌肽与分子筛柱中的分离介质之间的非特异相互作用)的A缓冲液预平衡的分子筛Sephacryl S-200HR柱，然后以同样的缓冲液洗脱，得到两个洗脱峰，收集活性峰样品浓缩，再经Milli-Q水充分透析后冷冻干燥。
5、反相HPLC分离上一步冷冻干燥的样品用30％乙腈(含0.1％TFA)溶解并经30％乙腈(含0.1％TFA)平衡C18柱分离，用30％～80％乙腈(含0.1％TFA)进行线性梯度洗脱，收集到若干分子量在1000D至1500D左右的多肽。在乙腈浓度达到50％左右时，三种有抗菌活性的目标产物依次被洗脱。
6、质谱测定三种抗菌肽的分子量依次为AFP11462.645D、AFP21476.390D、AFP31490.530D；氨基酸组成分析表明AFP1(1462.645D)由1个Ala，1个Ile，1个Pro，1个Thr，3个Glx(Glu或Gln)，2个Tyr和1个Orn组成；AFP2(1476.390D)由1个Ala，1个Ile，1个Pro，1个Thr，3个Glx(Glu或Gln)，2个Tyr和1个Orn组成；而AFP3(1490.530D)则是由1个Val，1个Ile，1个Pro，1个Thr，3个Glx(Glu或Gln)，2个Tyr和1个Orn组成。三种抗菌肽对小麦赤霉病菌和水稻纹枯病菌均有很强的抑制能力。
本发明所涉及到的各种缓冲液配方实验手册中均可查到。
本发明的三种抗菌肽纯度高，具有高效的抑菌活性，可作为生物防治应用，人类致病真菌的抑菌实验表明对脚气病的病原真菌也有抑制作用。
本发明的的制备工艺快速高效，目标产物纯度高，产物的纯度经质谱鉴定可达98％以上。三种抗菌肽命名为AFP1、AFP2和AFP3。
经提纯的上述AFP1、AFP2和AFP3可用于农作物病虫害(如水稻纹枯病、小麦赤霉病、西瓜枯萎病等)的防治；同时可用于治疗人畜的由真菌引发的皮肤病(如脚气等)，其中对红色毛癣菌、须毛癣菌作用明显；还可用作家畜的饲料添加剂，以预防黑曲霉、黄曲霉等真菌导致的饲料霉变；另外对正常哺乳动物细胞无不良影响，但对癌细胞株，部分病毒则有明显杀伤作用。这预示抗菌肽在治疗及预防癌症和抗病毒方面具有良好的应用前景。
具体实施例方式
本发明枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离提纯方法的步骤如下1、枯草芽孢杆菌发酵液的粗提液的制备是将枯草芽孢杆菌JA的发酵液经Millipore公司的切向流超滤系统超滤浓缩后(截留分子量为1000D)6000r/min离心取上清液得到。
2、DEAE-Sepharose FF柱层析将粗提液用A缓冲液(20mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液)充分透析，8000r/min离心收集上清液，过A缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱，用B缓冲液(含1.0mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液)与A缓冲液在线混合进行线性梯度洗脱，收集对黑曲霉、小麦赤霉和水稻纹枯病菌均有抑菌作用的活性峰，并将收集的活性洗脱液经Millipore公司的Stirred Cells 8050超滤杯浓缩(截留分子量为3000D)。
3、SOURCE 15PHE柱层析将阴离子柱收集的活性组份上B缓冲液预平衡的SOURCE 15PHE柱，B缓冲液淋洗至基线，再用A缓冲液进行淋洗，最后用蒸馏水洗脱得到活性峰，收集合并后浓缩。
4、Sephacryl S-200HR柱层析浓缩后的样品过含0.5mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液预平衡的分子筛Sephacryl S-200HR柱，然后以同样的缓冲液洗脱，得到两个洗脱峰，收集活性峰样品浓缩，再经Milli-Q水充分透析后冷冻干燥。
5、反相HPLC分离上一步冷冻干燥的样品用30％乙腈(含0.1％TFA)溶解并经30％乙腈(含0.1％TFA)平衡C18柱分离，用30％～80％乙腈(含0.1％TFA)进行线性梯度洗脱，收集到若干分子量在1000D至1500D左右的多肽。在乙腈浓度达到50％左右时，三种有抗菌活性的目标产物依次被洗脱。
质谱测定三种抗菌肽的分子量依次为AFP11462.645D、AFP21476.390D、AFP31490.530D；氨基酸组成分析表明AFP1(1462.645D)由1个Ala，1个Ile，1个Pro，1个Thr，3个Glx(Glu或Gln)，2个Tyr和1个Orn组成；AFP2(1476.390D)由1个Ala，1个Ile，1个Pro，1个Thr，3个Glx(Glu或Gln)，2个Tyr和1个Orn组成；而AFP3(1490.530D)则是由1个Val，1个Ile，1个Pro，1个Thr，3个Glx(Glu或Gln)，2个Tyr和1个Orn组成。
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离提纯方法，是将枯草芽孢杆菌发酵液的粗提液，经阴离子交换柱DEAE-Sepharose FF的分离、疏水柱SOURCE15 PHE的分离、分子筛柱Sephacryl S-200HR的分离和反相C18柱的分离纯化后获得3种主要的抗菌肽。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离提纯方法，其特征在于枯草芽孢杆菌发酵液的粗提液是利用超过滤的装置对发酵液进行浓缩和纯化，截留分子量在1000D以上的物质。
3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离提纯方法，其特征在于枯草芽孢杆菌发酵液的粗提液是将枯草芽孢杆菌JA的发酵液经Millipore公司的切向流超滤系统超滤浓缩后，截留分子量在1000D以上的物质，并经6000r/min以上的速度高速离心取得的上清液。
4.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离提纯方法，其特征在于(1)、经阴离子交换柱DEAE-Sepharose FF的分离将粗提液用A缓冲液-20mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液充分透析后，离心收集上清液，过经A缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱，用B缓冲液-含1.0mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液与A缓冲液在线混合，使缓冲液中的(NH4)2SO4浓度按线性梯度增加以洗脱结合在阴离子交换柱上不同成分，从中收集对黑曲霉、小麦赤霉和水稻纹枯病菌均有抑菌作用的活性峰，并将收集的活性洗脱液经截留分子量为3000D超滤杯浓缩；(2)、疏水柱SOURCE 15 PHE的分离将阴离子柱分离后收集并经超滤浓缩的活性组份上经B缓冲液预平衡的SOURCE 15 PHE柱，先B缓冲液将不与SOURCE 15 PHE柱结合的杂质洗去，再用A缓冲液进行淋洗进一步除去杂质，最后用蒸馏水洗脱得到活性峰，收集合并后浓缩；(3)、分子筛柱Sephacryl S-200HR的分离浓缩后的样品过含0.5mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液预平衡的分子筛Sephacryl S-200HR柱，然后以同样的缓冲液洗脱，得到两个洗脱峰，收集活性峰样品浓缩，再经Milli-Q水充分透析后冷冻干燥；(4)、反相C18柱的分离上一步冷冻干燥的样品用30％乙腈(含0.1％TFA)溶解并经30％乙腈(含0.1％TFA)平衡C18柱分离，用浓度按线性梯度递增的乙腈(30％～80％，含0.1％TFA)洗脱，收集到若干分子量在1000D至1500D左右的多肽，在乙腈浓度达到50％左右时，三种有抗菌活性的目标产物依次被洗脱。
5.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离提纯方法，其特征在于(1)、经阴离子交换柱DEAE-Sepharose FF的分离将粗提液用A缓冲液-20mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液充分透析，8000r/min离心收集上清液，过A缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱，用B缓冲液-含1.0mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液与A缓冲液在线混合进行线性梯度洗脱，收集对黑曲霉、小麦赤霉和水稻纹枯病菌均有抑菌作用的活性峰，并将收集的活性洗脱液经截留分子量为3000D超滤杯浓缩；(2)、疏水柱SOURCE 15 PHE的分离将阴离子柱收集的活性组份上B缓冲液预平衡的SOURCE 15 PHE柱，B缓冲液淋洗至基线，再用A缓冲液进行淋洗，最后用蒸馏水洗脱得到活性峰，收集合并后浓缩；(3)、分子筛柱Sephacryl S-200HR的分离浓缩后的样品过含0.5mol/L(NH4)2SO4的A缓冲液预平衡的分子筛Sephacryl S-200HR柱，然后以同样的缓冲液洗脱，得到两个洗脱峰，收集活性峰样品浓缩，再经Milli-Q水充分透析后冷冻干燥；(4)、反相C18柱的分离上一步冷冻干燥的样品用30％乙腈(含0.1％TFA)溶解并经30％乙腈(含0.1％TFA)平衡C18柱分离，用30％～80％乙腈(含0.1％TFA)进行线性梯度洗脱，收集到若干分子量在1000D至1500D左右的多肽，在乙腈浓度达到50％左右时，三种有抗菌活性的目标产物依次被洗脱。
全文摘要
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离提纯方法，它包括粗提液的制备，阴离子交换柱DEAE－Sepharose FF的分离、疏水柱SOURCE 15 PHE的分离、分子筛柱Sephacryl S－200HR的分离和反相C18柱的分离纯化，最终得到3种主要抗菌肽。这类抗菌肽具有热稳定性高，耐受蛋白酶水解的能力，且微生物不易对其产生耐药性。本发明分离提纯工艺具有快速、高效、高回收率的特点，产物的纯度经质谱鉴定可达98％以上。
文档编号C07K1/00GK1611511SQ20041001448
公开日2005年5月4日 申请日期2004年3月27日 优先权日2004年3月27日
发明者王军, 刘静, 余增亮 申请人:中国科学院等离子体物理研究所