专利名称：一种富集产聚酮类化合物细菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物富集方法，特别是涉及一种富集产聚酮类化合物细菌的方法及其使用的荧光标记探针。
背景技术：
聚酮是一大类结构多样化的天然产物，具有重要的医用价值，包括大环内酯类、四环素类、蒽环类、聚醚类等许多抗生素都属于该类化合物。世界上聚酮来源的药物每年的销售额达80亿美元。聚酮类化合物主要来源于微生物、植物等生物的次级代谢产物，由于微生物体积小、繁殖速度快、大规模培养技术成熟，因此成为寻找新聚酮类化合物的重要资源。传统的方法是首先分离微生物，再进行活性筛选，分离活性次级代谢产物，这种方法是否能够得到聚酮类化合物并不确定，是一种随机的筛选方法。此外，自然界中90％以上的微生物采用上述方法无法分离培养，对这一部分无法分离培养的微生物资源的开发利用仍然处于探索时期。近年来，随着分子生物技术的发展，弄清了聚酮类化合物生物合成途径的分子机理并对生物合成途径的基因进行了克隆研究。聚酮类化合物的生物合成有着很强的规律性，目前已知的聚酮类化合物按合成途径主要分为大环聚酮类化合物和芳香环聚酮类化合物两种，这两类化合物分别由I型聚酮合成酶合成途径(PKSI)和II型聚酮合成酶合成途径(PKS II)合成。通过克隆得到了一系列聚酮类化合物生物合成基因簇，在此基础上发展起来的组合生物合成技术近几年得到了很大的发展，成为新药开发的重要策略之一。因此，寻找新的聚酮类化合物产生菌及其生物合成基因成为目前的研究热点之一。现有微生物富集技术主要是根据微生物种属(如真菌，放线菌等)或物理性质(如嗜热、嗜冷、嗜酸、嗜碱等)进行富集，尚未见有针对产某一类特定化合物的微生物的富集方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种富集产聚酮类化合物细菌的新方法，它能够从环境样品中富集产生聚酮类化合物的细菌，以弥补现有技术的上述不足。
一种富集产聚酮类化合物细菌的方法，其特征是首先将环境样品制成液体混悬液，经过滤、离心收集微生物，再用缓冲液制成菌悬液，然后用荧光标记的寡核苷酸探针与菌悬液进行原位杂交，将能产生聚酮类化合物的细菌进行荧光标记，对杂交后的菌悬液采用流式细胞仪进行微生物的分选，将荧光标记的细菌从菌悬液中分选出来。
本发明的方法能够富集环境中(如土壤、河水、湖水、海水、海泥、海洋动植物共附生)产聚酮类化合物的细菌，特别是富集环境样品中大量存在的未能培养的细菌，具有针对性强、操作简单、快速、灵敏、高效的优点。
具体实施例方式
1.环境样品的预处理如采用海水、湖水或河水，可用200目尼龙筛网过滤除去杂质，滤液用0.22μm微孔滤膜过滤，滤饼用PBS缓冲液悬浮，使细胞浓度为105个/ml；如采用海洋动植物样品，则将海洋动植物样品切成小块，PBS浸泡，超声振荡，用200目尼龙筛网过滤除去杂质，滤液用0.22μm微孔滤膜过滤，滤饼用PBS缓冲液悬浮，使细胞浓度为106个/ml；如采用土壤或海泥样品，则将土壤或海泥加适量的PBS，振荡混匀，静置10分钟后取上清液，沉淀继续加 PBS重复前述操作，反复三次。上清液用200目尼龙筛网过滤除去杂质，滤液用0.22μm微孔滤膜过滤，滤饼用PBS缓冲液悬浮，使细胞浓度为108个/ml。
2.探针的设计本发明所用的探针设计在聚酮合成酶系中酮基合成酶(KS)和酰基转移酶(AT)基因的保守区域，长度为21个碱基，每条探针的5’末端标记荧光染料，命名为KS1和AT1，其序列分别为KS15’CGT CGA GGC CCA CGG CAC CGG 3’AT15’TTC TCC GGC CAG GGC TCC CAG 3’该组序列的5’末端分别标记荧光染料FITC，由发明人提供，上海博亚生物技术有限公司合成。
3.荧光原位杂交取微生物菌悬液1ml，5000×g离心5min，沉淀加250μm PBS，750μm4％PFA，重新悬浮微生物细胞，4℃固定1-3h。5000×g离心5min，沉淀用乙醇/PBS混合液(7∶3，vol∶vol)悬浮。同上条件离心，沉淀用100μl杂交缓冲液(0.9MNaCl，0.01％SDS，20mMTris-HCl[pH7.2]，25％deionized formamide)悬浮，同时加入荧光标记探针2.5ng/μl，46℃杂交3h，反应结束后，5000×g离心5min，PBS洗涤一次。
4.流式细胞仪分选杂交后的细胞采用流式细胞仪FACS Vantage(Becton Dickinson)进行分选，侧向散射光波长为488nm，收集荧光阳性区域的细胞，得到能够产生聚酮类化合物的细菌。
权利要求
1.一种富集产聚酮类化合物细菌的方法，其特征是首先将环境样品制成液体混悬液，经过滤、离心收集微生物，再用缓冲液制成菌悬液，然后用荧光标记的寡核苷酸探针与菌悬液进行原位杂交，将能产生聚酮类化合物的细菌进行荧光标记，对杂交后的菌悬液采用流式细胞仪进行微生物的分选，将荧光标记的细菌从菌悬液中分选出来。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的探针设计在聚酮合成酶系中酮基合成酶(KS)和酰基转移酶(AT)基因的保守区域，其5’末端分别标记荧光染料，其序列分别为KS15’CGT CGA GGC CCA CGG CACCGG 3’；AT15’TTC TCC GGC CAG GGC TCC CAG 3’
3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的环境样品包括土壤、河水、湖水、海水、海泥、海洋动植物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的菌悬液浓度为105-108个细胞/ml。
全文摘要
一种富集产聚酮类化合物细菌的方法，其特征是首先将环境样品制成液体混悬液，经过滤、离心收集微生物，再用缓冲液制成菌悬液，然后用荧光标记的寡核苷酸探针与菌悬液进行原位杂交，将能产生聚酮类化合物的细菌进行荧光标记，对杂交后的菌悬液采用流式细胞仪进行微生物的分选，将荧光标记的细菌从菌悬液中分选出来。本发明的方法能够富集环境中(如土壤、河水、湖水、海水、海泥、海洋动植物共附生)产聚酮类化合物的细菌，特别是富集环境样品中大量存在的未能培养的细菌，具有针对性强、操作简单、快速、灵敏、高效的优点。
文档编号C07H21/00GK1597926SQ20041002457
公开日2005年3月23日 申请日期2004年8月18日 优先权日2004年8月18日
发明者朱天骄, 李静 申请人:中国海洋大学