专利名称：一种快速大量提纯贝壳珍珠层可溶性蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用快速蛋白质层析系统(FPLC)在较短时间内分离提纯大量贝壳蛋白质的方法，生产的产品可广泛应用于生物材料和体外培育珍珠的研究和生产。
背景技术：
探讨贝壳的形成机制为纳米材料、矿物质聚合材料和模板晶体等新材料的开发开启了一个新的思路。可溶性贝壳蛋白质(SMP)在贝壳的形成过程中起了决定性作用，调控CaCO3晶体的沉积，包括方解石和文石晶体的核化、生长、物相转换和晶体形态等。近些年的研究表明贝壳蛋白质能够促进人类造骨细胞的分化、诱导骨的生成、促进骨修复，因而逐渐应用到材料医学上。可溶性贝壳蛋白质的提取主要是利用EDTA或者乙酸浸泡贝壳粉，离心得到上清液，然后透析上清液得到蛋白质。目前，关于可溶性贝壳蛋白质的纯化方法主要是通过SDS-PAGE电泳，从凝胶上回收蛋白质。这种方法简便、快速，但是产量低且会导致蛋白质变性。另外一种纯化方法是通过高效液相色谱(HPLC)获得纯化可溶性贝壳蛋白质。这种方法提高了蛋白质产量，且一定程度上解决了蛋白质变性的问题。但是，获得的可溶性贝壳蛋白质在量上远远不能满足医学中骨修复的临床应用和体外培育珍珠的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用先进的快速蛋白质层析系统(FPLC)大量提纯可溶性贝壳蛋白质的方法，它能满足现有技术的上述需求。
一种快速大量提纯贝壳珍珠层可溶性蛋白质的方法，包括对贝壳进行冲洗、酸处理、粉碎、透析、离心和干燥提取贝壳蛋白质，其特征是再利用FPLC的脱盐和阴离子交换层析对上述贝壳蛋白质进行分离纯化。
利用本发明可以在较短时间内大量获得纯化的可溶性贝壳蛋白质，并且能保持其活性。一般在提取到贝壳可溶性蛋白质后，通过FPLC在20分钟时间内便可完成一次纯化循环。每次循环可以得到0.3～0.6毫克纯化的可溶性贝壳蛋白质。本发明可以加速可溶性贝壳蛋白质在诱导人类骨的生成、促进骨修复的临床应用，同时为实现体外培育高附加值的珍珠奠定技术基础。
附图1为用快速蛋白质层析系统(FPLC)对皱纹盘鲍贝壳珍珠层可溶性蛋白质脱盐时得到的色谱图。
附图2为用快速蛋白质层析系统(FPLC)对脱盐后的皱纹盘鲍贝壳珍珠层可溶性蛋白质进行阴离子交换层析时得到的色谱图。
附图3为用快速蛋白质层析系统(FPLC)对阴离子交换层析所得的贝壳蛋白质B峰进行反相层析时得到的色谱图。
附图4为用快速蛋白质层析系统(FPLC)阴离子层析和反相层析所得的蛋白峰进行SDS-PAGE电泳分离所得的电泳图。图中MW为蛋白质分子量标准，Sample为FPLC阴离子层析或反相层析所得的蛋白峰。
附图5为不添加任何贝壳蛋白质的情况下，CaCO3超饱和溶液中典型的菱形立方方解石沉积的扫描电镜照片。
附图6为添加快速蛋白质层析系统(FPLC)中用阴离子交换层析所得的蛋白B峰的情况下，CaCO3超饱和溶液中对称的猬状文石沉积的扫描电镜照片。
具体实施例方式
将皱纹盘鲍贝壳表面用自来水刷洗干净，放入5％的氢氧化钠溶液中浸泡10小时，取出后刷去表面杂质及附着物，用蒸馏水冲净后室温下阴干24小时，得到干净的贝壳。用酸处理贝壳，去除角质层和棱柱层，得到纯的珍珠层。将珍珠层贝壳粉碎，用含0.01％NaN3的浓度为5％的醋酸溶液透析72小时以上，再用蒸馏水透析72小时，得到含有珍珠层可溶性贝壳蛋白质的溶液，将其在20,000g下离心30分钟。取上清液，真空干燥，得到干粉状可溶性蛋白质。
利用快速蛋白质层析系统(FPLC)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)两种手段进行贝壳蛋白质的分离提纯，具体方法和结果如下(1)脱盐。将可溶性贝壳蛋白质干粉溶于超纯水，在FPLC系统中脱盐，条件是脱盐柱HiTrapTMDesalting G25；洗脱液pH8.0的20mMTris-Hcl；平衡1个柱床；洗脱4个柱床；流速6毫升/分钟；三个脱盐柱联用。所得的峰谱如图1。
(2)阴离子交换分离。将脱盐后的蛋白质溶液在FPLC系统中用阴离子交换柱进行分离，条件是离子交换柱HiTrapTMDEAE Sepharose；洗脱液ApH8.0的20mM Tris-Hcl；洗脱液BpH8.0的20mM Tris-Hcl+1MNaOH；平衡2个柱床；冲洗2个柱床；洗脱梯度洗脱液B在10个柱床内保持24％，然后在5个柱床内升至70％；流速2毫升/分钟。阴离子交换层析得到三个峰，分别是流穿峰、蛋白A峰和蛋白B峰，所得的峰谱如图2。
(3)反相分离。将阴离子交换得到的蛋白B峰在FPLC系统中用反相柱进行提纯，条件是反相柱RESOURCETMRCP；洗脱液ApH2.17浓度为0.065％的三氟乙酸(TFA)+2％的乙睛；洗脱液BpH1.75浓度为0.05％的TFA+80％乙睛；平衡2个柱床；冲洗2个柱床；洗脱梯度洗脱液B在15个柱床内由0％升至100％，保持2个柱床；流速1毫升/分钟。反相层析只得到一个峰，峰谱如图3。
(4)SDS-PAGE蛋白质电泳。将阴离子层析或反相层析得到的蛋白质进行SDS-PAGE分离，二者都只得到1条带，并且其分子量相同(15.1kDa)。条件是分离胶18％；浓缩胶24％；电压150V；电泳时间90分钟；电泳槽Mini-PROTEAN II(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)。电泳结果表明反相层析得到的峰，即阴离子交换层析得到的蛋白B峰为1种纯的蛋白质。电泳图见图4。
在此基础上，配制CaCO3超饱和溶液，分别观察在不添加任何贝壳蛋白质和添加阴离子交换层析所得的蛋白B峰的情况下生成CaCO3晶体的物相，并用扫描电镜分析晶体的结构特性。结果表明A处理得到典型的菱形立方方解石；B处理得到对称的猬状文石(分别如图5和图6)。说明在FPLC系统中用阴离子交换层析得到的蛋白质保留了其生物活性。
应用本发明提纯杂色鲍、海湾扇贝、海螺、淡水珍珠蚌和大瓶螺贝壳珍珠层的可溶性蛋白质，可以得到类似的结果。
本发明中脱盐用洗脱液为pH7.5-8.5的浓度为20mM的Tris-Hcl；2-5个脱盐柱联用；流速为5-6毫升/分钟。阴离子交换所用的洗脱液A为pH7.5-8.5的浓度为20mM的Tris-Hcl，洗脱液B为pH7.5-8.5的浓度为20mMTris-HCl+1M NaOH；洗脱梯度为洗脱液B在10个柱床内保持24％，然后在5个柱床内升至70％；流速为1-2毫升/分钟。
权利要求
1.一种快速大量提纯贝壳珍珠层可溶性蛋白质的方法，包括对贝壳进行冲洗、酸处理、粉碎、透析、离心和干燥提取贝壳蛋白质，其特征是再利用FPLC的脱盐和阴离子交换层析对上述贝壳蛋白质进行分离纯化。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的脱盐用洗脱液为pH 7.5-8.5的浓度为20mM的Tris-Hcl；2-5个脱盐柱联用；流速为5-6毫升/分钟。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的阴离子交换所用的洗脱液A为pH 7.5-8.5的浓度为20mM的Tris-Hcl，洗脱液B为pH7.5-8.5的浓度为20mMTris-HCl+1M NaOH；洗脱梯度为洗脱液B在10个柱床内保持24％，然后在5个柱床内升至70％；流速为1-2毫升/分钟。
全文摘要
一种快速大量提纯贝壳珍珠层可溶性蛋白质的方法，包括对贝壳进行冲洗、酸处理、粉碎、透析、离心和干燥提取贝壳蛋白质，其特征是再利用FPLC的脱盐和阴离子交换层析对上述贝壳蛋白质进行分离纯化。利用本发明可以在较短时间内大量获得纯化的可溶性贝壳蛋白质，并且能保持其活性。一般在提取到贝壳可溶性蛋白质后，通过FPLC在20分钟时间内便可完成一次纯化循环。每次循环可以得到0.3～0.6毫克纯化的可溶性贝壳蛋白质。本发明可以加速可溶性贝壳蛋白质在诱导人类骨的生成、促进骨修复的临床应用，同时为实现体外培育高附加值的珍珠奠定技术基础。
文档编号C07K14/435GK1613871SQ20041002458
公开日2005年5月11日 申请日期2004年8月23日 优先权日2004年8月23日
发明者张文兵, 麦康森, 徐玮, 李静, 董瑞娜, 赵建民, 谭北平, 艾庆辉, 刘付志国, 马洪明 申请人:中国海洋大学