可可茶提取物用于制备预防及改善疲劳及其临床症状的药物及食品的应用的制作方法

专利名称：可可茶提取物用于制备预防及改善疲劳及其临床症状的药物及食品的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及天然植物提取及应用领域，尤其是涉及可可茶提取物的应用。
背景技术：
物质文明和精神文明急速发展的今天，人们在不断接受新事物的同时也感受并正在承受来自过去未曾有过的各种新的精神压力。有人夸张的概括知识爆炸的现代社会是一个精神压力的时代，实际上这个说法也并不过分。一般所说的现代人疲劳多半是指精神压力或精神疲劳。过去，作为一般意义上的疲劳多指疲劳感、倦怠感及食欲不振等身心状态，同时也包括精神疲劳引起的睡眠障碍、意欲低下等多种临床症状的一种广泛概括。传统的抗疲劳多从改善身体疲劳、食欲不振、营养缺损等方面着想，以提供营养补充剂为主。市售体育饮料一般是采用补充发汗后失去的维生素、氨基酸及矿物质为主，而不能直接预防或减轻疲劳。实际目前消费的强壮剂一般也多是采用维生素或氨基酸为原料。但是，强壮剂、体育饮料等营养剂对精神疲劳引起的神经损伤诱发的各种临床症状的确难以发挥治疗效果。
“病从气来”，尽管是人们经常可以听到的这一句传统医学中的经典概述，但真正理解这句话的含意还应该说是通过近年来科学研究所作出的解释。现在，人们已充分认识到精神疲劳是可以引起多种生活习惯病的。一般认为疲劳是由身体在接受各种刺激或精神压力后所产生的紧张、不安、恐怖等的生理反应。疲劳除对一些刺激原的特定反应外，也存在生理上的共通反应。如交感神经—副肾髓质系统或下垂体—副肾皮质系统兴奋时诱发肾上腺素分泌，使血压上升，脉搏、呼吸频率增加等，当然精神疲劳也会促进副肾皮质释放氢化可的松(cortisol)。这些反应实际上也是身体的一种适应性防御表现或称疲劳反应。概括的说，精神压力通过作用于中枢神经系统，影响視丘下部继发的各种适应性防御反应。身体的疲劳反应一般是通过两种途径体现一种是通过交感神经系统末梢释放去甲肾上腺素(noradrenaline)或刺激副肾髓质分泌肾上腺素(adrenalin)发挥作用；另一种疲劳情况传导通路是通过视丘下部释放促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone)刺激下垂体分泌促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)，并作用于副肾皮质促进氢化可的松分泌来完成的。过去，人们常常使用人参等滋养强壮剂、vitaminE等抗氧化剂及营养补充剂作为抗疲劳剂使用。尽管上述方法对于改善精神疲劳确有一定疗效，但最适宜的方法应该说还是缓解精神紧张和抗不安。目前，临床上广泛使用的安眠药或苯二氮卓(benzodiazepine)类镇静药用于缓解精神疲劳，但这些药物具有一定的副作用和依赖性而限制其使用范围。
近年来的研究证明，精神疲劳作用交感神经刺激脑广泛部位释放中枢神经递质去甲肾上腺素(noradrenaline)，并引起不安、紧张等精神症状。此外，也作用视丘下部促进副肾皮质释放促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing factor)和增加下垂体、副肾皮质分泌促肾上腺皮质激素(ACTH)。当然交感神经也分布在副肾髓质，因此精神疲劳也会刺激肾上腺素(adrenalin)释放入血液中。可以想象随着疲劳的程度加深，持续时间增长，无疑会影响到身体很多脏器，结果引起像消化性溃疡、虚血性心脏病、脑血管损害、高血压、高脂血症等症状，也会诱发或增加神经症、抑郁症(depression)等的发病率。因此精神疲劳也被认为是生活习惯病的起因之一。精神疲劳带给人体的不健康因素，一般认为是因体内动态平衡(homeostasis)被破坏所至。这可能也正是传统医学的病因论中所经常提到的“病从气来”的理由所在。精神疲劳诱发各种临床症状的应对方法过去多数采用对症治疗或使用安眠药及抗不安剂。安眠药用于一时性改善身心状态，缓解疲劳。抗不安药的一般临床效果是缓和、改善身心损害引起的不安感、紧张感，睡眠、意识水平低下。现在，广泛使用的镇静药苯二氮卓类药物多数具有副作用，连用后中断时又多会出现反跳现象及临床依赖性，所以不宜频繁使用。可以说，药物应该仅作为改善或治疗不安等神经症状一种辅助手段，而且仅适合最必要、最少量、最短期间的使用。确切说镇静药物或安眠药难以称为理想的抗疲劳剂。而人们更需要的是一种无催眠作用，无肌肉松弛作用，不产生健忘、耐性、依赖性等副作用的可以日常饮用，可以有效保持生物体动态平衡，有效防止疲劳，改善身心状态的健康饮料或健康食品。
茶的故乡在中国南部，其根据之一是中国南部自然生长着多种多样的杂种及变种的野生茶。一般人们知道，茶叶(Camellia sinensis L.O.Kuntze)是茶科茶属植物的一种。早在1753 Carl von Linne已将茶叶记载为Thea sinensis L.。1887年Carl Ernst Otto Kuntze又将茶叶命名为Camellia sinensis(L.)O.Kuntze。之后，人们又不断在茶属植物中发现新品种，目前总数已超过200余种。1984年Chang & Bertholomew又将茶科植物再次分类。现在，茶叶归属于Camellia属。根据Chang & Bertholomew在1984的分类Camellia属又分Protocamellia、Camellia、Thea、及Metacamellia的4个亚属。Thea亚属中又包括Corallina、Brachyandra、Longipedicellata、Chrysantha、Calpandria、Thea、Longissima及Glaberrima组。其中Thea组中又有Quinquelocularis、Pentastylae、Gymnogyne及Sinensis 4个系。在Sinensis系中除传统茶叶(Camellia sinensis)之外，还有C.pubicosta、C.angustifolia、C.fangchensis、C.ptilophylla及C.parvisepala等植物，可可茶(Camellia ptilophylla Chang)则是其中的一种。在植物分类上，可可茶是传统茶叶(Camellia sinensis)的近缘种植物，被人们发现后又称为新种茶。根据近年的调查结果，野生可可茶主要自然生长在广东省龙门地区的狭窄范围内，长期以来为当地人通过杀青、半发酵、发酵等不同制茶方法制成绿茶、乌龙茶及红茶等茶叶用于日常饮用。至今为止没有发现饮用可可茶的副作用及不安感的现象。长期以来当地人也将可可茶用作健康茶来饮用，可可茶可以说是一种饮用安全的日常饮料。可可茶的主要特征不同于传统茶叶中的甲基黄嘌呤(methyxanthine)类代谢途径。茶叶中由可可碱转化为咖啡碱时需要一种可可碱氮-甲基转移酶(theobromine 1N-methyltranserase)的作用，而可可茶因缺少传统茶中所含有的该酶而使其嘌呤生物碱(purine alkaloids)的代谢停止在可可碱阶段而不能生成咖啡碱(Biosynthesis and Metabokism ofPurine Alkaloids in Leaves of Cocoa Tea(Camellia ptilophylla)J.Plant Res.，111599-604，1998)。又因其茶中含有可可(cacao)中(或日常食用chocolate)的主要活性成分可可碱，所以被称为可可茶(cocoa tea)。由于可可碱是一种在咖啡碱化学结构的1位上不存在甲基的化合物，在活性上表现出与咖啡碱不同的生理作用，如对中枢神经系统的缓解作用，一些镇静活性等。因此，可可茶又被称作睡前可以饮用的休息茶。实际上，野生可可茶含有微量的咖啡碱，但经过本发明人的多年研究，现在已培育出完全无咖啡碱的纯种可可茶。由于可可茶不含咖啡碱，所以也适用于老年、孕妇、儿童、胃肠功能低下或心脏不健康等人的饮用。近年来有关可可茶的生产动向为研究者及企业所关注。
近年来，人们非常关心对天然物质生理活性的研究，特别是对茶类所具有生物功能更为关注。人类饮茶已有数千年的历史。自古以来茶叶的各种健康功效早以为人们所知，茶叶的健康功效一般被认为是来自多酚及咖啡碱的生物活性。人们知道咖啡碱具有促进身体新陈代谢，提高大脑集中注意力，增加工作能力等活性。咖啡碱也是一种临床用药物，主要用于嗜睡、倦怠、肾性浮肿、偏头痛、高血压性头痛等症状的改善。“喝杯茶提提神”是人们经常听到的一句话，实际上也是来自对茶叶中咖啡碱药理作用的一种心理期待。人们知道，作为生命单位的细胞在接受各种情况刺激时相应做出各种生物反应。细胞所从事生理活动，实际是一种细胞内各种各样的酶促反应过程。当然，酶促反应过程是在一定的启动因子控制下进行，并不是在盲目的反应。环磷酸腺苷(Adenosine 3’，5’-cyclicmonophosphate，cAMP)则是细胞启动因子控制系统之一。腺苷酸环化酶(Adenylate cyclase)又称为3’，5’-环磷酸腺苷合成酶(3’，5’-cyclic AMPsynthetase)是cAMP-启动因子控制系统的最初反应酶。腺苷酸环化酶(Adenylate cyclase)的活化促进cAMP合成及细胞内的cAMP浓度上升的同时，一个激酶(cAMP依赖性蛋白激酶)活化，并与其他酶磷酸化(phosphorylation)结合的同时，启动因子开始启动。这种担当细胞内信息递质的化学物质又被称作第二信使(second messenger)。当然，细胞内也存在一种名为磷酸二酯酶(phosphodiesterases)的cAMP分解酶。咖啡碱抑制磷酸二酯酶，减少细胞内部cAMP分解，增加细胞内的cAMP浓度，活化细胞内的各种酶促反应。此外，咖啡碱及黄嘌呤(xanthin)类化合物对腺苷(adenosine)受体的直接阻断作用也是这类化合物的药理作用之一。
很多研究已证明，腺苷在脑内蓄积会引起嗜睡，睡眠时腺苷被脑细胞重新回收，使脑内腺苷水平降低又使人恢复清醒。咖啡碱作用于腺苷受体，竞争性抑制腺苷与受体结合。实际上，咖啡碱对大脑并无兴奋作用，而这种作用多是来自脑细胞不能接受腺苷的作用而引起的。当然，咖啡碱抑制腺苷受体，会使大脑的内源性谷氨酸盐(glutamine)、多巴胺(dopamine)、endorphin等兴奋作用活性物质处为优势，而使中枢处于兴奋状态。正是根据这个原因，咖啡碱的兴奋作用受到大脑中固有多巴胺等内源性中枢性递质的作用范围的限制。对咖啡因的轻度依赖性，实际是一种习惯性，一种个人嗜好。再有，喝茶利尿是个常识。其根据是咖啡碱阻断肾脏的腺苷受体，影响肾血流量。所以有人根据这个原理通过饮茶来改善肾性浮肿。
正是这样，咖啡碱作用于神经突触(synapse)，结果可以提高中枢神经系统机能及增加反应能力，改善嗜睡及倦怠感。咖啡碱也可以促进肾上腺素分泌，刺激大脑增强注意力及记忆能力。也有一些研究证明咖啡因促进细胞内脂肪酸作为能量源游离，提高运动持久力。咖啡碱对血管的作用也是因作用血管部位不同而不同，咖啡碱扩张脑血管，有利于改善偏头痛及高血压性头痛。此外，咖啡碱也直接作用于骨骼肌，增强肌肉收缩力，减轻疲劳。
咖啡碱是一种白色粉末，微针状结晶(水合物)或六角柱状结晶(非水合物)状化合物。无味、口感苦涩。咖啡因微溶于水，但随温度上升溶解度增加，例如，溶解1g咖啡因在常温需46ml水，80℃降至5.5ml，而用沸水则仅需在1.5ml。咖啡碱对热稳定，熔点为238℃，升华温度在178℃。咖啡因的分子式为C8H10N4O2，分子量为194.19。咖啡碱分子内因含有非氨基酸性氮原子，故又被称作植物生物碱。此外，咖啡因分子的基本骨架是由含有碳分子、氮分子的6元环并5元环构成，因此其学名又称这类化合物为嘌呤生物碱。咖啡碱的嘌呤环上含有2个氧原子和3个甲基(-CH3)。化学上将含有2个氧原子的嘌呤环物质称为黄嘌呤(xanthin)类化合物，而含有甲基的黄嘌呤类化合物则称甲基黄嘌呤类化合物。咖啡碱是甲基黄嘌呤类化合物的代表物质又名1，3，7-Trimethylxanthin。当然，茶碱(theophylline，1，3-Dimethylxanthin)及可可碱(theobromine，3，7-Dimethylxanthin)也同属于这类化合物。茶叶中含有少量的茶碱，而可可碱则是可可(cacao)豆的主要活性成分。
甲基黄嘌呤类化合物，随着甲基数增加，脂溶性也随之增大，因此更容易通过血脑屏障。咖啡碱的中枢兴奋作用也并非仅仅对健康有益。例如咖啡碱不仅作用于大脑皮质，还随剂量增加作用于延髓诱发精神不安，大剂量也可以兴奋脊髓。过度使用咖啡碱会引起痉挛或出现肌肉震颤。尽管咖啡碱可以直接作用心肌，增加收缩及心跳数，增大心血输出量。但大量使用则会引起心跳过速或心律不齐。月经前后摄取咖啡碱会增加忧郁、不安感。咖啡碱容易通过胎盘及转移进入母乳，所以对没有咖啡碱分解酶的胎儿或乳儿来讲，咖啡碱在体内的代谢时间比成人要长，负面影响表现的要多。一些研究证明咖啡碱减少胎盘的血流量而影响胚胎的发育。临床医生从咖啡碱增加胎儿及乳儿心脏的收缩力等影响上考虑，提倡妊娠及授乳者需控制对咖啡碱的摄取量。消化性胃溃疡需减少对咖啡碱的摄取也为一般人所知。肝功能低下者因咖啡碱的代谢缓慢也有必要对其摄取进行控制。
从饮料中除去咖啡碱的技术最初是由德国开发，近年来欧美各国对不含咖啡碱的咖啡及红茶的消费量大幅上升。有统计认为美国对不含咖啡碱的咖啡的需求量约占咖啡市场的20％左右。
尽管可可茶的主要成分可可碱与咖啡碱同属甲基黄嘌呤类化合物，但可可碱对中枢并不像咖啡碱那样显示过强的兴奋作用，而是对中枢神经表现为一种缓和作用效果，给人一种平稳气氛。当然，可可碱与咖啡碱也有相近的药理效果，如利尿作用等。此外，可可碱可以降低血压，有益健康。可可碱的这些作用可能正是人们喜爱可可茶的原因。可可茶与传统茶叶相同，含有多酚、茶氨酸等活性成分，也可以说可可茶与传统茶一样有茶涩、茶甜、茶香。可可茶的特征是含有约3～6％的可可碱。人们知道，可可广泛消费的理由不仅仅其特有的茶涩香，也出自可可保护身心及陶冶心境方面。可可的涩香正是来自其活性成分可可碱。有人调查自然界中23万种以上的有花植物中，含有可可碱的植物不到数十种。可可茶含有3～6％可可碱，其含量可以说不少于原产于中南美的可可。近年来人们通过对脑波等研究中证明可可碱不仅可以使人身心更加舒适，也具有提高大脑集中注意力的效果。当然，可可碱的利尿、镇静、扩张血管、促进血流、疲劳恢复及降低血压效果也早已为人所知。可可碱与咖啡碱的最大不同是不影响人们的睡眠。而且，茶叶的抗氧化作用，抗菌作用，对血中胆固醇的调节等作用更是令人瞩目。传统茶叶提取物及主要活性成分多酚类化合物具有抑制糖吸收作用等已有报导。尽管可可茶是传统茶叶的近缘种植物，对可可茶的抗疲劳活性尚无任何应用方面的探讨。

发明内容
本发明的发明目的在于提供以可可茶(Camellia ptilophylla Chang)提取物及可可茶有效成分为原料，制备的安全性高并可以长期服用，不存在副作用的用于减轻、改善精神疲劳及疲劳引起的抑郁症(suppression)、不安症、自律神经异常亢进及高血压等各种临床症状的预防、改善和治疗的药物的用途。所述的药物包括有效治疗剂量的可可茶提取物，以及药学上可接受的载体。
本发明的另一发明目的在于提供以可可茶提取物及可可茶有效成分为原料，制备的可用于身心疲劳或疲劳引起的各种临床症状的预防或改善的健康食品、食品或食品添加剂的用途。本发明通过对精神疲劳及疲劳引起的各种临床症状的预防、改善无疑会有利于体力恢复及增强。因此，本发明提供的可可茶及可可茶有效成分可可碱为原料的健康食品、食品或食品添加剂也可以用于维持、恢复、增进体力及使精神安定的健康食品组成物。
本研究以小鼠的自发运动(ambulatory activity)、悬垂实验(traction test)为动物实验模型，评价可可茶提取物对小鼠不安的减轻效果及抗疲劳作用。其结果证明，可可茶提取物对小鼠行为表现出有意义的生理活性。此外，发明人也确认可可茶活性成分可可碱对上述实验具有明显的药理效果。同时发明人在使用可可茶及活性成分可可碱对戊巴比妥诱发小鼠睡眠实验模型的影响中发现，可可茶具有与传统茶叶活性成分咖啡碱不同的中枢药理作用。
本发明所述的可可茶提取物是采用热水或水与甲醇、乙醇等低级醇类、丙酮等极性溶剂的一种或二种以上的任意混合溶剂进行提取的。
因为可可茶中的生物碱(alkaloid)及儿茶酚类(catechins)都属于小分子化合物，一般用水提取即可，也可用不同浓度的低级醇类、丙酮等极性溶剂或任意混合溶剂来提取。在提取时，随着醇的添加，可可茶中活性成分的回收率会有所增加。尽管用水提取效果不如用醇添加提取，但随着水温增加，以及提取时间的延长，也可以达到与醇提取法相当的结果。因此，对可可茶中活性成分的提取而言，上述提取方法及其任意组合都可得到本发明所述的提取物。
鉴于可可茶提取物是以药剂或饮料作为最终产品开发，故从安全性角度考虑提取溶剂尽量选择乙醇为宜。提取时可可茶与溶剂的比率没有特定限制，但一般可可茶与溶剂的比例以5∶1～50范围为宜。本发明对提取温度没有特定限制，从室温到溶剂沸点范围都可适用。当然室温、常压及在溶剂沸点范围内提取最为理想。提取时间从10秒到24小时范围都可以。在提取可可茶提取物时，根据需要也可以在溶剂中添加重碳酸钠(sodium bicarbonate)、抗坏血酸钠盐(sodiumascorbate)等物质。这些提取方法不会影响可可茶本来具有的生物活性。
本发明提供的可可茶提取物固形剂使用量一般在0.1％至40％(W/W)，因为通常饮料添加浓度一般在0.1％至40％(W/W)范围较为适宜。在这个浓度范围内，可可茶提取物适于直接服用，容易被消费者接受。当然，作为添加物的可可茶提取物随着加入量的增大，可能会出现苦涩感觉。其解决办法可以根据市场需要及消费者的心理要求改换剂型，例如使用片剂、颗粒剂、胶囊剂等剂型。低浓度可可茶提取物溶液可以作为日常饮料提供给消费者。
本发明提供的可可茶及可可茶活性成分，可以用于各种口服剂型投放市场，提供预防或改善精神疲劳及疲劳引起的各种临床症状为目的的医药品、健康食品、食品或食品添加剂。当然，可可茶提取物也可以与常用的赋形剂等医药用担体结合并制剂化。必要时，也可以添加一些防腐剂、抗氧化剂、色素、甜味剂等制剂添加物用于各种制剂。
比较适宜的可可茶赋形剂，一般考虑有乳糖、白糖、D-甘露醇、淀粉、结晶纤维素等。润滑剂一般应采用硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉等。溶剂通常使用精制水、乙醇、丙二醇等。防腐剂一般采用氯丁醇、苄醇、二羟基乙酸等。抗氧化剂通常以亚硫酸盐、抗坏血酸等比较适宜。
本发明提供的可可茶提取物，可以其原型、提取物或粉末添加到制品中用于口服。可可茶提取物也可与其它饮料原料结合制成一定的饮料制品，如可可茶饮料、炭酸饮料、果汁饮料、乳酸菌饮料、运动饮料、豆乳等。可可茶提取物食品还可以考虑制成饼干、巧克力类、糖果类、口香糖类、快餐点心类、果冻点心类、面包、豆腐、酸奶酪等日常食品。
本发明提供的可可茶及可可茶活性成分作为缓和、改善精神疲劳及疲劳引起的抑郁症(suppression)、不安症、自律神经异常抗进及高血压等各种临床症状为目的医药品、健康食品、食品或食品添加剂用于日常生活。可可茶对郁症状、不安症、自律神经异常亢进的预防、改善作用是通过改善包括中枢作用下的小鼠睡眠、悬垂时间及自发运动频度的实验中得以证实和确认的。本发明提供的可可茶提取物给药量，根据使用者相对健康状况、年龄、性别及体重等条件也可以选择，一般成人以60Kg为平均体重，一天中口服可可茶提取物可以考虑在3g至10g范围内，可以分次服用。当然10g以上也不存在副作用等问题。
本发明所述的可可茶提取物含有以下活性成分可可碱(theobromine)、gallogatechin-gallate(GCG)、1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)及gallogatechin-3，5-digallate(GC-3，5-diGA)。
每克可可茶提取物中，上述活性成分可可碱的含量至少为200mg，GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量至少为40mg、25mg及100mg。
发明人首次从可可茶提取物中分离得到三个成分，经核磁共振(NMR)等波谱学方法测定化学结构，确认为以下三种已知化合物1)gallogatechin-gallate(GCG)2)1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)3)gallogatechin-3，5-digallate(GC-35diGA)上述三种成分在传统茶叶品种中尚无报道，可能是含量很少或很难检测出的。
发明人通过实验证明，与咖啡碱相比，可可碱也显示出一定的中枢唤醒作用倾向。可可茶提取物可明显地延长了戊巴比妥诱发的小鼠睡眠时间。可可茶的这一效果可能来自于可可碱以外的成分，并很可能是来自新分离到的上述三种活性成分。
本发明提供和证明了可可茶及可可茶有效成分可可碱为原料可以用于减轻、改善精神疲劳及疲劳引起的不安症、自律神经异常亢进等多种症状的预防、改善或治疗剂。同时本发明也提供精神疲劳及疲劳引起的各种临床症状预防、改善为目的健康食品、食品及食品添加剂。
根据本发明所提供的研究结果证明，含有多酚、可可碱等活性物质为主成分的可可茶不仅可以作为嗜好品、食品提供于消费市场，也可以作为健康食品及医疗用品用于改善精神疲劳、抗不安及预防因身心疲劳引起的各种临床症状。本发明提供的可可茶因可能改善精神疲劳初期段阶的中枢神经系统，因此可以讲是一种注重于从根本上对疲劳的缓和效果。此外，可可茶及其主成分可可碱是具有长期食品经验的安全性高的活性成分，可以用于日常饮用，在无意识中预防、减轻疲劳、缓和不安等症状。特别是脑力及体力作业前后服用效果更好。本发明是以可可茶及可可茶有效成分可可碱为原料，提供安全并长期服用可能，不存在副作用的减轻、改善精神疲劳及疲劳引起的抑郁症、不安症、自律神经异常亢进及高血压等各种临床症状的预防、改善和治疗剂。当然可可茶及可可茶有效成分可可碱为原料也可作为健康食品、食品或食品添加剂用于身心疲劳或疲劳引起的各种临床症状的预防或改善。本发明通过对精神疲劳及疲劳引起的各种临床症状的预防、改善无疑会有利于体力恢复及增进。因此，本发明提供的可可茶及可可茶有效成分可可碱为原料的健康食品、食品或食品添加剂也可以用于维持、恢复、增进体力及精神安定的健康食品组成物。由于本发明提供的可可茶是天然来源物质且有长期作为食品的经验和不含有咖啡碱等特点。不仅可适用于一般成年人，作为一种作用缓和的健康茶也适用于老年人、儿童及体力低下者。可可茶也可以应市场的需要作成绿茶、红茶及乌龙茶提供于消费者。


图1为可可茶提取物的HPLC分析图谱。
图2为小鼠自发运动实验的结果分析图，图中1为对照组，2为给药咖啡碱10mg/kg，3为给药可可碱10mg/kg，4为给药可可茶150mg/kg。
图3为可可茶对戊巴比妥诱发小鼠睡眠时间的影响结果分析图，图中1为对照组，2给药咖啡碱30mg/kg，3为给药可可碱30mg/kg，4为给药可可茶150mg/kg，5为给药可可茶300mg/kg。
具体实施例方式
本发明可以通过以下实施例进行详细说明，但并不仅仅局限于以下实施例。
实施例一可可茶提取物的制备取可可茶干燥叶100g，加入90℃热水2000ml浸提4分钟。提取液经纱布滤过后，将滤液在1000rpm、5分钟离心分离，回收上清液冷冻干燥即成。可可茶叶的上述冷冻干燥提取物用于本发明的下列实施例。
实施例二可可茶提取物的HPLC分析将上述可可茶提取物配制成1％水溶液后，经Sep-PaktC18 Cartridge(5ml，Waters制)吸附过滤，水洗净后，用乙腈洗脱分离。随后，将250mg所得分离组分在Develosil C30-UG-5(20mm×250mm，野村化学制)柱上，在0.05％三氟乙酸(TFA)存在条件下，用5-30％乙腈按线性梯度洗脱方式(5ml/mim，180分钟，220nm紫外检测)洗脱分离。回收得到的分离组分，再用YMC-Pak ODS(20×250mm、YMC制)柱，在0.1％TFA存在下，用20-25％乙腈按线性梯度洗脱方式(6ml/mim、60分钟，280nm紫外检测)洗脱精制。结果如图1所示，从中分离得到与传统茶叶不同的三个组分。
可可茶提取物的HPLC分析条件。层析柱资生堂capcell pak C18(φ4.6mm×150mm)，流动相A＝0.05％TFA/水；B＝90％CH3CN/0.05％TFA/水。B5→B35％(13分钟)，B35％→B70％(7分钟)，B70％(5分钟)。检测A280nm峰面积定量。PDA 220～500nm检测。
从可可茶提取物中分离得到三个成分，经核磁共振(NMR)等波谱学方法测定化学结构，确认为以下三种在传统茶叶品种中含量很少或很难检测出的已知化合物gallogatechin-gallate(GCG)、1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)及gallogatechin-3，5-digallate(GC-35diGA)。
左侧为EGCG的结构式 右侧为gallogatechin-gallate(GCG)的结构式传统茶主要含有EGCG。
1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)的结构式 gallogatechin-3，5-digallate(GC-3，5-diGA)的结构式实施例一所得到的可可茶提取物中各成分的含量如下Theobromine 278.75EGC 43.25(+)C 62.75EC 14.50EGCG 37.25GCG 199.001，3，4，6-GA-glc54.75GC-3，5-diGA 32.50
由于用水提取、用醇提取、用其他极性溶剂提取，或者混合法提取，每克可可茶提取物中，上述活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量有或多或少的差别，但发明人的不同实验多次表明，活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量至少为40mg、25mg及100mg。
实施例三小鼠自发运动实验(ambulatory activity test)使用7周龄雄性ICR小鼠(由日本CLEA公司购入)。小鼠在室温(23±1～2℃)、湿度55±5％、换气回数12～15回/时，照明时间12小时/日(上午7点开灯，下午7点关灯)；固形饲料CE-2(CLEA公司)；自由饮水的饲养条件下预备饲养1周后进行试验。本发明使用实验动物运动量测定装置(LaboratoryAmbulometer MODEL SMA-10 O’HARA & Co.，Ltd.(Quantitative analysis ofthe effects of lithium on the reverse tolerance and the c-Fos expressioninduced by methamphetamine in mice.Brain Research Protocols.411-18，1999.))测定小鼠自发运动量。检体给药30分钟前将小鼠放置在实验装置内适应实验环境，并记录每10分钟的合计自发运动量。小鼠经30分钟的适应后，不同浓度的检样以0.1ml/10g量经口给药。给药后每10分钟为记录单位计算小鼠自发运动量，连续测定120分钟。对照组小鼠经口给药同容量水。每实验组使用小鼠10只。
实验结果如图2所示，于对照组小鼠相比给于咖啡碱的小鼠的自发运动显著增加。而给与可可碱的小鼠自发运动于对照组小鼠相比无显著变化，给与可可茶提取物的小鼠的自发运动有一定的减少倾向。
实施例四小鼠悬垂实验(traction test)使用7周龄雄性ICR小鼠(日本CLEA公司购入)，小鼠在室温23±1～2℃、湿度55±5％、换气次数12～15回/小时，照明时间12小时间/日(上午7点开灯，下午7点关灯)，固体饲料CE-2(CLEA公司)，自由饮水的饲养条件下预备饲养1周后进行试验。
实验方法每实验组使用小鼠10只，检体经口给药30分钟后开始试验。悬垂实验是将小鼠前肢悬挂在直径2mm、长50cm、平行高度50cm的金属线上，测定小鼠的悬垂时间。结果如表一所示表一咖啡碱、可可碱及可可茶提取物对小鼠悬垂时间(秒)的影响

结果证明，与咖啡碱给药后引起小鼠的不安相比，可可碱对悬垂时间无明显的效果，可可茶提取物给药小鼠的悬垂时间有一定的延长倾向。
实施例五可可茶对戊巴比妥诱发小鼠睡眠时间的影响使用7周龄雄性ICR小鼠(由日本CLEA公司购入)，小鼠在室温23±1～2℃、湿度55±5％、换气次数12～15回/小时、照明时间12小时/日(上午7点开灯，下午7点关灯)，固体饲料CE-2(CLEA公司)，自由饮水的饲养条件下进行1周预备饲养后，进行试验。每实验组使用小鼠10只，各检体在50mg/kg戊巴比妥静脉注射30分钟前经口给药。记录小鼠的正向反射作为睡眠时间，分析咖啡碱、可可碱及可可茶提取物对苯巴比妥诱发小鼠睡眠时间的影响。
结果如图3所示，证明对照组小鼠睡眠时间为36.57±0.5分，30mg/kg咖啡碱给药的小鼠睡眠时间为30.19±0.23分，咖啡碱缩短小鼠的睡眠时间，对戊巴比妥诱发小鼠睡眠时间显示出一定的唤醒促进作用。与咖啡碱相比可可碱也显示出一定的中枢唤醒作用倾向。但可可茶提取物则明显的延长了戊巴比妥诱发的小鼠睡眠时间(*P＞0.05，by student t-test)。可可茶的这一效果可能来自于可可碱以外的成分。很可能是来自新分离到的上述三种活性成分。
权利要求
1.可可茶提取物用于制备预防及改善疲劳及其临床症状的药物的用途。
2.可可茶提取物用于制备预防及改善疲劳及其临床症状的食品的用途。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的可可茶提取物含有活性成分可可碱，每克可可茶提取物中可可碱的含量至少为200毫克。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的可可茶提取物含有活性成分gallogatechin-gallate，即GCG，每克可可茶提取物中GCG的含量至少为40毫克。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的可可茶提取物含有活性成分1，3，4，6-tetragalloyl-glucose，即1，3，4，6-GA-glc，每克可可茶提取物中1，3，4，6-GA-glc的含量至少为25毫克。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的可可茶提取物含有活性成分gallogatechin-3，5-digallate，即GC-3，5-diGA，每克可可茶提取物中GC-3，5-diGA的含量至少为100毫克。
7.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的可可茶提取物是采用热水或水与低级醇类、极性溶剂的一种或二种以上的任意混合溶剂进行提取的。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于所述的可可茶提取物在提取时，在溶剂中添加重碳酸钠和/或抗坏血酸钠盐。
9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的药物包括有效治疗剂量的可可茶提取物，以及药学上可接受的载体。
10.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的可可茶提取物的固形剂使用量为0.1％至40％重量比。
全文摘要
本发明公开了可可茶提取物及其活性成分用于制备预防及改善疲劳及其临床症状的药物及食品的应用。本发明是基于可可茶提取物及可可茶有效成分可可碱在小鼠自发运动实验、睡眠实验及悬垂实验中显示有意义的效果中得以确认和证明的。
文档编号C07H1/08GK1562281SQ20041002672
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月1日 优先权日2004年4月1日
发明者栗原博, 姚新生, 叶创兴 申请人:暨南大学