专利名称：从苦玄参中提取的苯乙醇苷类化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及从中药玄参科苦玄参属植物苦玄参中提取的苯乙醇苷类化合物，主要含有这些化合物的提取物以及它们的制备和在药物中的应用。
背景技术：
苦玄参是一种具有浓厚广西地方特色的药材广西是其主产区，首先由广西植物学者从民间发掘，并开展种植研究，现已在广西多个地区有大面积种植，药材资源丰富；首先由广西医药工作者开展植化、药理和临床研究。单味苦玄参对上呼吸道感染、腮腺炎等的治疗有良好的效果；几个以苦玄参为主要成分的中成药，临床效果反映良好。
但是，对于苦玄参的植化研究，目前只有三萜类和黄酮类化学成分的报道，且有效成分还不明确，难以对苦玄参总提取物进行取舍。所以，目前市场上几个以苦玄参为主要成分的中成药都存在服用量偏大、质量控制不准确的问题。
苦玄参中含有苯乙醇苷类化合物，苯乙醇苷类化合物是苦玄参具有清热解毒功用的物质基础含苯乙醇苷类成分的部位，至少在抗菌方面比苦玄参中的其他部位效果要好得多。多数苯乙醇苷含有酚羟基，与三氯化铁溶液作用后显墨绿色。这一特点使其可作为抗氧化剂用于预防低密度脂蛋白(LDL)的过氧化和动脉硬化症。此外，药理和临床研究结果还显示苯乙醇苷类化合物具有昆虫拒食作用、抗菌和抗病毒作用、神经系统兴奋作用、降脂作用以及对性功能障碍和健忘症等症的治疗作用等。
通过简单有效的手段分离提纯苦玄参中的苯乙醇苷类化合物，找到含有这些化合物的有效提取物，进一步将这些化合物和提取物制成治疗疾病的药物，对深入开发利用苦玄参和发展当地经济是非常有益的。
发明内容
本发明提供从玄参科苦玄参属植物苦玄参中提取的主含苯乙醇苷类化合物的提取物，本发明还进一步从该提取物中分离纯化得到5个新的苯乙醇苷类化合物。
具体地说，本发明以大孔吸附树脂或聚酰胺将苦玄参的总提取物划分成不同的部位，再通过药理实验测试其活性，发现了苦玄参中具有抗菌、促进淋巴细胞免疫活性和抗肿瘤的活性部位。之后，运用硅胶柱层析、C-18柱、中压和高压液相色谱法等分离方法，以及MS、IR、UV、IDNMR和LDNMR等多种鉴定技术，从该活性部位中分离鉴定了8个苯乙醇苷类化合物，其中5个化合物为新的化合物(即本发明的化合物)。
获得本发明的新化合物的提取分离过程如下1 总提取物的提取方法取苦玄参药材，净选，适当破碎。
1.1 水提方法将苦玄参药材投入提取罐中，加水3～15倍量，于50～100℃提取0.5～2h，滤取药液。残渣加水2～10倍量，同上法提取。合并药液，离心，或经浓缩后再离心。或在水煎浸膏(相对密度为1.05～1.30/60℃)中加入70～95％乙醇1～8倍量进行醇沉处理，取上清液，浓缩成浸膏。得到水提物。
1.2 醇提方法将苦玄参药材投入提取罐中，加30～95％乙醇(或甲醇)3～10倍量，于40～80℃提取0.5～2h，滤取药液。残渣再加30～95％乙醇(或甲醇)2～10倍量，于20～80℃提取0.5～2h。合并药液，回收乙醇(或甲醇)并浓缩至相对密度为1.02～1.2(60℃)的浸膏。得到醇提物。
2.主含苯乙醇苷类化合物的提取物2.1 大孔树脂处理方法方法一 取上述1.1和1.2的方法制备的水提物或者醇提物，上大孔树脂柱，依次用水、20～40％乙醇各2～8BV，洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥。得到提取物1。
方法二 取上述1.1和1.2的方法制备的水提物或者醇提物，上大孔树脂柱，依次用水、0.01～5％氢氧化钠溶液各2～8BV，洗脱，收集氢氧化钠洗脱液，加稀盐酸中和至pH6.0，浓缩，干燥。得到提取物2。
将方法二中的氢氧化钠洗脱液加稀盐酸至pH3～6，上大孔树脂柱依次用水和60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥。得到提取物3。
2.2 聚酰胺处理方法取上述1.1和1.2的方法制备的水提物或者醇提物，上聚酰胺柱。依次用水、30％～95％乙醇各2～8BV洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥。得到提取物4。
3.苯乙醇苷类化合物的分离取苦玄参提取物3或者提取物4，加1～3倍量硅胶拌样，过硅胶柱，以氯仿-甲醇(自19∶1至1∶1)洗脱，收集氯仿-甲醇自2∶1至1∶1之间流分，再经硅胶柱层析分离，以氯仿-甲醇-水为洗脱剂，以TLC检识，将成分相同的流分合并，得5个流分(i-v)。流分ii过RP-18中压柱，以甲醇-水(1∶1)为洗脱剂，以TLC检识，按流出先后，依次得化合物1为40mg、化合物2为25mg、化合物3为200mg。流分iii过半制备型RP-18高压柱，以甲醇-水(1∶1)为洗脱剂，得化合物4为70mg、化合物5为40mg、化合物6为15mg和化合物7为20mg。流分iv先过MCI柱，再过半制备型RP-18高压柱，以甲醇-水(2∶1)为洗脱剂，得化合物8，为60mg。
化合物4(阿克苷，acteoside)、5(异阿克苷，acteoside isomer)、6(顺式异阿克苷，cis-acteoside isomer)，为已知化合物。化合物1，化合物2，化合物3，化合物7和化合物8为新化合物，分别命名为cis-acteoside、picfeoside A、picfeosideB、picfeoside C、picfeoside D。其化学结构式如下 化合物1 苦玄参醇苷A R1＝trans-caffeoyl(反式咖啡酰基)，R2＝H化合物2 苦玄参醇苷B R2＝trans-caffeoyl(反式咖啡酰基)，R1＝H化合物3 苦玄参醇苷C R1＝R2＝H
化合物4 阿克苷R1＝trans-caffeoyl(反式咖啡酰基) R2＝R3＝R4＝R5＝H化合物5 异阿克苷 R2＝trans-caffeoyl(反式咖啡酰基) R1＝R3＝R4＝R5＝H化合物6 顺式异阿克苷 R2＝cis-caffeoyl(顺式咖啡酰基)R1＝R3＝R4＝R5＝H化合物7 顺式阿克苷R1＝cis-caffeoyl(顺式咖啡酰基)R2＝R3＝R4＝R5＝H化合物8 苦玄参醇苷D R1＝trans-feruloyl(反式阿魏酰基) R2＝R3＝R4＝acetyl(乙酰基)，R5＝CH3(甲基)其中，化合物1、2、3、7、8为新分离鉴定的化合物。
这些化合物的确认和鉴别如下化合物1浅褐色无定型粉末。负离子FAB-MS谱中，准分子离子峰出现在m/z 723[M-H]-，m/z 560处的碎片离子峰提示分子中有一个咖啡酰基。比较化合物1和3的分子量，二者之差刚好相当于一个咖啡酰基(分子量为163)。其分子式通过HRFABMS确定为C34H44O17(m/z[M-H]-723.2538，calcd.723.2500)。
在其1H NMR谱中，与化合物1相似，出现四个基团的特征信号E-caffeoyl(3个芳香质子构成的ABX系统，以及两个反式烯碳质子)、苯乙醇基(两个相互偶合的亚甲基，以及5个芳香质子，其中包括两对对称质子)、β-葡萄糖(δ4.81，d，J＝7.8Hz)和α-鼠李糖(δ6.21，d，J＝1.3Hz)。另外一个端基氢信号δ6.26(d，J＝7.8Hz)提示有一个β-芹菜糖存在。上述推断在化合物1的13C NMR谱中得到证实三个糖的端基碳原子分别出现在δ111.5，104.2和102.9，其中化学位移向低场的碳原子表示芹菜糖的端基碳为β构型[17]。DEPT谱中在δ80.4出现的季碳信号以及在δ19.3出现的甲基信号，分别归属于芹菜糖的C-3和鼠李糖的C-6。5个亚甲基碳原子信号分别归属于芹菜糖的C-4和C-5、葡萄糖的C-7、苯乙醇配基的C-7和C-8。化合物1中其他碳原子和质子均依据1D和2D NMR实验数据得到归属。基于葡萄糖上处于低场的H-4(δ5.69，t，J＝9.4)以及在HMBC谱中该质子与分子中唯一的羰基碳(δ167.1)发生远程相关，确定咖啡酰基连接于葡萄糖的C-4上。根据以上事实，化合物1的结构定为β-苯乙醇基-O-β-D-芹菜呋喃糖基-(1→4)-α-L-鼠李吡喃糖基-4-O-咖啡酰基(反式)-(1→3)-β-D-葡萄吡喃糖苷(β-phenylethoxy-O-β-D-apiofuranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-caffeoyl-β-D-glucopyranoside)。
该化合物为新化合物，我们将其命名为picfeoside C。
化合物2浅褐色无定型粉末。和化合物1一样，在负离子FAB-MS谱中，化合物2的准分子离子峰也出现在m/z 723[M-H]-。比较二者的NMR数据，差别主要在化合物2的葡萄糖中有两个碳原子向低场移动，m/z 560处的碎片离子峰提示分子中有一个咖啡酰基。比较化合物1和3的分子量，C-3移至δ82.7(Δ+2.0ppm)，C-6移至64.3(Δ+2.1ppm)。HMBC谱显示，葡萄糖的H-6(δ5.05)与唯一的羰基碳原子发生远程相关，即咖啡酰基通过酯键连接在葡萄糖的C-6位置。因此，化合物2的结构被确定为β-苯乙醇基-O-β-D-芹菜呋喃糖基-(1→4)-α-L-鼠李吡喃糖基-6-O-咖啡酰基(反式)-(1→3)-β-D-葡萄吡喃糖苷[β-phenylethoxy-O-β-D-apiofuranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl(1→3)-6-O-caffeoyl-β-D-glucopyranoside]。
该化合物为新化合物，我们将其命名为picfeoside D。
化合物3浅黄色无定形粉末。负离子FAB-MS谱中，准分子离子峰出现在m/z 561[M-H]-，对应分子式为C25H38O14。另外，m/z 429碎片离子峰m/z 429[M-132-H]-提示分子中含有一个戊糖。其分子式最后由HR FAB-MS测定(m/z[M-H]-561.2147，C25H38O14的计算值为561.2183)。
由13C和DEPT NMR谱知，化合物3含有一个甲基碳原子(δ18.9)，5个亚甲基碳原子(δ36.6，62.5，65.7，70.6，75.7)，17个次甲基碳原子(δ129.5，129.5，128.8，128.8，126.6，111.6，104.4，102.6，et al.)以及2个季碳原子(δ139.3，80.6)，由此可初步判断化合物3含三糖基团(包括一个鼠李糖和一个葡萄糖)和一个苯环上没有取代的苯乙醇基。在低场δ111.4出现的端基碳信号以及δ80.4信号提示第三个糖基为芹菜糖，且其端基中心为是β构型[17]。
将化合物3的NMR数据与含有相同三糖的已知化合物samioside[18]比较，其结构确定为β-苯乙醇基-O-β-D-芹菜呋喃糖-(1→4)-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-β-D-葡萄吡喃糖苷(β-phenylethoxy-O-β-D-apiofuranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranoside)。.
该化合物为新化合物，我们将其命名为picfeoside B。
化合物4和6在分离实验中，作者用MPLC分离得到一个化合物，有苦味，与FeCl3溶液反应成墨绿色。该化合物放置一周后，TLC检识呈两个斑点(展开剂氯仿∶甲醇∶水＝4∶1∶0.1)，再将其用半制备HPLC进行分离(流动相甲醇/水＝50/50)，即时减压蒸干。负离子FAB-MS显示出相同的准分子离子峰m/z 623[M-H]-。HR FAB-MS实验测定出这两个化合物的分子量623.1980(计算值623.1975)和623.1991(计算值623.1975)，确定它们的分子式均为C29H36O15，即化合物4和6为一对同分异构体。
前人曾从同科植物地黄中分离得到一系列酚性配糖体[10]。对比发现，化合物4的1H-和13C NMR数据与其中的阿克苷(Acteoside)[4]一致。化合物6也与它们非常接近，均显示一个咖啡酰基、一个苯乙醇基、一个葡萄糖和一个鼠李糖的特征信号。有文献报道，含不饱和芳香酰基的顺反异构体混合物在溶液中会相互转化达到等量平衡，而无法进一步纯化[11，12]。因而，化合物4和6可能为一对顺反异构体。
比较化合物4和6的1H-和13C NMR数据，二者的主要差异表现在咖啡酰基C-6的化学位移(4为δ122.7，6为δ125.9)，以及烯氢质子的化学位移和偶合常数方面。在1H NMR中，化合物6的烯氢质子信号出现在δ7.05(1H，d，J＝13.0Hz)和δ6.18(1H，d，J＝13.0Hz)，而化合物4的烯氢质子信号出现在δ8.05(1H，d，J＝16.0Hz)和δ6..74(1H，d，J＝16.0Hz)，据此我们可以判断化合物6中咖啡酰基为顺式构型(cis-form)[13]，即为4的顺式异构体，其结构为3，4-二羟基-β-苯乙醇基-O-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-4-O-咖啡酰基(顺式)-β-D-葡萄吡喃糖苷(3，4-dihydroxy-β-phenylethoxy-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-6-O-caffeoyl(-β-D-glucopyranoside)，俗名为顺式阿克苷(cis-acteoside)。化合物4和6中碳原子和质子，经HMBC、HMQC、ROESY和1H-1H COSY实验，分别进行了归属。
化合物5和7二者均为浅黄色无定形粉末，味苦，与FeCl3溶液反应后显墨绿色。负离子FAB-MS谱中显示出与化合物4和6相同的准分子离子峰m/z 623[M-H]-。由1H-和13C NMR、HMBC、HMQC和1H-1H COSY图谱均可确定二者分子中均含有一个咖啡酰基、一个苯乙醇基、一个葡萄糖和一个鼠李糖。因此，推断化合物4～7为四个同分异构体化合物。
化合物5与化合物4间的差异主要表现在葡萄糖的δC-6上，前者为64.3ppm，后者为62.4ppm。将化合物5的1H-和13C NMR数据与文献[14]对比，化合物5即可确定为异阿克苷(acteoside isomer)，咖啡酰基连接在葡萄糖的C-6上，即3，4-二羟基-β-苯乙醇基-O-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-6-O-咖啡酰基(反式)-β-D-葡萄吡喃糖苷(3，4-dihydroxy-β-phenylethoxy-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-6-O-caffeoyl(trans)-β-D-glucopyranoside)。
化合物5和7之间的差异，与化合物4和6之间的差异一致，也主要表现在烯氢质子的化学位移和偶合常数方面。在1H NMR中，化合物7的烯氢质子信号出现在δ6.88(1H，d，J＝13.0Hz)和δ5.92(1H，d，J＝13.0Hz)，而化合物5的烯氢质子信号出现在δ7.96(1H，d，J＝15.8Hz)和δ6.64(1H，d，J＝15.8Hz)。同样推断化合物7为化合物5的顺式构型，即化合物7的结构为3，4-二羟基-β-苯乙醇基-O-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-6-O-咖啡酰基(顺式)-β-D-葡萄吡喃糖苷(3，4-dihydroxy-β-phenylethoxy-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-6-O-caffeoyl(cis)-β-D-glucopyranoside)[15]。
化合物4，5和7为已知化合物，化合物6尚未见文献报道。
化合物8浅棕色无定形粉末，负离子FAB-MSm/z 777[M-H]-，对应分子式为C37H46O18。碎片离子峰m/z 601[M-C10H9O3]-，提示分子中可能有一个阿魏酰基发生断裂。化合物8的分子式最终由Negative-ion HR FABMS确证m/z 777.2582[M-H]-(C37H46O18的计算值777.2606)。
1H NMR中出现的δ3.75(3H，s)，7.30(1H，d，J＝1.8Hz)，7.16(1H，d，J＝8.0Hz)，7.26(1H，dd，J＝1.9，10.1Hz)，6.76(1H，d，J＝15.8Hz)和8.03(1H，d，J＝15.8Hz)信息，以及其UV光谱在288和330nm有最大吸收，表明有一个阿魏酰基存在。δ7.14(1H，d，J＝2.0)，6.91(1H，d，J＝8.2Hz)，6.80(1H，dd，J＝2.1，7.9Hz)以及2.98(2H，t，J＝7.3Hz)信息，说明8分子中有一个苯乙醇基。在其13C NMR谱中，有两个端基碳信号出现在04.3(d)和δ100.1(d)，结合δ63.4(t)和δ18.9(q)信息，推测有一个鼠李糖基和一个葡萄糖基存在。此外，化合物8还含有3个乙酰基(1H NMR δ1.89s，1.99s和2.06s；13C NMR δ20.7，20.8，20.8，170.4，170.4和170.7)，以及2个甲氧基(1H NMR δ3.71s和3.75s；13C NMR δ55.9q和56.1q)。将其1H和13C NMR数据与已知化合物Acetylmartynoside A[16]比较，前者仅比后者多一个乙酰基。
在HMBC谱中，鼠李糖上的H-2和H-3以及葡萄糖上的H-6(均通过1H-1HCOSY和HMQC确定)，分别与3个乙酰基上的羰基碳远程相关，由此确定了三个乙酰基的连接位置。在负离子FAB-MS中，m/z 547[M-rha-2Ac]-碎片离子峰也表明鼠李糖上连有两个乙酰基。
同理，两个甲氧基、苯乙醇基和鼠李糖基与葡萄糖的连接位置得以确定，化合物8的结构被确定为3-羟基-4-甲氧基-β-苯乙醇基-O-2’，3’-二乙酰基-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→3)-4-O-阿魏酰基(反式)-β-D-葡萄吡喃糖苷(3-hydroxy-4-methoxy-β-phenylethoxy-O-2’，3’-diacetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-feruloyl(trans)-6-O-acetyl-β-D-glucopyranoside Similarly)。
该化合物为新化合物，我们将其命名为picfeoside A。
以上化合物中化合物1、化合物2、化合物3、化合物7、化合物8为本发明的化合物。
通过以上1.1，1.2，2.1，2.2的提取方法，可以得到提取物1、2、3、4，这些提取物同样具有良好的药理活性，其中提取物3和提取物4为优选。
通过以上方法获得的提取物和化合物具有优良的药理活性，以下通过实验说明它们的作用。
4.药理活性对提取物1、2、3、4进行的药理活性测试，结果如下。
4.1 体外抑菌实验表1苦玄参提取部位最小抑菌浓度(MIC)测定
*注“-”表示无抑菌活性。
4.2免疫活性测试表2T、B淋巴细胞的增殖反应及细胞毒性实验结果
两种均具有一定的促进淋巴细胞免疫活性的作用。提取物4在100μg/ml浓度时有细胞毒作用，而提取物3在100μg/ml浓度时无细胞毒作用，提示样品3要优于样品4，推测两种工艺对样品成分有一定的影响。
4.3 抗肿瘤生物活性体外筛选试验cdc25s磷酸酯酶是蛋白酪氨酸磷酸酯酶家族成员中的一类双特异性磷酸酯酶，它可以去除细胞周期调节蛋白复合物CDK-Cyclin上的抑制性磷酸，从而推动细胞进入有丝分裂。它在许多肿瘤细胞中过度表达，并认为cdc25s至少是两个致癌基因(Rafl，c-Myc)的潜在靶点，可以和其他致癌基因共同作用，并且cdc25s磷酸酯酶底物特异性高并且催化机制专一，是有效的抗癌药物靶点。
表3提取物对细胞分裂周期磷酸酯酶cdc25的抑制试验cdc25抑制率％(化合物cdc25抑制率％(化合物IC50样品编号 活性评价浓度为100μg/ml)浓度为10μg/ml) (μg/ml)提取物475.862.27.6有活性提取物395.486.71.7有活性阳性对照 - - 4两种提取物均对cdc25s磷酸酯酶具有抑制活性，且提取物3要优于提取物4，提示两种工艺对成分有一定的影响。
对于本发明的5个新的化合物，同样进行了类似的研究实验，实验结果与提取物3和提取物4相似。
由于提取物3、4具有更加优越的特性，因此，是本发明优选的。
本发明还提供含有作为药物活性成分的生理有效量的提取物3、提取物4、化合物1、化合物2、化合物3、化合物7、化合物8的药物组合物。
这些提取物和化合物可以单独一种作为活性成分，也可以一种以上组合在一起作为活性成分。
本发明的组合物，可以是单位剂量的制剂形式，根据制剂的需要，其中可以加入药物可接受的载体。载体的比例可根据制剂的需要占组合物重量比的0.1-99.9％，其余为活性组分，活性组分的量在单位剂量的制剂中可以是1-1000mg，优选的是50-500mg，更优选的是100-400mg，其余为药物可接受的载体。
本发明的组合物的制备方法可以是常规的药物制剂的制备方法，如将原料和辅料混合均匀，根据制剂学常规技术制成不同的适合服用的剂型。
本发明的组合物可以制成任何适合服用的剂型，这些剂型选自片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、糖浆剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂、缓释制剂、控释制剂。优选的是口服剂型。
本发明的组合物制剂，其口服给药的制剂如片剂和胶囊通常为一种单位剂量，并含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂。对于片剂，还可对片剂进行包衣。
适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性成分分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。
口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。
对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的原料和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将原料溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。
用基本相同的方式制备胃肠外悬浮液，除了是将活性化合物悬浮在载体而不是将其溶解，而且在将其悬浮于无菌载体之前，用环氧乙烷对其进行消毒。表面活性剂或湿润剂可包括在此组合物中，以利于这种活性化合物的均匀分布。
本发明的制剂，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述的载体选自甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
本发明的制剂在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服1-3次，每次1-20剂，如1-20针或粒或片。
本发明提供的苦玄参提取物以及苯乙醇苷类化合物及其组合物，具有优越的免疫活性和抗肿瘤活性，而且具有低毒，用量小，活性强的特点，对开发利用苦玄参是有利的。
具体实施例方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1提取物1制备1)水提物制备将苦玄参药材投入提取罐中，加水8倍量，于50～100℃提取1h，滤取药液。残渣加水6倍量，同上法提取。合并药液，离心，或经浓缩后再离心。或在水煎浸膏(60℃下相对密度为1.20)中加入90％乙醇8倍量进行醇沉处理，取上清液，浓缩成浸膏。得到水提物。
2)醇提物提取将苦玄参药材投入提取罐中，加30～95％乙醇(或甲醇)8倍量，于50～80℃提取1～2h，滤取药液。残渣再加30～95％乙醇(或甲醇)8倍量，于20～80℃提取1h。合并药液，回收乙醇(或甲醇)并浓缩至相对密度为1.02～1.2(60℃)的浸膏。得到醇提物。
3)取上述1)的水提物，上大孔树脂柱，依次用水、40％乙醇各4BV，洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥。得到提取物1。
实施例2提取物2的制备1)水提物制备将苦玄参药材投入提取罐中，加水8倍量，于50～100℃提取1h，滤取药液。残渣加水6倍量，同上法提取。合并药液，离心，或经浓缩后再离心。或在水煎浸膏(60℃下相对密度为1.20)中加入90％乙醇6倍量进行醇沉处理，取上清液，浓缩成浸膏。得到水提物。
2)醇提物提取将苦玄参药材投入提取罐中，加30～95％乙醇(或甲醇)8倍量，于50～80℃提取1h，滤取药液。残渣再加30～95％乙醇(或甲醇)8倍量，于20～80℃提取0.5～2h。合并药液，回收乙醇(或甲醇)并浓缩至相对密度为1.02～1.2(60℃)的浸膏。得到醇提物。
3)提取物2的制备取上述1)方法制备的水提物，上大孔树脂柱，依次用水、0.2％氢氧化钠溶液各2～8BV，洗脱，收集氢氧化钠洗脱液，加稀盐酸中和至pH6.0，浓缩，干燥。得到提取物2。
实施例3提取物3的制备1)水提物制备将苦玄参药材投入提取罐中，加水6倍量，于50～100℃提取1h，滤取药液。残渣加水8倍量，同上法提取。合并药液，离心，或经浓缩后再离心。或在水煎浸膏(60℃下相对密度为1.20)中加入90％乙醇6倍量进行醇沉处理，取上清液，浓缩成浸膏。得到水提物。
2)醇提物提取将苦玄参药材投入提取罐中，加30～95％乙醇(或甲醇)9倍量，于50～80℃提取0.5～2h，滤取药液。残渣再加30～95％乙醇(或甲醇)8倍量，于20～80℃提取2h。合并药液，回收乙醇(或甲醇)并浓缩至相对密度为1.02～1.2(60℃)的浸膏。得到醇提物。
3)取上述2)的方法制备的醇提物，上大孔树脂柱，依次用水、0.2％氢氧化钠溶液各2～8BV，洗脱，收集氢氧化钠洗脱液，加稀盐酸至pH3～6，上大孔树脂柱依次用水和60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥。得到提取物3。
实施例4提取物4的制备1)水提物制备将苦玄参药材投入提取罐中，加水6倍量，于50～100℃提取1h，滤取药液。残渣加水8倍量，同上法提取。合并药液，离心，或经浓缩后再离心。或在水煎浸膏(60℃下相对密度为1.20)中加入90％乙醇6倍量进行醇沉处理，取上清液，浓缩成浸膏。得到水提物。
2)醇提物提取将苦玄参药材投入提取罐中，加30～95％乙醇(或甲醇)9倍量，于50～80℃提取0.5～2h，滤取药液。残渣再加30～95％乙醇(或甲醇)8倍量，于20～80℃提取2h。合并药液，回收乙醇(或甲醇)并浓缩至相对密度为1.02～1.2(60℃)的浸膏。得到醇提物。
3)提取物4制备取上述2)的方法制备的醇提物，上聚酰胺柱。依次用水、30％～95％乙醇各2～8BV洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥。得到提取物4。
实施例5化合物1的制备取苦玄参提取物3，加1～3倍量硅胶拌样，过硅胶柱，以氯仿-甲醇(自19∶1至1∶1)洗脱，收集氯仿-甲醇自2∶1至1∶1之间流分，再经硅胶柱层析分离，以氯仿-甲醇-水为洗脱剂，以TLC检识，将成分相同的流分合并，得5个流分(i-v)。流分ii过RP-18中压柱，以甲醇-水(1∶1)为洗脱剂，按流出先后，收集流速最快的单体化合物流份，以TLC检识后，得化合物1，质量约为40mg。
实施例6化合物2的制备取苦玄参提取物4，加1～3倍量硅胶拌样，过硅胶柱，以氯仿-甲醇(自19∶1至1∶1)洗脱，收集氯仿-甲醇自2∶1至1∶1之间流分，再经硅胶柱层析分离，以氯仿-甲醇-水为洗脱剂，以TLC检识，将成分相同的流分合并，得5个流分(i-v)。流分ii过RP-18中压柱，以甲醇-水(1∶1)为洗脱剂，按流出先后，收集流速仅次于化合物1的单体化合物流份，以TLC检识后，得化合物2，质量约为25mg。
实施例7化合物3的制备取苦玄参提取物3，加1～3倍量硅胶拌样，过硅胶柱，以氯仿-甲醇(自19∶1至1∶1)洗脱，收集氯仿-甲醇自2∶1至1∶1之间流分，再经硅胶柱层析分离，以氯仿-甲醇-水为洗脱剂，以TLC检识，将成分相同的流分合并，得5个流分(i-v)。流分ii过RP-18中压柱，以甲醇-水(1∶1)为洗脱剂，按流出先后，收集流速仅次于化合物2的单体化合物流份，以TLC检识后，得化合物3，质量约为200mg。
实施例8化合物7的制备取苦玄参提提取物4，加1～3倍量硅胶拌样，过硅胶柱，以氯仿-甲醇(自19∶1至1∶1)洗脱，收集氯仿-甲醇自2∶1至1∶1之间流分，再经硅胶柱层析分离，以氯仿-甲醇-水为洗脱剂，以TLC检识，将成分相同的流分合并，得5个流分(i-v)。流分iii过半制备型RP-18高压柱，以甲醇-水(1∶1)为洗脱剂，得化合物7，质量约为20mg。
实施例9化合物8的制备取苦玄参提取物3，加1～3倍量硅胶拌样，过硅胶柱，以氯仿-甲醇(自19∶1至1∶1)洗脱，收集氯仿-甲醇自2∶1至1∶1之间流分，再经硅胶柱层析分离，以氯仿-甲醇-水为洗脱剂，以TLC检识，将成分相同的流分合并，得5个流分(i-v)。流分iv先过MCI柱，再过半制备型RP-18高压柱，以甲醇-水(2∶1)为洗脱剂，得化合物8，质量约为60mg。
实施例10含有提取物1的片剂的制备取100g提取物1，与淀粉200g，糖粉100g，混合，95％乙醇为润湿剂，制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁为润滑剂，压片，包衣，制成1000片包衣片。
实施例11含有提取物2的组合物的制备取100g提取物2，与淀粉200g，糖粉100g，混合，95％乙醇为润湿剂，制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁为润滑剂，压片，包衣，制成1000片包衣片。
实施例12取100g提取物3，与淀粉200g，糖粉100g，混合，95％乙醇为润湿剂，制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁为润滑剂，压片，包衣，制成1000片包衣片。
实施例13取100g提取物4，与淀粉200g，糖粉100g，混合，95％乙醇为润湿剂，制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁为润滑剂，压片，包衣，制成1000片包衣片。
实施例14取10g化合物1，与淀粉200g，糖粉100g，混合，95％乙醇为润湿剂，制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁为润滑剂，压片，包衣，制成1000片包衣片。
实施例15取10g化合物2，与淀粉200g，糖粉100g，混合，95％乙醇为润湿剂，制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁为润滑剂，压片，包衣，制成1000片包衣片。
实施例16取10g化合物3，与淀粉200g，糖粉100g，混合，95％乙醇为润湿剂，制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁为润滑剂，压片，包衣，制成1000片包衣片。
实施例17取10g化合物7，与淀粉200g，糖粉100g，混合，95％乙醇为润湿剂，制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁为润滑剂，压片，包衣，制成1000片包衣片。
实施例18取10g化合物8，与淀粉200g，糖粉100g，混合，95％乙醇为润湿剂，制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁为润滑剂，压片，包衣，制成1000片包衣片。
权利要求
1.一种中药苦玄参的提取物，其特征在于，经过以下步骤制备得到，a.苦玄参药材用水提取，用乙醇沉淀，或苦玄参药材用乙醇提取，b.a步骤所得水提醇沉后的上清液或醇提物，经过大孔树脂或聚酰胺层析柱层析。
2.权利要求1的提取物，其特征在于，所经过的步骤还包括，c.依次用水洗脱，用乙醇或氢氧化钠溶液洗脱，d.收集乙醇洗脱液或氢氧化钠洗脱液。
3.权利要求2的提取物，其特征在于，还经过将步骤d的氢氧化钠洗脱液加盐酸调节PH值至pH3～6，用大孔树脂柱层析，依次用水和20％～95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液的步骤。
4.权利要求2或3的提取物，其特征在于，还经过将洗脱液浓缩、干燥的步骤。
5.权利要求1的提取物，其特征在于，经过以下步骤制备得到a.苦玄参药材用水提取，用乙醇沉淀，或苦玄参药材用乙醇提取，b.a步骤所得水提醇沉后的上清液或醇提物，上聚酰胺层析柱层析，c.依次用水、20％～95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，d.浓缩，干燥。
6.权利要求1的提取物，其特征在于，经过以下步骤制备得到a.苦玄参药材用水提取，用乙醇沉淀，或苦玄参药材用乙醇提取，b.a步骤所得水提醇沉后的上清液或醇提物，水提物或者醇提物，用大孔树脂柱层析，c.依次用水、氢氧化钠溶液，洗脱，收集氢氧化钠洗脱液，加稀盐酸至pH3～6，d.用大孔树脂柱层析，依次用水和乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液。
7.权利要求2的提取物，其特征在于，步骤c中作为洗脱剂的乙醇为20～95％浓度的乙醇，氢氧化钠溶液为0.01～5％浓度的氢氧化钠溶液。
8.以权利要求1-7的提取物作为药物活性成分的药物组合物。
9.权利要求6的组合物，其特征在于，是单位剂量的制剂形式，其中活性成分的量在单位剂量的制剂中为1-1000mg，其余为药物可接受的载体，载体的比例占组合物重量比的0.1-99.9％。
10.权利要求9的组合物，是适合药用的任何剂型。
11.权利要求10的组合物，是经过胃肠道给药的剂型。
12.权利要求11的组合物，是片剂，胶囊剂，颗粒剂，丸剂，口服液剂型。
13.从权利要求1-7的提取物中制备的化合物，具有以下结构， 其中R1是反式咖啡酰基时，R2是H或R1是H时，R2是反式咖啡酰基，或R1＝R2＝H
14.从权利要求1-7的提取物中制备的化合物，具有以下结构， 其中R1＝顺式咖啡酰基，R2＝R3＝R4＝R5＝H或R1＝反式阿魏酰基，R2＝R3＝R4＝乙酰基，R5＝CH3
15.以权利要求13或14的化合物作为药物活性成分的药物组合物。
16.权利要求15的组合物，其特征在于，是单位剂量的制剂形式，其中活性成分的量在单位剂量的制剂中为1-1000mg，其余为药物可接受的载体，载体的比例占组合物重量比的0.1-99.9％。
全文摘要
本发明涉及从苦玄参中提取的苯乙醇苷类化合物，主要含有这些化合物的提取物以及组合物，它们的制备和在药物中的应用，这些化合物和提取物是经过水提或醇提，经过大孔树脂或聚酰胺或硅胶进行层析，用水或乙醇或碱水洗脱得到，这些化合物或提取物具有抗菌作用和抗肿瘤作用。
文档编号C07H15/18GK1563026SQ20041003064
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月2日 优先权日2004年4月2日
发明者邹节明, 王力生, 王征 申请人:桂林三金药业股份有限公司