专利名称：一种高生物活性的角质细胞生长因子突变体，其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞生长因子，具体地说涉及一种高生物活性的角质细胞生长因子突变体，还涉及其制备方法及用途。
背景技术：
目前，成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors，FGFs)超家族已经有24个成员。角质细胞生长因子-2(keratinocyte growth factor-2，KGF-2)也叫成纤维细胞生长因子-10(FGF-10)，是FGFs超家族中角质细胞生长因子(KGFs)家族的一员。1997年，Emoto等首次克隆得到人KGF-2 cDNA全长627bp，编码由208个氨基酸残基组成的单链多肽，其N端有一段约40个氨基酸残基组成的疏水信号肽序列。对人KGF-2与其受体FGFR2IIIb复合物的晶体结构分析表明，KGF-2分子中与FGFR2IIIb的主要作用位点包括Leu73、Gln74、Gly75、Asp76、Arg78、Thrl14、Phe146、Glu154和Arg155。对突变体D76A、R78A和R155A进行的研究表明，它们的受体结合力和促上皮细胞增殖活性较野生型KGF-2都明显下降，表明这三个氨基酸残基在KGF-2与受体结合中起重要作用。
KGF-2有两个细胞膜表面受体，即FGFR1IIIb和FGFR2IIIb，二者分别由FGFR1和FGFR2基因编码。KGF-2与FGFR2IIIb的结合力很高，而与FGFR1IIIb的结合力很低，只有在高浓度KGF-2存在的情况下才与FGFR1IIIb结合。FGFR2IIIb仅在上皮细胞中表达，KGF-2特异性促进上皮细胞增殖和分化的作用，主要是通过FGFR2IIIb介导的信号传导途径完成的。FGFR1IIIb在多种类型的成纤维细胞中都表达，在皮肤的部分脂肪腺、海马和小脑的神经元中也高水平表达，但对于KGF-2由FGFR1IIIb介导的信号通路的生物学作用仍不清楚。
KGF-2由间充质来源的细胞合成，并通过直接作用或与其它FGFs的相互作用通过上皮一间充质屏障，调节个体发育。在脊椎动物的个体发育过程中，KGF-2参与并调控多种组织和器官的形成。KGF-2基因敲除鼠没有肺的发育，出生即死亡，也没有前后肢、甲状腺、垂体和唾液腺的分化，牙齿、肾、毛囊和消化系统的发育也存在缺陷。在脊椎动物肢的发育过程中，肢间充质细胞表达KGF-2并诱导形成尖外胚层嵴。在脊椎动物肺分支形态建成过程中，KGF-2由肺节周围的中胚层间充质细胞表达，并通过趋化效应作用于远端内胚层细胞，促进肺分支的形成。
KGF-2是一个多功能的细胞生长因子，能特异性促进上皮细胞的生长、增殖和迁移，在临床应用研究中倍受关注。研究表明，KGF-2在促进创口愈合，预防辐射对正常机体造成的损伤，以及治疗溃疡等方面都有非常好的效果。
Smith等用无胸腺裸鼠的皮肤移植实验模型，表明KGF-2对移植皮肤的愈合具有极为显著的促进作用。Xia等利用局部缺血损伤诱导的兔耳真皮溃疡模型，表明KGF-2能显著促进表皮细胞的生长，加快上皮组织和肉芽组织的形成。对小鼠背部皮肤切割创口模型的研究表明KGF-2能增加创口的机械张力和胶原质含量，加快创口愈合，在起始和加速外伤性创口愈合中发挥重要作用。与KGF-1、TGF-β等其它生长因子相比，KGF-2对创口愈合效果最好，并且几乎不形成明显的疤痕。因此，KGF-2对外科手术创口的愈合研究很有价值。
KGF-2在预防辐射对正常机体造成的损伤方面也有非常显著的作用。Okunieff等对受辐射鼠模型的研究表明，KGF-2能提高骨髓对全身辐射的耐受性，保护小肠隐窝受到辐射损伤，降低辐射引起的胃肠道损伤，预防粘膜炎的发生。对胸部进行局部照射的大鼠，KGF-2气管滴注能显著降低局灶性肺炎和肺纤维化程度，对射线诱发的肺损伤有保护作用。FGFs超家族的许多成员对正常组织都具有辐射防护作用，但同时又与辐射诱导的正常组织损伤、肿瘤的进攻性和转移有关。KGF-2由于其受体的特异性，使它在具备防辐射损伤作用的同时没有潜在的负作用。Alderson等对人的乳腺癌、卵巢癌、肺癌等30种癌细胞系进行的体内外实验结果都表明，虽然这些细胞表面都有FGFR2IIIb，但KGF-2并不促进这些肿瘤细胞生长，表明KGF-2只选择性作用于正常上皮细胞，而不促进肿瘤细胞的增殖。Ning等对人鳞状癌细胞系增殖作用的研究也表明，KGF-2不促进鳞状癌细胞系的增殖，同时也不影响这些细胞对辐射的敏感性。这些实验结果都表明，KGF-2对临床上放化疗患者的治疗很有价值，既不影响临床治疗效果，还能保护患者的正常组织免受辐射损伤，并且还有增加癌症治疗中放疗指标的潜力。
另外，KGF-2对溃疡和肠炎也有很好的治疗效果。Miceli等对利用硫酸葡聚糖钠盐诱导的鼠溃疡模型的研究发现，注射KGF-2几乎能完全恢复肠道表面的正常细胞构造，KGF-2通过促进上皮细胞受损伤单层的重建，修复肠道表面的细胞构造。Han等利用消炎痛诱导的大鼠肠溃疡模型研究也表明，KGF-2静脉注射能显著降低急性和慢性肠损伤。持续的KGF-2给药，能维持小鼠正常体重，改善宏观和微观肠炎症和溃疡，降低贫血，并且没有明显的毒副作用，表明KGF-2对溃疡和肠炎的临床治疗意义。
目前，美国人类基因组科学公司正在进行重组人KGF-2的新药研究工作。该实验小组对重组人KGF-2对猕猴和健康人的药物学和药代动力学效果进行了评估，实验结果表明，KGF-2每天给药并没有药物的累积效应及显著的免疫原性，表明KGF-2局部用于皮肤是安全的。该公司正在进行三项KGF-2的II期临床试验一是静脉溃疡；二是骨髓移植前高剂量化疗引起的粘膜炎；三是溃疡性大肠炎。其中静脉溃疡的实验已基本完成。实验结果显示了KGF-2良好的治疗效果。KGF-2作为一种新型多肽类药物有着广阔的市场开发和应用前景。
到目前为止，尚未见到在第115位和第117位氨基酸残基突变的KGF-2突变体的报道。
发明内容
本发明公开了一种人角质细胞生长因子突变体，该突变体是将人角质细胞生长因子的第115位氨基酸残基由丝氨酸残基突变为苏氨酸残基，第117位氨基酸残基由谷氨酸残基突变为丙氨酸残基。将此突变体命名为KGF-2/STEA。
本发明的突变体KGF-2/STEA具有序列表中序列4所示的氨基酸序列，其编码基因具有序列表中序列3所示的核苷酸序列。
本发明还公开了人角质细胞生长因子突变体KGF-2/STEA的制备方法。该方法包括如下步骤1、突变体KGF-2/STEA的cDNA序列的克隆。
根据已报道的KGF-2基因序列(序列表中序列1所示)，设计并合成针对KGF-2 cDNA序列的特异性引物，利用PCR方法从人胎肝cDNA文库中克隆KGF-2cDNA。扩增产物回收，酶切后与测序载体连接，制备重组质粒，转化感受态细胞，筛选阳性克隆并测序。
然后进行突变体KGF-2/STEA cDNA的克隆KGF-2/STEA是双位点突变体，所以需要将两个突变位点依次分别引入，即先产生E117A位点突变的cDNA，然后再以此cDNA为模板，引入S115T位点突变，从而获得KGF-2/STEA双突变体cDNA序列。具体方法如下以上面制备的含有KGF-2基因序列的重组质粒为模板，分别用两对引物扩增，引入E117A突变位点，获得包含KGF-2/E117A全长基因的两个重叠片段。然后，将扩增产物混合作为模板，利用KGF-2两端引物进行PCR反应，获得E117A位点突变的cDNA。以此片段为模板，按上述相同方法，获得E117A位点以及S115T位点突变的KGF-2/STEA cDNA。将该cDNA回收酶切后与经相同酶切的质粒进行连接，连接产物转化感受态细胞，筛选阳性克隆并测序。
2、重组人KGF-2和KGF-2/STEA的表达和纯化分别从由含有KGF-2的质粒和含有KGF-2/STEA的质粒转化的大肠杆菌的平板上挑取单克隆菌落，接入培养基中培养，并诱导表达，离心收菌。菌体沉淀进行超声破碎，取上清过SP阳离子交换柱，目的蛋白在0.9M NaCl处洗脱。经15％SDS-PAGE电泳分析和Western blotting鉴定表明纯化产物仅为一条目的蛋白带，主要存在于超声裂解上清中，大小约21kD，表达量约占菌体总蛋白的20％。(见图1，图2)。
3.重组人KGF-2和KGF-2/STEA的生物学活性检测包括受体结合力检测和促细胞增殖活性检测。其中受体结合力检测是利用竞争性ELISA方法进行的。实验结果表明KGF-2/STEA的受体结合力较KGF-2显著增强(见图3)。采用正常大鼠气管上皮细胞，用MTT法进行促细胞增殖活性检测，结果表明KGF-2/STEA的促上皮细胞增殖活性较KGF-2明显增强，而且差异显著(图8)。
KGF-2分子中的115Ser与其受体分子中的多个氨基酸残基都有相互作用，本发明将KGF-2分子中115Ser突变成多一个侧链甲基的Thr，从而加强KGF-2与受体的相互作用。同时KGF-2分子中117Glu主要是通过主链C和N原子与受体作用，将其突变为Ala，在不减少与受体作用的前提下，消除其长侧链可能产生的空间位阻。本发明通过PCR方法，以KGF-2cDNA为模板，利用特异性引物引入突变，获得突变体KGF-2/STEA的cDNA序列。将此cDNA连入原核表达载体中，利用大肠杆菌进行表达。对突变体KGF-2/STEA的检测表明，其生物学活性均较野生型的KGF-2有显著增强，达到了通过突变增强其生物学活性的目的。
本发明还公开了突变体KGF-2/STEA的用途。
本发明通过实验证明突变体KGF-2/STEA的生物性活性如受体结合力和促上皮细胞增殖活性较KGF-2都显著增强，因此突变体KGF-2/STEA具有KGF-2的各种功能和用途。它能起始和加速外伤性创口的愈合，快速高效修复各种皮肤损伤，减少疤痕形成，对临床上治疗浅度烧伤及其他皮肤损伤有重要价值；还具有辐射防护作用，它能促进正常上皮细胞增殖，而对肿瘤细胞既不促进其增殖，也不降低其对辐射的敏感性，所以对临床放化疗治疗中保护患者的正常组织和器官免受辐射损有重要价值，同时还有增加癌症治疗中放疗指标的潜力；可用于溃疡以及肠炎的治疗。因此突变体KGF-2/STEA可以作为一种潜在的新型多功能药物制剂，具有非常重要的商业价值和十分广阔的市场开发和应用前景。
另一方面，由于它能促进角质上皮细胞的增殖，加速皮肤角质层和基底层的修复，所以具有延缓皮肤细胞衰老，促进皮肤细胞修复，使皮肤光滑丰润的作用，因此可用于美容和化妆品行业。
图1为BL21超声破碎电泳结果。其中1.pET17b/STEA转化的BL21；2.pET17b转化的BL21；3.pET17b/KGF-2转化BL21的超声沉淀；4.pET17b/KGF-2转化BL21的超声上清；5.pET17b/STEA转化BL21的超声沉淀；6.pET17b/STEA转化BL21的超声上清。
图2为目的蛋白的纯化和Western blotting结果。其中1.低分子量蛋白标准；2.重组人KGF-2纯化产物；3.KGF-2/STEA纯化产物；4.KGF-2/STEA的Western blotting结果；5.重组人KGF-2的Western blotting结果。
图3为竞争性ELISA对受体结合力的检测结果。
图4为MTT法对RTE细胞促增殖作用的检测结果。
具体实施例方式
实施例一重组人KGF-2及KGF-2/STEAcDNA序列的克隆一、材料
1.菌株、载体和细胞E.coli BL21菌株和pET17b原核表达载体均为本室保存，正常大鼠气管上皮细胞(RTE)购自协和基础医学细胞中心，2.酶与试剂人胎肝cDNA文库购自Clontech公司，BamHI、NdeI、Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司，T4 DNA连接酶和小量质粒提取试剂盒购自Promega公司，DNA回收试剂盒购自鼎国生物公司，重组人FGFR2β(IIIb)/Fc购自R&D公司，酶标板和96孔细胞培养板购自Costar公司，TMB购自AMRESCO公司，HRP标记的二抗购自CHEMICON公司，SP SepharoseFastflow阳离子交换柱购自Pharmacia公司，胎牛血清、MEM培养基和胰酶消化液均购自Gibco公司，MTT购自Sigma公司，其它生化试剂均为国产分析纯。
3.培养基LB培养基液体培养基称取胰化蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母抽提物5g，用蒸馏水定溶至1L；固体培养基则需再加15g琼脂。
RM培养基称取Na2HPO4·12H2O 15.12g，KH2PO43g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1g，MgCl2·6H2O 0.203g，50％甘油20ml，酸水解酪蛋白20g，调PH至7.0，用蒸馏水定溶至1L。
二、方法与结果根据已报道的KGF-2基因序列，设计并合成了针对成熟KGF-2 cDNA序列的特异性引物F1(见序列表中序列5)和R1(见序列表中序列6)，利用PCR方法从人胎肝cDNA文库中克隆KGF-2 cDNA。PCR反应体系为20μl10×buffer2μl，2.0mmol/L dNTP 2μl，5pmol/μl的F1 2μl，5pmol/μl的R1 2μl，人胎肝cDNA 1.5μl，Taq DNA聚合酶0.2μl，ddH2O 10.3μl。扩增条件为94℃预变性5min；94℃ 30s，50℃30s，72℃30s，25个循环；72℃延伸2min。扩增产物回收后经NdeI和BamHI双酶切后与经相同酶双切的pET17b质粒进行连接，连接产物转化E.coli BL21感受态细胞，筛选阳性克隆送Bioasia公司测序。经测序，证明克隆到正确的成熟KGF-2 cDNA序列，见序列表中序列1，其编码的氨基酸序列见序列表中序列2，该质粒记为pET17b/KGF-2。
突变体KGF-2/STEA cDNA的克隆KGF-2/STEA是双位点突变体，所以需要将两个突变位点依次分别引入，即先产生E117A位点突变的cDNA，然后，再以此cDNA为模板，引入S115T位点突变，从而获得KGF-2/STEA双突变体cDNA序列。具体步骤如下以pET17b/KGF-2质粒为摸板，分别利用引物F1和rE117A(其序列如序列表中序列7所示)，以及fE117A(其序列如序列表中序列8所示)和R1进行扩增。PCR反应体系为20μl10×buffer 2μl，2.0mmol/LdNTP 2μl，5pmol/μl引物各2μl，模板0.2μl，Pfu DNA聚合酶0.4μl，ddH2O11.4μl。扩增条件为94℃预变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，22个循环；72℃延伸2min。扩增产物分别回收后，各取0.1μl，混合后作为模板，利用引物F1和R1进行PCR反应，反应体系和条件同前，扩增产物回收，此时获得的片段为E117A位点突变的cDNA。以此片段为模板，利用引物F1和rS115T/E117A(其序列如序列表中序列9所示)以及fS115T/E117A(其序列如序列表中序列10所示)和R1分别进行PCR反应，扩增产物分别回收后，各取0.1μl，混合后作为模板，利用引物F1和R1再次进行PCR，反应体系和条件同前。扩增产物回收后经NdeI和BamHI双酶切后与经相同酶双切的pET17b质粒进行连接，连接产物转化E.coli BL21感受态细胞，筛选阳性克隆送Bioasia公司测序。经测序，证明获得正确的KGF-2/STEA cDNA序列，见序列表中序列3，其编码的氨基酸序列见序列表中序列4，该质粒记为pET17b/STEA。
实施例二重组人KGF-2和KGF-2/STEA的表达和纯化一、材料同实施例一。
二、方法与结果分别从pET17b/KGF-2和pET17b/STEA转化大肠杆菌BL21的平板上挑取单克隆菌落，接入50ml含0.5％葡萄糖的氨苄抗性LB培养基中，35℃摇床摇至OD600＝0.6-1.0。收菌，并转接入1L氨苄抗性的RM培养基中，35℃摇至OD600＝0.5-1.0，加入IPTG至终浓度为0.5mM。诱导表达5h后，于4℃8000rpm离心收菌。菌体沉淀用50ml 20mM的PB(PH7.4，含2mM EDTA)缓冲液重悬，进行超声破碎，至溶液透明。于4℃10000rpm离心，取上清过SP阳离子交换柱，目的蛋白在0.9M NaCl处洗脱。经15％SDS-PAGE电泳分析和Westernblotting鉴定表明纯化产物仅为一条目的蛋白带，大小约21kD(图1，图2)，目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的20％。
实施例三重组人KGF-2和KGF-2/STEA的生物学活性测定一、材料同实施例一。
二、方法与结果1、重组人KGF-2和KGF-2/STEA的受体结合力检测利用竞争性ELISA方法对重组人KGF-2及KGF-2/STEA的受体结合力进行检测，具体操作如下将纯化的重组人KGF-2用包被稀释液(NaCO31.59g，NaHCO32.93g，用蒸馏水定容至1L)稀释至10μg/ml，以100μl/孔加入96孔酶标板，4℃包被过夜；次日，用PBS(PH 7.4，NaCl 8g，KH2PO40.24g，Na2HPO41.44g，KCl 0.2g，用蒸馏水定容至1L)洗涤3次，2min/次；每孔加入200μl 3％的脱脂奶粉(3g脱脂奶粉溶于100ml PBS中)，37℃封闭2h；用PBST(含0.05％Tween20的PBS)洗涤3次，2min/次；每孔加100μl浓度为0.5μg/ml的与Fc嵌合的FGFR2IIIb受体，37℃反应1h；用PBST洗4次，2min/次；各加入100μl用PBST稀释至1、10、50、100和500ng/ml的重组人KGF-2(或KGF-2/STEA)，记为竞争性待测孔，同时设置仅加入100μl PBST的无竞争参照孔，每个浓度做三个复孔，37℃反应1.5h；用PBST洗3次，2min/次；每孔加100μl按1∶3000稀释的HRP的Fc抗体，37℃反应45min；用PBST洗4次，2min/次；每孔加100μl TMB底物反应液(按A液[200mg TMB，100ml DMSO，用蒸馏水定容至1L]B液[14.6g Na2HPO4，9.33g柠檬酸，6.4ml 0.75％过氧化氢尿素，用蒸馏水定容至1L]1∶1混合)进行显色，5min后，每孔加50μl 2N的H2SO4终止反应，测定450nm的吸光值。按下列公式计算出校正后的待测孔吸收值校正值＝待测孔吸收值/参照孔吸收值。对重组人KGF-2和KGF-2/STEA的受体结合力测定结果进行比较，表明KGF-2/STEA的受体结合力较KGF-2显著增强(图3)。
2、重组人KGF-2和KGF-2/STEA的促细胞增殖活性检测RTE细胞为正常大鼠气管上皮细胞，用含20％胎牛血清的MEM培养液培养至80％融合时，收集细胞，以2.5×104个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，50μl/孔；然后每孔加入50μl按倍比稀释的KGF-2(或KGF-2/STEA)，终浓度分别为0.01、0.1、1、10、100和1000ng/ml，每个浓度做三个复孔；培养48h后，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)；继续培养5h后，每孔加100μl 10％SDS(溶于0.01N HCl中)，待紫色甲肷结晶溶解后，测定570nm的吸光值。对重组人KGF-2和KGF-2/STEA的促RTE增殖作用的测定结果进行比较，表明KGF-2/STEA的促上皮细胞增殖活性较KGF-2明显增强，而且差异显著(图4)。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所<120>一种高生物活性的角质细胞生长因子突变体，其制备方法及用途<130>
<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>510<212>DNA<213>
<400>1atgggtcagg acatggtgtc accagaggcc accaactctt cttcctcctc cttctcctct 60ccttccagcg cgggaaggca tgtgcggagc tacaatcacc ttcaaggaga tgtccgctgg120agaaagctat tctctttcac caagtacttt ctcaagattg agaagaacgg gaaggtcagc180gggaccaaga aggagaactg cccgtacagc atcctggaga tcacatcagt agaaatcggc240gttgttgccg tcaaagccat taacagcaac tattacttag ccatgaacaa gaaggggaaa300ctctatggct caaaagaatt taacaatgac tgtaagctga aggagaggat agaggaaaat360ggatacaata cctatgcatc atttaactgg cagcataatg ggaggcaaat gtatgtggca420ttgaatggaa aaggagctcc aaggagagga cagaaaacac gaaggaaaaa cacctctgct480cactttcttc caatggtggt acactcataa 510<210>2<211>169<212>PRT<213>
<400>2Met Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser1 5 10 15Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr Asn20 25 30His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys35 40 45Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys50 55 60
Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly65 70 75 80Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn85 90 95Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys100 105 110Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe115 120 125Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys130 135 140Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala145 150 155 160His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser165<210>3<211>510<212>DNA<213>
<400>3atgggtcagg acatggtgtc accagaggcc accaactctt cttcctcctc cttctcctct60ccttccagcg cgggaaggca tgtgcggagc tacaatcacc ttcaaggaga tgtccgctgg120agaaagctat tctctttcac caagtacttt ctcaagattg agaagaacgg gaaggtcagc180gggaccaaga aggagaactg cccgtacagc atcctggaga tcacaaccgt agcaatcggc240gttgttgccg tcaaagccat taacagcaac tattacttag ccatgaacaa gaaggggaaa300ctctatggct caaaagaatt taacaatgac tgtaagctga aggagaggat agaggaaaat360ggatacaata cctatgcatc atttaactgg cagcataatg ggaggcaaat gtatgtggca420ttgaatggaa aaggagctcc aaggagagga cagaaaacac gaaggaaaaa cacctctgct480cactttcttc caatggtggt acactcataa 510<210>4<211>169<212>PRT<213>
<400>4Met Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser1 5 10 15Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr Asn20 25 30His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys35 40 45Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys50 55 60Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Thr Val Ala Ile Gly65 70 75 80Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn85 90 95Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys100 105 110Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe115 120 125Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys130 135 140Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala145 150 155 160His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser165<210>5<211>27<212>DNA<213>
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<400>6cgggatcctt atcattatga gtgtaccacc attggaaga39<210>7<211>27<212>DNA<213>
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<400>10ctggagatca caaccgtagc aatcggc 2权利要求
1.一种角质细胞生长因子突变体，其特征在于角质细胞生长因子的第115位氨基酸残基由丝氨酸残基突变为苏氨酸残基，第117位氨基酸残基由谷氨酸残基突变为丙氨酸残基。
2.根据权利要求1所述的角质细胞生长因子突变体，其特征在于具有序列表中序列4所示的氨基酸序列。
3.权利要求1或2所述的角质细胞生长因子突变体，其特征在于其编码基因具有序列表中序列3所示的核苷酸序列。
4.制备权利要求1或2所述的角质细胞生长因子突变体的方法，其特征在于包括以下步骤(1)角质细胞生长因子突变体cDNA序列的克隆；(2)角质细胞生长因子突变体的表达和纯化；(3)角质细胞生长因子突变体活性测定。
5.权利要求1或2所述的角质细胞生长因子突变体在制备促进创伤愈合药物中的应用。
6.权利要求1或2所述的角质细胞生长因子突变体在制备辐射损伤预防药物中的应用。
7.权利要求1或2所述的角质细胞生长因子突变体在提高癌症治疗中放疗的指标中的应用。
8.权利要求1或2所述的角质细胞生长因子突变体在化妆品中的应用。
9.权利要求1或2所述的角质细胞生长因子突变体在制备溃疡治疗药物中的应用。
10.权利要求1或2所述的角质细胞生长因子突变体在制备肠炎治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种高生物活性的角质细胞生长因子突变体，还公开了该突变体的制备方法及用途。本发明的突变体是将角质细胞生长因子的第115位氨基酸残基由丝氨酸残基突变为苏氨酸残基，第117位氨基酸残基由谷氨酸残基突变为丙氨酸残基。本发明的突变体是通过基因工程中的点突变技术制备的，突变后的角质细胞生长因子的受体结合力以及促上皮细胞增殖活性均较突变前显著增强。本发明的突变体可以用于制备促进表皮创口愈合，预防辐射损伤，治疗溃疡及肠炎等方面的多肽类药物，还可以提高癌症治疗中的放疗指标。
文档编号C07K14/435GK1690078SQ200410034008
公开日2005年11月2日 申请日期2004年4月21日 优先权日2004年4月21日
发明者王金凤, 徐东刚, 王嘉玺, 彭善云, 邹民吉, 蔡欣 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所