专利名称：分离自藤黄树脂并具有抑制肿瘤/癌细胞生长活性的化合物以及包含其的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及得自于藤黄树脂(gamboge resin)的丙酮萃取产物以及从该丙酮萃取产物被进一步纯化的化合物，包括被命名为福木呫吨酮A(formoxanthone A)的新化合物，证实该丙酮萃取产物以及这些被进一步纯化的化合物具有抑制肿瘤/癌细胞生长的活性。本发明也涉及用以获得这些被进一步纯化的化合物的方法，以及该丙酮萃取产物与这些被进一步纯化的化合物用于制备抑制肿瘤/癌细胞生长的药物组合物的用途。
背景技术：
藤黄树脂是福木科(Guttiferae)藤黄属(Garcinia)植物所分泌的胶质树脂(the gamboges of Garcinia sp.)，它自古以来即被用作为植物性染料及色素的来源，也为一些地区如印度、泰国等国的民间药。
藤黄(拉丁学名Garcinia morella Desv；汉语拼音为TENGHUANG；英文名为gamboge)为常绿乔木，生长于热带地区，分布于印度者主要为Garcinia morella Desv，而分布于泰国者主要为G.harburyi Hook。在开花之前，于离地约2公尺处将茎干的皮部作螺旋状割开并收取流出的树脂，予以加热干燥后即成为固体状的藤黄树脂。
依据传统中药(Traditional Chinese Medicine，TCM)典籍的记载，藤黄具有消肿、化毒、止血、杀虫的功效。自1934年迄今，有不少文献报导藤黄树脂内所含成分的研究，而目前已知可从藤黄树脂的萃取液中分离出许多化合物，包括藤黄素(morellin)、藤黄酸(morellicacid)、藤黄树脂酸(gambogic acid)、藤黄醇(morellinol)、异藤黄素(isomorellin)、异藤黄酸(isomorellic acid)、异藤黄树脂酸(isogambogicacid)、异藤黄醇(isomorellinol)、新藤黄树脂酸(neogambogic acid)、去氧藤黄素(desoxymorellin)、二氢异藤黄素(dihydroisomorellin)、α-藤黄素(α-guttiferin)和β-藤黄素(β-guttiferin)等。
曾有文献报导，藤黄树脂含有某些成分对于人肺癌细胞(HELcell)、人子宫颈癌细胞(HeLa cell)和人鼻咽癌细胞(KB cells)等具有细胞毒活性(M.Tada等人，(1996)，Phytochemistry，41，815-920；G.A.Cordell等人，(1993)，Magnetic Resonance in Chemistry，31，340-347)。
另有报导指出，一种中国民间药，竹节香附(Anemone raddeana)的根可用于治疗风湿病与神经痛(neuralgis)，而从竹节香附根部的乙醇萃取物可分离出桦木醇与桦木酸，其中证实桦木醇可防止人白血球中的蛋白质的酪氨酰基磷酸化，因而得以抑制超氧化物产生(K.Yamashita等人，(2002)，Clinica Chimica Acta，325，91-96)。
Darrick S.H.L.Kim等人曾于Bioorganic & Medical ChemistryLetters(1998)，8，1707-1712中报导，在桦木酸的母结构上作简单的修饰可以生成能被开发成为有力的抗癌药的衍生物。另有报导指出，桦木酸会通过对粒线体产生直接作用而触发细胞凋亡(Simone Fulda等人，(1998)，The Journal Of Biological Chemistry，278，33942-33948)，并对肿瘤细胞具有选择性细胞毒性(Valentina Zuco.等人，(2002)，Cancer Letters，175，17-25)。
就申请人所知，迄今无任何文献或专利案曾经公开可由藤黄树脂分离出桦木醇与桦木酸这两种化合物。
US 6462041公开以下列化学式I、II或III表示的藤黄树脂酸及其类似物与衍生物
(其中R1至R5如该案中所定义)，上述具有化学式I、II或III的化合物被公开为硫胱胺酸蛋白酶(caspases)的活化剂与细胞凋亡的诱发剂。
EP 0 428 815 A1公开由一种由藤黄(Garcinia morella Desv.)的树脂来萃取溶细胞毒素的方法，其中涉及使用乙醇与氯仿以及薄层色谱法(TLC)，得到被命名为GMD1630的产物。但是，此件专利公开案没有公开该GMD1630产物是包含单一化合物还是由具相似性质的化合物所构成的混合物。
基于以上所述，从藤黄树脂制备具有生物活性的萃取物或纯质的化合物来供制造例如抗癌药的药物，应是极具产业上价值的。
发明内容
本发明提供一种藤黄树脂的丙酮萃取产物，而由该丙酮萃取产物可进一步纯化得到下列9种化合物桦木醇、桦木酸、藤黄酸、异藤黄酸、藤黄树脂酸、异藤黄树脂酸、异藤黄醇、去氧藤黄素以及被命名为福木呫吨酮A的新化合物。
证实依据本发明的藤黄树脂的丙酮萃取产物以及这些被进一步纯化的化合物能有效地抑制肿瘤/癌细胞的生长。因此，本发明也提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的下列任一者(i)以丙酮萃取藤黄树脂而得到的产物；(ii)福木呫吨酮A；(iii)福木呫吨酮A以及至少一种选自桦木醇、桦木酸、藤黄酸、异藤黄酸、藤黄树脂酸、异藤黄树脂酸、异藤黄醇与去氧藤黄素的化合物。
下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明，所以本发明以上所述以及其他目的与特征，可借由参照下文的描述、所附的权利要求和附图而变得更为清楚，附图中图1显示于后文中被命名为TSB-14的依据本发明的藤黄树脂的丙酮萃取产物的HPLC洗脱曲线；图2是HPLC洗脱曲线，其中依据本发明所得到的7种纯化自藤黄树脂的产物(它们于后文中分别被命名为TSB-2～TSB-8)用来作为进行HPLC分析的标准品，而各个波峰上的编号各自对应于这些产物TSB-2～TSB-8的编号；图3是HPLC洗脱曲线，其显示图1与图2的比对结果，为显现依据本发明所得到的纯化自藤黄树脂的7种产物TSB-2～TSB-8对应于TSB-14的洗脱曲线中的那些波峰，其中产物TSB-14的样品浓度被调高以方便比对；图4是HPLC洗脱曲线，其显示依据本发明的产物TSB-14的HPLC结果(上方)，以及产物TSB-14加上各为500μL的产物TSB-4丙酮溶液与产物TSB-8丙酮溶液的HPLC结果(下方)，以辨认对应于产物TSB-4与TSB-8的洗脱峰；以及图5是HPLC洗脱曲线，其显示依据本发明所得到的7种纯化自藤黄树脂的产物TSB-2～TSB-8出现在依据本发明的产物TSB-14的洗脱曲线中的对应位置。
具体实施例方式
基于藤黄树脂粉末对于萃取溶剂的溶解性以及萃取溶剂的沸点与安全性的考虑，丙酮似为最佳选择，申请人于是尝试以丙酮萃取藤黄树脂，继而移除丙酮，得到丙酮萃取产物，其被命名为TSB-14。
丙酮萃取产物TSB-14的进一步组分分离主要是采用柱色谱法，而适用的柱填充剂优选是一般常用的硅胶以及Sephadex LH-20，前者属于吸附基质，而后者为大小排阻色谱法用的柱填充剂。
该丙酮萃取产物TSB-14先以硅胶柱进行吸附色谱，并以正己烷/乙酸乙酯梯度(100/0→4/1)进行洗脱，即先以正己烷洗脱，而后渐续提高乙酸乙酯的洗脱梯度，得到3个部分，也就是GME1、GME2及GME3，其中如下面实施例2中所述，GME1是100/0→10/1的洗脱部分，GME2是10/1→4/1的洗脱部分，而GME3是4/1→1/1的洗脱部分。
上述GME1、GME2和GME3部分的洗脱溶剂皆以真空旋转蒸发仪予以去除。
于分级分离分离过程中，各个部分的检测通过薄层色谱法(TLC)与显色试剂进行，并且参照一般的操作程序来检测各个部分中的组分分离情况。
该部分GME2接而以填充有Sephadex LH-20的柱进行分子筛色谱。在以正己烷/乙酸乙酯/甲醇(2∶1∶1)洗脱后，依据TLC的检测，取第23瓶部分来重复分子筛色谱(正己烷/乙酸乙酯/甲醇，2∶1∶1)与硅胶柱色谱(正己烷/氯仿/甲醇，梯度洗脱1∶1∶0→0∶1∶0→0∶10∶1)，而在硅胶柱色谱洗脱时先后获得两个无色针状晶体产物，分别被命名为TSB-0以及TSB-1。另外，取第46瓶部分进行薄层色谱(TLC)，并取出对应于薄层色谱片上被显色试剂(参照下面实施例2及表1)显示出的粉红色点的部分来重复分子筛色谱、硅胶柱色谱，最后进行制备薄层色谱，得到两个产物，分别命名为TSB-6及TSB-7。然后，取第47瓶部分进行TLC，并取出对应于TLC片上被显色试剂显示出的粉红色点(参照下面实施例2及表1)的部分来重复分子筛色谱与硅胶柱色谱，最后再进行分子筛色谱及重结晶，得到橙黄色片状晶体，命名为TSB-2。另外又取第63瓶进行硅胶柱色谱，并以二氯甲烷/甲醇(30∶1)洗脱，再经由制备薄层色谱(正己烷/乙酸乙酯，2∶1)以及重结晶得到黄色针状晶体产物，命名为TSB-4。
对该部分GME1进行硅胶柱色谱，并以正己烷/丙酮(5∶1)洗脱，取第26瓶进行分子筛柱色谱(正己烷/乙酸乙酯/甲醇，2∶1∶1)后再经制备薄层色谱(正己烷/乙酸乙酯，4∶1)，得到两个产物，分别命名为TSB-5及TSB-3。另外，将第23瓶及第51瓶各自进行硅胶柱色谱，前者以正己烷/二氯甲烷(1∶1)洗脱，后者以正己烷及正己烷/乙酸乙酯(7∶1)梯度洗脱，继而进行TLC并取出以及合并对应于TLC片上显示出具有相同Rf值且被显示为粉红色点的部分进行硅胶柱色谱并以二氯甲烷洗脱，然后进行TLC并且集中与收集对应于TLC片上被显示为粉红色点的部分，再予以进行色谱(包括硅胶及分子筛柱色谱)，最后进行制备薄层色谱及重结晶，得到橙色针状晶体产物，命名为TSB-8。
对上述9种纯化得到的产物进行光谱分析，包括红外光谱、核磁共振谱(1H-及13C-NMR)及质谱等。
产物TSB-0与TSB-1经化学结构鉴定后确认是两种已知桦木酸衍生物，即桦木醇及桦木酸，它们分别具有下列所示化学式 TSB-0(桦木醇) TSB-1(桦木酸)产物TSB-7及TSB-2经化学结构鉴定后确认是两种已知的藤黄酸立体异构物，即藤黄酸及异藤黄酸，它们分别具有下列所示化学式 TSB-7(藤黄酸) TSB-2(异藤黄酸)产物TSB-5及TSB-3经化学结构鉴定后确认是两种已知的藤黄树脂酸立体异构物，即藤黄树脂酸与异藤黄树脂酸，它们分别具有下列所示化学式 TSB-5(藤黄树脂酸)TSB-3(异藤黄树脂酸)
产物TSB-6经化学结构鉴定后确认是异藤黄醇，它具有下列所示化学式 TSB-6(异藤黄醇)产物TSB-8经化学结构鉴定后确认是去氧藤黄素，它具有下列所示化学式 TSB-8(去氧藤黄素)经化学结构鉴定并与已知化合物的光谱资料比对结果，确认TSB-4是未曾见于文献记载的新化合物，将它命名为福木呫吨酮A，并具有下列所示的化学式 本发明从藤黄树脂所得到的产物TSB-4(福木呫吨酮A)在呫吨酮骨架上具有(1)3个羟基分别位在C-1、C-3与C-5位置处；(2)1个γ，γ-二甲基烯丙基链位在C-4位置处；(3)1个2，2-二甲基吡喃环位在C-6、C-7位置处；(4)1个二取代双键位在C-11与C-12位置之间以及1个三取代双键位在C-17与C-18位置之间。
根据上述化学结构，可经由化学反应而制备出具有下列通式的福木呫吨酮A衍生物 其中各个R独立地代表氢；被任选地取代的低级烷基，优选具有1-6个碳原子；被任选地取代并具有3-20个碳原子的芳基，优选为C5-C12芳基；被任选地取代并具有3-30个碳原子的芳烷基，优选为(C5-C12)芳基(C1-C6)烷基，更优选为(C6)芳基(C1-C3)烷基；或是以化学式Ra-CO表示的酰基，其中Ra为被任选地取代的低级烷基，优选地具有1-6个碳原子；被任选地取代并具有3-20个碳原子的芳基，优选为C5-C12芳基；被任选地取代并具有3-30个碳原子的芳烷基，优选为(C5-C12)芳基(C1-C6)烷基，更优选为(C6)芳基(C1-C3)烷基。
举例而言，因为上述羟基皆是位于芳环上，可通过甲基化而获得甲氧基衍生物，或可通过乙酰化而获得乙酰基衍生物。另外，对于位在呫吨酮环的外的双键，可通过氢化来处理该双键而生成氢化衍生物，或是以其他加成反应予以处理，例如水合可生成醇基衍生物，而过氧化可生成环氧化物衍生物，例如具有下列化学式者
申请人进一步探究本发明所得到的藤黄树脂的丙酮萃取产物、由该丙酮萃取产物进一步纯化得到的9种产物(TSB-0至TSB-8)以及由这些纯化产物所构成的混合物的生物活性，发现该丙酮萃取产物、产物TSB-2至TSB-8以及由这些产物所构成的混合物在抑制肿瘤/癌细胞(例如肝癌细胞、肺癌细胞、乳癌细胞、大肠癌细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞等)的生长方面有效。在抑制肿瘤/癌细胞的生长方面，产物TSB-0与TSB-1或许不象产物TSB-2至TSB-8的效果显著，但申请人发现，当它们与其他产物组合使用时，产物TSB-0与TSB-1似乎会展现激活其他产物的效用，因而预期产物TSB-0与TSB-1可于含有产物TSB-2至TSB-8当中至少一种的药物组合物内当作药引来用。
根据文献所载，属于三萜的桦木醇与桦木酸具有多样性的药理活性，包括在体外与体内对人黑色素瘤癌细胞有效，而且它们的安全性甚佳。因此，当与属于呫吨酮的产物TSB-2至TSB-8合用时，产物TSB-0与TSB-1这两个三萜化合物应有辅助或协同效用的功能。
因此，本发明提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的下列任一者(i)以丙酮萃取藤黄树脂而得到的产物；(ii)福木呫吨酮A；(iii)福木呫吨酮A以及至少一种选自桦木醇、桦木酸、藤黄酸、异藤黄酸、藤黄树脂酸、异藤黄树脂酸、异藤黄醇以及去氧藤黄素的化合物。
在优选的实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含以丙酮萃取藤黄树脂而得到的产物。
在另一优选的实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含福木呫吨酮A以及至少一种选自桦木醇、桦木酸、藤黄酸、异藤黄酸、藤黄树脂酸、异藤黄树脂酸、异藤黄醇以及去氧藤黄素的化合物。
在更优选的实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含福木呫吨酮A、藤黄酸、异藤黄酸、藤黄树脂酸、异藤黄树脂酸、异藤黄醇以及去氧藤黄素、桦木醇以及桦木酸。在更优选的实施方案中，本发明提供一种药物组合物，以组合物的重量为基准，其包含5％的福木呫吨酮A、8％的藤黄酸、8％的异藤黄酸、18％的藤黄树脂酸、15％的异藤黄树脂酸、2％的异藤黄醇以及4％的去氧藤黄素、8％的桦木醇以及8％的桦木酸作为活性组份。
本发明由藤黄树脂所分离纯化出的9种产物包含藤黄醇、去氧藤黄素、两种桦木酸衍生物，也就是桦木醇与桦木酸，以及两组立体异构物，也就是藤黄酸与异藤黄酸以及藤黄树脂酸与异藤黄树脂酸。再者，依据化合物的萃取与分离的实验结果，含量最高的是藤黄树脂酸与异藤黄树脂酸这两个立体异构物，接而为藤黄酸与异藤黄酸这两个立体异构物。
申请人依照化合物的结构特性来将该9种产物作不同的组合，而证实该9种产物的各式组合都会表现出优异的抑制癌细胞生长的效用。因此，参照初步的药理试验结果并考虑上述9种产物的产业应用，可就期望的效用来将上述9种产物配制成具不同活性组份与组成比例的药物组合物。
于是，在优选的实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含福木呫吨酮A、桦木酸以及下列化合物组合的任一者(1)异藤黄树脂酸、藤黄树脂酸与去氧藤黄素；(2)异藤黄酸、藤黄酸与异藤黄醇；(3)藤黄树脂酸、藤黄酸与去氧藤黄素；(4)异藤黄树脂酸、异藤黄酸与异藤黄醇。
在优选的实施方案中，本发明提供一种药物组合物，以组合物的重量为基准，其包含5％的福木呫吨酮A、10％的桦木酸、20％的异藤黄树脂酸、50％的藤黄树脂酸与5％的去氧藤黄素作为活性组份。
在另一优选的实施方案中，本发明提供一种药物组合物，以组合物的重量为基准，其包含5％的福木呫吨酮A、10％的桦木酸、20％的异藤黄酸、50％的藤黄酸与5％的异藤黄醇作为活性组份。
在又一优选的实施方案中，本发明提供一种药物组合物，以组合物的重量为基准，其包含5％的福木呫吨酮A、10％的桦木酸、40％的藤黄树脂酸、30％的藤黄酸与5％的去氧藤黄素作为活性组份。
在另一优选的实施方案中，本发明提供一种药物组合物，以组合物的重量为基准，其包含5％的福木呫吨酮A、10％的桦木酸、40％的异藤黄树脂酸、30％的异藤黄酸与5％的异藤黄醇作为活性组份。
依据本发明的药物组合物可利用本领于技术人员所详知的技术而被制造成合适的药学形式被非肠道地、局部地或口服地给药，这包括，但不限于，注射剂(例如，无菌的水溶液或分散体)、无菌的粉末、锭剂、片剂、丸剂、胶囊以及类似的物。此外，依据本发明的生物活性组份可被并入至持续释放制品与处方中。
任选地，本发明的药物组合物可以额外地包含广泛用于药物制造技术的药学上可接受的载体。例如，该药学上可接受的载体可包含一种或多种下列试剂溶剂(例如，水、生理盐水、缓冲溶液、甘油、有机溶剂)、乳化剂、悬浮剂、分解剂、粘结剂、赋形剂、稳定剂、防腐剂、润滑剂、吸收延迟剂、脂质体以及类似的物。
为了制造口服固体状制品，赋形剂以及，若需要的话，粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、调味剂和/或类似的物可与依据本发明的藤黄树脂萃取物相混合。所形成的混合物接而可通过本身为本领于公知的方法而被形成为锭剂、经包覆的锭剂、颗粒、粉末、胶囊或类似的物。这些添加剂可为那些一般被使用于现今的技术领域当中者，包括赋形剂糖类[诸如葡萄糖、乳糖、蔗糖、红糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉]、氯化钠、碳酸钙、高岭土、微晶纤维素与硅酸；粘合剂水、乙醇、丙醇、蔗糖溶液、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液、羧基甲基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基丙基淀粉、甲基纤维素、乙基纤维素、虫胶、磷酸钙与聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂干淀粉、藻酸钠、被粉末化的琼脂、碳酸氢钠、碳酸钙、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯与乳糖；润滑剂经纯化的滑石、硬脂酸盐类、硼砂与聚乙二醇；以及矫味剂蔗糖、苦橙皮、柠檬酸与酒石酸。
在依据本发明的优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含药学上可接受的赋形剂，且该赋形剂包含至少一种选自蔗糖、红糖、乳糖、山梨糖醇、甘露糖醇、玉米淀粉以及结晶纤维素的糖类。当使用糖类作为赋形剂，除可增进粉末状药物化合物的特性外，还有辅助溶解的效用。
为了制造口服液体状制品，调味剂、缓冲剂、稳定剂以及类似的物可与依据本发明的藤黄树脂萃取物相混合。所形成的混合物接而可通过本身为本领于公知的方法形成供内服用的溶液、糖浆、酏剂或类似的物。在此例中，该调味剂可相同于前面所提到者。该缓冲剂的例示物为柠檬酸钠，而该稳定剂的例示物为黄蓍胶、阿拉伯胶与明胶。
为了制造注射品，pH值调控剂、缓冲剂、稳定剂、等渗性剂(isotonicity)以及类似之物可与依据本发明的藤黄树脂萃取物相混合。所形成的混合物接而可通过本身为本领于公知的方法而形成皮下的、肌肉内的或静脉内注射品。该pH值调控剂与缓冲剂的实例包含柠檬酸钠、醋酸钠与硫酸钠。该稳定剂的例示物包含焦亚硫酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、巯基乙酸与硫羟乙酸。这些等渗性剂的实例包括氯化钠与葡萄糖。
如本文所用的，“治疗有效量”此术语系指当将依据本发明的药物组合物给予需要该组合物来治疗的个体时，足以提供期望达致的治疗功效且不会对非靶组织或器官产生不期望的严重危害的用量。该治疗有效量会视不同的因素而变化，这些因素包括，例如，病症的种类，要被治疗的个体的体重、年龄、身体状况以及反应，药物的给药途径等。此治疗有效量可为本领于技术人员来决定。
依据本发明的药物组合物的给药剂量与给药次数会视下列因素而变化要被治疗的疾病的严重性，给药途径，以及要被治疗的个体的体重、年龄、身体状况与反应。举例而言，依据本发明的药物组合物的每日给药剂量可以为2.1至3.0mg/Kg体重，并呈单一剂量或是分成数个剂量的形式来给药，例如分成三个剂量时每次的给药剂量为0.7至1.0mg/Kg体重。
依据本发明的药物组合物可被单独地给药，或是与其他用于治疗肿瘤或癌症的治疗方法或治疗药物来组合使用。这些治疗方法包括化学疗法和外部光束放射疗法(external beam radiation therapy)，而这些治疗药物包括，但不限于，太平洋紫杉醇(paclitaxel)、顺氯氨铂、卡铂、环磷酰胺以及阿霉素。
本发明将就下面实施例来作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明的实施的限制。
实施例一般操作程序红外光谱使用JASCO FT-IR 5300光谱仪测定。
紫外光谱使用HITACHI U-3000光谱仪测定。
质谱(EIMS)使用JEOL HX110或JEOL SX-102A质谱仪测定。
质子及碳-13核磁共振(1H NMR &13C NMR)使用BRUKERAM400型、VARIAN GEMINI-400型或BRUKER ADVANCEDMX-600型测定。
柱色谱包括使用Sephadex LH-20(Pharmacia Fine Chemicals)的分子筛柱色谱以及使用Merck Kiesegel 60(70-230mesh ASTM)的硅胶柱色谱。
薄层色谱(TLC)片使用Merck Silica gel 60F254玻璃片(20×20cm)，层厚度为0.25mm，并可切割成适宜的大小来使用。
制备薄层色谱(PLC)片使用Merck Silica gel 60F254玻璃片(20×20cm)，厚度为0.5mm或1mm。
薄层色谱(TLC)的显色使用如下的显色试剂配方(a)Ce(SO4)2·4H2O(0.8g)，(b)(NH4)6Mo7O24·4H2O(20.0g)，(c)浓硫酸(23mL)；(d)蒸馏水(377mL)。
显色反应以UV灯照射并于短波长(254nm)及长波长(365nm)下进行检测。
高性能液相色谱(HPLC)所用的仪器为Rainin，型别SD-200；UV检测器以固定波长360nm进行检测；分析柱为LiChrospher100RP-18e 5μm(Merck)；流动相90％乙腈以及10％去离子水加有0.05％三氟乙酸(v/v)；流速为1.0ml/min；分析条件以丙酮溶解样品以形成适当稀释液，并注入至HPLC仪器中。
实施例1.制备源自藤黄树脂的丙酮萃取产物萃取程序将采购自本地中药材店铺的藤黄树脂磨碎而成粉末，并在室温下将粉末(100g)浸泡于丙酮溶剂内进行萃取(6×500mL)每次24小时。将合并的萃取液经滤纸自然过滤，滤液继而以真空旋转蒸发仪将丙酮溶剂移除，得到棕黄色胶状固体(65g)(S.A.Ahmad等人，(1966)，Journal Chemical Society(C)，772-779)。
此处所得到的丙酮萃取产物被称为TSB-14，而为了解产物TSB-14的主要组成分布，依照前述的一般操作程序进行产物TSB-14的HPLC分析，得到如图1所示的HPLC洗脱曲线。
实施例2.制备源自藤黄树脂的纯化化合物实验操作程序以下所描述的柱色谱是依照前述的一般操作程序进行。
以35g得自上述实施例1的产物TSB-14进行硅胶柱色谱(柱直径10cm×长度80cm)，并以正己烷/乙酸乙酯梯度(100/0→4/1)进行洗脱，溶剂以真空旋转蒸发仪去除，分取成3个部分GME1(10g)、GME2(14g)以及GME3(8g)。
GME1乃是梯度洗脱至正己烷/乙酸乙酯(100/0→100/10)时所收集的部分，以TLC(展开溶剂二氯甲烷/甲醇，20∶1)检测出当中含有主成分TSB-5(见下述)以及具有Rf值＞TSB-5的Rf值的其他成分。
GME2是梯度洗脱至正己烷/乙酸乙酯(10/1→4/1)时所收集的部分，以TLC(展开溶剂二氯甲烷/甲醇，20∶1)检测出当中含有主成分TSB-5以及具有Rf值略小于TSB-5的Rf值的TSB-7、TSB-6及TSB-2等成分。
GME3是梯度洗脱至正己烷/乙酸乙酯(4/1→1/1)时所收集的部分，以TLC(展开溶剂二氯甲烷/甲醇，20∶1)检测时已测不出TSB-5，而只含有所具Rf值小于TSB-5的其他极性较大的成分，且已有拖尾现象。
取该部分GME2(10g)进行Sephadex LH-20柱色谱(柱5cm×80cm)，在本文中称为A柱，在以正己烷/乙酸乙酯/甲醇(2∶1∶1)进行洗脱[部分大小100mL]后，取第23瓶部分再重复Sephadex LH-20柱色谱(洗脱溶剂正己烷/氯仿/甲醇，2∶1∶1)与硅胶柱色谱(洗脱溶剂正己烷/氯仿/甲醇梯度，1∶1∶0→0∶1∶0→0∶10∶1)，而在硅胶柱色谱洗脱时先后获得两个呈无色针状结晶的产物TSB-0(320mg)以及TSB-1(450mg)。
另外取A柱洗脱后所得到的第46瓶部分进行薄层色谱(展开溶剂二氯甲烷/甲醇，20∶1)，并取出对应于TLC片上被显色试剂显示出的粉红色点的部分来重复分子筛柱色谱(正己烷/乙酸乙酯/甲醇，2∶2∶1)以及硅胶柱色谱(洗脱溶剂正己烷/乙酸乙酯，4∶1)，最后进行制备薄层色谱(展开溶剂二氯甲烷/甲醇，100∶1)，得到呈橙色粉末的产物TSB-6(44mg)及TSB-7(220mg)。
另外又取A柱洗脱后所得到的第47瓶部分进行薄层色谱(展开溶剂二氯甲烷/甲醇，20∶1)，并从TLC片上取出对应于被显色试剂显示出的粉红色点的部分进行Sephadex LH-20柱色谱(洗脱溶剂正己烷/乙酸乙酯/甲醇，2∶2∶1)。以真空浓缩来移除洗脱液，而后对残余物进行硅胶柱色谱(洗脱溶剂正己烷/乙酸乙酯4∶1；正己烷/乙酸乙酯1∶0→10∶1梯度洗脱；正己烷/乙酸乙酯/甲醇20∶3∶1)，最后进行分子筛柱色谱(Sephadex LH-20，洗脱溶剂正己烷/乙酸乙酯/甲醇，2∶2∶1)。以真空浓缩来移除洗脱溶剂，将残余物重结晶，得到呈橙黄色片状晶体的产物TSB-2(815mg)。
另外又取A柱洗脱后所得到的第63瓶部分进行硅胶柱色谱(洗脱溶剂二氯甲烷/甲醇，30∶1)，继而进行TLC以取出对应于TLC片(展开溶剂二氯甲烷/甲醇，20∶1)上被显色试剂(喷显色试剂后并加热，参见一般操作程序以及表1)显示出的黄色点的部分，将收集的部分合并，并以真空蒸发仪来移除洗脱溶剂，将残余物进行制备薄层色谱(展开溶剂正己烷/乙酸乙酯，2∶1)，得到呈黄色针状结晶的产物TSB-4(52mg)。
另外取该部分GME1(8g)进行硅胶柱色谱(柱6cm×80cm)，在本文中称为B柱，在以正己烷/丙酮(5∶1)进行洗脱[部分大小100mL]后，取第26瓶进行分子筛柱色谱(洗脱溶剂正己烷/乙酸乙酯/甲醇，2∶2∶1)，以真空蒸发仪来移除洗脱溶剂，并将残余物进行制备薄层色谱(展开溶剂正己烷/乙酸乙酯，4∶1)，得到呈橙色粉末的产物TSB-5(1050mg)以及呈深黄色粉末的产物TSB-3(850mg)。
另外，将B柱洗脱后所得到的第23瓶及第51瓶各自进行硅胶柱色谱，前者以正己烷/二氯甲烷(1∶1)洗脱，后者以正己烷→正己烷/乙酸乙酯(1∶0→7∶1)梯度洗脱，并通过TLC来取出对应于TLC片(展开溶剂正己烷/丙酮，6∶1)上具相同Rf值且被显色试剂显示为粉红色点的部分，将收集的部分合并，并以真空蒸发仪来移除洗脱溶剂，对残余物进行硅胶柱色谱(洗脱溶剂二氯甲烷)洗脱，然后通过TLC来收集并合并对应于在TLC片(展开溶剂正己烷/丙酮，6∶1)上被呈现为粉红色点的部分，以真空蒸发仪来移除洗脱溶剂，对残余物进行分子筛柱色谱(洗脱溶剂正己烷/乙酸乙酯/甲醇，2∶2∶1)，并以真空蒸发仪来移除洗脱溶剂，最后残余物通过制备薄层色谱(展开溶剂正己烷/二氯甲烷，2∶1)以及重结晶而得到呈橙色针状晶体的产物TSB-8(60mg)。
实施例3.纯化自藤黄树脂的化合物的鉴定和表征实验操作程序依照前述的一般操作程序进行实施例2所得到的9种源自藤黄树脂的产物的物理化学性质分析，包括红外光谱(IR)、核磁共振光谱(1H-及13C-NMR)、质谱(EIMS)以及薄层色谱。
结果实施例2所得到的9种产物(TSB-0至TSB-8)在薄层色谱片上的显色结果显示于表1，其中在所进行的测试下，产物TSB-4被观察到皆显现出黄色。
表1.源自藤黄树脂的产物在薄层色谱片上的显色结果
由所观察到的TLC显色行为以及物理化学性质，初步认定产物TSB-4是未记载于文献的新化合物。
接而以各种光谱分析来检测这9种产物，所得到的实验数归纳如下1.产物TSB-0测得的产物TSB-0性质如下无色针状结晶，熔点257～259℃。
IRνmaxcm-1(KBr)3400，3090，2970，1640，1460，1380，1040，1020，880。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ4.65(1H，d，J＝2.0Hz)，4.55(1H，d，J＝2.0Hz)，3.77(1H，d，J＝10.9Hz)，3.31(1H，br d，J＝10.9Hz)，3.16(1H，dd，J＝11.2，5.0Hz)，1.66(3H，s)，1.01，1.00，0.95，0.80，0.74(各个3H，s)。
13C NMR(CDCl3，100MHz)δ150.62，109.74，79.14，60.80，55.57，50.67，49.05，47.96，42.92，41.16，38.99，38.93，37.56，37.36，34.48，34.10，30.02，29.42，28.09，27.58，27.27，25.48，21.01，19.19，18.44，16.13，15.37，14.87。
EIMS m/z(相对强度)442[M]+(76)，427(11)，424(16)，411(77)，399(12)，385(14)，288(15)，273(6)，271(5)，257(9)，247(10)，245(10)，234(56)，220(30)，207(90)，203(80)，189(100)。
依据所测得的光谱数据，鉴定产物TSB-0是具有下面所示化学结构式的已知化合物，即桦木醇 2.产物TSB-1测得的产物TSB-1性质如下无色针状结晶，熔点290～292℃。
IRνmaxcm-1(KBr)3600-2400，3070，2950，1690，1640，1240，1040，880。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ0.75，0.86，0.95，0.97，1.00，1.70(各个3H，s)，2.23(1H，dt，J＝12.4，2.8Hz)，2.30(1H，dt，J＝12.8，3.6Hz)，3.02(1H，dt，J＝10.4，4.8Hz)，3.12(1H，dd，J＝11.2，5.2Hz)，4.59，4.71(各个1H，brs)。
13C NMR(CD3OD-CDCl3，100MHz)δ178.93，150.51，109.16，78.53，55.98，55.14，50.31，46.75，42.17，40.41，38.53，38.06，36.88，34.08，32.01，30.32，29.39，27.56，26.66，25.29，20.62，18.94，18.02，15.76，15.56，15.03，14.34。
EIMS m/z(相对强度)456[M]+(70)，438(35)，423(25)，410(20)，395(15)，316(15)，302(18)，259(30)，248(80)，234(55)，220(60)，207(80)，203(60)，189(100)。
依据所测得的光谱数据，鉴定产物TSB-1是具有下面所示化学结构式的已知化合物，即桦木酸 3.产物TSB-2测得的产物TSB-2性质如下黄色片状结晶，熔点204～209℃。
IRνmaxcm-1(KBr)3500-2400，2960，1735，1680，1650，1590，1430，1380，1325，1130，1040，960，870。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.56(1H，d，J＝6.9Hz)，6.63(1H，d，J＝9.6Hz)，5.51(1H，d，J＝9.6Hz)，5.12(1H，dd，J＝13.6，6.8Hz)，3.52(1H，dd，J＝6.2，4.7Hz)，3.26(2H，d，J＝7.4Hz)，2.66(1H，m)，2.55(2H，m)，2.35(1H，dd，J＝13.4，4.6Hz)，1.75(3H，s)，1.72(3H，s)，1.65(3H，s)，1.44(3H，s)，1.43(3H，s)，1.35(3H，s)，1.30(3H，s)。
13C NMR(CDCl3，100MHz)δ200.93，178.91，171.86，161.10，157.64，157.28，136.97，135.39，133.35，131.70，128.63，126.18，122.12，115.44，108.27，103.18，100.49，90.71，83.71，83.64，78.65，49.06，46.88，29.95，28.93，28.33，25.71，25.31，21.62，18.09，11.34。
EIMS m/z(相对强度)560[M]+(100)，545(47)，532(22)，517(36)，405(44)，389(11)，363(24)，349(17)，307(12)，287(22)，285(16)，245(15)，215(12)，189(5)。
依据所测得的光谱数据，鉴定产物TSB-2是具有下面所示化学结构式的已知化合物，即异藤黄酸 4.产物TSB-3测得的产物TSB-3性质如下深黄色无定型粉末，熔点110～112℃。
IRνmaxcm-1(KBr)3500-2400，2960，2920，1735，1685，1640，1590，1435，1400，1380，1330，1175，1140，1045，960，805，760。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ12.70，12.69(1H，s)，7.48(1H，d，J＝6.8Hz)，6.59(1H，d，J＝10.4Hz)，6.47(1H，t，J＝7.2Hz)，5.38，5.36(1H，d，J＝10.0Hz)，5.03(2H，m)，3.44(1H，m)，3.21(1H，m)，3.17(1H，m)，2.56(1H，m)，2.45(1H，m)，2.27(1H，dd，J＝12.0，4.4Hz)，1.97(2H，m)，1.67，1.64，1.57，1.54，1.52，1.47，1.32，1.27(各个3H，s)。
13C NMR(CDCl3，100MHz)δ202.95，202.88，178.76，178.71，172.38，172.24，161.34，161.21，157.52，157.27，137.07，136.82，135.32，133.23，133.18，131.77，131.70，131.64，128.86，128.49，124.67，123.76，123.69，122.09，115.86，107.82，102.81，102.70，100.38，100.27，90.66，90.55，83.68，83.55，83.51，81.23，81.19，48.95，46.87，46.78，41.83，29.94，29.83，28.97，28.86，27.42，27.27，25.61，25.57，25.37，25.22，22.68，21.55，18.07，18.00，17.53，11.26。
EIMS m/z(相对强度)628[M]+(78)，613(11)，600(12)，546(68)，545(100)，517(26)，473(15)，389(8)，355(11)，271(5)，245(12)，214(19)，189(8)。
依据所测得的光谱数据，鉴定产物TSB-3是具有下面所示化学结构式的已知化合物，即异藤黄树酯酸 5.产物TSB-5测得的产物TSB-5性质如下橙色粉末，熔点96～99℃。
IRνmaxcm-1(KBr)3600-2400，2950，2910，1735，1680，1625，1585，1450，1430，1400，1380，1325，1255，1170，1135，1040，950，880，800，755。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ12.72，12.70(1H，s)，7.51，7.50(1H，d，J＝6.9Hz)，6.52，6.51(1H，d，J＝10.0Hz)，6.17，6.07(1H，t，J＝7.4Hz)，5.34，5.30(1H，d，J＝10.0Hz)，5.02(2H，m)，3.44(1H，m)，3.26(1H，m)，3.10(1H，m)，2.97(1H，m)，2.88(1H，m)，2.47(1H，dd，J＝9.2，2.5Hz)，1.99(2H，m)，1.71，1.70，1.69，1.66，1.54，1.50，1.29，1.22(各个3H，s)。
13C NMR(CDCl3，100MHz)δ203.26，178.82，178.78，171.89，171.70，161.35，161.20，157.51，157.45，157.24，138.51，135.52，135.26，133.26，133.11，131.77，131.61，131.29，131.25，127.38，127.34，124.62，124.30，123.79，122.21，115.80，107.64，107.46，102.77，102.60，100.41，100.33，90.97，90.87，83.70，83.58，81.15，80.93，48.92，46.72，41.89，41.59，29.84，29.78，29.15，28.77，28.71，27.55，26.81，25.51，25.55，25.11，22.65，21.52，20.60，18.05，17.97，17.51。
EIMS m/z(相对强度)628[M]+(46)，613(7)，600(12)，546(48)，545(100)，517(24)，474(13)，391(7)，355(7)，287(6)，245(9)，214(13)，189(5)。
依据所测得的光谱数据，鉴定产物TSB-5是具有下面所示化学结构式的已知化合物，即藤黄树酯酸 6.产物TSB-6测得的产物TSB-6性质如下橙色粉末，熔点137～139℃。
IRνmaxcm-1(KBr)3460，2970，2925，1735，1645，1630，1590，1460，1435，1400，1385，1330，1300，1250，1210，1185，1165，1140，1045，960，880，810。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ12.68(1H，s)，7.41(1H，d，J＝7.2Hz)，6.59(1H，d，J＝10.0Hz)，5.49(1H，d，J＝10.0Hz)，5.19(1H，t，J＝7.0Hz)，4.73(1H，t，J＝8.0Hz)，3.61(2H，q，J＝10.2Hz)，3.49(1H，d，J＝4.7Hz)，3.47(1H，d，J＝4.7Hz)，3.32(1H，dd，J＝14.5，6.8Hz)，3.24(1H，dd，J＝14.3，7.7Hz)，2.60(1H，d，J＝7.7Hz)，2.48(1H，d，J＝9.4Hz)，2.31(1H，dd，J＝13.5，4.7Hz)，1.74，1.68，1.64，1.25，1.01(各个3H，s)，1.41(6H，s)。
13C NMR(CDCl3，100MHz)δ203.35，180.33，161.06，157.80，157.44，138.01，134.40，133.63，131.87，126.31，121.90，118.20，115.50，108.44，103.00，100.72，90.48，84.50，83.41，78.66，67.92，49.09，47.00，30.09，28.96，28.28，28.21，25.71，25.29，21.57，18.14，12.49。
EIMS m/z(相对强度)546[M]+(100)，531(18)，518(44)，503(40)，485(9)，433(7)，405(33)，391(10)，363(19)，349(13)，307(10)，287(25)，245(8)，231(18)，214(12)，189(5)，105(6)。
依据所测得的光谱数据，鉴定产物TSB-6是具有下面所示化学结构式的已知化合物，即异藤黄醇 7.产物TSB-7测得的产物TSB-7性质如下橙色粉末，熔点106～109℃。
IRνmaxcm-1(KBr)3500-2400，2960，2920，1735，1680，1650，1625，1590，1430，1325，1120，1040，870，735。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ12.71(1H，s)，7.51(1H，d，J＝6.8Hz)，6.49(1H，d，J＝10.0Hz)，6.05(1H，t，J＝7.0Hz)，5.39(1H，d，J＝10.0Hz)，4.99(1H，d，J＝6.0Hz)，3.45(1H，dd，J＝6.4，4.7Hz)，3.27(1H，m)，3.08(1H，m)，2.97(2H，sept，J＝8.0Hz)，2.49(1H，d，J＝9.3Hz)，2.28(1H，dd，J＝13.4，4.5Hz)，1.70，1.69，1.67，1.60，1.36，1.34，1.26(各个3H，s)。
13C NMR(CDCl3，100MHz)δ203.47，179.07，171.74，161.22，157.65，157.34，138.46，135.39，133.42，131.46，127.64，126.00，122.22，115.44，108.04，103.16，100.55，90.93，83.82，78.55，49.01，46.80，29.87，29.26，28.82，28.40，28.20，25.68，25.14，21.57，20.63，18.06。
EIMS m/z(相对强度)560[M]+(100)，545(56)，532(63)，517(48)，487(12)，433(9)，405(81)，391(22)，363(38)，349(24)，307(18)，287(64)，245(40)，231(21)，215(20)，189(10)。
依据所测得的光谱数据，鉴定产物TSB-7是具有下面所示化学结构式的已知化合物，即藤黄酸
8.产物TSB-8测得的产物TSB-8性质如下橙色针状结晶，熔点109～110℃。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ12.89(1H，s)，7.45(1H，d，J＝7.2Hz)，7.27(1H，s)，6.65(1H，d，J＝10.4Hz)，5.53(1H，d，J＝9.6Hz)，5.30(1H，br d，J＝6.0Hz)，4.43(1H，br s)，3.49(1H，m)，3.32(2H，m)，2.50(2H，m)，2.34(1H，m)，1.78，1.71，1.68，1.59，1.33，1.03(各个3H，s)，1.45(6H，s)。
EIMS m/z(相对强度)530[M]+(100)，515(22)，502(92)，488(30)，487(83)，459(11)，433(20)，405(49)，391(15)，363(24)，349(16)，307(13)，287(27)，231(13)，215(37)，189(6)。
依据所测得的光谱数据，鉴定产物TSB-8是具有下面所示化学结构式的已知化合物，即去氧藤黄素 9.产物TSB-4测得的产物TSB-4性质如下黄色针状结晶，熔点115～118℃。当以氯化铁试剂反应(FeCl3test)时呈阳性，这表示它是一种酚类化合物。
IRνmaxcm-1(KBr)3640，3450，3150，2960，2900，1632，1602，1570，1500，1460，1420，1395，1340，1295，1230，1130，1055，870，825，790。
1H NMR(丙酮-d6，600MHz)δ13.09(1H，s，OH-1)，7.40(1H，s，H-8)，6.55(1H，d，J＝10.0Hz，H-11)，6.32(1H，s，H-2)，5.87(1H，d，J＝10.0Hz，H-12)，5.36(H，m，H-17)，3.55(2H，d，J＝7.3Hz，H2-16)，1.84(3H，s，H-20)，1.63(3H，s，H-19)，1.48(6H，s，H3-14，H3-15)。
13C NMR(丙酮-d6，125MHz)δ181.24(C＝O)，163.41(C-3)，162.26(C-1)，155.56(C-4a)，146.94(C-6)，146.43(C-10a)，134.42(C-18)，132.30(C-12)，131.77(C-5)，123.33(C-17)，122.08(C-11)，119.03(C-7)，115.20(C-8a)，113.15(C-8)，107.54(C-4)，103.26(C-9a)，98.40(C-2)，78.84(C-13)，28.26(C-14，15)，25.93(C-19)，22.16(C-16)，18.00(C-20)。
EIMS m/z(相对强度)394[M]+(66)，393(23)，379(100)，339(30)，323(16)，311(13)，295(5)，278(10)，203(4)，162(7)。
产物TSB-4的质谱(EI-MS)数据显示，有分子峰[M]+位在m/z 394，这相当于一分子式为C23H22O6的呫吨酮。
产物TSB-4的1H NMR光谱显示它有螯合羟基(δ13.09)、2个芳族质子的单峰[δ6.32(1H，s)及δ7.40(1H，s)]、2个甲基质子的单峰[δ1.48(6H，s)]以及2个互相偶合的顺式烯属质子[δ5.87(1H，d，J＝10Hz)及δ6.55(1H，d，J＝10Hz)]。这些讯号表示，在产物TSB-4的分子结构上存在有一个二甲基色烯环。
此外，从产物TSB-4的1H NMR光谱数据得知，有2个乙烯基甲基质子[δ1.63(3H，s)及δ1.84(3H，s)]、亚甲基质子[δ3.55(2H，d，J＝7.3Hz)]和烯属质子[δ5.36(1H，m)]，这表示产物TSB-4的分子结构含有一个γ，γ-二甲基烯丙基链。
由以上资料可知，在产物TSB-4的呫吨酮结构中存在有一个2，2-二甲基吡喃环和一个γ，γ-二甲基烯丙基链的取代。
除了利用二维核磁共振(2D-NMR)同核相关谱(HomonudearCorrelation Spectroscopy，1H-1H COSY)来印证上述1H NMR光谱中的偶合情形外，从异核多量子相关实验(1H-Detected heteronuclearmultiple-quantum coherence，HMQC)(J＝150Hz)发现δ7.40与δ113.15相关；δ6.32与δ98.40相关；δ6.55与δ122.08相关；δ5.87与δ132.30相关。这显示吡喃环中的两个二取代的烯属碳的化学位移是δ122.08及δ132.30。另外，三取代烯属质子的δ5.36与δ123.33相关，而与它偶合的亚甲基质子(δ3.55)则与δ22.16相关。
另外，从产物TSB-4的多键异核多量子相关实验(1H-Detectedmultiple-bond heteronuclear multiple-quantum coherence，HMBC)(J＝8Hz)光谱数据也发现，螯合羟基(δ13.09)与二个季碳(δ103.26及δ162.26)相关，另与一个未取代芳环碳(δ98.40)相关。此证明呫吨酮骨架的C-2位置并无羟基取代。C-2质子讯号δ6.32与二个季碳(δ103.26，107.54)相关，另与二个接羟基季碳(δ163.41，162.26)相关。亚甲基质子(δ3.55)与季碳(δ163.41，155.56，134.42，及δ107.54)相关；另与叔碳碳(δ123.33)相关。此证明了γ，γ-二甲基烯丙基链是接在C-4位置。故呫吨酮骨架的A环为1，3-二羟基-4-γ，γ-二甲基烯丙基取代。
从HMBC光谱发现，另一个芳族质子(δ7.40)与羰基碳(δ181.24)及两个接氧碳(δ146.43，δ146.94)相关，也与吡喃环中烯属碳之一(δ122.08)相关。由此可知此质子(δ7.40)是位于C-8，即羰基的peri-位置，故所接吡喃环与呫吨酮骨架必以线型结合。最后剩余的羟基则只有接于C-5位置的唯一可能，其碳谱的化学位移是δ131.77。
综合以上资料，鉴定产物TSB-4是具有下面所示化学结构式的新化合物
将产物TSB-4命名为福木呫吨酮A{IUPAC命名1，3，5-三羟基-6’，6’-二甲基-2H-吡喃并(2’，3’6，7)-4-(3-甲基丁-2-烯基)呫吨酮或7，9，12-三羟基-2，2-二甲基-10-(3-甲基-丁-2-烯基)-2H-吡喃并[3，2-b]呫吨-6-酮}。
藤黄树脂丙酮萃取产物TSB-14的组分鉴定为了进一步了解藤黄树脂的丙酮萃取产物TSB-14的成分分布，参照上文的一般操作程序进行TSB-14的HPLC分析，所得结果如图1所示。
由于TSB-0与TSB-1无紫外线吸收特性，于此使用TSB-2至TSB-8等7种纯化化合物来作为进行HPLC分析的标准品，得到如图2所示的HPLC洗脱曲线，其中各个波峰上的编号各自对应于这些产物TSB-2～TSB-8的编号。
为找出产物TSB-2～TSB-8各自对应图1中所示的丙酮萃取产物TSB-14的洗脱曲线中的那些波峰，调高丙酮萃取产物TSB-14的样品浓度进行HPLC，得到如图3所示的HPLC洗脱曲线。
经比对图1至图3的结果发现，TSB-4及TSB-8在TSB-14中的含量似乎不高，以致于在HPLC洗脱曲线中所显示出的对应波峰甚低。为了确认TSB-4及TSB-8的波峰所在位置，以只含丙酮萃取产物TSB-14(上方)以及添加有TSB-4(500μl)和TSB-8(500μl)的丙酮萃取产物TSB-14(下方)进行HPLC，得到如图4所示的HPLC洗脱曲线。
为显示依据本发明所得到的7种纯化自藤黄树脂的产物TSB-2～TSB-8出现在依据本发明的产物TSB-14的洗脱曲线中的对应位置，得到如图5所示的HPLC洗脱曲线。
因此，由HPLC结果而确认依据本发明的藤黄树脂丙酮萃取产物TSB-14内含有下列9种化合物桦木醇(TSB-0)、桦木酸(TSB-1)、异藤黄酸(TSB-2)、异藤黄树脂酸(TSB-3)、福木呫吨酮A(TSB-4)、藤黄树脂酸(TSB-5)、异藤黄醇(TSB-6)、藤黄酸(TSB-7)以及去氧藤黄素(TSB-8)。而除了上述已被纯化的9种化合物外，该丙酮萃取产物TSB-14还含有大约25％的微量组分，包括三萜类和呫吨酮类以及其他未知化合物。
实施例4.源自藤黄树脂的丙酮萃取产物以及经纯化的化合物的药理实验为了确定依据本发明的丙酮萃取产物TSB-14以及由该萃取物被进一步纯化出的产物TSB-1至TSB-8的生物活性，进行下面的药理活性分析。
药理试验1.体外抗癌测试依据本发明的丙酮萃取产物TSB-14以及由该萃取物被进一步纯化出的产物TSB-1至TSB-8的体外抗癌试验是委托国际知名的MDSPanlabs Pharmacology Services代为进行。
此癌细胞生长抑制试验主要是用来检测药物候选物对于癌细胞的增殖影响，当中所涉及的作用原理是活细胞能将alamarBlue试剂(Biosource，USA)由原来无荧光的氧化状态(非荧光，蓝色)经代谢作用反应成为具荧光的还原形式(荧光，红色)的能力，而根据所测得的由alamarBlue试剂产生的荧光数据结果，活细胞的增殖情形与细胞活性即可被量化检测出。
于此实验中，药物候选物的试验浓度被设为0.01、0.1、1、10以及100μg/ml，并使用下列细胞株进行6种人癌细胞MCF-7(乳癌)、HT-29(大肠癌)、HL-60(血癌)、HepG2(肝癌)、A549(肺癌)与U937(淋巴癌)，以及1种正常的人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)。此外，使用二甲亚砜(DMSO)(40％)作为阴性对照以及使用丝裂霉素作为阳性对照。
根据MDS Panlabs Pharmacology Services的实验报告，依据本发明的丙酮萃取产物TSB-14以及由该萃取物被进一步纯化出的产物TSB-1至TSB-8对于上述6种人癌细胞以及1种正常的人细胞的50％细胞生长抑制浓度(IC50)与50％细胞毒杀浓度(LC50)分别显示于下面的表格中。
表1.藤黄树脂的丙酮萃取产物TSB-14对于癌细胞的50％生长抑制浓度(IC50[μg/ml])以及半数致死浓度(LC50[μg/ml])
表2.自藤黄树脂纯化出的产物TSB-1至TSB-8对于癌细胞的50％生长抑制浓度(IC50[μg/ml])
“-”表示未测定。
表3.自藤黄树脂纯化出的产物TSB-1至TSB-8对于癌细胞的半数致死浓度(LC50[μg/ml])
“-”表示未测定。
从表1至表3所示结果可知，不论是依据本发明的丙酮萃取产物TSB-14或是由该萃取物被进一步纯化出的产物TSB-2至TSB-8都明显地具有抑制肿瘤细胞生长的效用，因而具有开发成抗癌药物的高潜力。
药理试验2.包含产物TSB-0至TSB-8的混合物配方的体外抗癌效用为进一步了解依据本发明的产物TSB-0至TSB-8当混合使用时的生物活性，依据下面的表4来配制混合物配方TSB-9、TSB-10、TSB-11、TSB-12与TSB-13，并同样委托MDS Panlabs PharmacologyServices代为进行体外抗癌试验，所得结果分别示于表5至表9。
表4
表5.配方TSB-9对于癌细胞的生长抑制效用
表6.配方TSB-10对于癌细胞的生长抑制效用
表7.配方TSB-11对于癌细胞的生长抑制效用
表8.配方TSB-12对于癌细胞的生长抑制效用
表9.配方TSB-13对于癌细胞的生长抑制效用
从表5至表9所示结果可知，依据本发明的从藤黄树脂纯化出的产物TSB-1至TSB-8，在作不同的组合下，都明显地表现出抑制肿瘤细胞生长的效用，因而具有发展成抗癌药物的高潜力。
药理试验3.混合物配方TSB-9的体内生物活性混合物配方TSB-9被进一步拿进行动物试验，其中使用衍生自C.B-17/Icr背景的严重合并型免疫缺乏症候群(Severe CombinedImmune Deficiency，SCID)雌性小鼠(6-8周大，20-22克重)小鼠。本动物实验也是委托MDS Panlabs Pharmacology Services进行。
将人乳癌细胞MCF-7(ATCC HTB-22)(1×107个细胞/0.2m1)皮下植入至小鼠的背侧，并将雌二醇苯甲酸盐(estradiol benzoate)(Sigma，USA)以50μg/小鼠的剂量于每周皮下注射至小鼠历时4周以当作补充品。当肿瘤成长达到直径≥5mm(该天即被表示为第1天)时，带有肿瘤的裸鼠被随机地分成4组(各组有6只小鼠)。
混合物配方TSB-9被溶于10％DMSO中，且以40mg/kg与80mg/kg的两种剂量于每天被各自地经口给药给小鼠，总共进行连续21天。丝裂霉素以2mg/kg的剂量并呈4天的间隔被腹膜腔内地给药给小鼠共计5个剂量，以此处理组作为阳性对照。
在给予测试物质后，这些小鼠就下列事项来作观察明显的中毒征侯、体重以及肿瘤体积。于实验期间每间隔4天作一次测量并记录。所得实验结果被示于表10与表11中。
表10.混合物配方TSB-9的体内抑制肿瘤生长效用
*当％T/C≤42％时，表示有显著的抗肿瘤活性。
表11.混合物配方TSB-9对于实验动物的体重影响
*实验组的体重值当以不成对的史徒登氏试验(unpairedStudent test)来作分析时，显示出相对于载体对照组的体重值有显著的变化(p＜0.05＝。
在29天的期间中，80mg/kg剂量的混合物配方TSB-9引起显著的肿瘤重量抑制作用，而40mg/kg剂量的混合物配方TSB-9引起相对于赋形药对照的中度肿瘤重量抑制作用。
于本说明书中被引述的所有文献资料与专利案以其整体被并入本案作为参考资料。若有所冲突时，本案的详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神的下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如随文所附的权利要求所示者的限制。
权利要求
1.一种化合物，其特征在于该化合物具有下列所示化学式
2.一种药物组合物，其特征在于该药物组合物包含治疗有效量的下列任一者(i)以丙酮萃取藤黄树脂而得到的产物；(ii)如权利要求1的化合物；(iii)如权利要求1的化合物以及至少一种选自桦木醇、桦木酸、藤黄酸、异藤黄酸、藤黄树脂酸、异藤黄树脂酸、异藤黄醇以及去氧藤黄素的化合物。
3.如权利要求2的药物组合物，其特征在于该药物组合物包含以丙酮萃取藤黄树脂而得到的产物。
4.如权利要求2的药物组合物，其特征在于该药物组合物包含如权利要求1的化合物、藤黄酸、异藤黄酸、藤黄树脂酸、异藤黄树脂酸、异藤黄醇以及去氧藤黄素、桦木醇以及桦木酸。
5.如权利要求2的药物组合物，其特征在于以组合物的重量为基准，该药物组合物包含5％的如权利要求1的化合物、8％的藤黄酸、8％的异藤黄酸、18％的藤黄树脂酸、15％的异藤黄树脂酸、2％的异藤黄醇以及4％的去氧藤黄素、8％的桦木醇以及8％的桦木酸。
6.如权利要求2的药物组合物，其特征在于该药物组合物包含如权利要求1的化合物、桦木酸以及下列化合物组合的任一者(1)异藤黄树脂酸、藤黄树脂酸与去氧藤黄素；(2)异藤黄酸、藤黄酸与异藤黄醇；(3)藤黄树脂酸、藤黄酸与去氧藤黄素；(4)异藤黄树脂酸、异藤黄酸与异藤黄醇。
7.如权利要求6的药物组合物，其特征在于以组合物的重量为基准，该药物组合物包含5％的如权利要求1的化合物、10％的桦木酸、20％的异藤黄树脂酸、50％的藤黄树脂酸与5％的去氧藤黄素。
8.如权利要求6的药物组合物，其特征在于以组合物的重量为基准，该药物组合物包含5％的如权利要求1的化合物、10％的桦木酸、20％的异藤黄酸、50％的藤黄酸与5％的异藤黄醇。
9.如权利要求6的药物组合物，其特征在于以组合物的重量为基准，该药物组合物包含5％的如权利要求1的化合物、10％的桦木酸、40％的藤黄树脂酸、30％的藤黄酸与5％的去氧藤黄素。
10.如权利要求6的药物组合物，其特征在于以组合物的重量为基准，该药物组合物包含5％的如权利要求1的化合物、10％的桦木酸、40％的异藤黄树脂酸、30％的异藤黄酸与5％的异藤黄醇。
11.如权利要求2的药物组合物，其特征在于该药物组合物进一步包含药学上可接受的载体。
12.如权利要求6的药物组合物，其特征在于该药学上可接受的载体包含一种或多种下列试剂赋形剂、溶剂、乳化剂、悬浮剂、分解剂、粘结剂、稳定剂、防腐剂、润滑剂、吸收延迟剂与脂质体。
13.如权利要求12的药物组合物，其特征在于该药学上可接受的载体是赋形剂并包含至少一种选自蔗糖、红糖、乳糖、D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、玉米淀粉以及结晶纤维素的糖类。
14.如权利要求2的药物组合物，其特征在于该药物组合物被制造成适于口服给药的形式。
15.如权利要求2的药物组合物，其特征在于该药物组合物可供应用于治疗至少一种选自乳癌、大肠癌、白血病、肝癌、肺癌与淋巴瘤的癌症。
16.一种用以抑制选自乳癌细胞、大肠癌细胞、白血病细胞、肝癌细胞、肺癌细胞与淋巴瘤细胞的肿瘤/癌细胞的生长的药物组合物，其特征在于该药物组合物包含(i)以丙酮萃取藤黄树脂而得到的产物；(ii)如权利要求1的化合物；(iii)如权利要求1的化合物以及至少一种选自桦木醇、桦木酸、藤黄酸、异藤黄酸、藤黄树脂酸、异藤黄树脂酸、异藤黄醇以及去氧藤黄素的化合物。
17.如权利要求16的药物组合物，其特征在于该药物组合物包含以丙酮萃取藤黄树脂而得到的产物。
18.如权利要求16的药物组合物，其特征在于该药物组合物包含如权利要求1的化合物、藤黄酸、异藤黄酸、藤黄树脂酸、异藤黄树脂酸、异藤黄醇以及去氧藤黄素、桦木醇以及桦木酸。
19.如权利要求18的药物组合物，其特征在于以组合物的重量为基准，该药物组合物包含5％的如权利要求1的化合物、8％的藤黄酸、8％的异藤黄酸、18％的藤黄树脂酸、15％的异藤黄树脂酸、2％的异藤黄醇以及4％的去氧藤黄素、8％的桦木醇以及8％的桦木酸作为活性组份。
20.如权利要求16的药物组合物，其特征在于该药物组合物包含如权利要求1的化合物、桦木酸以及下列化合物组合的任一者(1)异藤黄树脂酸、藤黄树脂酸与去氧藤黄素；(2)异藤黄酸、藤黄酸与异藤黄醇；(3)藤黄树脂酸、藤黄酸与去氧藤黄素；(4)异藤黄树脂酸、异藤黄酸与异藤黄醇。
21.如权利要求20的药物组合物，其特征在于以组合物的重量为基准，该药物组合物包含5％的如权利要求1的化合物、10％的桦木酸、20％的异藤黄树脂酸、50％的藤黄树脂酸与5％的去氧藤黄素。
22.如权利要求20的药物组合物，其特征在于以组合物的重量为基准，该药物组合物包含5％的如权利要求1的化合物、10％的桦木酸、20％的异藤黄酸、50％的藤黄酸与5％的异藤黄醇。
23.如权利要求20的药物组合物，其特征在于以组合物的重量为基准，该药物组合物包含5％的如权利要求1的化合物、10％的桦木酸、40％的藤黄树脂酸、30％的藤黄酸与5％的去氧藤黄素。
24.如权利要求20的药物组合物，其特征在于以组合物的重量为基准，该药物组合物包含5％的如权利要求1的化合物、10％的桦木酸、40％的异藤黄树脂酸、30％的异藤黄酸与5％的异藤黄醇。
25.如权利要求16的药物组合物，其特征在于该药物组合物进一步包含药学上可接受的载体。
26.如权利要求25的药物组合物，其特征在于该药学上可接受的载体包含一种或多种下列试剂赋形剂、溶剂、乳化剂、悬浮剂、分解剂、粘结剂、稳定剂、防腐剂、润滑剂、吸收延迟剂与脂质体。
27.如权利要求26的药物组合物，其特征在于该药学上可接受的载体是赋形剂并包含至少一种选自蔗糖、红糖、乳糖、山梨糖醇、甘露糖醇、玉米淀粉以及结晶纤维素的糖类。
28.如权利要求16的药物组合物，其特征在于该药物组合物被制造成适于口服给药的形式。
29.一种以丙酮萃取藤黄树脂而得到的产物，其特征在于该产物具有如图1所示的HPLC洗脱曲线的组份分布，并且包含如权利要求1的化合物、桦木醇、桦木酸、藤黄酸、异藤黄酸、藤黄树脂酸、异藤黄树脂酸、异藤黄醇以及去氧藤黄素。
全文摘要
本发明涉及得自于藤黄树脂的丙酮萃取产物以及从该丙酮萃取产物进一步纯化的化合物，包括被命名为福木呫吨酮A的新化合物。证实该丙酮萃取产物以及这些被进一步纯化的化合物具有抑制肿瘤/癌细胞生长的活性。本发明也涉及用以获得这些被进一步纯化的化合物的方法，以及该丙酮萃取产物与这些被进一步纯化的化合物用于制备抑制肿瘤/癌细胞生长的药物组合物的用途。
文档编号C07D493/04GK1699368SQ20041004754
公开日2005年11月23日 申请日期2004年5月21日 优先权日2004年5月21日
发明者李森彬, 陈秋明 申请人:台湾森本生物科技开发股份有限公司