专利名称：针对表皮生长因子基因的小干扰核糖核酸分子及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸技术领域，具体的说是涉及针对表皮生长因子(Cripto)基因mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)及其在制备有效杀伤肿瘤细胞的药物中的用途。
背景技术：
恶性肿瘤是一种危害人类生命健康的主要疾病，但迄今为止对此仍无有效的治疗手段。长期以来科学家们一直在试图研制可以有效治疗恶性肿瘤的新药。
据世界卫生组织统计，每年全世界新发恶性肿瘤病人约1000万，死于肿瘤的600～700万。在我国，每年新发病约200万，死亡约140万/按13亿人口计算)。随着人口老龄化、吸烟、生活方式的城市化和工业化影响的进一步加强，这一趋势将继续下去。肿瘤为多机制的复杂疾病，目前仍用早期诊断、手术、放疗、化疗等手段，疗效有限，且给病人带来较大的痛苦。结肠癌是目前我国发病率增长最快的肿瘤之一。转移及化疗耐药是结肠癌治疗的最大难题，目前尚缺乏有效的治疗手段及药物，寻找有效的治疗药物和治疗手段，乃当务之急。彻底攻克结肠癌等恶性肿瘤的艰巨任务只能通过以上治疗手段结合免疫治疗、基因治疗等综合治疗手段来完成。
大多数实体瘤的发生发展与癌基因的激活与扩增有关。最近研究发现，表皮生长因子(Cripto)基因与恶性肿瘤的发生发展密切相关。Cripto是一种自分泌型肿瘤生长因子，是EGF家族成员之一。该基因最早在人和小鼠胚胎肿瘤细胞中发现表达，进而发现在人乳房癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、阴茎癌、膀胱癌及前列腺癌等中均呈过度表达，而正常组织表达很低或缺失。提示该基因在结肠癌等恶性肿瘤的形成发展中扮演着重要的角色。体外实验中发现，该基因促使细胞恶性增殖细胞迁移，抑制凋亡。由此提示，该可作为一个恶性肿瘤肿瘤基因治疗的新靶点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种作为抗肿瘤药物的活性成分的有效杀伤肿瘤细胞的针对表皮生长因子(Cripto)基因mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)。该小干扰核糖核酸分子为双链RNA分子，具有SEQ ID NO1-12的核苷酸序列，并与具有以下特征的核苷酸序列至少70％的同源度正义链和负义链的长度均为21个核苷酸，正义链和负义链各自的3’端为两个连续的脱氧胸苷酸(TT)，两条链除去3’端的TT以外的19个核苷酸上的硷基互补形成双链，正义链自5’端开始的19个核苷酸序列和SEQ ID NO1的核苷酸序列中连续两个硷基为腺嘌呤(A)的核苷酸之后的19个核苷酸序列完全一致，每条链中的硷基为鸟嘌呤(G)的核苷酸数量与硷基为胞嘧啶(C)的核苷酸数量之和占除去3’端的TT以外的19个核苷酸数量的比例为大于25％小于75％(即G/C比例)，本发明提供的核苷酸序列的负链及其一个核甘酸的突变体和已知人类基因无同源性。
“无同源性”在此是指本发明提供的核苷酸序列和其任意一个位置的核苷酸突变体和已知人类基因和基因表达片段无100％的相同。
上述小干扰RNA分子(SiRNA)为人工合成，正义链和负义链各自的3’末端有两个脱氧胸甘酸(TT)，其它19个核苷酸的碱基可以是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)；两条链除去3’端的TT以外的19个核苷酸上的碱基互补(A和U，C和G)形成双链，但它们3’端的两个TT却以单链的形式存在。
当SEQ ID NO1的核苷酸序列出现两个以上连续的碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸时，上述“正义链自5’端开始的19个核苷酸序列和SEQ ID NO1的核苷酸序列的连续两个硷基为腺嘌呤(A)的核苷酸之后的19个核苷酸序列完全一致，”可以被理解为“正义链自5’端开始的19个核苷酸序列和该两个以上连续的碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸中的最后两个核苷酸之后的19个核苷酸序列完全一致。”本发明提供的对应于该共同序列的小干扰RNA分子(SiRNA)能够通过细胞内的RISC(RNA-induced silencing complex)有效地抑制人类人类结肠癌LS-174T细胞Cripto基因表达，从而有助于针对Cripto基因高表达的结肠癌或cripto基因高表达的恶性肿瘤患者进行治疗。
当本发明提供的核苷酸序列还同时具有以下特征时，本发明所提供的小干扰RNA分子，前述的效果更好1)、核苷酸序列的正义链自5’端开始的第一个核苷酸是碱基为鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)的核苷酸中的一种；也就是说当SEQ ID NO1的序列中出现两个以上连续的碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸时，正义链自5’端开始的19个核苷酸序列和该两个以上连续的碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸中的最后两个核苷酸之后的19个核苷酸序列完全一致，”。
2)、上述SiRNA序列和已知的人类其他基因和表达片段无100％的同源性。
SEQ ID NO1-12为本发明提供的核苷酸序列SiRNA序列编号 号正义链序列 反义链序列 平均分子量 攻击范围#C11 UUCGGCCUCGGUCUUCCCATT UGGGAAGACCGAGGCCGAATT 13347.2 45-65C22 CAGAACCUGCUGCCUGAAUTT AUUCAGGCAGCAGGUUCUGTT 13317.2 106-126C33 CUGUGAGCACGAUGUGCGCTT GCGCACAUCGUGCUCACAGTT 13347.2 184-204C44 GAGAACUGUGGGUCUGUGCTT GCACAGACCCACAGUUCUCTT 13332.2 206-226C55 UGCUGGCACGGUCAGCUCCTT GGAGCUGACCGUGCCAGCATT 13362.2 266-286C66 CUACCACCGUCUGCACGUATT UACGUGCAGACGGUGGUAGTT 13332.2 365-385C77 UCGACAUUGACCUAUUUCCTT GGAAAUAGGUCAAUGUCGATT 13287.2 437-457C88 GGCUGCUGCUACAAUGUCCTT GGACAUUGUAGCAGCAGCCTT 13332.2 500-520C99 GUCAGCCAUAUCUCCAUUGTT CAAUGGAGAUAUGGCUGACTT 13302.2 660-680C10 10 CUGUGCAAGGCCUGGUGUUTT AACACCAGGCCUUGCACAGTT 13332.2 981-1001C11 11 GUCCAUCUGCGUGUGUGCATT UGCACACACGCAGAUGGACTT 13332.2 1205-1225C12 12 GAAUGAAGCCUCCUUAGAATT UUCUAAGGAGGCUUCAUUCTT 13287.2 1414-1434*如果序列中有N，则取A、U、C、G四种核甘酸的平均分子量339.2来计算#攻击范围是指该核苷酸序列在SEQ ID NO1序列中的相对应位置。
对于以上所说的同源度的数值，以80％以上为更佳。本发明所说的同源度是指任何SiRNA，其核苷酸序列和本发明所说的核苷酸序列的正义链或负义链序列，在相应位置上的核苷酸相同率。
本发明所提供的有效抑制还包括针对以上所提到的有效杀伤肿瘤细胞的针对Cripto mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)的序列的任何部份或全部经化学修饰后所形成的的小干扰RNA分子。
所述化学修饰包括主要包括以下三类第一、对连接相邻两个核苷酸的磷酸二酯键的部份修饰或用其它任何化学键取代。典型的磷酸二酯键的部份修饰是将磷酸双键上的氧置换成硫(硫化)或其它元素，或将磷酸单键上的氧变成氮(氮化)或其它元素和化学基团；对磷酸二酯键本身的全部取代，也包括对其本身或其部份以及和它相连的两个核糖的部份或全部改变，典型的例证是将磷酸二酯键和两个相邻的核糖变成肽键，使得核酸变成肽核酸(peptidenucleic acid，PNA)；第二、对核甘中核糖的五元环进行改变或其侧链上的化学基团作修饰。改变核糖环的典型例证如将五元的核糖环变成六环的Morpholino环；对核糖侧链上的修饰主要是指将核糖2’位上OH变成其它元素(如卤素元素)，或用其它化学基团替代OH中的H(例如烷基)。第三、将核苷酸上的碱基环作整体的改变或侧链的修饰。
大多数实体瘤的发生发展与癌基因的激活与扩增有关。表皮生长因子(Cripto)基因过表达与许多恶性肿瘤的发生发展密切相关。有效地封闭该基因的表达，将会有助于治疗与Cripto过表达有密切关系的恶性肿瘤。因此，本发明所提供的小干扰RNA cripto SiRNA可应用于制备治疗与Cripto表达增加相关的人类恶性肿瘤及恶性肿瘤相关的疾病的药物中。
图1为12种SiRNA处理癌细胞后Cripto mRNA的表达水平。
图2为C1对LS-174T细胞cripto mRNA水平作用的浓度效应(48小时)。
图3为C12对LS-174T细胞cripto mRNA水平作用的浓度效应(48小时)。
图4为C1，C12对LS-174T细胞cripto mRNA水平作用的时间效应(100nM)。
具体实施例方式
本发明结合实施例作进一步的说明。
实施例1 SiRNA的合成SiRNA的合成可委托公开对外开展合成业务的商业公司，比如美国Dharmacon公司，具体可通过www.dharmacon.com获知，所有的SiRNA分子都经过2位上脱保护、脱盐、纯化、和退火形成双链处理，然后溶于焦碳酸二乙酯处理的蒸馏水中。
本发明提供的小干扰RNA分子(SiRNA)的制备方法也可采用常规的固相化学合成法。
以SEQ ID NO1的小干扰RNA分子(SiRNA)为例整个化学合成可大致分成四个的过程(1)寡聚核糖核酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐退火无菌消毒。
具体制备操作如下(1)、寡聚核糖核酸的合成SiRNA的合成是在自动DNA/RNA合成仪(例如Applied Biosystems EXPEDITE 8909)上进行，根据c1号的小干扰RNA分子的核酸序列(正义链5’-UUCGGCCUCGGUCUUCCCATT，反义链5’-UGGGAAGACCGAGGCCGAATT)的次序将对应的核苷酸逐个连接起来。由于SiRNA是由一段19聚的寡聚核糖核酸和一个2聚的脱氧胸苷酸组成。因此起始物为固相(CPG)连接的5’-O-对二甲氧基三苯甲基-胸苷(1-2umol)。具体每一个循环合成可分为四步来完成。第一步是将与固相连接的胸苷上5’位的保护基在3％三氯乙酸的作用下洗脱；第二步在活性催化剂S-乙基四唑的作用下，将5’-O-对二甲氧基三苯甲基-胸苷亚磷酰胺偶联到已脱去保护的上一个胸苷上，形成二胸苷亚磷酸三酯。偶合时间和偶合循环的次数均按仪器厂家提供程序来完成；第三步是将偶合的二胸苷亚磷酸三酯在0.05M碘水的作用下氧化成二胸苷磷酸三酯；第四步是乙酰化，将固相上的少量未反应的活性基团(例如羟基和胺基)在乙酸酐的作用下形成酯或酰胺。从而达到封闭作用，用以减少整体副产物的产生。重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。
(2)脱保护将合成好的固相SiRNA放入一个可以密封的小瓶，并与加入1毫升的甲胺水溶液(10M，50％乙醇)，静置在室温。两小时后，取出溶液，并将固相CPG再次用乙醇；水和乙腈的混合液淋洗，并将淋洗液和前面取出的溶液合并一处，将其溶剂抽干。在小瓶中继续加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)。将溶液在室温静置12个小时。脱去所有寡聚核糖核酸上的保护基(包括碱基，核苷磷酸和核苷2’位的硅烷化保护基)。再经过乙醇沉淀，产生SiRNA的粗产物。
(3)纯化分离将SiRNA的粗产物溶解在2毫升的乙酸铵的水溶液中，然后经过反相C18高压液相色谱的分离。运用梯度淋洗的方法，收集SiRNA的主产物(淋洗液A0.1M的乙酸铵；淋洗液b20％的0.1M的乙酸铵和80％的乙腈)。将SiRNA的主产物的溶剂除去，并加入5毫升80％乙酸水溶液，在室温静置15分钟。然后将此溶液进行阴离子交换的分离(DEAE-5PW，阴离子交换柱)，即可得到纯度在90％以上的SiRNA(梯度淋洗，淋洗液A0.025M的Tris-HCl，0.025M NaCl pH＝8，5％乙腈；淋洗液b0.025M的Tris-HCl，2.0M NaCl，pH＝8，5％乙腈)。
(4)脱盐退火无菌消毒纯化的SiRNA经过透析，除去盐份，SiRNA的溶液进行过滤消毒和干燥结晶。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸进行退火处理形成稳定的双股交链的SiRNA。其方法是将正义链和反义链的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的缓冲溶液中(10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)。将此溶液加热到95℃，然后缓缓将此溶液冷却致室温(此过程应不少于一个小时)。最后将此溶液存放在4℃冰箱中保存，以便随时可以使用。
经过纯化后的SiRNA的纯度和鉴定有两种比较常用的办法。其一用毛细管凝胶电泳法来鉴定SiRNA的纯度，该方法可参见Paulus A，Ohms JI.Analysisof oligonucleotides by capillary gelelectrophoresis.J Chromatogr1990，507113-123。
其二是用MALDI-TOF质谱来准确测量其分子量，从而确定SiRNA的化学结构组成。
本发明所说的所有SiRNA都可以根据其序列采用上述方法制备，鉴定方法同上。
实施例2 细胞培养和SiRNA的转染1、细胞培养人类结肠癌LS-174T细胞有Cripto基因高表达。该细胞体外采用10％胎牛血清的RPMI1640培养基(含青、链霉素各100U/ml)培养，每日换液。
2、SiRNA的转染SiRNA转入肿瘤细胞借助于Invitrogen(www.invitrogen.com)公司的Oligofectamine来进行，具体步骤按照说明书来进行。简述如下，1.0×105的肿瘤细胞接种于24孔培养板上过夜，第二天被转入SiRNA，然后继续培养不同时间后，收集细胞，检测细胞中cripto mRNA的水平。
3、LS-174T细胞cripto mRNA表达水平的检测肿瘤细胞Cripto mRNA表达水平的检测用实时PCR的技术来进行。具体可以分为以下三步第一，细胞中RNA的提取，该方法可以参照现有的标准方法学来进行(见第四章，Currentprotocols in Molecular Biology，John & Wiley，2003)。第二步，cDNA的合成，合成方法也可参照标准的方法学来进行(见第五章，Current protocolsin Molecular Biology，John & Wiley，2003)。第三步，实时PCR的进行，实时PCR是在ABI7700序列检测仪上进行，具体方法参照ABI公司的标准程序来进行。Cripto引物上游，5’-CAATTCGGCCTCGGTCTTC-3’，；下游，5’-TTCAGGCAGCAGGTTCTGTTT -3’。FAM探针引物5’-CTCCTTACTGTGCTGTATCCCCATGG-3’。实时PCR探针的序列是5’-CCGCTTCTCGTCGATGTAGGTCACG-3’，对应于cripto cDNA序列中的1710到1734位。循环反应条件50℃，2min，1个循环；95℃，10min；95℃，15sec，60℃，1min。共40个循环。
实施例3 SiRNA对肿瘤细胞cripto mRNA的抑制作用1、SiRNA的选择本发明选择了针对cripto mRNA编码区的SiRNA分子共12个，即SEQ ID NO1-12所列的12个SiRNA分子。攻击位点从起始密码的45-1414之间，每个SiRNA分子中19个互补成双链的核苷酸序列中的G/C在42％-68％之间。
2、12个SiRNA对LS-174T细胞cripto mRNA表达的作用A、浓度为100nM的12个SiRNA对SW480细胞cripto mRNA的作用用100nM的这120种SiRNA作用于LS-174T细胞48小时后，观察它们对cripto mRNA水平的作用时12种SiRNA对cripto RNA均有一定的抑制作用。以第C1号(SEQ ID NO1)和C12号(SEQ ID NO12)对cripto mRNA抑制作用最为明显，分别达到86％、84％。结果参见图1，图示100nM的12种SiRNA作用于结肠癌LS-174T细胞48小时后对细胞中cripto mRNA水平的影响，对照组(control)是指细胞在等同条件下用转染试剂作处理，纵坐标表示SiRNA处理组cripto基因表达的mRNA水平占对照组的相对百分率，图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
B、C1 SiRNA对LS-174T细胞cripto mRNA抑制作用的浓度效应为了观察第1号SiRNA对Cripto mRNA抑制的浓度效应，我们选择了浓度从1.56nM到200nM。结果发现C1 SiRNA对Cripto mRNA抑制作用具有明显的浓度效应。结果参见图2，图中纵坐标表示SiRNA处理组cripto基因表达的mRNA水平占对照组的相对百分率，图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
C、C12 SiRNA对LS-174T细胞cripto mRNA抑制作用的浓度效应为了观察第C12号SiRNA对Cripto mRNA抑制的浓度效应，我们选择了浓度从1.56nM到200nM。结果发现C12 SiRNA对Cripto mRNA抑制作用具有明显的浓度效应。结果参见图3，图中纵坐标表示SiRNA处理组cripto基因表达的mRNA水平占对照组的相对百分率，图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
D、C1，C12 SiRNA对LS-174T细胞cripto mRNA抑制作用的时间效应为了观察第1和12号(100nM)SiRNA对Cripto mRNA抑制的时间效应，我们选择了24，48，72小时三个时间点。结果发现，C1及C12在24小时cripto基因即有抑制作用，48小时抑制作用明显增强(与24小时比较)，72小时更加明显(与24小时比较)。但72小时与48小时的抑制作用比较，差别不大，结果参见图4，图中纵坐标表示SiRNA处理组cripto基因表达的mRNA水平占对照组的相对百分率，图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
实施例4 SiRNA的修饰SiRNA的修饰的种类可分三大类，并且每一类中有许多变化，因此它们各自的合成方法不尽一样。这里列举两种最为常见的SiRNA修饰方法。并且，下述的方法并不限制本发明所述的有关对SiRNA修饰的保护范围。
1、硫化硫化是指将核苷磷酸二酯键上的一个氧原子转变成硫原子形成核苷硫代磷酸二酯。由于整个SiRNA的其它组成结构没有变化，因此它的合成和实施例1的SiRNA合成过程基本一样。只需将合成过程中的氧化反应变成硫化反应，在此反应中加入适当的硫化试剂，例如3H-1，2-benzodithiol-3-one1，1-dioxide(又称Beaucage试剂)。
2、核苷2’位羟基的修饰核苷2’位羟基的修饰是指用各种饱和烷氧基或不饱和烷氧来取代核苷五员糖环上的2’位羟基。其中最常见的是用甲氧基来取代核苷2’位的羟基。SiRNA的核苷2’位甲氧基化的合成和实施例1的SiRNA的合成步骤基本一致，只需要在偶合反应中用2’-甲氧基核苷亚磷酰胺来取代2’-叔丁基二甲基硅氧基核苷亚磷酰胺即可。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
权利要求
1.有效杀伤肿瘤细胞的针对表皮生长因子mRNA的小干扰核糖核酸分子，它为双链RNA分子，具有SEQ ID NO1-12的核苷酸序列，与具有以下特征的核苷酸序列至少70％的同源度正义链和负义链的长度均为21个核苷酸，正义链和负义链各自的3’端为两个连续的脱氧胸苷酸(TT)，两条链除去3’端的TT以外的19个核苷酸上的硷基互补形成双链，正义链自5’端开始的19个核苷酸序列和SEQ ID NO1的序列中连续两个硷基为腺嘌呤(A)的核苷酸之后的19个核苷酸序列完全一致，每条链中的硷基为鸟嘌呤(G)的核苷酸数量与硷基为胞嘧啶(C)的核苷酸数量之和占除去3’端的TT以外的19个核苷酸数量的比例为大于25％小于75％。
2.权利要求1所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对表皮生长因子mRNA的小干扰核糖核酸分子，所述同源度大于80％。
3.权利要求1至2中的任一所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对表皮生长因子mRNA的小干扰核糖核酸分子的任何部份或全部经化学修饰后所形成的的小于扰核糖核酸分子。
4.如权利要求3中所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对表皮生长因子mRNA的小干扰核糖核酸分子，所述化学修饰包括对连接核苷酸的磷酸二酯键的部份修饰或用其它任何化学键取代。
5.如权利要求3中所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对表皮生长因子mRNA的小干扰核糖核酸分子，所述化学修饰包括对这些分子侧链上核糖的2位上的OH作任何化学的修饰和改变，和碱基上任何位置作化学修饰或改变。
6.权利要求1所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对表皮生长因子mRNA的小干扰核糖核酸分子在制备治疗抗肿瘤与肿瘤相关疾病的药物中的应用。
7.如权利要求4所述的有效杀伤肿瘤细胞的针对表皮生长因子mRNA的小干扰核糖核酸分子在制备治疗与表皮生长因子表达增加相关的疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种作为抗肿瘤药物的活性成分的有效杀伤肿瘤细胞的针对表皮生长因子(Cripto)基因mRNA的小干扰核糖核酸分子(SiRNA)，该核苷酸序列的负链及其一个核甘酸的突变体和已知人类基因无同源性。本发明提供的对应于该共同序列的小干扰RNA分子(SiRNA)能够通过细胞内的RISC有效地抑制人类人类结肠癌LS－174T细胞Cripto基因表达，从而有助于针对Cripto基因高表达的结肠癌或Cripto基因高表达的恶性肿瘤患者进行治疗，可应用于制备治疗与Cripto表达增加相关的人类恶性肿瘤及恶性肿瘤相关的疾病的药物中。
文档编号C07H21/00GK1616476SQ200410066528
公开日2005年5月18日 申请日期2004年9月16日 优先权日2004年9月16日
发明者丁佳逸, 范钰, 郑树 申请人:浙江大学, 杭州新瑞佳生物医药技术开发有限公司