专利名称：用于转基因青鳉鱼的基因片段的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的核酸片段。
背景技术：
观赏用鱼是渔产业之一环并具有全球性市场。因此，利用DNA重组及转基因技术，藉以改变观赏用鱼的表型具有巨大市场价值。
转基因鱼研究是利用基因由异源及同源的调节元件所驱动，并由组成或组织特异性表达基因所产生的。调控元件包括抗冻蛋白(antifreezeprotein)、鼠金属硫蛋白(metallothionein)、鸡的δ-结晶(δ-crystalline)、鲤鱼β肌动蛋白(carp β-actin)、鲑鱼组蛋白H3(histone H3)及鲤鱼α球蛋白(α-globin)的基因等等。然而，于转基因鱼中使用这些DNA元件有很大的缺点，包括表达效率低及转基因的镶嵌型(mosaic)表达。
将青鳉鱼(mekada)β-肌动蛋白启动子所驱动的lac报导基因显微注射入青鳉鱼卵后，虽然表达很少且具有高度的镶嵌性，但还是会导致lacZ基因短暂的表达，甚至在第一子代也会表达出来。Hamada等人将绿色荧光蛋白与青鳉鱼β-肌动蛋白启动子融合后，显微注射至鱼卵所产生出来的青鳉鱼胚胎的报告中也有类似的结果。(Hamada et al.，1998，Mol Marine Biol Biotechnol 7173-180)。
不幸的，传统转基因技术只能产生出释放镶嵌或微弱荧光之转基因鱼。这些转基因鱼荧光仅能于荧光显微镜下以特定波长光源观察。基于此非实用性及种种困难，这些荧光转基因鱼因消费者接受度不佳难以达到商业上的成功。
Chi-Yuan Chou等人发表了一个两端连接反向末端重复序列，以增加青鳉鱼体内转基因表达效率的DNA构建质粒。转基因在第0代及之后两代的表达都呈一致性(Chi-Yuan Chou et al.，2001，TransgenicResearch 10303-315)。虽然一种转基因绿色荧光青鳉鱼已有文献发表，而产生其它的荧光基因(如红色荧光蛋白)的不同类转基因鱼之方法及条件皆不相同，且因转基因技术之基因构建，基因表达，基因遗传的策略不同与不确定因素，使得吾人不能轻易由现有技术推得。
发明内容
为克服现有技术的转基因荧光鱼缺点，本发明彻底并谨慎地在设计中使用概念性突破。一pβ-DsRed2-1-ITR质粒构建体可以经由将青鳉鱼的β-肌动蛋白启动子导入pDsRed2-1-ITR(Clontech)表达质粒产生。适量的该pβ-DsRed2-1-ITR质粒接着以显微注射导入青鳉鱼一细胞时期受精卵细胞质中。注射后之卵细胞以子代是否于全身肌肉表达荧光筛选之。取会表达荧光之子代转基因荧光鱼进行繁殖。
虽然现有技术已揭露产生转基因绿色荧光鱼之方法，然而本发明之转基因红色荧光鱼之技术与以往显有不同。在质粒构建方面，第一代转基因绿色荧光蛋白质粒，其β-肌动蛋白启动子序列由质粒pOBA-109经限制酶SalI与NcoI作用后，回收的4kb DNA片段与质粒pEGFPITR经限制酶SalI与NcoI作用后，回收的4.7kb DNA片段接合反应作用而成。而第二代转基因红色荧光蛋白质粒，由于可运用之限制酶切割位置较少，因此其接合方式更为复杂困难。首先，其β-肌动蛋白启动子序列由质粒pOBA-109经限制酶EcoRI与NcoI作用后，进行补入突出的5′端的处理，再进一步回收4kb DNA片段，而质粒pDsRedITR经限制酶SalI与BamHI作用后，进行补入突出的5′端的处理，接着进行DNA之5′端脱磷酸作用(Dephosphorylation)，再将4.7kb DNA片段回收。最后将先前所述之含β-肌动蛋白启动子序列的DNA与4.7kb DNA片段经接合反应作用而成。
在受精卵显微注射方面，第一代转基因绿色荧光蛋白所选用的毛细管针头孔径为4-5μm，并在注射针管壁做硅化处理，在100倍放大倍率下，将DNA(10ng/ml)注入受精卵的细胞质中，所注射的溶液体积约20-30pl，显微注射后的存活率为85％-90％。在第二代转基因红色荧光蛋白所选用的毛细管针头孔径为1.6-2.5μm，为DNA溶液不会堵塞的最小孔径，所注射的溶液体积约20-30pl在注射管壁不做硅化处理，显微注射后的存活率为90％-95％，约提高5％。
由于红色荧光蛋白比率色荧光蛋白表达较为稳定，绿色荧光蛋白在转基因青鳉鱼纯品系的表达上会有偏向黄绿色与橘绿色，在红色荧光蛋白转基因青鳉鱼不会有色差的情形，相形之下红色荧光蛋白对青鳉鱼胚胎发育似乎具有毒性，在所筛选得到的红色荧光青鳉鱼皆为杂合子(heterozygote)。
此外，在转基因鱼的孵化上，红色转基因鱼亦有明显较绿色转基因鱼为高的困难度。可见下表
由单次产卵数、平均产卵数、产卵率、坏卵率、孵化率、养成率、平均体长、体重、卵重等，都明显发现纯合子的红TK-1都与绿色TK-1有很大的差异。红TK-1的纯合子的活存率及体长、体重都较绿TK-1明显为低，所以两者间有明显的不同之处。
本发明中之“青鳉鱼”一词是指来自但非限定于以下之Adrianichthyidae(稻米鱼)诸如Oryzias javanicus，Oryzias latipes，Oryziasnigrimas，Oryzias luzonensis，Oryzias profundicola，Oryzias matanensis，Oryzias mekongensis，Oryzias minutillus，Oryzias melastigma，O.curvinotus，O.celebensis，X.oophorus，及X.saracinorum。优选的青鳉鱼来自但非限定于以下之青鳉科(Oryziinae)品种诸如Oryzias javanicus，Oryziaslatipes，Oryzias nigrimas，Oryzias luzonensis，Oryzias profundicola，Oryziasmatanensis，Oryzias mekongensis，Oryzias minutillus，Oryzias melastigma，O.curvinotus，O.celebensis。最佳的青鳉鱼为Oryzias latipes。
本发明提供一基因片段，其中包括(1)一青鳉鱼β-肌动蛋白启动子；(2)一荧光基因；及(3)腺相关病毒的反向末端重复序列(ITR)。
本发明优选的片段为 本发明亦提供一质粒，其中该质粒包含本发明的基因片段。
本发明红色荧光基因可由BD Bioscience Clontech购买。在本发明实施中，pDsRed2-1当成红色荧光基因之来源。pDsRed2-1编码之DsRed2，其是一DsRed之变体，设计来达到更快速的成熟及降低非特异性聚集。DsRed2包含一系列对应人类密码子优先使用之沉默(silent)碱基对改变供哺乳动物细胞之高度表达。在哺乳动物细胞培养中，当DsRed2结构性表达时，散发红色细胞可于转染后24小时内以荧光显微镜观察。大型不可溶之蛋白聚集通常可在表达DsRed1系统之细菌及哺乳动物细胞中观察到，而表达DsRed2之系统则显着地减少。成熟快速，更稳定的红色荧光蛋白亦可让宿主细胞良好地适应；以DsRed2转染的哺乳类培养细胞未显示明显降低生存能力迹象—在测试过的一些细胞株之中，表达DsRed2的细胞与未经转染对照组显示相同的型态(如黏附，折光)及生长特性。pDsRed2-1是一不具启动子的DsRed2载体，可用来监测插入多重克隆部位(MCS)的不同启动子及启动子/增强子组合的转录。
本发明方法提供5种对现有方法之改进1.本发明核酸序列片段之主体系如pDsRed2-1-ITR之质粒构建体，该质粒可易于商业上取得。
2.本发明核酸序列片段使青鳉鱼能由全身性骨胳肌遍布地散发出荧光。
3.本发明方法，包含用显微注射将转基因构建体入受精卵，确保转基因青鳉鱼以较高比率高品质地在全身性骨骼肌散发荧光。
4.异质转基因鱼可稳定地将转基因遗传至下一代。因此可用自然培育方法维持转基因数量与减少育种开销。
5.转基因青鳉鱼的荧光，散发于其全身性骨胳肌，可以轻易的以肉眼所见。红色荧光更能在较短波长光源下被加强，为观赏鱼提供较高的观赏价值。
综上所述，本发明提供一种产生具全身性荧光转基因青鳉鱼的方法，包括
(a)构建一质粒，其中包含反向末端重复序列(ITR)，CMV启动子，一荧光基因，S40 polyA及ITR；(b)以青鳉鱼β-肌动蛋白启动子置换CMV启动子，产生一新的质粒构建体；(c)以NotI将新的质粒构建体线性化；(d)将适量线性化之质粒构建体以显微注射入受孕青鳉鱼卵；(e)筛选带荧光之卵；(f)孵育筛选卵使成熟并与野生种交配；及(g)筛选包含转基因之子代并产生全身性荧光青鳉鱼。
因此，优选之线性化构建体选自于 用于本发明方法中之优选荧光基因为来自pDsRed2-1之红色荧光基因。
在本发明产生转基因青鳉鱼的方法中，注射入受孕卵中之适量NotI-线性化质粒构建体足以将转基因导入青鳉鱼之生殖细胞。注射入受孕卵中之线性化质粒构建体之优选量为1-10nl。注射入受孕卵中之线性化质粒构建体之最佳量为2-3nl。
本发明亦对转基因青鳉鱼提供以本发明方法产生的全身性荧光。优选的青鳉鱼具有全身性红色荧光。其它颜色的荧光鱼如蓝色荧光蛋白(BFP)基因，黄色荧光蛋白(YFP)基因或青色荧光蛋白(CFP)基因亦可以相同技术产生。
图1显示来自pOBA-109与pDsRed2-1-ITR的pβ-DsRed2-1-ITR质粒构建体。
图2显示产生转基因青鳉鱼之程序。
图3照片显示一来自F2代(取自以本发明的pβ-DsRed2-1-ITR核酸片段成功转染种鱼)的3个月龄转基因青鳉鱼，证实其红色荧光之表达。
图4显示线性化质粒构建体pβ-DsRed2-1-ITR(8.7kb)。
具体实施例方式
以下实施例属非限制性并仅作为在本发明中各种可能及特色之代表。
产生具红色荧光青鳉鱼的方法1.商业上可获得之质粒构建体，pDsRed2-1(Clontech)，用于制备表达载体。
2.DsRed片段来自于pDsRED2-1质粒。CMV启动子及两个腺相关病毒之反向末端重复序列(ITR)被与DsRed片段连接，如图1制备质粒构建体pDsRed2-1-ITR所描述之。pDsRed2-1-ITR质粒构建体具较佳的表达稳定性。
3.产生新质粒构建体pβ-DsRed2-1-ITR
如图1所示，青鳉鱼β-肌动蛋白启动子通过以NcoI与EcoRI限制酶切割质粒构建体pOBA-109获得。先使用NcoI，填充末端，接着以EcoRI切割产生一4kb片段。
如图1所示，CMV启动子由限制酶BamHI及SalI自构建体pDsRed2-1-ITR切下。BamHI及SalI之切割产生一4.7kb片段。接着，青鳉鱼β-肌动蛋白启动子被插入位于pDsRed2-1-ITR质粒构建体中，已切去之原CMV启动子处。产生之质粒构建体具有两段145bp腺相关病毒之反向末端重复序列(ITR)。其中一ITR位于SV40 poly A之3’端，另一则位于β-肌动蛋白启动子之5’端。
如图1所示，产生之质粒构建体pβ-DsRed2-1-ITR其全长为8.7kb。pβ-DsRed2-1-ITR包括(1)青鳉鱼β-肌动蛋白启动子(使全身遍布性表达)；(2)珊瑚红色荧光蛋白；(3)腺相关病毒反向末端重复序列；及(4)pUC质粒构建体基础。
质粒构建体pβ-DsRed2-1-ITR被转化至大肠杆菌5α。
4.质粒构建体之线性化如图1所示，适量之pβ-DsRed2-1-ITR质粒以适量限制酶NotI切割。一小量经切割之产品以琼脂糖凝胶电泳分析并确认其线性。如预期，片段长度为8.7kb。接着，经切割之DNA产物以含酚∶氯仿(1∶1)溶液萃取，用酒精沉淀，风干后以10μg/ml浓度溶于PBS缓冲液，使用于后续之细胞质显微注射。
5.细胞质显微注射
a.受精卵之收集于夜间11时实施显微注射步骤及培养箱进入黑暗期之前，以分离网处理鱼的分隔与收集，次日早晨在日光期开始后，依图2步骤1描述，每15-20分钟收集鱼卵。在每一次的显微注射中，注射30-40颗卵；依图2步骤3，每次实验注射250-300颗卵。
b.显微注射线性化之构建体经定量并依需要浓度溶于含酚红指示剂之5倍PBS缓冲液。以青鳉鱼用显微注射器(Drummond)之微毛细管(微毛细管注射针头宽度范围从2到10μm)拾起DNA。当微针头伸入细胞质内，以2-3nl之DNA注射之。
c.孵育受精卵经注射之卵以无菌溶液湿润，培养于培养箱，温度设定于26℃。24小时后，荧光可于发育中的胚胎观察到，如图2第4步骤所示。
6.荧光显微镜观察经注射之胚胎置于一含水培养皿中。红色荧光之分布与强度于荧光显微镜下观察(Leica MZ-12；荧光系统光源Hg 100W；主发散波长558nm，主吸收波长583nm，滤镜组RFP-Plus；照相系统MPS60)。
7.转基因之胚源传送如图2所示，源自显微注射pβ-DsRed2-1-ITR片段之卵的红色荧光青鳉鱼与野生型配种，获得能表达一致性荧光的子代。表达荧光之F1代再度与野生型配种以获得F2子代(图3)，其全部能表达红色荧光，且能容易地与不表达荧光的鱼区别。转基因青鳉鱼与野生型青鳉鱼的不同在蓝色光下更容易区别。
本发明之DNA片段可经修改以令其携带其它的荧光基因，因此能产生具不同荧光的鱼。
其它包括他种荧光基因之转基因构建体可以与红色荧光一同导入青鳉鱼卵中使鱼具有不同的体色。
本发明之青鳉鱼可以广泛应用于医学研究及生命科学中其它领域的研究，例如，细胞融合，克隆，体细胞核转基因技术，细胞运动性，细胞目标，及胚胎发育研究。
本发明已详细说明及举例，以使本领域人员能施行并加以利用，唯任何替代、变更与修改均应在不脱离本发明之精神与范围内进行。
本领域人员很快便会发现到本发明很容易便可达到目标，并得到本文中所述之结果及优点。细胞株、胚胎、动物及其产生过程和方法仅为示范性之优选实施例代表，并非欲限制发明之范围。本领域人员将会想到对本发明进行修改及其它用途，唯这些修改均应包含在本发明的精神内并仅限于申请专利范围内。
本领域人员显然很容易便可在不脱离本发明之精神与范围内对本发明进行变更与修改。
本说明书所述之所有专利及发表均为此领域中和发明有关之一般技术。本说明书所述及之专利与发表文章可说明本领域人员具有的技术程度。
本文所述之发明图式可在没有任何要件或限制下施行，而非特定本文所揭露者。所使用之名词及表达仅为说明之用，而非用于限制，且非欲利用这些名词及表达来排除任何所示及所述或其部分特征之等价物，而是认为各种变更修改仍可能在发明申请专利范围内。因此，应该了解虽然已利用优选实施例及选择性的特征来具体揭露本发明，但本领域人员可能会根据此中所揭露之构想加以修改及变更，唯这些修改与变更应当在本发明所附申请专利请求项所定义之范围内。
其它实施例在下列的权利要求书中提到。
权利要求
1.一基因片段，其包括(1)一青鳉鱼β-肌动蛋白启动子；(2)一荧光基因；及(3)腺相关病毒的反向末端重复序列(ITR)。
2.权利要求1的基因片段，其为如图4所示的8.7kb的pβ-DsRed2-1-ITR。
3.权利要求1的基因片段，其中荧光基因选自蓝色荧光蛋白(BFP)基因、黄色荧光蛋白(YFP)基因或青色荧光蛋白(CFP)基因。
4.一包含权利要求1的基因片段的质粒。
5.一包含权利要求2的基因片段的质粒。
6.一种产生全身性荧光青鳉鱼的方法，包含(a)构建一质粒，其中包含反向末端重复序列(ITR)、CMV启动子、一荧光基因、S40 poly A及ITR；(b)以青鳉鱼β-肌动蛋白启动子置换CMV启动子，产生一新的质粒构建体；(c)以NotI将新的质粒构建体线性化；(d)将适量线性化的质粒构建体以显微注射入受精青鳉鱼卵；(e)筛选带荧光的卵；(f)孵育筛选卵使成熟并与野生种交配；及(g)筛选包含转基因的子代并产生全身性荧光青鳉鱼。
7.权利要求6的方法，其中线性化质粒构建体是如图4所示的8.7kb的pβ-DsRed2-1-ITR。
8.权利要求6的方法，其中荧光基因为来自pDsRed2-1的红色荧光基因。
9.权利要求6的方法，其中，注射入受精卵中的适量NotI-线性化质粒构建体足以将转基因导入青鳉鱼的生殖细胞。
10.权利要求9的方法，其中注射入受精卵中的适量线性化质粒构建体为2-3nl。
11.权利要求6的方法，其中荧光基因选自蓝色荧光蛋白(BFP)基因、黄色荧光蛋白(YFP)基因或青色荧光蛋白(CFP)基因。
12.一种全身性荧光青鳉鱼，其由权利要求6的方法产生。
13.权利要求12的青鳉鱼，其中该青鳉鱼具有全身性红色荧光。
14.权利要求12的青鳉鱼，其中该青鳉鱼来自Adrianichthyidae。
15.权利要求12的青鳉鱼，其中该青鳉鱼选自Oryzias javanicus，Oryzias latipes，Oryzias nigrimas，Oryzias luzonensis，Oryzias profundicola，Oryzias matanensis，Oryzias mekongensis，Oryzias minutillus，Oryziasmelastigma，O.curvinotus，O.celebensis，X.oophorus，或X.saracinorum。
16.权利要求15的青鳉鱼，其中该青鳉鱼选自Oryzias javanicus，Oryzias latipes，Oryzias nigrimas，Oryzias luzonensis，Oryzias profundicola，Oryzias matanensis，Oryzias mekongensis，Oryzias minutillus，Oryziasmelastigma，O.curvinotus或O.celebensis。
17.权利要求16的青鳉鱼，其中该青鳉鱼为Oryzias latipes。
18.权利要求12的青鳉鱼，其拥有全身性蓝色荧光。
19.权利要求12的青鳉鱼，其拥有全身性黄色荧光。
20.权利要求12的青鳉鱼，其拥有全身性青色荧光。
全文摘要
本发明涉及一核酸片段，其中包括(1)一青鳉鱼β－肌动蛋白启动子；(2)一荧光基因；及(3)腺相关病毒的反向末端重复序列(ITR)。本发明还涉及一质粒，其中包括本发明的核酸片段。
文档编号C07K14/435GK1664099SQ200410094708
公开日2005年9月7日 申请日期2004年11月12日 优先权日2004年1月8日
发明者蔡怀桢 申请人:邰港科技股份有限公司, 蔡怀桢