专利名称：血管粘着分子及其功能的调节的制作方法
本申请是2000年3月13日申请的申请号为00806320.6的中国发明专利“血管粘着分子及其功能的调节”的分案申请。
本发明涉及鉴定血管粘着分子的新亚族，以及调节这些分子的功能以治疗各种疾病。
在胚胎和出生后早期发育的整个过程中，内皮细胞通过血管生成和血管发生形成新的血管。在成年生物体内，内皮细胞限定血液组织屏障并由非循环的休眠细胞组成。这些极性化细胞彼此通过紧密接合和粘着接合连接以形成细胞的连续层。内皮细胞层的功能在于维持组织稳态、纤维蛋白溶解、凝集、血管紧张及白细胞反式迁移。所有这些性质都是受粘着分子表达和功能的精细调节控制的。
炎症、肿瘤生长、创伤或血管发生等病理状态均导致血管内皮上粘着分子数目和功能的临时改变，并进而改变血管的稳态。例如，肿瘤可增加血管生成因子的局部浓度，使非循环休眠内皮细胞转换成增殖的内皮。血管生成转换是由包括IL-8、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、可溶性VCAM-1、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肿瘤坏死因子(TNF)在内的几种因子诱导的。结果，已有血管的内皮细胞降解细胞外基质(ECM)和浸入周围组织，进而导致肿瘤的血管形成。
在血管生成转换期间，内皮细胞基因表达的模式受到改变。例如，用bFGF或TNFα处理内皮细胞可使参予内皮细胞迁移的粘着分子αvβ3整联蛋白表达增加4倍。另外，血管生成转换可改变内皮的炎性反应，导致白细胞向肿瘤异常迁移。正常情况下，白细胞在内皮上粘着并通过内皮迁移而从血液中外渗。这些机制发生在一个涉及选择蛋白、整联蛋白和免疫球蛋白超家族粘着分子的多步骤过程中。
在肿瘤相关内皮中，已发现VCAM、ICAM和选择蛋白是受到下调的。这些粘着分子的下调可能代表一种肿瘤免受免疫系统的细胞毒性细胞侵入的机制。
本发明的目的是寻找在处于肿瘤影响下的内皮中受到转录调节的免疫球蛋白超家族(Ig Sf)的新的粘着蛋白。
本发明的再一个目的是定义用于治疗各种适应症如肿瘤和炎症的衍生于新的粘着蛋白的分子。
在导致本发明的研究中，使用小鼠实验模型鉴定在上皮细胞系与黑素瘤细胞共培养期间受调节的转录物。为了将筛选策略限制于Ig Sf的粘附分子，发展了一种称为“定向差异显示”的新的RNA显示方法。这种改良的显示技术的新颖性在于只使用一组简并引物。如将在实施例中证明的，令人惊奇地发现这种方法具有足够高的特异性。
更具体地说，使用部分简并的引物(在本案中，简并水平是一组内有2048至4096个不同形式的引物)使之针对见于Ig Sf成员的C2区域中的保守序列，以驱动基于聚合酶链反应(PCR)的定向差异显示技术(Samaridis & Colonna(1997)Eur.J.Immunol.27，660-665)。
基于这一发现，本发明提供一种特异性鉴定差异表达的DNA序列的方法，其包括使用差异显示反转录PCR，其中使用一组部分或完全简并的靶基因特异性引物。常规RNA显示策略的一个主要限制因素是该方法缺乏特异性。为了提高这种特异性，本发明人在寻找其它粘着分子中使用了针对编码带C2区之分子的序列的简并引物。通过对比几个Ig Sf粘着分子的C2区，并鉴定围绕参与C2区结构Y(RQYS)-C-x-A-S-N-x2-G的半胱氨酸残基的线性氨基酸共有区达到了此目的。在更普遍的意义上说，这种方法也可用于寻找其它序列，其中一个或多个最常见共有序列的反向翻译被用来设计用于进行差异显示的简并引物。
该方法用于鉴定在黑素瘤或癌细胞存在下因汇合而在内皮细胞中受到下调的转录物。cDNA编码具有不寻常结构特征，并称为CRAM-1(“汇合调节的粘着分子”)的新的Ig Sf分子。目前对参予白细胞反式迁移的结构相关分子JAM的描述，提示存在有其中以JAM和CRAM-1为原型的新的粘着分子家族。与EST数据库的序列对比进一步用于此分子家族的第三个成员CRAM-2的克隆。
图1显示编码CRAM-1和CRAM-2蛋白的小鼠cDNA序列。在本申请中，名称JAM和JAM-1、CRAM-1和JAM-2，以及CRAM-2和JAM-3是可以互换使用的。
编码JAM、CRAM-1和CRAM-2的转录物的比较组织分布显示了这些分子在内皮和上皮区室中的优先表达，表明了其在维持细胞-细胞接触中的作用。休眠内皮细胞的细胞-细胞相互作用调节血管通透性、细胞周期及白细胞穿过内皮细胞壁的反式迁移。
为了进一步阐明三种分子的功能和相互影响，使用了一种分子研究手段。为此，构建了由Flag尾端和与可溶性或膜结合形式的CRAM-1、CRAM-2或JAM融合的增强绿色荧光蛋白(EGFP)组成的嵌合分子(参见图2)。当转染到细胞系中时，CRAM-1和JAM的EGFP融合产物集中在细胞-细胞接触点，证明这些分子在细胞-细胞联系中发挥作用。相反，CRAM-2在细胞表面有更为广泛的分布。另外，CRAM-1的可溶性构建体阻断白细胞的体外跨内皮迁移，而可溶性JAM则只显示出边际效应。总之，这些结果提示这一新的粘着分子亚族在维持血管完整性和内皮层功能中发挥重要作用。
基于这些发现，本发明提供了用基于CRAM多肽的试剂抵抗慢性炎症和肿瘤发展等医学适应症的新方法。
更具体地说，本发明涉及属于人免疫球蛋白超家族的一个亚族的分离形式的多肽，该多肽显示与鼠汇合调节的粘着分子1或2(CRAM-1或CRAM-2)的氨基酸序列至少有70％序列同源性(参见图3上行和第二行)。图4和5分别显示小鼠JAM-2(CRAM-1)和JAM-3(CRAM-2)之间在氨基酸水平上的序列对比。
见于人或动物体内的CRAM多肽是生长细胞的标记。CRAM表达在生长的细胞中受到上调。
本文公开的是作为该家族成员的两种新的小鼠多肽。基于这些多肽的序列信息，可以用已知的方法如PCR、DNA文库的交叉杂交、抗体的交叉反应性来鉴定该家族的其它成员。
序列信息可以是氨基酸序列或编码氨基酸序列的核苷酸序列。
更具体地说，本发明涉及人的相应多肽，其基本上包括如图6B所示的氨基酸序列和与之至少70％同源的氨基酸序列。
除了使用本文公开的两种CRAM蛋白鉴定其它种动物如人中该家族的其它成员外，也可使用这两种蛋白质和其相应的家族成员制备衍生的分子，如抗本发明(多)肽的抗体、蛋白质的重组等同物(可以是可溶形式的)，或包括该多肽之至少一部分氨基酸序列的肽。适当的氨基酸序列部分是细胞外区域VC2和膜最接近的胞质序列A-[Y，Q]-[R，S]-[R，K]-G-[C，Y]-F。
除了抗体和(多)肽型衍生物外，本发明还涉及具有编码完整多肽或其部分之序列的多或寡核苷酸，该多肽具有与本文所述的CRAM-1或CRAM-2蛋白的氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列。更具体地说，本发明涉及与图6中所示的人DNA CRAM-1序列至少70％，优选80％，更优选90％，最优选100％同源的核苷酸序列。
例如这样的多或寡核苷酸可以是RNA或DNA，并且可以是引物，探针，反义RNA等。
所有这些分子均可用于调节见于人或动物体之原始多肽的功能，或用于诊断。
例如可用抗体抑制肿瘤中的血管生成。可使用它们作为针对携带CRAM多肽之细胞的导向分子。抗体可以自身发挥作用，或者可以与如毒素、放射性标记、荧光标记、酶标记、光活化标记的其它分子，以及与脂质体、细胞等偶联。
标记的抗体特别适于抗体的诊断应用，即可以利用它们定位生长的肿瘤中的血管生成。此外，可以使用与毒素或放射性分子偶联的抗体特异性地杀伤肿瘤(通过导向肿瘤中的(生长的)血管)。
发现除了淋巴结和淋巴集结等淋巴样器官中的淋巴和高内皮小静脉外，在正常维管结构中未检测到CRAM型分子。其优点是，例如抗CRAM抗体的定向作用可以是对例如肿瘤细胞高度特异的，因而避免了不希望有的副作用。
此外，(多)肽可使分子结合在血管生成维管上，且借此刺激或抑制血管生成。
可以使用具有与CRAM多肽基本上相同的氨基酸序列的(多)肽治疗血管内皮的炎性反应。根据本发明，发现可用sCRAM-1-IG2Do或抗CRAM-1单克隆抗体抑制白细胞的跨内皮迁移。因此可使用这种分子或相似分子抑制或刺激例如见于炎症中的免疫反应。
分子在HEV血管细胞上的体内特异性表达(其为淋巴细胞迁移中特化的)支持CRAM对淋巴细胞迁移或血管通透性的刺激作用。因此这种作用可能是由于对正常参予封阻血管床的分子(CRAM-1，CRAM-2，JAM，PECAM，VE-钙粘着蛋白)的调节。这一发现构成了本发明的其它应用的基础，其中包括递送本发明的重组CRAM分子(多)肽或抗CRAM-1单克隆抗体，以调节内皮细胞间接合。
也可使用抗CRAM抗体阻断生长的细胞中的细胞-细胞相互作用。这种阻断导致正常情况下维持血管屏障功能所需的细胞间接触被打乱。可利用这一发现提高生长的血管的通透性，以增加药物向生长的肿瘤、月经后子宫等部位的释放。因此可利用细胞间接触的打乱来阻断带抗原的肿瘤细胞如血管瘤(源于血管内皮的肿瘤)或某些迅速生长的癌瘤的发展。
为了诊断上的应用，可以利用标记的抗体，以及利用与见于表达CRAM蛋白之内皮细胞中的CRAM DNA或mRNA互补的标记的寡核苷酸。
下列实施例中将进一步举例说明本发明，实施中所涉及的附图如下图1编码CRAM-1和CRAM-2蛋白的鼠cDNA序列。将muCRAM-1亚克隆到pcDNA3载体中并使用Sp6和T7引物测序。作为IMAGE克隆从EST文库(AcAA690843和W80145)中得到muCRAM-2并在pT7T3-DPac载体中使用T7和T3引物进行序列测定。
图2实施例中所用分子工具的图解显示。上框中展示新家族的结构和重要的残基。星号代表三种分子的胞质部分中的推测的磷酸化位点。C2区域中第二个典型Cys残基在JAM序列中丢失。不同的嵌合分子呈现在融合位点的位置和周围残基的下方。白色背景中显示来源于JAM、CRAM-1或CRAM-2序列的部分分子。
图3CRAM-1和CRAM-2氨基酸序列的对齐比较。虚线指示缺口。
图4鼠和人CRAM-1(JAM-2)之间的序列对比。
图5鼠和人CRAM-2(JAM-3)之间的序列对比。
图6人CRAM-1的核苷酸序列(上框)、人CRAM-1的完整氨基酸序列(中框)，和人CRAM-2的部分氨基酸序列。
图7使用简单引物进行定向差异显示。(A)编码存在于C2 Ig区域中之序列的PCR引物的核苷酸序列。两个引物由于编码Ser残基的密码子而编码相同的序列。简并性水平是编码YRCXAS的引物有4096种不同的形式，其他引物有2048种形式。(B)示出用YYCXAS1引物得到的放射性PCR产物显示。各泳道相当于从t-end内皮细胞系(泳道t-end)、B16黑素瘤细胞系(泳道B16)，或两细胞系的共培养物(中央泳道)得到的cDNA跑出的PCR产物显示。箭头指示在共培养条件下从下调的转录物CRAM-1得到的PCR产物。
图8(A)汇含调节的粘着分子1(CRAM-1)cDNA的核苷酸和推测的氨基酸序列。划下线部分为推测的疏水信号肽(第一个)和跨膜区域(第二个)。图中指出预计的N-糖基化位点(划掉)，可能形成二硫键的半胱氨酸(括号)和可能的磷酸化位点的Ser/Thr/Tyr残基(黑体)。(B)鼠CRAM-1蛋白的结构模型。显示VH和C2样Ig区域的细胞外部分有两个推断的N连接的糖基化位点。箭头指向由用于定向差异显示的部分简并引物(YYCXAS1)导向的区域。
图9JAM、CRAM-1和CRAM-2鼠蛋白序列对比。黑框内为相同残基，灰色框指出同源残基。CRAM-2和CRAM-1之间的总体相同性为36％，JAM和CRAM-1之间为31％，JAM和CRAM-2之间为33％，各自的同源性为52％、52％和49％。序列中虚线显示缺口。星号标示V和C2区域的典型保守残基(Cys和Trp)。
图10以PT-PCR方法在不同泳道中检测的(A)或以Northern印迹法在各种组织中检测的(B)编码JAM、CRAM-1和CRAM-2之转录物的表达。(A)对来源于经TNF处理的(泳道2和11相当于TNF处理的t-end)，或未处理的(泳道3、4、6、7、9、12分别相当于b-end.5、e-end.2、t-end V++L-、t-end VlowL++、TME和t-ehd)内皮细胞的cDNA进行PT-PCR。泳道5和10相当于肿瘤细胞系B16(黑素瘤)和KLN205(癌)。泳道8相当于未转化的胸腺表皮细胞系MTE4-14。泳道1是对含有克隆的cDNA的质粒进行JAM、CRAM-1和CRAM-2扩增的阳性对照。(B)与小鼠Northern印迹进行P32探针杂交的放射自显影。图左侧标明用于各个杂交的探针。以2kb大小检测JAM和CRAM-1的杂交信号。
图11JAM-2和JAM-1定位于已确立的细胞-细胞接触点。A用抗JAM-2(a)或抗JAM-1(b)抗体对低聚甲醛固定的TME细胞进行免疫细胞化学分析。箭头指示蛋白质特异性定位于细胞-细胞接触点。标尺相当于10μm。BJAM-2-EGFP(a)和JAM-1-EGFP(c)嵌合分子特异性地定位于被转染细胞间的细胞接触点。转染的和非转染的细胞之间未观察到EGFP重组蛋白质富集(箭头)。标尺相当于20μm。CTME内皮细胞表面生物素化后JAM-2的免疫沉淀。分别使用抗PECAM(泳道1)和抗JAM-1(泳道2)抗体作为用CRAM-XIXH36抗体(泳道3)进行免疫沉淀的阴性和阳性对照。图右侧标出分子量。DCHO转染的细胞中的EGFP重组蛋白质的免疫沉淀。使用抗JAM-2(泳道2、3、6)、抗JAM-1(泳道1、4、5)免疫沉淀来自未转染的(泳道1和2)、JAM-1-EGFP(泳道3和4)，或JAM-2-EGFP(泳道5和6)转染的CHO细胞中的生物素化的溶胞产物。图右侧指出分子量。
图12在有或没有趋化因子SDF-1存在下，脾细胞通过TNF活化的内皮细胞单层迁移。使用三种内皮瘤野生型t.end.1或用编码CRAM-1或CRAM-2的cDNA转染的t.end.1。试验两种抗小鼠CRAM-1的IgG1单克隆抗体F-26或H-26影响反式迁移的能力。
图13CRAM-1对汇合功能的调节作用。使用对HPRT和CRAM-1 cDNA特异的引物的混合物驱动半定量PCR。PCR反应在1.2％琼脂糖凝胶上进行并用溴化乙锭染色。泳道1、2和3相当于100、50、10％细胞汇合。100％汇合(泳道1)中可见微弱的CRAM-1信号。指明内皮细胞系(t-end.1和TME)自身或与肿瘤细胞系KLN205混合的培养条件。
图14小鼠组织中JAM-2(a)、JAM-1(b)或β-肌动蛋白(c)转录物的Northern印迹分析。显示对胚胎pc和成年mRNA制剂的分析结果。图右侧标出杂交信号的大小。
图15JAM-2、JAM-1、ZO-1和PECAM表达的免疫组织学分析。用抗JAM-2(a，e，i)、抗JAM-1(b，f，j)、抗ZO-1(c，g，k)或抗PECAM(a，h，1)抗体着染一系列的肾(a-d)或肠系膜淋巴结(e-1)切片。各个图片系列(a-d，e-h和i-1)都是用同样的CCD设定获得的。
图16内皮细胞上的JAM-2表达。A内皮细胞系(tEnd.1、eEnd.2和TME)或鳞状癌细胞系(KLN205)上JAM-2、JAM-1和PECAM表达的细胞荧光分析。阴影表示用针对CD4的抗体得到的阴性对照。B新鲜分离的内皮细胞上的JAM-2的细胞荧光分析。经胶原蛋白酶/分散酶消化解离所指出的器官，用所指出的DiIAc-LDL、CD31和抗JAM-2或抗JAM-1染色。通过选通对DiIAc-LDL(FL-2)和CD31(FL-3)呈阳性的内皮细胞群体得到直方图剖视图。删去抗JAM-1或JAM-2的原始mAb得到阴性对照。
图17(A)细胞-细胞接触形成期间的JAM-2-EGFP定位。在JAM-2-EGFP转染的CHO细胞单层形成期间以每小时3分钟收集单个荧光照片。显示前18分钟得到的照片。在0时间，星号认定存在于视野中的三种细胞。在第6，12和18分钟，箭头标明JAM-2-EGFP在新形成的细胞-细胞接触点的再定位。(B)受伤后的JAM-2-EGFP定位。箭头符号指出受伤侧并且箭头尖突出标明富集JAM-2-EGEP的膜过程。照片上标出了所经过的时间。标尺相当于10μm。
图18JAM-2表达降低旁侧细胞通透性。通过非转染的CHO细胞单层、用Tac(huIL2Rα)转染的或用所指出的EGFP融合蛋白(JAM-1和JAM-2)转染的CHO细胞的FITC-葡聚糖扩散，估测旁侧细胞通透性。将JAM-2-EGFP或JAM-1-EGFP转染到CHO细胞中导致旁侧细胞通透性明显降低(分别为57.8％+/-4.9和70.8％+/-3.6，p＜0.0001，而Tac转染并没有明显地影响旁侧细胞通透性(100.4％+/-4.4，p＝0.9872)。结果相对于非转染的CHO细胞进行了校正。
图19将JAM-2-EGFP(A)和JAM-1-EGFP(B)导向已存在的紧密连接点。用抗-occludin和抗兔-德克萨斯红着染用JAM-2-EGFP(A)或JAM-1-EGFP(B)稳定转染的汇合MDCK细胞。显示从基础至顶端水平的一系列照片(间隔0.9μm)的EGFP荧光(a)或occludin染色(b)。左边基础水平是任意限定的，如一系列照片包括+3.6和+4.5μm处焦点上的紧密接合水平(至右边的第4和第5个照片)。
图20可溶性重组分子对白细胞跨内皮迁移的影响。(A)以相对指数表示反式迁移并基于在非处理的t-ehd细胞系上得到的数值进行校正(虚线指数1)。显示在1μg sJAM-Ig2do(白方块)或1μg sCRAM-1-Ig2do(黑方块)存在下得到的结果。以5次独立的反式迁移实验的平均值计算指数。(B)经Facs分析然后用抗CD3-FITC和抗B220-PE染色，从所得到的百分数计算细胞数，并以其表示反式迁移细胞的表型。星号代表与对照组有显著差异的实验点。
在下列实施例中，术语JAM和JAM-1、CRAM-1和JAM-2，以及CRAM-2和JAM-3可以互换使用。
实施例材料和方法细胞系胸腺(tEnd.1)和胚胎(eEnd.2)内皮细胞系(Williams et al.，1989，Cell 571053-1063)由W.Risau和B.Engelhardt博士(MaxPlanck Institute，Bad-Nauheim，Germany)提供。SV40转化的淋巴结内皮细胞系TME由A.Hamann博士提供(Harder et al.，1991，Exp.Cell Res.197259-267)提供。鳞状细胞癌KLN 205、CHO、MDCK和骨髓瘤细胞系Sp2/0得自美国典型组织培养物保藏中心(ATCC)。除CHO外，所有细胞均生长在添加10％FCS(PAA Laboratories，Linz，Austria)、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素(均购自Gibco BRL)的DMEM(Gibco BRL，Paisley，Scotland)中。CHO细胞生长在添加上述成分的Nut.Mix.F-12(HAM)中。用PBS/0.15mM EDTA洗，然后在胰酶/EDTA中37℃温育5分钟分离粘附细胞。
显示、克隆和序列分析为了进行共培养实验，取5×105个t.End.1细胞连同2.5×104个B16 F10黑素瘤细胞在10cm组织培养皿中培养64小时。作为对照，取5×105个t.End.1细胞和2.5×105个B16 F10细胞分别在同样条件下培养在64小时后产生汇合单层。按照生产商的说明书(Gibco BRL，Paisley，Scotland)在培养皿中用Trizol试剂直接提取总RNA。利用Oligo-dT(16链节)引物和Superscript反转录酶(Gibco BRL，Paisley，Scotland)由5μg总RNA制备cDNA。使用对管家HPRT cDNA特异的引物，对1μl 1∶5稀释的cDNA进行27轮PCR以检查cDNA的质和量。用下列编码C2区域中遇到的最常见氨基酸序列YRCXAS、YQCXAS和YYCXAS的简并引物5′TAYAGNTGYNNNGCYTCYAA3′、5′TAYCRGTGYNNNGCYTCYAA3′和5′TAYTAYTGYNNNGCYTCYAA3′进行差异PCR。PCR条件包括使用2μl稀释的cDNA；2.5μl 10×Goldstar PCR缓冲液；2μl MgCl2；2μl简并引物(0.3mM)；0.5μl dNTP(0.1mM)；0.1μl αP33dATP(10mci/m(Amersham PharmaciaBiotech，Dübendorf，Switzerland)；15.65μl H2O；0.25μl Goldstar Tag聚合酶(Eurogentech，Seraing，Belgium)。
PCR的参数如下94℃45秒；50℃90秒和72℃45秒，重复40次。加入甲酰胺/EDTA加样缓冲液并将样品于94℃变性2分钟。然后在6％聚丙烯酰胺凝胶上分离PCR产物，并使用Kodak OM-Mat进行放射自显影。比较带的明暗度。
从干燥的聚丙烯酰胺凝胶上切下差异表达的带并按已述方法(Liangand Pardee，1992，Science 257967-970)经煮沸和乙醇沉淀回收片段。然后使用没有P33-ATP的增加浓度的dNTP(不是2μM，而是0.2mM)再扩增PCR产物。将按已述方法(Sambrook，Fritsch，and Maniatis，Molecularcloning；2nded.，Cold Spring Harbor Laboratory，Press；1989)将再扩增的产物克隆到pGem-T Easy载体(Promega Corp，Wallisellen，Switzer-land)中。
使用Thermo Sequence荧光标记引物循环测序试剂盒(AmershamPharmacia Biotech，Dübendorf，Switzerland)和LI-COR DNA分析系统(MWG-Biotech GmbH，Ebersberg，Germany)测定两个独立克隆的核酸序列。
JAM-3的鉴定通过在ExPASy分子生物学服务器(即Blast，Prosite，Swiss-Prot)上可用的应用进行序列分析和比较。鉴定与CRAM-1同源的三个不同的EST(登记号AA726206、AA052463和AA175925)。它们均不编码全长转录物并且都包括有起始ATG序列。因此，按照生产商的说明书(GibcoBRL，Paisley，Scotland)，使用快速扩增cDNA末端的5′RACE-PCR系统(版本2.0)得到5′编码序列。
使用下列三个基于EST序列设计的引物5′-GAGGTACTTGCATGTGCT-3′用于合成第一条链，5′-CGACAGGTGTCAGATAACA-3′和5′-CACCCTCCTCACTCGT-3′用于两个嵌套式PCR。将5′RACE-PCR产物克隆到pGem-T载体中。为了得到CRAM-1的全长编码序列，用Not I和Hpa I限制性酶消化克隆的5′RACE-PCR产物和EST(登记号AA726206)并连接到pGem-t载体中。全长CRAM-2的克隆是基于序列比较和5′RACE技术的同样策略完成的。最后从EST登记号AA690843和W80145得到编码CRAM-2的全长cDNA。这两个克隆的不同在于3′未翻译区的长度。
Northern印迹按照试剂使用说明书，使用Trizol(Life Technologies AG，Basel，Switzerland)提取细胞或组织的总mRNA。使用Oligotex mRNA纯化试剂盒(Qiagen，Zurich，Switzerland)从250μg总RNA中提取Poly-A+mRNA。胚胎Poly-A Northern印迹购自CLONTECH(P.H.Stehelin and CieAG，Basel，Switzerland)。由pcDNA3载体(Invitrogen，Leek，Netherlan-ds)制备核糖探针，并包括编码JAM-1和JAM-2的免疫球蛋白区域的序列，或编码β-肌动蛋白的全长编码序列。在含有50％甲酰胺的缓冲液中于62℃进行杂交。然后将印迹洗两次(0.5×SSC，0.1％SDS，67℃)，并于-80℃在KodakX-Omat上进行放射自显影。
汇合实验研究内皮细胞汇合对JAM-2 mRNA水平的影响。将2×105个TME内皮细胞在6、10和15cm直径培养皿中培养，64小时后达到从10％到100％不等的细胞汇合水平。64小时后用锥虫兰排除法和计数法检查细胞数目。结果可见所有情况下的细胞数目均相同，而且与培养皿的表面积无关。
使用半定量PCR反应或Northern印迹法确定在各种条件下转录物的相对量。为了检测JAM-2转录物，使用5′-GACTCACAGACAAGTGAC-3′和5′-CACCCTCCTCACTCGT-3′引物对，得到750bp扩增产物。作为内部对照，使用下列对Hprt cDNA特异的引物扩增350bp长的片段5′-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3′和5′-GAGGGTAGGCTGGCCTATAGGCT-3′。
表达载体的构建利用HindIII和Not I位点，将编码EGFP的序列从pEGFP载体(CLONTECH，P.H.Stehelin and Cie AG，Basel Switzerland)亚克隆到pcDNA3中，因此命名为pcDNA3/EGFP。利用见于分别编码JAM-2和JAM-1之胞质区域的序列中的3′限制位点Hpa I和Sca I，将EGFP之N末端的两个序列融合到pcDNA3载体(Invitrogen，Leek，Netherlands)中。分别用SacII/HpaI或HindIII/ScaI消化，从pGemt或pRc/CMV上切下编码JAM-2或JAM-1的插入段。
然后将编码序列克隆到用Age I消化的pcDNA3/EGFP载体中，将末端修平并进一步用HindIII或SacII酶消化。如此在JAM-2的氨基酸位置DGV291和JAM-1的QPS285处产生融合位点。按照以前描述的方法(Ballestrem et al.，1998，J.Cell Sci.1111649-1658)转化CHO细胞。
在含有1mg/ml G418的培养基中将被转染的CHO细胞培养2周，以选择用于通透性测定的稳定转化体。分离抗性集落并以流式细胞仪(FACScalibur apparatus，Becton Dickinson，Mountain View，CA)检查EGFP荧光强度，并用显微镜(Axiovert，Zeiss，Oberkochen，Germany)检查荧光定位。
使用Axiovert荧光显微镜和Openlab软件进行缩时图象显微术。
整合Flag-Tag(G.Wiedle，Dep.of Pathology，CMU，Geneva)编码序列以对哺乳动物表达载体pcDNA3(Invetrogen，Leek，Holland)进行修饰。以PCR方法制备含有可溶形式JAM、CRAM-1和CRAM-2蛋白之编码序列的Flag-Tag构建体。在所有情况下，均设计正向引物以适应ATG起始区。在编码一个Ig可溶形式之铰链区的序列中，或在编码两个Ig区域可溶分子的C2和跨膜区之间区域的序列中，均设计反向引物。所有反向引物都具有其中包括XbaI限制位点的3′延长部分，以便在Flag-Tag修饰的载体中进行直接的框内克隆。在PCR中利用Pfu DNA聚合酶，以避免频繁突变(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。然后用XbaI消化PCR片段并克隆到pcDNA3 Flag-Tag载体中，用EcoRI消化、用Klenow填平，然后再用XbaI消化。
试剂和免疫荧光分析使用下列单克隆抗体抗PECAM(GC51，大鼠IgG2a；EA-3，大鼠IgG1)和抗JAM(H202.106.7.4，大鼠IgG1)(Malergue et al.，1998，Mol.Immunol.351111-1119；Piali et al.，1993，Eur.J.Immunol.232464-2471)。
使用标准技术，并以重组可溶性分子作为免疫原(Aurrand-Lions etal.，1996，Immunity 5391-405)，在实验室中产生一组抗JAM-2的CRAM抗体。用ELISA方法筛选所选择的杂交瘤用于生产能特异性识别重组可溶性JAM-2分子的抗体。进一步在JAM-2 cDNA转染的CHO细胞上试验阳性克隆(未示出)。
除了IgG2b亚类的CRAM-25F24外，所有CRAM抗体都是IgG1或IgG2a同型的。按照生产商的说明书，在蛋白G琼脂糖柱(Pharmacia BiotechEurope，Dübendorf，Switzerland)上纯化抗体。使用CRAM-19H36 mAb进行免疫沉淀，而CRAM-18F26是用于免疫组织化学分析的试剂。用CRAM-4H31和CRAM-17D33 mAb得到相似的结果。
使用与FITC或德克萨斯红(Jackson Immunoresearch，Milan，AG，LaRoche，Switzerland)偶联的次级试剂(分别用于细胞荧光光度术和免疫组织化学)进行免疫荧光分析。
为了进行免疫组织化学分析，用冷却的(-20℃)甲醇将样品固定5分钟。在PBS、0.2％明胶，0.05％吐温20中使样品重新水合，与初级抗体一起温育过夜后洗涤样品，并用与德克萨斯红偶联的适当次级试剂显现之。为了分析新鲜内皮细胞，按照已建立的方法(Kramer etal.，1984，J.Cell Bidl.99692-698)用胶原酶/分散酶消化以解离新鲜切割的组织。37℃下用DiI酰基化的LDL(Molecular Probe EuropeBV，Leiden，Netherlands)将解离的细胞着染2小时，然后再用抗CRAM-19和山羊抗大鼠FITC探针着染。洗涤三次后，用生物素化的抗CD31(Pharmingen)和链霉抗生物素Red 670(Life technologiesAG，Basel，Switzerland)着染细胞。
在对两种内皮细胞标记乙酰化的LDL(FL-2)和CD31(FL-3)呈阳性的细胞上进行JAM-1或JAM-2表达分析。删去初级抗体即得到阴性对照。
免疫沉淀使用10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、150mM NaCl、0.5％Triton×100、0.5％NP40、用于溶胞的蛋白酶抑制剂混合物(Roche DiagnosticsLtd，Rotkreuz，Switzerland)，按照以前描述的方法(Aurrand-Lions etal.，1997，Cellular Immunology 176173-179)完成免疫沉淀。在免疫沉淀，SDS/PAGE，和转移到硝酸纤维素膜上后，使用与过氧化物酶(Jackson Immunoresearch)和ECL(Amersham Pharmacia Biotech，UK)偶联的链霉抗生物素揭示生物素化蛋白质。
通透性测定使用Transwell小室(6.5mm直径、PC滤器、0.4μm孔径，Costar Corp.)检测通透性。简单地说，在先已用0.2％明胶包被30分钟的滤器上将1×104个转化或未转化的CHO细胞培养到汇合成片。5天后，将培养基换成预加温的没有FCS的Nut/F12培养基(下方小室中500μl，上方小室中200μl)。以1mg/ml的终浓度在上方小室中加入FITC-葡聚糖(分子量38，900，Sigma Chemical Co.)。
1小时后，除掉小室并使用细胞荧光仪II直接读出下方小室中的荧光强度。计算5个独立小室的平均荧光强度并使用Statview软件和t试验不成对比较法比较之。为了校正实验结果，以使用野生型CHO细胞得到的平均荧光强度值作为100％。
转染和可溶性分子的纯化按照生产商的说明书(Gibco BRL，Paisley，Scotland)，借助Lipofectamine试剂用可溶性Ig1Do和Ig2Do Flagtag/pcDNA-3构建体瞬时转染293 T、Bosc 23或稳定转染CHO细胞。转染后，在10天期间内每两天收集上清液。用含有蛋白酶抑制剂混合物(BoehringerMannheim，Germany)的PBS将共价连接到抗Flag抗体上的M2小珠(Kodak，New Haven，USA)洗两次。然后将小珠与被转染细胞的上清液于4℃保温3小时。用含有蛋白酶抑制剂的PBS洗5次后，用小珠装柱，并用10mM甘氨酸缓冲液(pH3.4)洗脱重组分子(参见使用说明书)。然后在Centricon-10(Millipore)上浓缩含有重组分子的洗脱部分并对PBS透析。
使用Micro BCA测定法(Biorad)测定蛋白质终浓度。使纯化的产物受到SDS/PAGE电泳，然后用考马斯兰染色以分析其纯度。
反式迁移测定按已述方法(Wheerasinghe et al.，1998，J.Cell Biology 142595-607)完成白细胞通过内皮细胞的反式迁移。简单地说，在1μg Ig可溶性重组分子sJAM 2do或sCRAM-1 2do存在下，将1×105个t-end细胞在反式小井单元(聚碳酸酯滤膜，5μm孔经，Costar)中培养2天。2天后，向上区室内加入得自淋巴结和淋巴集结的1×106个白细胞，并在实验期间每小时监测反式迁移细胞的数目。4小时后，合并从5个独立的小井得到的反式迁移细胞，并对B和T细胞标记B220和CD3进行细胞荧光光度分析。使用Facscalibur仪器和Cell-Quest分析程序(Becton-Dickinson)测得结果。
为了用脾细胞进行反式迁移测定，将3×105个内皮细胞接种到反式小井单元(聚碳酸酯滤膜，8μm孔经，Costar)中，使细胞经18小时形成单层。除去上区室中的培养基并向上区室内加入以Ficoll离心法从脾组织新鲜制备的106个白细胞(在100μl中)。向下区室的培养基(终浓度40nM)内加入SDF-1以建立上和下区室之间的趋化因子梯度。为了用抗体进行实验，在有脾细胞的上区室中加入浓度为10μg/ml的纯化的抗体18-F26或19-H36。4小时后，收获并计数反式迁移的白细胞(在下区室中)。结果以引入数的百分比(％)表示。
结果定向差异显示内皮细胞中基因的调节依赖于它们的环境。本发明涉及鉴定当内皮与肿瘤细胞接触时受到调节的基因。为此目的，使用黑素瘤细胞(B16)与内皮瘤细胞系(t-end)的共培养物建立体外测定法。使用从混合物中提取的总RNA作为制备受到差异PCR筛选之cDNA的模板。使用从单独培养的内皮细胞或黑素瘤细胞制得cDNA作为对照。比较三个不同模式以鉴定受到共培养条件调节的转录物。为了将分析限制在编码Ig超家族之细胞表面分子的序列上，使用针对围绕Ig超家族分子中C2区域C末端半胱氨酸的序列的部分简并引物。使用编码序列YYCxAS1的引物得到PCR产物的最具重现性的模式(图7A)。这种RNA显示技术的改良方法被称为TDD，即“定向差异显示”。
在TDD的重复实验中，鉴定了十六个差异表达的基因。克隆后，进行核苷酸和氨基酸序列分析，发现16个PCR产物中有3个可能是编码Ig超家族之未知成员的候选序列。选择3个候选序列中的一个(CRAM-1)作进一步地研究。当分别培养时，t-end.1内皮细胞和B16黑素瘤细胞表达高水平的CRAM-1转录物。但当处于共培养条件下时，CRAM-1的表述水平受到向下调节(图7B)。相当于CRAM-1的350bp片段的翻译显示了表明Ig C2区域结尾的氨基酸序列YYCxAS之后是含18氨基酸(加有跨膜区记号)疏水段的可读框(ORF)。
免疫球蛋白超家族成员CRAM-1PCR产物序列和核苷酸数据库间的序列比较揭示出小鼠EST数据库中的同源和相同序列。EST的存在表明，PCR产物相当于体内表达的序列。发现三个EST在其3′端含有与TDD产物中的300bp相同的300bp序列。每个EST的3′末端均含有一个Poly-A尾部。总EST长度为1270bp并且相当于CRAM转录物的3′末端。因为转录物的5′末端在EST cDNA克隆中丢失，所以其可经5′RACE-PCR得到。图8A中显示推想的CRAM-1cDNA之所得的1980核苷酸长的全长编码序列。有一个5′末端翻译起始16bp下游的强共有位点(GACATGG)，然后是推测为310氨基酸之蛋白质的单一ORF。继潜在起始蛋氨酸之后的31氨基酸区域为信号肽的特征序列。推测切割位点是在Ala 31-Val 32处。
推断的鼠CRAM-1蛋白质的结构示于图8B中，并且由带有可变重链的细胞外区域和带有两个潜在N连接的糖基化位点(aa 104和192)的恒定2型样免疫球蛋白区域(Pfam，The Sanger Centre and Blast)组成。疏水性分析(Tmpred，ISREC)推断在242-260位置之间有一个跨膜区。推测的胞质区由49个氨基酸组成并含有一些高度保守的Ser/Thr和Tyr磷酸化位点(图8A，斜体字表示的残基)。用Prosite程序检索已知的模式，鉴定出作为蛋白激酶C的SSK/SYK，作为CK2的SKQD/TSEE和作为酪氨酸激酶磷酸化标记的KQDGESY/KHDGVNY等基元。
JAM、CRAM-1和CRAM-2限定一个新的亚族几种蛋白质显示与CRAM-1有高度同源性。发现Ig超家族的两个成员人A33抗原和小鼠中性细胞粘着分子的一部分即N-CAM与CRAM-1分别有41％和46％同源性。Ig Sf的另一个成员JAM具有与CRAM-1相似的结构，有34％氨基酸序列相同性和54％同源性。利用JAM和CRAM-1之间的明显相同性找到EST数据库中的第三个密切相关的序列，即CRAM-2，这三种分子之间的相同性提示在Ig超家族中存在一个新的分子亚族(图9)。同源性不仅影响V和C2区的总体结构(图9中的C54至C118和C147至C235)，而且影响胞质区内部的序列。令人感兴趣的是，发现这三种分子之间最趋异的区域是在V区的开始部分(位置40至60)和近端胞质部分(位置280至300)。这两个区域的功能相当于Ig超家族其它成员中与配体结合和信号转导相关的序列，表明了JAM、CMAM-1和CRAM-2在细胞-细胞联系中的作用。
JAM、CRAM-1和CRAM-2 mRNA的组织分布使用PT-PCR检测不同器官的细胞中三种转录物的表达。尽管不同的转录物的表达程度不同但所试验的所有内皮、表皮和大多数肿瘤细胞系均为阳性(图10A)。发现CRAM-1在SV40转化的HEV细胞系TME(泳道9)，和胚胎内皮细胞系t-end 2(泳道2)中的表达水平最高。CRAM-2和JAM转录物显示了更为局限的分布，并伴随CRAM-1转录物见于成年内皮细胞系中(泳道3、7、9和12)。值得注意的是，JAM和CRAM-2转录物经TNF处理内皮细胞受到下调，而CRAM-1转录物的水平则保持不变(泳道2和11)。令人感兴趣的是，胚胎内皮细胞系(泳道4)或代表t-end的血管生成变体的成年内皮细胞系(泳道6)没有表达JAM或CRAM-2。
用Northern印迹法探查JAM-2转录物的组织分布并与JAM-1比较(图14)。JAM-2转录物为2Kb长，其在胚胎组织，和在淋巴集结、淋巴结、肾及成年动物组织中得到高度表达。在睾丸中检测到1.8Kb的推定的剪接变体。JAM-2转录物在肺、肝、脾和胸腺中的表达水平较低。比较胚胎发生期间JAM-1和JAM-2的相对丰度早至交配后7.5天即可检测到编码JAM-2的mRNA，而在胚胎发生期间根本未检测到JAM-1mRNA。
这些结果提示胚胎发生期间CRAM-1被广泛表达，并表明在成年组织中的表达局限于表皮或内皮区室。这一结果是与其在细胞极性化组织的建立和维持中发挥作用这一观点相符的。
45KD蛋白质JAM-2在细胞-细胞接触点的定位取决于同嗜性相互作用因为HEV衍生的细胞系TME表达最高水平的JAM-2，所以使用该内皮细胞系进一步研究JAM-2的亚细胞定位，并与JAM-1的亚细胞定位相比较。JAM-2蛋白质在内皮细胞表面上的定位局限于细胞-细胞接触点(图11A，a)。JAM-2的染色比JAM-1的染色弱，而且细胞间的膜延伸不太明显。
然后研究了存在于细胞-细胞接触点的JAM-2是否与JAM-2同嗜性相互作用，或者是否与相邻细胞上的另一分子异嗜性相互作用。为此，使JAM-2蛋白与绿色荧光蛋白(JAM-2-EGFP)融合，并将构建体转染到CHO细胞中。当用JAM-2-EGFP cDNA转染的CHO细胞达到汇合成片时，只在两个细胞均表达这种蛋白质的细胞-细胞接触处观察到JAM-2(图11B)，而表达细胞和非表达细胞间的接触处则没有JAM-2(图11B，a，由箭头尖示出)。当用嵌合分子JAM-1-EGFP转染细胞时，得到同样的结果(图11B，b)。这一结果表明，JAM-2或JAM-1需要同嗜相互作用以定位于细胞-细胞接触处。
为了鉴定JAM-2的生化性质，进行了分别由TME细胞系或由被转染的CHO细胞表达的JAM-2或EGFP嵌合蛋白质的免疫沉淀(图11C和D)。抗JAM-2抗体CRAM-19H36免疫沉淀来自TME细胞溶胞产物的45kD单条带(图11C，泳道3)。
在还原或非还原条件下的表观分子量是完全相同的(结果未示出)，并相当于由JAM-2的氨基酸序列推断的预计分子量(每个N糖基化位点占5kDa)。使用H202-106抗JAM特异性抗体免疫沉淀JAM-1产生一条低分子量带(~42KD，泳道2)，排除了抗JAM-2和抗JAM-1抗体间发生交叉反应的可能。
表面生物素化后免疫沉淀重组JAM-1-EGFP或JAM-2-EGFP蛋白质，产生分别为70和73KD的单一宽带，表明分子是在CHO转染细胞表面上表达的(图11D，泳道4和6)。因为EGFP分子量为28kD，所以所测得的这些分子量是在预料中的。
致密度和白细胞迁移为了弄清分子如何影响内皮细胞单层的完整性和它们如何调节血管内皮的功能，在重组可溶性JAM或CRAM-1存在下进行了白细胞跨内皮迁移测定。在sJAM-Ig2Do或sCRAM-1-Ig2Do存在下将内皮细胞培养2天。在此期间单层完整性没有受到影响，可能是由于细胞-细胞接触形成机制的分子丰余性。在1μg重组可溶性分子存在下进行反式迁移测定。如图20A中所示，在前3个小时中，sJAM-Ig2Do的存在(空方框)对反式迁移细胞的数目影响不大。4小时后，反式迁移细胞的数目高于对照组(虚线)。相反，sCRAM-1-Ig2Do的存在(黑圆圈)明显降低了反式迁移细胞的数目。
因为白细胞群体是异源性的，所以须估测是否sCRAM-1-Ig2Do作用于特异的白细胞亚群，或者是否反式迁移受到阻断而无特异性。为此目的，就淋巴细胞标记物CD3和B220标记了反式迁移的细胞(图20B)。
很显然，sCRAM-1-Ig2Do特异地阻断非淋巴样白细胞，即髓样谱系细胞的反式迁移(中心框，点线栏)。相反，sJAM-Ig2Do没有明显增加反式迁移T细胞的数目(左框，空心栏)，对其它细胞亚群没有任何影响。
此外，当使用CRAM-1转染的内皮细胞进行反式迁移测定时，可见反式迁移数增加(图12)，而CRAM-2转染则对反式迁移没有影响。当在测定体系中加入SDF-1时，白细胞跨内膜迁移率达到20％。这是由于受到抗CRAM-1单克隆抗体的部分阻断所致。
这些结果表明内皮细胞间CRAM-1的会合可能调节内皮层的功能。可以预想到，当内皮细胞达到汇合时该家族的分子将会变成屏障。为此，在不同的培养条件下研究了内皮细胞中CRAM-1转录物的调节作用。
CRAM-1受到细胞高度汇合的向下调节因为编码CRAM-1的转录物不受TNF的调节，但当内皮细胞与肿瘤细胞共培养时则受到下调，所以使用汇合测定试验进一步研究了这种调节作用。在低汇合下，细胞活跃循环并且未发生CRAM-1相互作用，而在高汇合条件下，细胞分化较少而且CRAM-1受到约束。在各种细胞密度下用半定量RT-PCR法检测了CRAM-1的mRNA表达的水平。如图13中所示，当达到细胞汇合时的(图13中的泳道1、2、3分别相当于100、50和10％汇合)，CRAM-1转录物的表达水平降低。这种效应很难用t-end细胞检测到，但用高表达CRAM-1的TME细胞系较为显著。当内皮细胞与本身并不表达CRAM-1的KLN 205癌细胞共培养时，也提高内皮中CRAM-1的下调作用。这一结果进一步证实了CRAM-1表达与细胞周期之间的关联，因为肿瘤细胞与内皮细胞接触后可提高内皮细胞的生长速度。值得注意的是，用KLN 205癌细胞获得的结果与我们原来的筛选策略中用B16黑素瘤细胞得到的结果完全相同。这表明了肿瘤影响内皮细胞行为的一般机制。
JAM-2在胚胎发生期间高表达，并且在成年组织中局限于HEV和内皮细胞亚群为了更好地限定JAM-2的组织分布，对表达最高水平JAM-2转录物的肾和肠系膜淋巴结切片进行了免疫组织学分析(图15)。在肾脏的皮质区中，用抗PECAM(GC51)或抗JAM-2(CRAM-XVIIIF26)mAb监测小管间结构的特异性着染，而抗ZO-1或抗JAM-1则主要着染小管表皮细胞(结果未示出)。
因此本发明人将关注的焦点放在血管结构上(其向下深入到髓质并相当于边缘静脉或直小血管内皮结构)。为此目的，制备一系列切片并用抗PECAM染色鉴定血管结构(图15d)。在相邻切片的等同区域上，用抗JAM-2、抗JAM-1或抗ZO-1检测线性内皮间染色情况(分别见图15a、b和c)。在肠系膜淋巴结切片上，用抗JAM-2的mAb获得高内皮小静脉(HEVs)的典型染色(图15e)。还发现HEV表达JAM-1、ZO-1或PECAM(图15f、g和h)，同时在染色的亚细胞定位上有细微差异(图15e-h，插入图)。在肠系膜淋巴结的皮质区，用所有抗体均观察到被膜下淋巴窦的典型染色(图15i-1)，相应于输入淋巴管的染色。因此，用CRAM-18F26抗JAM-2 mAb染色仅限于某些内皮细胞或与维管结构密切相关的结构。
为了澄清内皮细胞染色是否可解释图15中所示的照片，对各种细胞系或从解离组织新鲜分离的内皮细胞进行JAM-2表达的细胞荧光光度分析。内皮细胞系(tEnd.1，eEnd.2和TME)在细胞表面上表达低水平的JAM-2或可变水平的JAM-1(图16A)。
对在胶原酶/分散酶器官解离后得到的细胞悬液进行三重染色，进行新鲜分离的内皮细胞的细胞计量分析。通过获得用PECAM/CD31和乙酰化LDL着染的细胞鉴定内皮细胞(Voyta et al.，1984，J，CellBiol.992034)。图16B显示该双阳性细胞群体的JAM-2或JAM-1染色。在肾和淋巴集结中，所有分离的CD31和乙酰化LDL阳性细胞也都呈JAM-2染色，这就意味着这些器官中至少内皮细胞体内表达了JAM-2。当对得自淋巴结的细胞进行染色时，只在细胞亚群上发现有JAM-2表达，这就反映出该组织内可能存在有内皮细胞表型的异质性。
总之，细胞计量和免疫组织化学分析的结果表明肾、淋巴集结和淋巴结的内皮细胞共表达了JAM-1和JAM-2。
JAM在细胞-细胞接触点的动态定位使用缩时图象显微术进一步研究JAM-2特异性定位于细胞-细胞接触点的机制。胰酶消化用荧光嵌合分子稳定转染的CHO细胞，并铺敷在成象的分隔室载玻片中。细胞涂布后，JAM-2-EGFP的表面表达不是均匀的，而是主要集聚在细胞-细胞接触点(图17A，由星号标示的细胞)。在新的细胞-细胞接触点形成期间，观察到JAM-2-EGFP重新定位于细胞接合处，并且在形成新的细胞-细胞接触的细胞间接触点上检测到一个强的荧光信号(箭头)。嵌合蛋白质富集在接触细胞间的膜突出部，形成12至18分钟后可见到的“拉链样”图象。令人感兴趣的是，在形成新的膜接触期间JAM-2在原始细胞-细胞接触点的定位没有丢失(参见图中左上角细胞接触点)。这一发现表明JAM-2-EGFP特异地重新定位于新的细胞接触点，并且在接合后其定位是稳定的。
为了进一步弄清JAM-2定位的要求，在使细胞单层受伤后进行缩时图象显微术(图17B)。受伤边缘处细胞中的JAM-2仍保留在其完整的接触位点(箭头尖)，但受伤侧(箭头)则失去了JAM-2的定位，表明JAM-2借助相对细胞上配体实现的接合对于维持其膜定位是必需的。受伤后90分钟内，伤口边缘的细胞开始迁移到受伤区域中。有趣的是，这些细胞仍通过呈亮荧光(即JAM-2阳性，箭头尖)的膜突出部分与邻近细胞保持接触。这些结果支持JAM-2同嗜相互作用可能在细胞-细胞接触的建立和维持中发挥作用这一假设。
JAM-2增加单层致密度并参予形成紧密接合复合物因为已证明参予细胞-细胞连接的许多分子可调节细胞单层的细胞旁通透性，所以试验了JAM-2是否也可影响这一功能。JAM-2-EGFP转染降低了对FITC葡聚糖的细胞旁通透性并使CHO细胞单层的密闭程度改善42.5％；而无关分子Tac(IL2Rα)的转染则不明显地降低CHO转染细胞的细胞旁通透性(图18)。JAM-1-EGFP转染也降低CHO转染细胞单层的细胞旁通透性。
这些结果提出了一个是否嵌合分子能够参入极性化表皮细胞中的亚细胞特化区室如紧密接合点的问题。
为了回答这个问题，将EGFP嵌合蛋白转染到MDCK细胞中，并将其亚细胞定位与紧密接合标记occludin的定位相比较。如图19A中所示，当分析每个相隔0.9μm的一系列图片上的EGFP荧光并与occludin染色比较时，可见JAM-2-EGFP特异性地富集于处于紧密接合水平的细胞-细胞接触点。在基础水平(左侧)下，观察到细胞内EGFP荧光点。对JAM-1-EGFP转染的MDCK细胞所作的相似分析(图19B)显示了与occludin相似的共定位。然而，JAM-1-EGFP荧光的分布与处于紧密接合水平的JAM-2-EGFP中所观察到的情况相比连续性较差。
讨论本实施例报道了使用新的筛选策略鉴定受调节的编码粘着分子Ig超家族成员的转录物。本文所描述的是用这种方法克隆作为受调节之转录物的新的分子CRAM-1。用半定量RT-PCR证实在肿瘤存在下生长的内皮细胞中所观察到的调节作用，并且显示这种调节作用是依赖于细胞的生长期的。由于在改变细胞汇合条件下发生差异表达，所以采用CRAM-1即“汇合调节的粘着分子-1”这一名称。
本文也描述了与CRAM-1密切相关的序列即CRAM-2。CRAM-1和-2代表粘着分子新亚族的原型，所说的亚族还包括最近已描述的分子JAM(Chretien et al.，1998，Eur.J.Immunol.28，4094-4104；Malergue etal.，1998，Mol.Immunol.35，1111-1119)。
CRAM-1和JAM优先在细胞-细胞接触点被内皮和表皮组织表达，并赋予极性化层以特殊性质。可溶性重组分子在跨内皮迁移测定中的作用及JAM、CRAM-1和CRAM-2的调节作用表明，这三种分子在维持血管生理学中起着重要作用。
已证明称为定向差异显示(TDD)的新的筛选策略是一种选择性扩增感兴趣cDNA的有效技术。TDD成功地开发了使用部分简并的引物，以选择性地导向C2样Ig区域的保守区Y(Y/Q/R)CXAS。反复实验导致可重现的显示图形。16个差异表达的转录物中，有三个相当于与保守的Ig序列有显著同源性的基因。这种特异性的增加可以克服已知的经典RNA指纹分析和差异显示技术中的主要困难。长期以来一直使用RNA指纹分析鉴定差异表达的基因。然而，由于所利用的是序列特异性引物，所以这种方法只检测选择的和已知的蛋白质的转录物。另一方面，RNA显示中利用随机引物并包括非特异性扩增转录物。在这种情况下，目标是在mRNA水平上确认两个生物学系统间的任何差异。TDD是一种结合RNA指纹分析的特异性和差异RNA显示的简并性，从而提高选择性的先进的筛选方法。由于相关转录物的导向，所以这种技术显著地减少了筛选所需要的时间。因此，使鉴定特定蛋白质家族的新成员成为可能。这是对已报导的非特导性筛选策略的实质性改进。
利用这些共同特征构建重组蛋白质，以研究JAM、CRAM-1和CRAM-2的功能。在本实施例中，在体外反式迁移测定中描述了sJAM-Ig2Do和sCRAM-1-Ig2Do的作用。用sCRAM-1-Ig2Do可观察到对髓样细胞迁移的特异性阻断作用，而用sJAM-Ig2Do则只显示对淋巴细胞有小的影响。
在TNF的影响下，JAM和CRAM-2转录物显示有相似的组织分布和表达调节作用，表明它们是通过相似的生理机制起作用的。相反，CRAM-1转录物不受TNF而受内皮细胞增殖速度或密度调节。事实上，循环细胞中CRAM-1转录物的过表达和其在休眠细胞中的下调表明这种分子参予连续细胞单层的建立。其在细胞的汇合单层中的功能是维持内皮细胞层和相关性质。因为不同的白细胞群体都必须迁移到免疫反应位点，所以认为非淋巴样细胞通过CRAM-1依赖性机制迁移，而淋巴样细胞则通过JAM或CRAM-2迁移。在这种情况下，可以联合使用不同的可溶性重组分子来调节免疫反应。
权利要求
1.属于人免疫球蛋白超家族的一个亚族的分离形式的多肽，该多肽显示整个序列长度分别与如图3中上和下行中所示的鼠汇合调节的粘着分子1或2(CRAM-1或CRAM-2)的氨基酸序列有至少70％同源性。
2.如权利要求1中限定的多肽，其包括与如图6中所示的人CRAM-1的氨基酸序列至少70％、优选至少80％，更优选至少90％，最优选基本上100％同源的氨基酸序列。
3.针对如权利要求1和2中限定的多肽的抗体。
4.如权利要求3的抗体用作携带如权利要求1和2中限定之多肽的细胞的导向分子。
5.如权利要求3或4中限定的抗体用于抑制肿瘤血管生成。
6.如权利要求3或4中限定的抗体用于治疗炎性反应。
7.如权利要求3或4中限定的抗体用于调节，特别是增加血管通透性。
8.如权利要求7中限定的抗体，其中血管通透性的增加是在肿瘤中实现的以便递送药物。
9.如权利要求3-8中限定的抗体，与选自毒素、放射性标记、荧光标记、酶标记、光活化性标记、脂质体、药物和细胞的另一种分子偶联。
10.具有与如权利要求1和2中限定的多肽基本上相同的氨基酸序列的可溶性多肽用于治疗炎性反应。
11.具有如权利要求1和2中限定的多肽之至少一部分氨基酸序列的肽用于治疗炎性反应。
12.如权利要求11中限定的肽，其中至少一部分氨基酸序列包括细胞外区域VC2，和/或膜近端胞质序列A-[Y，Q]-[R，S]-[R，K]-G-[C，Y]-F。
13.如权利要求1、2、11和12中限定的可溶形式的(多)肽用于调节血管通透性。
14.具有编码完整多肽或其部分的核苷酸序列的多或寡核苷酸，其中所说的多肽具有与如图3上和下行中给出的氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列。
15.如权利要求14中限定的具有编码完整多肽或其部分的核苷酸序列的多或寡核苷酸，其中所说的多肽具有与如图6中所示的人CRAM-1的氨基酸序列至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选基本上100％同源的氨基酸序列。
16.如权利要求15中限定的多或寡核苷酸，其具有基本上相同于如图6中所示的人CRAM-1之核苷酸序列的核苷酸序列。
17.如权利要求14-16中限定的多或寡核苷酸，该多或寡核苷酸是RNA或DNA。
18.如权利要求14-17中限定的多或寡核苷酸，该多或寡核苷酸是引物、探针、反义RNA等。
19.特异性鉴定差异表达的DNA序列的方法，该方法包括使用差异显示反转录PCR，其中使用一组对靶基因特异的部分或完整的简并引物。
全文摘要
本发明涉及属于人免疫球蛋白超家族的一个亚族的分离形式的新的多肽，该多肽显示分别与如图3中上和下行所示的鼠汇合调节的粘着分子1或2(CRAM－1或CRAM－2)的氨基酸序列至少有70％序列同源性。本发明还涉及上述多肽的抗体及它们在治疗炎症和肿瘤中的应用。
文档编号C07H21/00GK1637019SQ20041009527
公开日2005年7月13日 申请日期2000年3月13日 优先权日1999年3月11日
发明者B·A.·英霍夫, M·奥兰德-里昂斯 申请人:Rmf迪克塔吉恩有限公司