改进的提取方法

专利名称：改进的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种改进的提取方法，本发明尤其涉及一种从动物组织分离低分子量肽的改进提取方法。
背景技术：
在保健食品和生物医药市场中，对动物产品提取物的需求不断增长，其中包括高浓度的生长因子和其它低分子量的多肽。造成这种需求的原因是，相对于组织或者其它原材料中的大型蛋白质，更小型的多肽具有增强的生物活性，并经常表现出更大的溶解度和稳定性。特别是，低分子量的肽和生长因子的提取物具有使其适用于多种用途的特性，其中包括医疗(例比，治疗外伤)产品、食品添加剂的成分、化妆品以及培养基。
水性提取动物组织的多种标准方法已经被开发并广泛应用于蛋白质的分离，Scopes R.K.(1987)。常规的水性提取方法包括使用某些粉碎细胞的方法，例如在水或者盐溶液或缓冲液的存在下，用超声波或者机械搅拌(在搅拌机中)。有时提取系统的PH值是可调节的，或者使用除垢剂或者其它添加剂，从而增强特定目标蛋白质(例如，与膜相关酶)的溶解度。然而，通常初始的蛋白质提取物包含大范围分子量的蛋白质。因此，还需要进一步的处理步骤，从所有的蛋白质提取物中有选择性地富集生长因子和其它低分子量的多肽。
为了获得浓缩低分子量肽的、富集生长因子组织提取物的商业产品，需要可实施的成本有效的方法，从混合物中去除不需要的高分子量的蛋白质。目前的方法适用于在工业规模下获得富含生长因子的组织提取物部分或者其它动物来源的材料(例如，血液、牛奶和初乳)，其中包括超滤法；凝胶过滤色谱法(GFC)(又名排阻色谱法)；其它色谱分级分离系统(如离子交换分离、疏水性相互作用分离、亲和性分离)；多相系统中的液相分离；利用水溶性有机溶剂(乙醇和丙酮)从水溶液(例如，液相)中沉淀，通常有机溶剂被冷冻处理，有时也加入非水溶性有机溶剂(氯仿)以增强其变性的效果，Scopes，R.K.(1987)；使用中性盐或者氨基酸进行盐析处理。
然而，在大部分的实例中，这些方法已经被用于分离酶或者其它中度的大分子蛋白质，而并非用于浓缩生长因子和其它的肽。例如，采用冷乙醇沉淀是传统Cohn分离方法的基础，该方法用于从血浆制备白蛋白和其它蛋白。因此，这些方法存在一些缺点，换句话说不适用于浓缩生长因子和其它低分子量的多肽。
超滤法和GFC法都需要昂贵的资金投入，都对污垢十分敏感，而GFC法会造成所需低分子量片段的稀释。其它色谱分离系统操作花费昂贵，趋向提纯特定的肽，而不是将高分子量或者低分子量的片段分离。
当不稳定蛋白质(例如，酶)是所需要的产物，此蛋白质被始终保留在水相环境中时，需要特别使用多相系统中的液相分离(例如，浊点提取物和水的双相系统)，Skopes R.K.(1987)，Tani H.et al.(1997)。由此有助于保留分子的生物活性。此方法的缺点是，需要去除的大量的除垢剂、盐和/或水溶性聚合体存在的条件下获得所需的产品。由此提高了操作费用，通常还需要使用附加的步骤，例如超滤。
其它保留方法也都会造成添加了必须从多肽溶液中除去的其它大量化学物质(有机溶剂、氨基酸或者盐)。由于需要附加的处理步骤，费用不断提高，在大量使用易燃和/或有毒溶剂的情况下，会引发安全问题。上述溶剂的安全处理和最后的清除需要使用特殊的设计、以及通常费用高昂的操作装置和设备。
所有的参考文献，包括本说明书引用的任何专利或者专利申请通过在此引述合并于本文。不需要任何允许，所有文献均构成现有技术。这些文献的论述包括作者的声明，申请人保留质疑引用文件的精确度和相关性的权利。可以清楚的理解，尽管本文引用了许多种现有技术的公开出版物，但是，在新西兰或者其它国家这些文献没有构成一种许可，使所有这些文件构成本领域内的部分公知常识。
在此确认，名词“包括”在不同的条件下既有排除的意思，也有包含的意思。在本说明书中除了另做声明，名词“包括”应该具有包含的意思—也就是不仅包括文献直接列出的成份，还包括其它未限定的成份与元素。当涉及方法或者工艺的一个或者多个步骤使用名词“包括”时，也同样采用的是上述概念。
本发明的目的是提出上述问题或者至少向公众提供有用的选择。
通过以实施例方式给出的后续说明，本发明的其它方面和优点将显而易见。

发明内容
这些从组织提取液去除大分子蛋白质多种方法的缺点是当小分子量肽是目标肽时，发明人不得不考虑新型的替换方法。也就是，在水性提取前，使用一种有机溶剂(优选乙醇)在组织内原位变性，从而阻止高分子量的蛋白质片断的初始分解。以前已经使用过有机溶剂处理固体组织，但是只特别用于组织的去脂与脱水(Scopes，RK(1987)，Betzing，H et al(1975))，而不是提高后续水性提取物中低分子量多肽的浓度。因此，还需要分离低分子量的肽。
根据本发明的一个方面，提供一种从原始组织分离低分子量(LMW)肽的方法，其中包括如下步骤a)使组织均质化；b)将有机溶剂和均质化组织混合，形成完全湿润的浆液；c)静置或者搅拌浆液使组织内的蛋白质原位变性；d)从组织去除有机溶剂；e)将步骤(b)中有机溶剂处理的组织与足量的水或者水溶液混合提取肽；f)从步骤(e)的组织残渣中分离液体提取物，获得含有从组织中去除的低分子量肽部分的水溶液。
贯穿全文的名词“肽”，“多肽”和“蛋白质”可以交替使用，而且，意为含有一个或多个氨基酸组成的至少一个链的分子。
名词“分离”意为完全的分离，或者是在低分子量肽离析的组织内从高分子量的肽或者其它不需要的材料中提纯。
贯穿全文的名词“低分子量肽”或者“LMW肽”意为一种分子量为10,000道尔顿或者以下的肽。
贯穿全文，名词“分子量”用在本发明表示为用凝胶过滤色谱法确定的肽分子量。
贯穿全文的名词“总蛋白质提取物”用在这里表示一种使用标准现有技术的液相提取技术制备而成的组织提取提取物，例如背景技术中详细描述的技术，此技术并未试图控制提取物所含蛋白质的分子量。
贯穿全文，名词“搅拌”或者其语法变换都指的是，为了达到混合效果搅拌、震动或者用超声波照射的方法。
本领域技术人员可以理解，其它水溶性(非肽)成分(“NPC”)还可以与采用本发明方法制备的LMW肽一起分离出来。在一些实例中，这些NPC的确是提取工艺所需要的成份，既可以是与LMW肽一起被提取，也可以替代LMW肽作为提取成份。
组织可以是任何动物的组织，或者是需要提取LMW肽的其它完全固态的动物产品(包括干燥血液、乳液或者初乳，且不限于此)。
总之，可以通过超声波或者机械搅拌均化组织，使其完全分解。例如，可以使用研钵和研棒、搅拌器或者任何其它适合的设备，使组织均质化。然而，上述所列的方式不应视为限定。
总之，在均质化之前，组织可以随意进行干燥预处理步骤，有利于组织的均质化或者保存。
组织可以采用任何可以去除组织水份且不会影响组织内目标LMW肽特性的方法干燥。
在优选的实施例中，组织可以进行冷冻干燥，从而不影响热敏感的生长因子。
有机溶剂可以是不影响目标LMW肽性质的任何有机溶剂。
在一些实施例中，有机溶剂可以是丙酮，乙睛，丙醇，丙烷-1-醇或者丙烷-2-醇。上述列表不应视为限定。
在优选实施例中，由于其抗微生物活性和低毒性，有机溶剂可以是乙醇。最优选的是，在干燥组织的情况下可以使用70％的乙醇。
在优选实施例中，当向新鲜组织使用本发明的提取方法时，可以加入足量的纯态乙醇，以提供对应大约30％乙醇体积的总含水量。可选择性的是，当达到此水含量时，如果需要，可以进一步加入70％的乙醇，生成充分湿润的松软浆液。
本领域技术人员认为，可以任选使用更高或者更低浓度的乙醇，在70％乙醇的优选浓度下出现了乙醇最佳的抗微生物活性。
为了便于参照，现仅将有机溶剂设定为乙醇。
贯穿全文，名词“充分湿润”意为向细微分离的固体加入足量的液体，从而生成自由流动的浆液。
用在此处的名词“液相”指的是常规固体(例如，蛋白质)材料溶液的应用，从而使本发明方法的操作完全在液体环境中进行。
贯穿全文，名词“环境温度”意为周围环境的温度，应该在10-30℃的范围。
总之，可以在环境温度下将充分湿润的浆液静置或者搅拌，并持续至少1个小时。最优选的是，在环境温度下将充分湿润的浆液静置或者搅拌，并持续至少3个小时或者更长的时间。但是，如果需要保留LMW肽的生物活性，本发明方法不排除在更低的温度下完成上述步骤(例如，低于环境温度)。在优选的实施例中，与单纯使浆液静置相比，优选采用搅拌处理，本领域技术人员有理由认为，搅拌可以从组织中更有效地提取可溶性成份。
本领域技术人员可以认定，静置充分湿润浆液的时间应该足够长，从而使组织内的蛋白质原位变性。同时也减少了浆液的微生物负载。在将充分湿润的浆液静置后，可以采取多种不同方法去除乙醇。
在一些实施例中，可以采用过滤、浓缩、或者其它物理方式去除乙醇。但是，已经成为共识的是，采用此种方式去除乙醇，会导致最终水溶液中LMW肽产量降低。同时会发生一些不溶于水的肽或者LMW肽部分溶解到有机溶剂中。
因此，在优选的实施例中，可以采用在真空中直接蒸发有机溶剂的方式去除乙醇。最优选的是，仅使用轻度加热就可以实现蒸发，由此使温度保持在30℃以下，目的在于保护热敏感的生长因子。
一旦乙醇被去除，乙醇处理的组织可以在强真空条件下充分干燥，例如，在冷冻干燥机或者类似设备中干燥。当需要去除微量有机溶剂，从而在此步骤保存组织，或者减少微量有机溶剂影响LMW肽产量或者成份的几率时，推荐使用此任选步骤，所述LMW肽是从本方法后续步骤f)或者步骤g)的最终水基提取物中获得，步骤g)将在下面详细论述。
用在这里的名词“水溶液”意为一种溶剂是水、并且包括盐溶液或者缓冲液的溶液。
在一些优选的实施例中，还包括一个附加步骤d1)，其中步骤d)的溶剂处理组织可以在进行步骤e)之前充分干燥。
在步骤d)或者d1)中的乙醇处理组织可以与水或者适合的盐溶液或者缓冲溶剂混合(包括磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、TRIS缓冲液、或者稀释的氯化钠溶液，且不限于此)。优选的是，将所得混合物充分搅拌1个小时。为了保护生长因子，可以在低温条件下—即环境温度下或者更低的温度下进行上述步骤。
可以想象，采用多种不同的方法从步骤e)中的乙醇处理组织中分离出液态提取物。
例如，可以采用下列方法分离液态提取物(如，从固体残渣中分离)倾析法；离心法；
过滤法；或者对于本领域技术人员显而易见的其它适当方法。
最优选的是，采用离心法、精细过滤法、或者其它适合的净化方法澄清液体提取物。
在一些优选的实施例中，还可以包括附加步骤g)，其中步骤g)可以是一遍或者是多遍地重复步骤e)和f)，以提高由步骤e)的组织残渣中获得液体提取物的产量。
一旦从步骤f)或者g)中获得低分子量的肽溶液，为了储存或者进一步加工(例如，产品制剂)，可以任选干燥此液体提取物。
在优选的实施例中，为了获得低分子量的肽，可以干燥步骤f)或者g)的液体提取物。
尽管其它干燥方式有可能取决于低分子量目标肽的特性，最优选的是，采取冷冻干燥的方式实现步骤f)或者g)低分子量肽溶液的干燥。
本发明另一方面，还提供了由本发明方法获得的低分子量肽分离混合物。
本发明另一方面，还提供了有机溶剂在组织内原位变性蛋白质的用途，此应用可以作为从组织分离低分子量肽的分离方法的一部分。
因此，与现有技术的提取方法相比，本发明原位提取LMV方法的优选实施例包括许多优点，其中包括1.同现有技术的提取方法相比，本发明提供了一种获得分离LMW肽提取物、且具有更高LMW肽浓度的简便方法。
2.提供一种特别分离LMW肽的方法。
3.提供一种将使用大量昂贵或者危险溶剂的可能性最小化的方法。


参照以实施例方式给予的下列说明以及附图，本发明的其它方面将会显而易见图1a表示了鹿茸总蛋白质提取物的凝胶过滤色谱图像。
图1b表示了采用本发明新型原位提取法制备的鹿茸LMW提取物，并且在色谱图下方给出了近似的分子量尺度。
图2在液相中加入冷乙醇从鹿茸总蛋白提取物沉淀高分子量的蛋白制备的LMW提取物。
图3表示了鹿茸LMW提取物的凝胶过滤色谱图谱，该提取物是由新型原位提取方法制备的，并且在预处理的培养步骤中使用不同浓度的乙醇(持续了3小时)。
图4图解说明了鹿茸LMW提取物中LMW和HMW蛋白的比率，该提取物是由新型原位提取方法制备的，并且在预处理的培养步骤中使用不同浓度的乙醇(持续了3小时)。
图5表示了鹿茸LMW提取物的凝胶过滤色谱图谱，该提取物是由新型原位提取方法制备的，并且在预处理的培养步骤中使用不同浓度的乙醇(持续了16.5小时)。
图6图解说明了鹿茸LMW提取物中LMW和HMW蛋白的比率，该提取物是由新型原位提取方法制备的，并且在预处理培养步骤的不同时期使用70％的乙醇。
图7图解说明了鹿茸LMW提取物中LMW和HMW蛋白的比率，该提取物是由新型原位提取方法制备的，并且在预处理培养步骤中使用不同比率的70％乙醇。
图8表示了鹿茸LMW提取物的凝胶过滤色谱图形，该提取物是由新型原位提取方法制备的，并且在预处理步骤中使用不同的有机溶剂。
图9表示了鹿茸LMW提取物的凝胶过滤色谱图形，该提取物是由新型原位提取方法制备的，并且在水合提取的步骤中使用多种缓冲液。
图10表示了鹿胎盘LMW提取物的凝胶过滤色谱图形，该提取物是由新型原位提取方法制备的，并且在预处理的培养步骤中使用不同浓度的乙醇。
图11表示了鹿LMW提取物的凝胶过滤色谱图形，该提取物是由新型原位提取方法制备的，并且在预处理的培养步骤中使用不同浓度的乙醇。
图12表示了羊肝LMW提取物的凝胶过滤色谱图形，该提取物是由新型原位提取方法制备的，并且在预处理的培养步骤中使用不同浓度的乙醇。
图13表示了羊肝LMW提取物的凝胶过滤色谱图形，该提取物是由新型原位提取方法制备的，并且在水性提取步骤中使用不同的缓冲液。
图14表示了，与从冷冻干燥鹿茸组织制备的相似提取物相比，采用新型原位提取方法从冷冻鹿茸组织制备的LMW提取物的凝胶过滤色谱图形。
本发明的最佳实施方式LMW原位提取方法—热干燥和冷冻干燥的鹿茸称取5.00克由传统(热)干燥鹿角中间部位获得的鹿茸粉末，再放入500ml的Buchi蒸馏瓶中。加入足量的70％乙醇(大约30毫升)生成可流动的浆液，并且在环境温度(20℃)下用磁力搅拌器搅拌混合物1小时。然后，使用带有30℃水浴的Buchi蒸发器，旋转蒸发去除溶剂。在高度真空条件下使用油泵(Edward)去除微量的残留溶剂1小时。将100ml去离子水加入干燥的残留物中，并且在环境温度(20℃)下使用磁搅拌器搅拌混合物3小时。接着使用玻璃纤维滤纸(Whatman GF/A)，4℃下采用14,600g离心过滤30分钟。将上清液倒入玻璃瓶中，然后在冷冻干燥机中薄层冷冻并冷冻干燥，从而提供鹿茸LMW提取物(0.297g，5.9％产量)，其表现为褐色微粘的固体。经测定，获得的LMW提取物中IGF-1的含量为0.32ug/g，参见表1。
使用由冷冻干燥鹿角获得的5.00克复合鹿茸粉末，重复上述提取方法。获得了0.312克的LMW提取物(6.2％)，其呈自由流动的褐色固体。经测定，LMW提取物中IGF-1含量为0.32ug/g，参见表1。
表1.在原材料(鹿茸粉末)和用本发明方法从原材料获得的LMW提取物中生长因子IGF-1和TGFβ2的含量

在提取条件的比较中使用小规模LMW原位提取方法精确称量500mg的组织(鹿茸、鹿胎盘、羊肝脏)或者冷冻干燥的鹿血，加入带有特氟隆衬帽的玻璃试管。加入足量的有机溶剂，以提供对应固体材料所需的比率，在环境温度(20℃)下使用震动搅拌器(IKA)将混合物搅拌至所需的时间。在大部分实例中，除非另做说明，加入3ml溶剂(比率6∶1，v/w)，持续混合3小时。接着，使用真空离心机(Heto)去除大多数的有机溶剂，在强真空条件下使用冷冻干燥机(FTS)去除剩余微量的有机溶剂。
向有机溶剂处理的试验材料加入10ml水合缓冲液。在大部分的实例中，除非另做说明，使用的缓冲液是0.05M磷酸盐缓冲液(PH6.9)。在环境温度(20℃)下使用Vibramax搅拌器(IKA)搅拌混合物1小时，然后，在4℃下以2000g离心15分钟。将上清液转移至干净试管，在4℃下以4000g离心15分钟。在对生长因子做GFC(在下文做详细描述)分析之前将完全澄清的上清液转移至干净试管。在一些试验中，使用真空烤箱在预先称重的试管中充分干燥5.0ml的等分试样，以确定提取物的产量。
在许多实例中，如上所述，未进行有机溶剂的预处理，而是使用缓冲液提取试验原料。这些样品用做对照样品，以确定使用溶剂预处理去除高分子量蛋白质的有效性。
低分子量提取物的分析在superose 12 HR 10/30柱(Amersham Biosciences)中采用GFC方法分析低分子量的提取物，既可以使用含有0.3M氯化钠和0.05％叠氮化钠的0.05M磷酸盐缓冲液(PH6.9)，也可以使用0.05M碳酸氢铵作为洗脱液。先将固体提取物样品溶解在磷酸盐缓冲液中，浓度大约为5mg/ml，再将每种溶液10ul注入柱内，并以每分钟0.75毫升的流速洗脱。直接注入10ul按照小规模LMW原位提取方法制备的提取物溶液，并在相同的条件下洗脱。通过测定280纳米处的紫外吸收值，检测蛋白质。
在上述条件下，通过分离具有已知分子量的已知蛋白质的标准混合物，确定Superose 12柱的分子量标准。然后，以蛋白质分子量的对数为自变量，保留时间为因变量，绘制标准曲线。使用标准曲线，通过内插法确定洗脱蛋白质峰值的近似分子量。
使用了Turbochrom 4.1(PE Nelson)，开发了数据自动处理方法，用于比较提取物中低分子量和高分子量蛋白质的比率。此方法可以汇总出在使用磷酸盐缓冲液洗脱的样品的色谱图中保留时间小于20.5分钟的所有峰值区域(“高分子量”峰值，由于分子量大于8000道尔顿的蛋白质)，和保留时间大于20.5分钟的峰值区域(“低分子量”峰值，由于分子量小于8000道尔顿的蛋白质)。对于用碳酸氢铵洗脱的样品，在18.5分钟保留时间下高分子量和低分子量的峰值之间等量均分。
已有技术—制备鹿茸总蛋白质提取物用于GFC分析冷冻干燥的光滑鹿茸粉(0.1克)与0.05M的磷酸盐缓冲液(PH6.9，3ml)用涡流混合器混合。接着，用2000g离心混合物5分钟，并在20℃条件下，在超声波清理室(Crest Ultrasonics)超声处理1小时。4℃下以12700g离心15分钟，澄清制备的总蛋白质提取物。然后，采用GFC法直接分析上清液—参照图1a)。总蛋白质提取物的方法是以现有技术中蛋白质提取方法为基础的，如Scopes，R.K.(1987)所述的。
已有技术—使用乙醇从液相的鹿茸总蛋白质提取物中沉淀高分子量蛋白质用于GFC分析在环境温度下轻微震动100毫升去离子水中10克干燥的鹿茸粉末3小时，制备鹿茸总蛋白提取物。以2100g离心混合物15分钟，将上清液转移至第二离心瓶中。再以21000g离心15分钟，为了澄清水性提取物，再冷却到4℃。在不断搅拌下逐渐加入3倍体积的100％冷乙醇。在4℃下以21000g离心浑浊的混合物30分钟，去除沉淀的蛋白质。在做GFC分析之前，在旋转蒸发器中将上清液蒸发至干燥状态，参见图2。总蛋白质提取方法是以现有技术的蛋白质提取方法为基础的，如Scopes，R.K.(1987)所述。
IGF-1的分析由Endolab(Canterbury Health Laboratories)采用对应人类IGF-1的放射性免疫测定法，分析样品的胰岛素类生长因子IGF-1。此测定法具有0.39ug/g的ED50值，对应冷冻干燥的提取样品具有0.02ug/g的检测极限。对于提取物的溶液，检测的ED50值是50ug/L，并且检测极限是4.1ug/L。
IGF-2的分析由Endolab(Canterbury Health Laboratories)采用对应人类IGF-2的放射性免疫测定法，分析提取物溶液样品的胰岛素类生长因子2(IGF-2)。此测定法具有1132ug/L的ED50值和32ug/L的检测极限。
EGF类的活性分析采用放射性受体测定法，测定提取物溶液样品的表皮生长因子类(EGF类)的活性。该测定法测定了样品中此类物质从培养基中A431细胞(表皮癌细胞系)上其受体替换放射性标记鼠EGF(Amersham)的能力。因为其它生长因子可以与EGF受体相结合，因此测定此结合活性作为EGF类的活性。
TGFβ1分析使用EMAX免疫测定系统(Promega Corporation)测定样品的转化生长因子β1(TGFβ1)。此测定特别针对TGFβ1(≤1.6％同TGFβ2的交叉活性和≤0.7％TGFβ3)，并且具有32pg/ml的检测极限。
TGFβ2分析使用EMAX免疫测定系统(Promega Corporation)测定样品的转化生长因子β2(TGFβ2)。此测定特别针对TGFβ2(≤3％与TGFβ1和TGFβ3的交叉活性)，并且具有32pg/ml的测试极限(相当于固体样品的032ng/g)。
结论IGF-1和TGFβ2采用新提取方法由冷冻干燥和/或热处理的鹿茸粉末制备的低分子量提取物的IGF-1和TGFβ2含量之间的比较列于上述的表1中。在每个例子中，与其原料鹿茸粉末测定的结果相比，由新方法制得的LMW提取物具有更高浓度的免疫活性IGF-1和TGFβ2。
使用本发明新方法制备的鹿茸低分子量提取物的分子量分布在图1中将使用70％乙醇预处理鹿茸粉末的水提取物的凝胶过滤图形与未经处理鹿茸粉末的可比提取物相比较。从图1(a)中可知，分子量大于10000道尔顿的蛋白质包括在未经升温的条件下从鹿茸中得到的大体积水基总蛋白提取物。通过比较，使用新型乙醇预处理方法(如图1(b))，实质上所有的高分子量蛋白质都不会出现在低分子量提取物中。
为了分离LMW肽，从标准水性鹿茸提取物沉淀高分子量的蛋白质，此操作在水相中进行。采用此方法是为了将由标准现有技术中蛋白质化学技术去除的蛋白质的分子量分布与本发明新方法去除的蛋白质分子量分布进行比较。如图2所示，向鹿茸总蛋白质水溶液加入3∶1比率的乙醇，也会基本上全部去除分子量大于10000道尔顿的蛋白质。图1b)和2中两种GFC色谱图之间的相似性说明，在本发明的新型提取方法中，乙醇产生了与液相中相同的非水溶性高分子量蛋白质(组织内原位)光谱。
本发明新方法中使用乙醇浓度的影响使用比率为6∶1(v/w)的30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％乙醇预处理3小时或者未经预处理后，用0.05M磷酸盐缓冲液(pH6.9)提取的冷冻干燥鹿茸样品的凝胶过滤色谱图形如图3所示。此图说明，低浓度的乙醇(30％，40％)和高浓度的乙醇(90％)去除高分子量蛋白质的能力低于中等浓度乙醇(50-80％)的能力。
如图4所示，由于低分子量蛋白质的原因，在乙醇浓度范围60-70％下总结合峰值区域的百分率到达最大值。低分子量峰值的绝对区域(用V.SEC表示)与取代蛋白质的浓度成正比，而且随着乙醇浓度从30％增加到90％缓慢降低。相反的是，高分子量峰值的绝对区域(用V.sec表达)随着乙醇浓度从30％升高到50％急剧下降，在乙醇浓度50-80％的低水平下保持平稳，在使用90％乙醇时，再次轻微上升。
在本发明新方法中使用乙醇培养时间的影响如上述试验所述在缓冲液提取之前，用不同的浓度的乙醇处理鹿茸，并做整夜的预处理(16.5小时)，将预处理时间调整为3小时，重复上述试验。通过比较图3和图5可知，预处理时间的增长仅使提取无溶液的凝胶过滤色谱法的图谱有轻微的变化。最明显的变化是，相对于3个小时的预处理期，在前17分钟重色谱柱洗涤时，表现出较高的去除高分子量蛋白质的能力。
使用70％乙醇采用不同的培养时间，对高分子量和低分子量蛋白质比例的影响结果参见图6。低分子量蛋白质的绝对区域(V.sec)从培养时间30分钟到16小时(过夜)基本保持恒定，但是随着时间的变化这些峰值按比例轻微上升。这是因为高分子量蛋白质的绝对峰值区域(in V.sec)逐渐下降，由于随着乙醇培养时间的增长，可以更有效地去除这些蛋白质。
本发明新方法中所用乙醇比率的影响图7所示，对应于提取的冷冻干燥鹿茸组织用量，本发明新方法中所用70％乙醇在2∶1和10∶1(v/w)之间不同比率的影响。在最后的提取物中高分子量和低分子量峰值比率在整个范围内保持适度的恒定，但是绝对峰值区域稳步下降。由于低分子量蛋白的原因，在峰值区域中上述效果最大，这说明，随着加入组织中乙醇的比率增加，这些蛋白质的产量降低。
本发明新方法使用的有机溶剂的影响图8中比较了使用不同缓冲液取代70％乙醇预处理冷冻干燥鹿茸对磷酸盐缓冲液提取物蛋白质图谱的影响，这些缓冲液分别为70％乙睛，70％丙酮，70％丙烷-2-醇或70％甲醇。在每种提取物中，很接近的高分子量蛋白质范围不复存在，这说明了每一种有机溶剂在本发明的新方法中都是有效的。
本发明新方法所用的水合缓冲液的影响图9比较了用不同水合缓冲液代替0.05M磷酸盐缓冲液(PH6.9)对于最终提取物的蛋白质图谱中水合提取物的影响，所述的水合缓冲机为水，0.05M氯化钠，0.05M柠檬酸盐缓冲液(PH4.1)，0.05M醋酸盐缓冲液(PH4.9)，0.05M tris缓冲液(PH7.8)，0.05M碳酸盐缓冲液(PH10.0)。在PH数值接近中性时(用水，氯化钠，tris或磷酸盐缓冲液)，在提取物中会出现范围非常相似的蛋白质)。但是，很少有高分子量蛋白质出现在低PH情况下(使用柠檬酸盐或醋酸盐缓冲液)制备的提取物中，然而，在高PH的情况下(用碳酸盐缓冲液)制备的提取物中，蛋白质图形中会明显出现更大范围的高分子量蛋白质。
上述每一种提取物的产量和生长因子含量都在表2中列出。在每一个例子中，在校正加入盐含量后，产量可以用提取物的干重计算，并以冷冻干燥鹿茸粉末初始重量的百分率表达。尽管根据水合提取物媒介的PH值而变化，但是所有提取物都含有可测含量的生长因子。EGF类的活性在低的PH值(用柠檬酸或者醋酸缓冲液)或者高PH值(用碳酸盐缓冲液)条件下制备的提取物中特异性增高。
表2.产物，IGF-1，IGF-2，TGFβ1，TGFβ2和EGF类似物在本发明LMW提取方法制得的鹿茸粉末提取物中的浓度

使用鹿茸以外材料新方法的应用用凝胶过滤色谱法对冷冻干燥的鹿胎盘、冷冻干燥的鹿血以及冷冻干燥的羊肝样品的提取物测定出色谱图，这些样品用0.05M磷酸盐缓冲液(PH6.9)提取，用30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(重量)乙醇以质量比为6∶1的比率对样品进行3小时的预处理，或者测定未经过预处理的样品，如图10，11和12分别所示。这些数据说明，用一定浓度范围的乙醇(特别是70％的乙醇)来做预处理，对于减少上述原料的水合提取物中的高分子量蛋白质是十分有效的，这些结果和以冷冻干燥光滑鹿茸为原料所得的结果是相似的。
将缓冲液用于羊肝水合提取物的前处理，用70％的乙醇以重量比为6∶1的比率预处理样品3小时的效果，如图13所示。至于光滑鹿茸，当水合提取的过程在酸性条件下操作时(用柠檬酸盐或者醋酸盐)，羊肝中高分子量蛋白质提取物是十分不明显的。
因此，新方法可以表现为适用于光滑鹿茸之外的其它组织和原料。
在新方法中应用冷冻光滑鹿茸组织如图14所示，LMW提取物的凝胶过滤图像，该提取物是用本发明所述方法从粉碎的冷冻光滑鹿茸组织提取而得，并将其同从冷冻干燥鹿茸所得的相似的提取物相比较。实质上，没有高分子量蛋白质在冷冻样品提取物的蛋白质图谱上出现。这说明了，本发明所述的新方法很大程度上减少了在冷冻组织水合提取物中高分子蛋白质的比例，此中情况同干燥的组织相类似。
讨论我们已经展示了在水合提取物中蛋白质分子量的分布，该提取物由用有机溶剂(乙醇)预处理的组织提取而得，该过程同下述过程相似，从水合溶液中获得的高分子蛋白质沉淀物，该水合溶液为附加冷处理有机溶剂的标准总蛋白质提取物。
新方法已经用乙醇、乙睛、丙酮、甲醇以及propan-2-ol作为例证，但是其它有机溶剂(包括但是不限于propan-1-ol，butan-1-ol)通过合理的推定可以应用。
新方法相对于液相方法的主要优点为
●用很少的有机溶剂；●不会导致组织提取无的稀释。
这些减少了使用可燃性有机溶剂的危险性又可以解决液相操作困难的问题。更进一步的说，新方法去除了对于去掉蛋白质沉淀物的分开澄清的必要步骤。取而代之的，高分子量蛋白质很简单的呈现不溶解性在组织的SITU中。因此，在水合条件下的提取物，以致只有低分子量蛋白质和肽段solubilisation分理出来。
应用乙醇在新方法中作为有机溶剂的一个主要的原因是由于它的抗微生物的活性(尤其是浓度为70％的乙醇)。这样就显著的减少了水合提取之前的组织原材料的细菌负载量。
在光滑鹿茸提取物中的高水平的IGF-1，IGF-2，TGFβ1，TGFβ2和EGF类似物活性，表示了新的生产方法保留了生长因子的活性。由此，可以合理的推定用乙醇预处理的组织提取物中富含其它生长因子。
新的方法已经用光滑鹿茸、鹿胎盘、鹿血和羊肝作为例证。与之相似的是，可以合理的假定，除了以上列举的，其它组织中的蛋白质也会呈现出乙醇预处理过程中的不溶解性，以便在后续的水合提取过程中提供丰富的低分子量蛋白质片断。
在新的方法中，已经使用干燥的和冷冻的鹿茸作为例证。与之相似的，可以合理的假定其它组织也可以应用在新方法中无论是非干燥的(冷冻鱼)或是干燥的状态。
本发明的各个方面已经用实施例的方式加以描述，在被审查的权利要求中，所做的不偏离原始保护范围的修改和增加都是允许的。
参考文献
Scopes，R.K.(1987)″PROTEIN Purification，Principles and Practice，2ND Edition″，Springer Verlag，New York，p 38.
Tani，H.，KAMIDATE，T.and WATANABE，H.(1997)″Micelle-mediated extraction″，Journal of ChromatographyA，780229-241.
Betzing，H.and Lekim，D.(1975)″Process of manufacturing enzymepreparation rich in lipase″，Patent GB1454983.
权利要求
1.一种从原始组织分离低分子量肽的方法，包括如下步骤(a)将组织均质化；(b)将均质化的组织和有机溶剂混合，形成一种充分湿润的浆液；(c)静置或搅拌浆液，使组织中的原始蛋白质变性；(d)从组织中去除有机溶剂；(e)将步骤(d)中所得的经有机溶剂处理的组织与足量的水或者水溶液混合以提取肽；(f)从步骤(e)的组织残渣中分离出液态提取物，从而获得含有从组织去除的低分子量肽片断的水溶液；
2.权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)之前所述组织经过干燥的预处理步骤。
3.权利要求2所述的方法，其中组织经过冷冻干燥处理。
4.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中所用的有机溶剂是乙醇。
5.权利要求1或4所述的方法，其中步骤(b)中所用的有机溶剂是70％乙醇。
6.权利要求1或4所述的方法，其中步骤(b)中所用的有机溶剂是浓度范围在50％-80％的乙醇。
7.权利要求1或4所述的方法，其中步骤(b)中所用的有机溶剂是浓度范围在60％-70％的乙醇。
8.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中所用的有机溶剂是纯态乙醇，其被加入到均质组织中以提供占乙醇30体积％的总水含量。
9.权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中静置或者搅拌浆液，并持续至少1小时。
10.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中静置或者搅拌浆液，并持续3小时或者更长的时间。
11.权利要求9或10所述方法，其中在本文限定的环境温度下静置或者搅拌浆液。
12.权利要求1所述的方法，包括附加步骤(d1)，其中在进行(e)步骤之前、步骤(d)所得的有机溶剂处理的组织经过充分的干燥处理。
13.权利要求1或12所述的方法，其中将步骤(d)或(d1)所得的有机溶剂处理的组织与水或者水溶液充分混合1小时。
14.权利要求13所述的方法，其中在本文限定的环境温度或者更低的温度下进行混合。
15.权利要求1所述的方法，还包括附加的步骤(g)，其中该步骤是将步骤(e)和(f)重复操作一次或多次，从而提高从步骤(e)中组织残渣获得液相提取物的产量。
16.权利要求1或15所述的方法，其中将从步骤(f)或者步骤(g)中所得到的液态提取物干燥，获得低分子量肽的提取物。
17.由权利要求1所述方法制得的分离的低分子量肽混合物。
18.有机溶剂在变性组织中原始蛋白质的应用，此用途作为从组织离析低分子量肽提取物的部分离析方法。
全文摘要
一种从原始组织分离低分子量肽的方法，包括如下步骤(a)将组织均质化；(b)将均质化的组织和有机溶剂混合，形成一种充分湿润的浆液；(c)静置或搅拌浆液，使组织中的原始蛋白质变性；(d)从组织中去除有机溶剂；(e)将(d)步骤中所得的经有机溶剂处理的组织与足量的水或者溶液混合，以提取肽；(f)从(e)步骤的组织残渣中分离出液态提取物，从而获得含有从组织去除的低分子量肽片断的水溶液。
文档编号C07K14/435GK1697792SQ200480000428
公开日2005年11月16日 申请日期2004年3月19日 优先权日2003年3月21日
发明者斯蒂芬·海恩斯 申请人:光滑鹿茸研究新西兰有限公司