α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸－β－酯的生产方法和α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸－α...的制作方法

专利名称：α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸－β－酯的生产方法和α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸－α ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(也称为α-L-(β-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸(缩写α-ARP))的生产方法，以及α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯(也称为α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(缩写α-APM))的生产方法。更具体地说，本发明涉及α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的生产方法，以及利用该生产方法生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯的方法，所述α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯是生产需求巨大的甜味剂α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯(产品名阿斯巴甜)的重要中间体。
背景技术：
通常已知的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯(以下有时缩写为“α-APM”)生产方法包括化学合成法和酶合成法。已知化学合成法有缩合N-保护L-天冬氨酸酐和L-苯丙氨酸甲酯来合成N-保护APM，再脱去N-保护基团获得APM；已知酶合成法有缩合N-保护L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯来合成N-保护APM，再脱去N-保护基团获得APM。但是，这两种方法都必需加、脱保护基的步骤，工艺非常麻烦。另一方面，有人研究了不使用N-保护基的APM生产方法(参见日本专利公开公报H02-015196)。但是，该方法由于产物的产量非常低而不适于工业化生产。因此，在这种情况下，急需开发低成本、工业化生产阿斯巴甜的方法。
发明公开本发明的一个目的是提供简便、廉价、高产且不经历复杂合成路线的生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的方法，α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯是α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯的中间体。本发明的另一个目的是提供简便、廉价、高产地生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯的方法。
考虑到以上目的，本发明的发明人进行了深入研究，结果发现一种新发现的酶或含酶物质能够由L-天冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸选择性地生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯，从而实现了本发明。
即，本发明如下所述。
生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(即α-L-(β-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸)的方法，该方法包括使用能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的酶或含酶物质，由L-天冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸生成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯。
按照以上[1]生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(即α-L-(β-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸)的方法，其中所述酶或含酶物质选自以下的一种或两种或更多种能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的微生物培养物、分离自所述培养物的微生物细胞以及所述微生物的微生物细胞处理产物。
按照以上[2]生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(即α-L-(β-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸)的方法，其中所述微生物属于选自以下的属气单胞菌属(Aeromonas)、固氮菌属(Azotobacter)、产碱菌属(Alcaligenes)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、稳杆菌属(Empedobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、拟威尔酵母属(Williopsis)、假丝酵母属(Candida)、地霉属(Geotrichum)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、噬细胞菌属(Cellulophaga)、威克斯氏菌属(Weeksella)、土地杆菌属(Pedobacter)、桃色杆菌属(Persicobacter)、柔发菌属(Flexithrix)、噬几丁质菌属(Chitinophaga)、圆杆菌属(Cyclobacterium)、古字状菌属(Runella)、栖热线菌属(Thermonema)、冷蛇菌属(Psychroserpens)、冰冷杆菌属(Gelidibacter)、Dyadobacter、火色杆菌属(Flammeovirga)、螺状菌属(Spirosoma)、弯杆菌属(Flectobacillus)、屈挠杆菌属(Tenacibaculum)、红嗜热盐菌属(Rhodotermus)、Zobellia、Muricauda、Salegentibacter、整形杆菌属(Taxeobacter)、噬纤维菌属(Cytophaga)、海滑菌属(Marinilabilia)、赖文氏菌属(Lewinella)、腐败螺旋菌属(Saprospira)和束缚杆菌属(Haliscomenobacter)。
按照以上[2]生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(即α-L-(β-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸)的方法，其中所述微生物是能够表达(A)或(B)蛋白质的转化微生物(A)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-616的氨基酸序列的蛋白质，(B)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-616的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质。
按照[2]生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(即α-L-(β-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸)的方法，其中所述微生物是能够表达(C)或(D)蛋白质的转化微生物(C)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列的氨基酸残基序数21-619的氨基酸序列的蛋白质，(D)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列的氨基酸残基序数21-619的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质。
按照[2]生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(即α-L-(β-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸)的方法，其中所述微生物是能够表达以下(E)或(F)蛋白质的转化微生物(E)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-625的氨基酸序列的蛋白质，(F)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-625的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质。
按照以上[2]生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(即α-L-(β-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸)的方法，其中所述微生物是能够表达以下(G)或(H)蛋白质的转化微生物(G)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-645的氨基酸序列的蛋白质，(H)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-645的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质。
按照[2]生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(即α-L-(β-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸)的方法，其中所述微生物是能够表达以下(I)或(J)蛋白质的转化微生物(I)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列的氨基酸残基序数26-620的氨基酸序列的蛋白质，(J)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列的氨基酸残基序数26-620的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质。
按照以上[2]生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(即α-L-(β-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸)的方法，其中所述微生物是能够表达以下(K)或(L)蛋白质的转化微生物(K)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列的氨基酸残基序数18-644的氨基酸序列的蛋白质，(L)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列的氨基酸残基序数18-644的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质。
按照[2]生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(即α-L-(β-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸)的方法，其中所述微生物是能够表达以下(M)或(N)蛋白质的转化微生物(M)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列的蛋白质，(N)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质。
按照[2]生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(即α-L-(β-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸)的方法，其中所述微生物是能够表达以下(O)或(P)蛋白质的转化微生物(O)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列的蛋白质，(P)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质。
按照权利要求[2]生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(即α-L-(β-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸)的方法，其中所述微生物是能够表达以下(Q)或(R)蛋白质的转化微生物(Q)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列，含有成熟蛋白区的蛋白质，(R)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质。
按照[3]生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(即α-L-(β-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸)的方法，其中所述微生物是能够表达以下(S)或(T)蛋白质的转化微生物(S)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列的蛋白质，(T)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质。
按照[2]生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(即α-L-(β-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸)的方法，其中所述微生物是能够表达以下(U)或(V)蛋白质的转化微生物(U)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列的蛋白质，(V)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质。
按照以上[2]生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(即α-L-(β-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸)的方法，其中所述微生物是能够表达以下(W)或(X)蛋白质的转化微生物(W)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列的蛋白质，
(X)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质。
按照以上[1]生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(即α-L-(β-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸)的方法，其中所述酶选自以下(A)-(X)中的至少一种(A)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-616的氨基酸序列的蛋白质，(B)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-616的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质，(C)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列的氨基酸残基序数21-619的氨基酸序列的蛋白质，(D)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列的氨基酸残基序数21-619的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质，(E)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-625的氨基酸序列的蛋白质，(F)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-625的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质，(G)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-645的氨基酸序列的蛋白质，(H)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-645的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质，(I)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列的氨基酸残基序数26-620的氨基酸序列的蛋白质，(J)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列的氨基酸残基序数26-620的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质，(K)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列的氨基酸残基序数18-644的氨基酸序列的蛋白质，(L)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列的氨基酸残基序数18-644的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质，(M)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列的蛋白质，(N)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质，(O)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列的蛋白质，(P)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质，(Q)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列的蛋白质，(R)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质，(S)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列的蛋白质，(T)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质，(U)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列的蛋白质，(V)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质，(W)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列的蛋白质和(X)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质。
生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯(即α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯)的方法，该方法包括利用权利要求1-16中任何一项的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的生产方法，合成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-甲酯(也称为α-L-(β-o-甲基天冬氨酰)-L-苯丙氨酸(缩写α-AMP))的反应步骤；以及将α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-甲酯(即α-L-(β-o-甲基天冬氨酰)-L-苯丙氨酸)转变为α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯的反应步骤。
通过本发明可容易地生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯。通过本发明的方法可简便、高产地生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯，减少了加/脱保护基之类复杂合成方法的使用。
而且，通过本发明可简便、高产且廉价地生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯。
当结合附图一起研读时，本发明的其它目的、特征和优势在以下本发明详述得到具体陈述，或根据以下本发明详述变得显而易见。
附图简述

图1图示了存在于细胞质组分(Cy)和周质组分(Pe)中的酶量。
本发明的最佳实施方式下文将按照以下顺序描述本发明<1>α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的生产方法1.α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的生产方法2.本发明使用的微生物3.本发明使用的酶；<2>α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯的生产方法。
<1>α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的生产方法1.α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的生产方法在本发明的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生产方法(后文也称为“本发明的肽生产方法”)中，在具有所述成肽活性的酶存在的情况下，使L-苯丙氨酸和L-天冬氨酸-α，β-二酯反应。即，在本发明的肽生产方法中，使用能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的酶或含酶物质，由L-天冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸生成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯。能够将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的酶或含酶物质是指具有反应催化能力或活性的酶或含酶物质，在该反应中L-苯丙氨酸能够基本不对L-天冬氨酸-α，β-二酯的β-酯位点进行亲核攻击，而仅对其α-酯位点进行亲核攻击。但是，如下文的参考实施例所示，还可以获得具有与上述能力相反的反应催化能力、由L-天冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸生成β-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-酯(也称为β-L-(α-o-取代天冬氨酰)-L-苯丙氨酸(缩写β-ARP))的酶或含酶物质，在该反应中L-苯丙氨酸能够基本不对L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点进行亲核攻击，而仅对其β-酯位点进行亲核攻击。
下式(I-α)(其中，“Me”表示甲基)通过举将L-天冬氨酸-α，β-二甲酯用作L-天冬氨酸-α，β-二酯的例子，列出了反应式，其中L-苯丙氨酸对L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点进行亲核攻击，生成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯(α-ARP)。如式(I-α)所示，在本发明的肽生产方法中，L-苯丙氨酸的氨基与L-天冬氨酸-α，β-二甲酯的α-甲酯位点反应，形成肽键。另一方面，下式(I-β)列出了反应，其中L-天冬氨酸-α，β-二甲酯的β-甲酯位点经历亲核攻击，生成β-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯(也称为β-L-(α-o-甲基天冬氨酰)-L-苯丙氨酸(缩写β-AMP))。在L-天冬氨酸-α，β-二甲酯的β-甲酯位点形成β-AMP中的肽键。本发明使用的所述酶或含酶物质基本上只加速式(I-α)的反应，基本上不引起式(I-β)的反应。可通过简单的反应步骤(式(II))由α-AMP生产α-APM，但不能由β-AMP直接生产α-APM。换句话说，本发明方法作为α-APM中间体的生产方法非常有效，可用于工业化生产。
反应式I-α 反应式I-β
反应式II 可通过混合所述酶或含酶物质与L-天冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸，使所述酶或含酶物质作用于L-天冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸。更具体地说，可使用这样的方法将所述酶或含酶物质加入到含L-天冬氨酸-二酯和L-苯丙氨酸的溶液中实现反应。当使用生产所述酶的微生物作为含酶物质时，或者可如上所述进行反应，或者可使用以下的或类似的方法，所述方法包括培养生产所述酶的微生物，以在微生物中或培养所述微生物的培养液中生产和累积所述酶，并向培养液中加入L-天冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸。按照常规方法回收如此生产的α-L-天冬氨酸-L-苯丙氨酸-β-酯，如有必要可进行纯化。
所述“含酶物质”可以是任何物质，只要其含有所述酶，其具体形式包括产所述酶的微生物培养物、分离自所述培养物的微生物细胞以及处理过的所述微生物的微生物细胞产物。微生物培养物是指通过培养微生物获得的物质，具体地说是指微生物细胞、用于培养所述微生物的培养基和由所培养微生物产生的物质等的混合物。另外，可清洗所述微生物细胞，用作清洗的微生物细胞。而且，处理过的微生物细胞产物包括对微生物细胞进行破碎、裂解或冻干所得得的产物，此外还包括通过处理微生物细胞回收的酶粗提物和进一步纯化获得的纯化酶。至于纯化处理过的酶，可使用通过各种纯化方法等获得的部分纯化的酶。另外，可使用通过共价键合法、吸附法、包埋法等固定化的固定化酶。而且，对于某些要使用的微生物，可在培养过程中对一部分微生物细胞进行裂解，在此情况下，也可将培养液的上清液用作所述含酶物质。
另外，对于含所述酶的微生物，可使用野生型菌株或表达所述酶的基因重组菌株。这样的微生物不限于含酶微生物细胞，还可以使用处理过的微生物细胞产物，例如经丙酮处理的微生物细胞和冻干微生物细胞。此外，可使用通过共价键合法、吸附法、包埋法等固定化处理微生物细胞产物所获得的固定化微生物细胞或固定化的处理过的微生物细胞产物。
优选使用能够生产具有α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生成活性的成肽酶的野生型菌株，因为可以更容易地生成肽，而不用经历制备基因重组菌株的步骤。另一方面，对于已经转化用来表达具有α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生成活性的成肽酶的基因重组菌株，可以进行修饰，以便更大量生产所述成肽酶。因此，以更大产量和更高速率合成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯是有可能的。在培养基中培养野生型或基因重组菌株微生物，以在培养基和/或微生物中累积成肽酶，并将该累积产物与L-天冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸混合，可以生成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯。
要指出的是，在使用培养产物、培养的微生物细胞、清洗的微生物细胞和通过破碎或裂解微生物细胞所获得的处理过的微生物细胞产物时，事实上通常存在分解所形成的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯而不是参与形成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的酶。在此情况下，优选在某些时刻加入金属蛋白酶抑制剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)。加入量在0.1mM-300mM之间，优选1mM-100mM。
如果表现出目标效果，酶或含酶物质的用量(有效量)可能就够了。尽管本领域一般技术人员可以通过简单初步的实验轻易地确定此有效量，但该用量在使用酶的情况下例如为约0.01-100单位(“U”)，在使用清洗的微生物细胞的情况下为约0.1-500g/L。要注意的是，1U的定义是可以在1分钟内于25℃由100mM L-天冬氨酸-α，β-二甲酯和200mM L-苯丙氨酸生产1μmol L-α-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-甲酯的酶量。
反应中使用的L-天冬氨酸-α，β-二酯可以是与L-苯丙氨酸缩合生成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的任何一种。L-天冬氨酸-α，β-二酯的实例包括L-天冬氨酸-α，β-二甲酯和L-天冬氨酸-α，β-二乙酯。当使L-天冬氨酸-α，β-二甲酯和L-苯丙氨酸反应时，生成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-甲酯(α-AMP)，当使L-天冬氨酸-α，β-二乙酯和L-苯丙氨酸反应时，生成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-乙酯(也称为α-L-(β-o-乙基天冬氨酰)-L-苯丙氨酸(缩写α-AEP))。
尽管作为原料的L-天冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸的浓度分别为1mM-10mM，优选为0.05M-2M，但可在某些情况下优选将任一种底物以相对于另一种底物等摩尔或以上的量加入，并根据需要进行选择。另外，在高浓度底物抑制反应的情况下，可以将其调节至不抑制反应的浓度并在反应过程中流加。
允许生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的反应温度为0-60℃，优选为5-40℃。另外，允许生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的反应pH为6.5-10.5，优选为7.0-10.0。
2.本发明使用的微生物就用于本发明的微生物而言，可以使用那些能够由L-天冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的微生物，没有具体限制。能够由L-天冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的微生物包括例如属于以下属的微生物气单胞菌属(Aeromonas)、固氮菌属(Azotobacter)、产碱菌属(Alcaligenes)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、稳杆菌属(Empedobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、拟威尔酵母属(Williopsis)、假丝酵母属(Candida)、地霉属(Geotrichum)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、噬细胞菌属(Cellulophaga)、威克斯氏菌属(Weeksella)、土地杆菌属(Pedobacter)、桃色杆菌属(Persicobacter)、柔发菌属(Flexithrix)、噬几丁质菌属(Chitinophaga)、圆杆菌属(Cyclobacterium)、古字状菌属(Runella)、栖热线菌属(Thermonema)、冷蛇菌属(Psychroserpens)、冰冷杆菌属(Gelidibacter)、Dyadobacter、火色杆菌属(Flammeovirga)、螺状菌属(Spirosoma)、弯杆菌属(Flectobacillus)、屈挠杆菌属(Tenacibaculum)、红嗜热盐菌属(Rhodotermus)、Zobellia、Muricauda、Salegentibacter、整形杆菌属(Taxeobacter)、噬纤维菌属(Cytophaga)、海滑菌属(Marinilabilia)、赖文氏菌属(Lewinella)、腐败螺旋菌属(Saprospira)和束缚杆菌属(Haliscomenobacter)。具体地说，以下可作为实例。
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ATCC 13136
维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)IFO 3741粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)FERMP-8460小杆短杆菌(Brevibacterium minutiferuna)FERM BP-8277微黄棒杆菌(Corynebacterium flavescens)ATCC 10340大肠杆菌(Escherichia coli)FERM BP-8276短稳杆菌(Empedobacter brevis)ATCC 14234食树脂黄杆菌(Flavobacterium resinovorum)ATCC 14231树状微杆菌(Microbacterium arborescens)ATCC 4348谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)FERM BP-8100短杆菌(Brevibacillus parabrevis)ATCC 8185蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)IFO 14175莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)IFO 3458格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)ATCC 14460嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)ATCC 13270鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)FERM BP-8124浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)NRRL B-1305淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)FERM BP-5568拟威尔酵母(Williopsis saturnus)IFO 0895木兰假丝酵母(Candida magnoliae)IFO 0705香地霉(Geotrichum fragrance)CBS 152.25Geotrichum amycelium IFO 0905西弗毕赤酵母(Pichia ciferrii)IFO 0905单孢酵母(Saccharomyces unisporus)IFO 0724戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)IFO 0422噬细胞菌(Cellulophaga lytica)NBRC 14961有毒威克斯氏菌(Weeksella virosa)NBRC 16016解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)NBRC 12017
流散桃色杆菌(Persicobacter diffluens)NBRC 15940多萝丝柔发菌(Flexithrix dorotheae)NBRC 15987松噬几丁质菌(Chitinophaga pinensis)NBRC 15968海圆杆菌(Cyclobacterium marinum)ATCC 25205飘软古字状菌(Runella slithyformis)ATCC 29530死亡栖热线菌(Thermonema lapsum)ATCC 43542伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpens burtonensis)ATCC 700359凉冰冷杆菌(Gelidibacter algens)ATCC 700364Dyadobacter fermentans ATCC 700827喜光火色杆菌(Flammeovirga aprica)NBRC 15941舌螺状菌(Spirosoma linguale)DSMZ 74大弯杆菌(Flectobacillus major)DSMZ 103海洋屈挠杆菌(Tenacibaculum maritimum)ATCC 43398海洋红嗜热盐菌(Rhodotermus marinus)DSMZ 4252Zobellia galactanivorans DSMZ 12802Muricauda ruestringensis DSMZ 13258Salegentibacter salegens DSMZ 5424整形杆菌(Taxeobacter gelupurpurascens)DSMZ 11116哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)NBRC 15051鲑肉色海滑菌(Marinilabilia salmonicolor)NBRC 15948连接赖文氏菌(Lewinella cohaerens)ATCC 23123大腐败螺旋菌(Saprospira grandis)ATCC 23119水束缚杆菌(Haliscomenobacter hydrossis)ATCC 27775在以上提及的微生物菌株中，以FERM编号描述的微生物保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，可根据各自编号提供。
在以上提及的微生物菌株中，以ATCC编号描述的微生物保藏在美国典型培养物保藏中心(P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，theUnited States of America)，可根据各自编号提供。
在以上提及的微生物菌株中，以IFO编号描述的微生物保藏在大阪发酵研究所(2-17-85 Jusanbon-cho，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)，可根据各自编号提供。
在以上提及的微生物菌株中，以NBRC编号描述的微生物保藏在日本技术评价研究所NITE生物资源中心(5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)，可根据各自编号提供。
在以上提及的微生物菌株中，以DSMZ编号描述的微生物保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)，可根据各自编号提供。
和以上提及的菌株一样，以FERM编号描述的微生物保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566 Japan)。粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)FERM P-8460于1985年9月30日保藏，分配的保藏号为FERM P-8460。谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)FERM P-9737最初于1987年12月4日保藏，该微生物的对照随后根据布达佩斯条约的规定于2002年7月1日转移至国际保藏机构，分配的保藏号为FERM BP-8100。嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonasmaltophilia)FERM BP-5568最初于1995年6月14日保藏，该微生物的对照随后根据布达佩斯条约的规定于1996年6月14日转移至国际保藏机构。小杆短杆菌(Brevibacterium minutiferuna)FERM BP-8277根据布达佩斯条约的规定于2002年1月20日国际保藏。大肠杆菌(Escherichia coli)FERM BP-8276根据布达佩斯条约的规定于2002年1月20日保藏在国际保藏机构。
短稳杆菌(Empedobacter brevis)菌株ATCC 14234(菌株FERM P-18545、菌株FERM BP-8113)于2001年10月1日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，分配的保藏号为FERM P-18545。该微生物的对照随后根据布达佩斯条约的规定于2002年7月8日转移至独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心保藏，分配的保藏号为FERM BP-8113(微生物标识短稳杆菌(Empedobacter brevis)菌株AJ 13933)。
鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)菌株AJ 110003于2002年7月22日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(保藏单位地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，分配的保藏号为FERM BP-8124。
要指出的是，菌株AJ 110003(FERM BP-8124)通过下述的鉴别实验确定为前述的鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)。菌株FERMBP-8124是革兰氏阴性杆菌(0.7-0.8×1.5-2.0μm)，不形成孢子且不能运动。其菌落为边缘完全光滑的圆形，具有低的突起，有光泽，淡黄色。该微生物于30℃生长，过氧化氢酶阳性，氧化酶阳性，氧化发酵(OF)实验(葡萄糖)阴性，基于这些特性判断其为属于鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)属的细菌。而且，由于其具有以下特性硝酸盐还原阴性、产吲哚阴性、由葡萄糖产酸阴性、精氨酸双水解酶(dihydrolase)阴性、脲酶阳性、七叶灵水解阳性、明胶水解阴性、β-半乳糖苷酶阳性、葡萄糖同化阳性、L-阿拉伯糖同化阴性、D-甘露糖同化阳性、D-甘露醇同化阴性、N-乙酰-D-葡糖胺同化阳性、麦芽糖同化阳性、葡糖酸钾同化阴性、正癸酸同化阴性、己二酸同化阴性、dl-苹果酸同化阴性、柠檬酸钠同化阴性、乙酸苯酯同化阴性和细胞色素氧化酶阳性，确定其特性类似于多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)或食神鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumspiritivorum)的特性。此外，尽管16S rRNA基因碱基序列的同源性分析结果表明和多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)高度同源(98.8％)，但不存在与该细菌菌株完全匹配的菌株。因此，将该细菌菌株鉴别为鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)。
对这些微生物来说，或野生型菌株或突变型菌株均可使用，或者可以使用通过细胞融合或遗传技术(例如基因操作)诱导的重组菌株。
为获得所述微生物的微生物细胞，可使所述微生物在合适的培养基中培养和生长。对用于该用途的培养基没有具体限制，只要其可使微生物生长。该培养基可以是含普通碳源、氮源、磷源、硫源、无机盐和有机营养源(根据需要添加)的普通培养基。
例如，可以使用任何碳源，只要微生物可以利用。可用碳源的具体实例包括糖如葡萄糖、果糖、麦芽糖和多糖，醇如山梨糖醇、乙醇和甘油，有机酸如延胡索酸、柠檬酸、乙酸、丙酸及其盐，碳氢化合物如石蜡，以及它们的混合物。
可用氮源的实例包括无机酸铵盐如硫酸铵和氯化铵，有机酸铵盐如延胡索酸铵和柠檬酸铵，硝酸盐如硝酸钠和硝酸钾，有机氮化合物如蛋白胨、酵母提取物、肉膏和玉米浆，以及它们的混合物。
另外，也可以适当混合并使用用于普通培养基的营养源如无机盐、痕量金属盐和维生素。
对培养条件没有特别的限制如培养可进行约12-48小时，同时在通气条件下分别适当控制pH和温度，pH范围为5-8，温度范围为15-40℃。
3.本发明使用的酶在上述本发明的肽生产方法中，使用能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的酶。在本发明的肽生产方法中，不限制酶的来源和生产方法，只要其具有这种活性。下文将阐述本发明所用酶的纯化和基因工程技术的应用。
(3-1)具有可用于本发明生产方法的酶的微生物对于生产本发明酶的微生物，可使用所有能够由L-天冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的微生物。所述微生物包括属于选自以下属的细菌等气单胞菌属(Aeromonas)、固氮菌属(Azotobacter)、产碱菌属(Alcaligenes)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、稳杆菌属(Empedodacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、拟威尔酵母属(Williopsis)、假丝酵母属(Candida)、地霉属(Geotrichum)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、噬细胞菌属(Cellulophaga)、威克斯氏菌属(Weeksella)、土地杆菌属(Pedobacter)、桃色杆菌属(Persicobacter)、柔发菌属(Flexithrix)、噬几丁质菌属(Chitinophaga)、圆杆菌属(Cyclobacterium)、古字状菌属(Runella)、栖热线菌属(Thermonema)、冷蛇菌属(Psychroserpens)、冰冷杆菌属(Gelidibacter)、Dyadobacter、火色杆菌属(Flammeovirga)、螺状菌属(Spirosoma)、弯杆菌属(Flectobacillus)、屈挠杆菌属(Tenacibaculum)、红嗜热盐菌属(Rhodotermus)、Zobellia、Muricauda、Salegentibacter、整形杆菌属(Taxeobacter)、噬纤维菌属(Cytophaga)、海滑菌属(Marinilabilia)、赖文氏菌属(Lewinella)、腐败螺旋菌属(Saprospira)和束缚杆菌属(Haliscomenobacter)。更具体地说，所述微生物包括短稳杆菌(Empedobacter brevis)ATCC 14234(菌株FERM P-18545、菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏物转移日2002年7月8日))、鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)菌株FERM BP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日2002年7月22日)、解肝磷脂土地杆菌(Pedobacterheparinus)IFO 12017(保藏机构大阪发酵研究所；2-17-85Jusanbon-cho，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)、整形杆菌(Taxeobactergelupurpurascens)DSMZ 11116(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，Germany)、海圆杆菌(Cyclobacterium marinum)ATCC 25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)和伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpens burtonensis)ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，theUnited States of America)等。本发明人研究了由L-天冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸高产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的产酶微生物，结果选择了短稳杆菌(Empedodacter brevis)ATCC 14234(菌株FERM P-18545、菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏物日2002年7月8日))、鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)FERM BP-8124菌株(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日2002年7月22日)、解肝磷脂土地杆菌(Pedobacterheparinus)IFO 12017菌株(保藏机构大阪发酵研究所；2-17-85Jusanbon-cho，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)、整形杆菌(Taxeobactergelupurpurascens)DSMZ 11116菌株(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)、海圆杆菌(Cyclobacterium marinum)ATCC25205菌株(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)和伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpens burtonensis)ATCC 700359菌株(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA20110，the United States of America)等微生物。
(3-2)酶的纯化如前所述，可由属于例如稳杆菌属(Empedobacter)的细菌纯化出本发明使用的成肽酶。以由短稳杆菌(Empedobacter brevis)分离和纯化出成肽酶的方法作为酶纯化实例进行了阐述。
首先，由短稳杆菌(Empedobacter brevis)如菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏物转移日2002年7月8日)的微生物细胞制备微生物细胞提取物，方法是使用超声波破碎等物理方法或使用细胞壁溶解酶的酶法破碎细胞，并通过离心分离等去除不溶组分。然后通过组合普通蛋白纯化方法如阴离子交换层析、阳离子交换层析或凝胶过滤层析，将以上述方式获得的细胞提取物分级分离，可纯化所述成肽酶。
用于阴离子交换层析的载体的实例是Q-Sepharose HP(Amersham生产)。当使含所述酶的细胞提取物经过该载体填装柱时，在pH8.5条件下在未吸附组分中回收酶。
用于阳离子交换层析的载体的实例是MonoS HR(Amersham生产)。使含所述酶的细胞提取物经过该载体填装柱，酶吸附在柱上，然后冲洗柱，用高盐浓度缓冲液洗脱酶。此时，盐浓度可以逐渐增加，或者可用采用浓度梯度。例如，在使用MonoS HR时，以约0.2-0.5M的NaCl浓度洗脱吸附在柱上的酶。
然后可通过凝胶过滤层析等进一步均一地纯化以上述方式纯化的酶。用于凝胶过滤层析的载体的实例是Sephadex 200pg(Amersham生产)。
在前述纯化步骤中，可按照下文所描述实施例说明的方法，通过测定每个级分的成肽活性，检定含酶的级分。序列表的SEQ IDNO1和SEQ ID NO2列出了以上述方式纯化的酶的内部氨基酸序列。
(3-3)DNA的分离、转化体的生产和成肽酶的纯化(3-3-1)DNA的分离本发明的发明人首先由短稳杆菌(Empedobacter brevis)菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏物转移日2002年7月8日)中成功地分离出一种可用于本发明肽生产方法的成肽酶的DNA。
本发明的一种DNA其具有SEQ ID NO5所述碱基序列的碱基序数61-1908的碱基序列，分离自短稳杆菌(Empedobacter brevis)菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏物转移日2002年7月8日)。具有碱基序数61-1908的碱基序列的DNA是编码序列(CDS)部分。碱基序数61-1908的碱基序列包含信号序列区和成熟蛋白区。信号序列区为碱基序数61-126的区域，而成熟蛋白区为碱基序数127-1908的区域。即，本发明既提供了含信号序列的成肽酶蛋白基因，又提供了成熟蛋白形式的成肽酶蛋白基因。SEQ ID NO5所述序列含有的信号序列是一种前导序列。据推测，由前导序列编码的前导肽的主要功能是由细胞膜内分泌到细胞膜外。由碱基序数127-1908编码的蛋白，即不包含前导肽的酯位点，推测其为成熟蛋白，具有高度的成肽活性。
本发明的另一种DNA其具有SEQ ID NO11所述碱基序数61-1917的碱基序列，分离自鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)菌株FERM BP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日2002年7月22日)。具有碱基序数61-1917的碱基序列的DNA是编码序列(CDS)部分。碱基序数61-1917的碱基序列包含信号序列区和成熟蛋白区。信号序列区为包括碱基序数61-120的区域，而成熟蛋白区为包括碱基序数121-1917的区域。即，本发明既提供了含信号序列的成肽酶蛋白基因，又提供了成熟蛋白形式的成肽酶蛋白基因。SEQ ID NO11所述序列含有的信号序列是一种前导序列。据推测，由前导序列编码的前导肽的主要功能是由细胞膜内分泌到细胞膜外。由碱基序数121-1917编码的蛋白，即不包含前导肽的部分，推测其为成熟蛋白，具有高度的成肽活性。
本发明另一种DNA其具有SEQ ID NO17所述碱基序数61-1935的碱基序列，分离自解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)菌株IFO12017(保藏机构大阪发酵研究所；2-17-85 Jusanbon-cho，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)。具有SEQ ID NO17所述碱基序数61-1935的碱基序列的DNA是编码序列(CDS)部分。碱基序数61-1935的碱基序列包含信号序列区和成熟蛋白区。信号序列区为包括碱基序数61-126的区域，而成熟蛋白区为包括碱基序数127-1935的区域。即，本发明既提供了含信号序列的成肽酶蛋白基因，又提供了成熟蛋白形式的成肽酶蛋白基因。SEQ ID NO17所述序列含有的信号序列是一种前导序列。据推测，由前导序列编码的前导肽的主要功能是由细胞膜内分泌到细胞膜外。由碱基序数127-1935编码的蛋白，即不包含前导肽的部分，推测其为成熟蛋白，具有高度的成肽活性。
本发明的另一种DNA其具有SEQ ID NO22所述碱基序数61-1995的碱基序列，分离自整形杆菌(Taxeobacter gelupurpurascens)DSMZ 11116(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，Germany)。具有SEQ ID NO22所述碱基序数61-1995的碱基序列的DNA是编码序列(CDS)部分。碱基序数61-1995的碱基序列包含信号序列区和成熟蛋白区。信号序列区为包括碱基序数61-126的区域，而成熟蛋白区为包括碱基序数127-1995的区域。即，本发明既提供了含信号序列的成肽酶蛋白基因，又提供了成熟蛋白形式的成肽酶蛋白基因。SEQID NO22所述序列含有的信号序列是一种前导序列。据推测，由前导序列编码的前导肽的主要功能是由细胞膜内分泌到细胞膜外。由碱基序数127-1995编码的蛋白，即不包含前导肽的部分，推测其为成熟蛋白，具有高度的成肽活性。
本发明另一种DNA其具有SEQ ID NO24所述碱基序数29-1888的碱基序列，分离自海圆杆菌(Cyclobacterium marinum)ATCC 25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)。具有SEQ ID NO24所述碱基序数29-1888的碱基序列的DNA是编码序列(CDS)部分。碱基序数29-1888的碱基序列包含信号序列区和成熟蛋白区。信号序列区为包括碱基序数29-103的区域，而成熟蛋白区为包括碱基序数104-1888的区域。即，本发明既提供了含信号序列的成肽酶蛋白基因，又提供了成熟蛋白形式的成肽酶蛋白基因。SEQ ID NO24所述序列含有的信号序列是一种前导序列。据推测，由前导序列编码的前导肽的主要功能是由细胞膜内分泌到细胞膜外。由碱基序数104-1888编码的蛋白，即不包含前导肽的部分，推测其为成熟蛋白，具有高度的成肽活性。
本发明的另一种DNA其具有SEQ ID NO26所述碱基序数61-1992的碱基序列，分离自伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpens burtonensis)ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)等。具有SEQ ID NO26所述碱基序数61-1992的碱基序列的DNA是编码序列(CDS)部分。碱基序数61-1992的碱基序列包含信号序列区和成熟蛋白区。信号序列区为包括碱基序数61-111的区域，而成熟蛋白区为包括碱基序数112-1992的区域。即，本发明既提供了含信号序列的成肽酶蛋白基因，又提供了成熟蛋白形式的成肽酶蛋白基因。SEQ ID NO26所述序列含有的信号序列是一种前导序列。据推测，由前导序列编码的前导肽的主要功能是由细胞膜内分泌到细胞膜外。由碱基序数112-1992编码的蛋白，即不包含前导肽的部分，推测其为成熟蛋白，具有高度的成肽活性。
此外，可以按照分子克隆，第2版，Cold Spring Harbor Press(1989)及其它出版物的描述，实施以下叙述的各种基因重组技术。
可通过聚合酶链反应(PCR，参见White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))，或者与短稳杆菌(Empedobacter brevis)、鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)、解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)、整形杆菌(Taxeobacter gelupurpurascens)、海圆杆菌(Cyclobacteriummarinum)或伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpens burtonensis)的染色体DNA或DNA文库杂交，获得可用于本发明的酶编码DNA。PCR使用的引物可根据内部氨基酸碱基序列进行设计，而内部氨基酸碱基序列基于如前述章节(3)的阐述，纯化的成肽酶确定。另外，因为本发明已经鉴别了成肽酶基因的碱基序列(SEQ ID NO5、SEQ ID NO11、SEQ ID NO17、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24和SEQ ID NO26)，所以可根据这些碱基序列设计引物或杂交探针，并使用所述探针分离基因。如果引物序列分别具有对应于5′-非翻译区和3′-非翻译区的序列，则其用作PCR引物，可以扩增该酶的全长编码区。以扩增同时含有SEQ ID NO5所述的前导序列和成熟蛋白编码区的区域为例，引物的具体实例包括具有SEQ ID NO5的碱基序数61上游区域碱基序列的5′-端引物，以及具有与碱基序数1908下游区域的碱基序列互补序列的3′-端引物。
例如，可按照一般方法使用，用亚磷酰胺酯(phosphoamidite)法(参见Tetrahedron Letters(1981)，22，1859)，由Applied Biosystems生产的380B型DNA合成仪，合成引物。例如，可使用Gene Amp PCRSystem 9600(Perkin-Elmer)和Takara LA PCR体外克隆试剂盒(TakaraShuzo)，按照供应商例如生产厂家说明的方法，进行PCR反应。
可用于本发明肽生产方法的酶的编码DNA，不论该DNA是否含有前导序列，都包括这样的DNA其与序列表中SEQ ID NO5所述CDS的DNA大致相同。即，可由突变酶编码DNA或具有该DNA的细胞中分离出下述DNA来获得与本发明DNA大致相同的DNA所述DNA与序列表中SEQ ID NO5所述CDS的互补碱基序列的DNA或由所述碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并编码具有成肽活性的蛋白。
本发明的DNA，不论其是否含有前导序列，都包括这样的DNA其与序列表中SEQ ID NO11所述CDS的DNA大致相同。即，可由突变酶编码DNA或具有该DNA的细胞中分离出下述DNA来获得与本发明DNA大致相同的DNA所述DNA与序列表中SEQ IDNO11所述CDS的互补碱基序列的DNA或由所述碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并编码具有成肽活性的蛋白。
本发明的DNA，不论其是否含有前导序列，都包括这样的DNA其与序列表中SEQ ID NO17所述CDS的DNA大致相同。即，可由突变酶编码DNA或具有该DNA的细胞中分离出下述DNA来获得与本发明DNA大致相同的DNA所述DNA与序列表中SEQ IDNO17所述CDS的互补碱基序列的DNA或由所述碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并编码具有成肽活性的蛋白。
本发明的DNA，不论其是否含有前导序列，都包括这样的DNA其与序列表中SEQ ID NO22所述CDS的DNA大致相同。即，可由突变酶编码DNA或具有该DNA的细胞中分离出下述DNA来获得与本发明DNA大致相同的DNA所述DNA与序列表中SEQ IDNO22所述CDS的互补碱基序列的DNA或由所述碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并编码具有成肽活性的蛋白。
本发明的DNA，不论其是否含有前导序列，都包括这样的DNA其与序列表中SEQ ID NO24所述CDS的DNA大致相同。即，可由突变酶编码DNA或具有该DNA的细胞中分离出下述DNA来获得与本发明DNA大致相同的DNA所述DNA与序列表中SEQ IDNO24所述CDS的互补碱基序列的DNA或由所述碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并编码具有成肽活性的蛋白。
本发明的DNA，不论其是否含有前导序列，都包括这样的DNA其与序列表中SEQ ID NO26所述CDS的DNA大致相同。即，可由突变酶编码DNA或具有该DNA的细胞中分离出下述DNA来获得与本发明DNA大致相同的DNA所述DNA与序列表中SEQ IDNO26所述CDS的互补碱基序列的DNA或由所述碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并编码具有成肽活性的蛋白。
例如可按照已确立的方法，根据例如序列表中SEQ ID NO5所述碱基序列，生产探针。另外，也可以按照已确立的方法，实施用探针来发现与所述探针杂交的DNA，从而分离靶DNA的方法。例如，可通过以下方法生产DNA探针扩增克隆在质粒载体或噬菌体载体中的碱基序列，用限制性酶切出希望用作探针的碱基序列，然后提取目的碱基序列。可根据靶DNA的情况对要切出的部分进行调整。
本文所用术语“在严格条件下”是指在该条件下形成所谓的特异性杂交，而不形成非特异性杂交。很难准确地用数值表示该条件。例如，可以一提的一个条件是在该条件下，具有高同源性的DNA如50％或以上，优选80％或以上，更优选90％或以上，互相之间杂交，同源性低于这些值的DNA互相之间不杂交，或者是用于DNA杂交漂洗的一般条件，在该条件下，于60℃和相当于1×SSC和0.1％SDS、优选0.1×SSC和0.1％SDS的盐浓度下进行杂交。尽管在所述条件下杂交的基因包括终止密码子出现在其序列上某些位置的基因或者由于活性中心突变而失去活性的基因，但它们可以轻易地除去，方法是将它们与市售表达载体连接，在合适的宿主中表达，使用后文所述方法测定表达产物的酶活性。
但是，对于在上述严格条件下杂交的碱基序列而言，优选该碱基序列编码蛋白在50℃和pH8条件下保留的酶活性，是其由原碱基序列作为碱基编码氨基酸序列的蛋白的酶活性的约一半或以上，优选80％或以上，更优选90％或以上。如以实例进行解释，例如，在严格条件下，与SEQ ID NO5所述碱基序列的碱基序数127-1908的碱基序列的互补碱基序列DNA杂交的碱基序列，则优选该碱基序列编码蛋白在50℃和pH8条件下保留的酶活性是SEQ ID NO6所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-616的氨基酸序列的蛋白的酶活性的约一半或以上，优选80％或以上，更优选90％或以上。
序列表中SEQ ID NO6列出了序列表中SEQ ID NO5所述CDS编码的氨基酸序列。序列表中SEQ ID NO12列出了序列表中SEQ IDNO11所述CDS编码的氨基酸序列。序列表中SEQ ID NO18列出了序列表中SEQ ID NO17所述CDS编码的氨基酸序列。序列表中SEQ ID NO23列出了序列表中SEQ ID NO22所述CDS编码的氨基酸序列。序列表中SEQ ID NO25列出了序列表中SEQ IDNO24所述CDS编码的氨基酸序列。序列表中SEQ ID NO27列出了序列表中SEQ ID NO26所述CDS编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO6所述的完整氨基酸序列，包含前导肽和成熟蛋白区，前导肽由氨基酸残基序数1-22构成，成熟蛋白区由氨基酸残基序数23-616构成。
SEQ ID NO11所述的完整氨基酸序列，包含前导肽和成熟蛋白区，前导肽由氨基酸残基序数1-20构成，成熟蛋白区由氨基酸残基序数21-619构成。
SEQ ID NO18所述的完整氨基酸序列，包含前导肽和成熟蛋白区，前导肽由氨基酸残基序数1-22构成，成熟蛋白区由氨基酸残基序数23-625构成。
SEQ ID NO23所述的完整氨基酸序列，包含前导肽和成熟蛋白区，前导肽由氨基酸残基序数1-22构成，成熟蛋白区由氨基酸残基序数23-645构成。
SEQ ID NO25所述的完整氨基酸序列，包含前导肽和成熟蛋白区，前导肽由氨基酸残基序数1-25构成，成熟蛋白区由氨基酸残基序数26-620构成。
SEQ ID NO27所述的完整氨基酸序列，包含前导肽和成熟蛋白区，前导肽由氨基酸残基序数1-17构成，成熟蛋白区由氨基酸残基序数18-644构成。
本发明DNA编码的蛋白是其中成熟蛋白具有成肽活性的蛋白质，而其编码蛋白与序列表中SEQ ID NO6、SEQ ID NO12、SEQID NO18、SEQ ID NO23、SEQ ID NO25或SEQ ID NO27所述氨基酸序列蛋白大致相同的DNA，不论其是否含有前导肽，也都包含在本发明DNA中。(要指出的是，碱基序列按照通用密码子编码由氨基酸序列指定。)即，本发明提供编码以下(A)-(X)所示蛋白的DNA(A)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-616的蛋白质，(B)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列的氨基酸残基23-616，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的蛋白质，(C)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列的氨基酸残基序数21-619的蛋白质，(D)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列的氨基酸残基21-619，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的蛋白质，(E)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-625的蛋白质，(F)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列的氨基酸残基23-625，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的蛋白质，(G)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-645的蛋白质，(H)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列的氨基酸残基23-645，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的蛋白质，(I)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列的氨基酸残基序数26-620的蛋白质，(J)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列的氨基酸残基26-620，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的蛋白质，(K)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列的氨基酸残基序数18-644的蛋白质，(L)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列的氨基酸残基18-644，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的蛋白质，(M)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列的蛋白质，(N)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点，含有成熟蛋白区的蛋白质，(O)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列的蛋白质，(P)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点，含有成熟蛋白区的蛋白质，(Q)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列的蛋白质，(R)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点，含有成熟蛋白区的蛋白质，(S)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列的蛋白质，(T)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点，含有成熟蛋白区的蛋白质，(U)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列的蛋白质，(V)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点，含有成熟蛋白区的蛋白质，(W)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列的蛋白质和(X)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列，并能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点，含有成熟蛋白区的蛋白质。
在此，尽管术语“多个”的含义依蛋白三维结构中氨基酸残基的位置和类型而有所变化，其在不显著损害氨基酸残基的三维结构和蛋白活性的范围内，具体地说是2-50，优选2-30，更优选2-10。但是，对于(B)、(D)、(F)、(H)、(J)、(L)、(N)、(P)、(R)、(T)、(V)或(X)的蛋白氨基酸序列中有一个或多个氨基酸替换、缺失、插入、增加和/或倒位的氨基酸序列，优选其编码蛋白在50℃和pH8条件下保留的酶活性，是无突变状态蛋白酶活性的约一半或以上，更优选80％或以上，再更优选90％或以上。例如，以(B)为例阐述对于序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列中有一个或多个氨基酸替换、缺失、插入、增加和/或倒位的氨基酸序列(B)，优选其编码蛋白在50℃和pH8条件下保留的酶活性，是序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列编码蛋白酶活性的约一半或以上，更优选80％或以上，再更优选90％或以上。
可通过修饰碱基序列，例如通过酯位点定向诱变、替换、缺失、插入或增加本发明酶基因中指定酯位点的氨基酸，来获得在前述(B)等中所述的氨基酸突变。另外，也可以通过本领域已知的诱变处理获得上述的修饰DNA。诱变处理是指例如用羟胺等体外处理编码本发明酶的DNA的方法，以及用通常用于人工诱变的诱变剂(例如紫外辐射、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸)处理含本发明酶编码DNA的埃希氏菌属(Escherichia)细菌的方法。
另外，天然存在的突变，例如可归于微生物种或菌株的差异，也包括在上述碱基替换、缺失、插入、增加和/或倒位中。通过在合适的细胞中表达具所述突变的DNA，并研究表达产物的酶活性，可获得其编码的蛋白与序列表中SEQ ID NO6、12、18、23、25或27所述蛋白大致相同的DNA。
(3-3-2)转化体的制备和成肽酶的生产将以上(3-3-1)所述DNA导入适宜宿主中，并于该宿主中表达所述DNA，可生产可用于本发明肽生产方法的成肽酶。
关于由所述DNA确定的蛋白的表达宿主，可使用的宿主实例包括各种原核细胞，包括埃希氏菌属(Escherichia)细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)、稳杆菌属(Empedobacter)细菌、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)细菌、黄杆菌属(Flavobacterium)细菌和枯草杆菌(Bacillus subtilis)，以及各种真核细胞，包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)和米曲霉(Aspergillusoryzae)。
通过将要导入的DNA插入到要表达DNA的宿主类型所对应的载体中，可制备用于将DNA导入宿主的重组DNA，以此形式可表达所述DNA编码的蛋白。如果短稳杆菌(Empedobacter brevis)等的成肽酶基因独有的启动子在宿主细胞中起作用，则该启动子可用作表达本发明DNA的启动子。另外，可将另一个在宿主细胞中起作用的启动子连接至本发明DNA，可根据需要在该启动子控制下表达所述DNA。
将重组DNA导入宿主细胞的转化方法实例包括D.M.Morrison的方法(参见Methods in Enzymology，68，326(1979))或用氯化钙处理受体微生物细胞增加DNA透过性的方法(参见Mandel，H.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))。
就使用重组DNA技术大量生产蛋白来说，在生产该蛋白的转化体中，所述蛋白结合形成蛋白包涵体，也是实施本发明的一个优选方式。此表达和生产方法的优势包括保护目标蛋白免受微生物细胞中存在的蛋白酶降解，以及通过破碎微生物细胞以及随后的离心分离等可简单容易地纯化目标蛋白。
以此方式获得的蛋白包涵体溶于蛋白变性剂，通过主要包括去除变性剂的活性再生步骤，蛋白转变为正确折叠的生理活性蛋白。存在众多这样的实例，包括人白介素-2的活性再生(参见日本专利申请公开公报S61-257931)。
为了由包涵体获得活性蛋白，需要一系列步骤，包括溶解和活性再生，这些步骤比直接生产活性蛋白更复杂。但是，对于在微生物细胞中大量生产对微生物生长具有害作用的蛋白的情况，则在微生物细胞中累积包涵体形式的失活蛋白可抑制这种作用。
包涵体形式目标蛋白的大规模生产方法的实例包括在强启动子控制下独立表达目标蛋白的方法，以及与已知大量表达的蛋白以融合蛋白形式表达目标蛋白。
下文将把生产转化大肠杆菌和使用该转化微生物生产成肽酶的方法作为实例，更具体地阐述本发明。而且，对于在大肠杆菌之类的微生物中生产成肽酶，可整合入含前导序列的前体蛋白的编码DNA或可整合入仅由不含前导序列的成熟蛋白区构成的DNA，并可根据所生产酶的生产条件、形式、使用条件等适当地选择蛋白编码序列DNA。
通常用在大肠杆菌中生产外源蛋白的启动子可用作表达成肽酶编码DNA的启动子。这样的启动子的实例包括T7启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子和其它强启动子。另外，可用的载体实例包括pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219和pMW218。除此之外，还可以使用噬菌体DNA载体。而且，可以使用含启动子并能够表达所插入DNA序列的表达载体。
为生产融合蛋白包涵体形式的成肽酶，将编码另一种蛋白(优选亲水性肽)的基因连接至成肽酶基因的上游或下游，以获得融合蛋白基因。在此方法中，编码另一种蛋白的基因可以是任何基因，只要其增加融合蛋白的累积量，并增强变性和再生步骤后融合蛋白的溶解性。这种基因的候选实例包括T7基因10，β-半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶(dehydrofolate reductase)基因、γ-干扰素基因、白介素-2基因和凝乳酶原基因。
当把这些基因与成肽酶编码基因相接时，要把基因连接使得密码子读框连贯。推荐使用连接在合适的限制酶-酯位点的基因或具有合适序列的合成DNA。
此外，为增加成肽酶产量，有时优选将为转录终止序列的终止子连接在融合蛋白基因下游。终止子包括例如T7终止子、fd噬菌体终止子、T4终止子、四环素抗性基因终止子和大肠杆菌trpA基因终止子。
对于在大肠杆菌中将编码成肽酶或融合蛋白(成肽酶与另一种蛋白融合)的基因导入载体，优选所谓的多拷贝型载体，其实例包括具有ColE1来源复制子的质粒，例如基于pUC的质粒、基于pBR322的质粒或其衍生物。本文使用的术语“衍生物”是指通过碱基替换、缺失、插入、增加和/或倒位进行了修饰的质粒。要指出的是，本文使用的修饰包括用诱变剂或紫外辐射进行突变处理过的修饰，或者自发突变修饰。
为筛选转化体，所述载体优选具有标记，例如氨苄青霉素抗性基因。这样的质粒是市售的表达载体，具有有效的启动子，如基于pUC载体(Takara Shuzo，Co.，Ltd.生产)、基于pRROK载体(ClonetechLaboratories，Inc.生产)、pKK233-2(Clonetech Laboratories，Inc.生产)等。
通过将DNA片段连接至载体DNA获得重组DNA。在此情况下，按照启动子、L-氨基酸酰胺水解酶或由L-氨基酸酰胺水解酶和另一种蛋白组成的融合蛋白的编码基因，以及根据情况选用的终止子的顺序连接。
在使用重组DNA转化大肠杆菌并培养所获得的大肠杆菌时，表达和生产成肽酶或由成肽酶和另一种蛋白组成的融合蛋白。尽管通常用于表达外源基因的菌株可用作要转化的宿主，但优选例如大肠杆菌菌株JM109。分子克隆，第2版，Cold Spring Harbor Press(1989)和其它出版物描述了实施转化和筛选出转化体的方法。
在表达融合蛋白形式的成肽酶时，可使用限制性蛋白酶切出成肽酶，所述限制性蛋白酶使用成肽酶中不存在的序列，如血液凝血因子Xa或激肽释放酶，作为识别序列。
通常用于培养大肠杆菌的培养基，例如M9-酪蛋白氨基酸培养基或LB培养基，可用作生产培养基。另外，按照所使用载体的标记、启动子、宿主微生物类型等，恰当地选择培养条件和生产诱导条件。
可使用以下的方法回收成肽酶或由成肽酶与另一种蛋白构成的融合蛋白。如果成肽酶或其融合蛋白溶在微生物细胞中，则在回收微生物细胞后，破碎或裂解微生物细胞，使其可用作粗提酶液。而且，可在使用前根据需要通过普通技术如沉淀、过滤或柱层析纯化成肽酶或其融合蛋白。在此情况下，还可以使用利用成肽酶或其融合蛋白抗体的纯化方法。
在形成蛋白包涵体时，用变性剂溶解包涵体。它们可与微生物细胞蛋白一起溶解。但是，考虑到后续纯化步骤，优选取出包涵体，然后溶解。可使用通常已知的方法由微生物细胞回收包涵体。例如，可通过破碎微生物细胞，然后离心分离，回收包涵体。能够溶解包涵体的变性剂实例包括盐酸胍(例如6M，pH5-8)和尿素(例如8M)。
通过透析去除这些变性剂来再生有活性的蛋白。Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液等可用作透析中使用的透析溶液，浓度可以是例如20mM至0.5M，pH可以是例如5-8。
再生步骤中的蛋白浓度优选保持在约500μg/ml或更低。透析温度优选为5℃或更低，以抑制再生的成肽酶出现自交联。而且，除了透析之外，稀释或超滤可用于去除变性剂，无论使用哪种变性剂预期都可以再生活性。
<2> α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯的生产方法本发明的α-APM生产方法包括第一步，按照“<1>α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的生产方法”合成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-甲酯；第二步，将α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-甲酯转变为α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯。
第一步中的优选条件等如“<1>α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的生产方法”所述。另外，可按照已知方法实施第二步，可参考例如日本专利公开H4-41155等描述的方法和优选条件。利用本发明的α-APM生产方法，可以高产廉价地生产重要的甜味剂α-APM。
实施例下文将通过实施例解释本发明。但是，本发明不限于这些实施例。为了测定产物，除了通过薄膜层析茚三酮染色(定性)确认之外，可通过以下的高效液相层析进行定量测定。柱Inertsil ODS-2(GLScience，Inc.生产)，洗脱含5.0mM 1-辛磺酸钠的磷酸水溶液(pH2.1)∶甲醇＝100∶15-50，流速1.0ml/分钟，检测210纳米(nm)。
实施例1生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-甲酯的微生物将50ml在1L中含20g甘油、5g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、3g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁、10g酵母提取物和10g蛋白胨的培养基(pH7.0)转移至500ml Sakaguchi摇瓶中，于115℃灭菌15分钟(培养基1)，用于培养示于表1-1的细菌和放线菌。制备在培养基1中含5g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、5g/L NaCl和20g/L琼脂的斜面琼脂培养基(pH7.0)，并于30℃在此斜面琼脂培养基上培养表1所示的微生物24小时。然后，将一菌环量所述微生物在培养基1中于30℃培养24小时，接着于30℃以120次/分钟振荡培养17小时。完成培养后，通过离心将微生物细胞与培养液分离，并在含10mMEDTA的0.1M硼酸盐缓冲液(pH9.0)中悬浮至100g/L(以微生物细胞湿重计)。
将50ml在1L中含10g葡萄糖、10g甘油、5g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、3g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁、5g酵母提取物、5g麦芽提取物和10g蛋白胨的培养基(pH6.0)转移至500ml Sakaguchi摇瓶中，并于115℃灭菌15分钟(培养基2)，使用该培养基培养示于表1-1的酵母。制备在培养基2中含5g/L葡萄糖、5g/L酵母提取物、5g/L麦芽提取物、10g/L蛋白胨、5g/L NaCl和20g/L琼脂的斜面琼脂培养基(pH6.0)，并于30℃在此斜面培养基上培养表1所示的酵母24小时。然后，将一菌环量所述酵母在培养基2中于30℃振荡培养24小时，接着于25℃以120次/分钟振荡培养17小时。完成培养后，通过离心将微生物细胞与这些培养液分离，并用含10mM EDTA的0.1M硼酸盐缓冲液(pH9.0)悬浮至100g/L(以微生物细胞湿重计)。
如下培养表1-2所示的微生物。使用在1L Daigo人工海水SP中含1g胰蛋白胨、1g酵母提取物和15g琼脂的琼脂固体培养基(pH7.2，于120℃灭菌15分钟)培养噬细胞菌(Cellulophaga lytica)NBRC14961(保藏机构日本技术评价研究所NITE生物资源中心，保藏机构地址5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)或多萝丝柔发菌(Flexithrix dorotheae)NBRC 15987(保藏机构日本技术评价研究所NITE生物资源中心，保藏机构地址5-8Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)。将在此培养基上于30℃接种培养48小时的噬细胞菌(Cellulophaga lytica)NBRC 14961(保藏机构NITE日本技术评价研究所生物资源中心，保藏机构地址5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)或多萝丝柔发菌(Flexithrix dorotheae)NBRC 15987(保藏机构NITE日本技术评价研究所生物资源中心，保藏机构地址5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于30℃主培养48小时。
使用绵羊血琼脂培养基(Nissui Plate，Nissui Pharmaceutical)培养有毒威克斯氏菌(Weeksella virosa)NBRC 16016(保藏机构日本技术评价研究所NITE生物资源中心，保藏机构地址5-8 Kazusa-Kamaashi2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)。将在此培养基上于30℃接种培养48小时的有毒威克斯氏菌(Weeksella virosa)NBRC 16016(保藏机构日本技术评价研究所NITE生物资源中心，保藏机构地址5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于30℃主培养48小时。
使用在1L蒸馏水中含10g蛋白胨、2g酵母提取物和1gMgSO4·7H2O和15g琼脂的琼脂固体培养基(pH7.0，于120℃灭菌15分钟)培养解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)NBRC 12017(保藏机构日本技术评价研究所NITE生物资源中心，保藏机构地址5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)。将在此培养基上于30℃接种培养48小时的解肝磷脂土地杆菌(Pedobacterheparinus)NBRC 12017(保藏机构日本技术评价研究所NITE生物资源中心，保藏机构地址5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于30℃主培养48小时。
使用在1L Daigo人工海水SP中含0.5g KNO3、0.1g甘油磷酸钠、1g三羟甲基氨基甲烷、5g胰蛋白胨、5g酵母提取物、15g琼脂和1ml微量元素溶液的琼脂固体培养基(pH7.0，于120℃灭菌15分钟)培养流散桃色杆菌(Persicobacter diffluens)NBRC 15940((保藏机构日本技术评价研究所NITE生物资源中心，保藏机构地址5-8Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)。注意微量元素溶液包含2.85g H3BO4、1.8g MnCl2·4H2O、1.36g FeSO4·7H2O、26.9mg CuCl2·2H2O、20.8mg ZnCl2、40.4mg CoCl2·6H2O、25.2mgNa2MoO4·2H2O和1.77g酒石酸钠)。将在此培养基上于25℃接种培养48小时的流散桃色杆菌(Persicobacter diffluens)NBRC 15940(保藏机构日本技术评价研究所NITE生物资源中心，保藏机构地址5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于25℃主培养48小时。
使用在1L蒸馏水中含3g细菌用酪胨(bactocasitone)、1g酵母提取物、1.36g CaCl2·2H2O和15g琼脂的琼脂固体培养基(pH7.0，于120℃灭菌15分钟)培养松噬几丁质菌(Chitinophaga pinensis)NBRC15968(保藏机构日本技术评价研究所NITE生物资源中心，保藏机构地址5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)。将在此培养基上于25℃接种培养48小时的松噬几丁质菌(Chitinophaga pinensis)NBRC 15968(保藏机构日本技术评价研究所NITE生物资源中心，保藏机构地址5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于25℃主培养48小时。
使用在1L Daigo人工海水SP中含5g蛋白胨、1g酵母提取物、0.2g FeSO4·7H2O和15g琼脂的琼脂固体培养基(pH7.0，于120℃灭菌15分钟)培养海圆杆菌(Cyclobacterium marinum)ATCC 25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)。将在此培养基上于25℃接种培养48小时的海圆杆菌(Cyclobacterium marinum)ATCC25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于25℃主培养48小时。
使用在1L蒸馏水中含1g蛋白胨、1g酵母提取物、1g葡萄糖和15g琼脂的琼脂固体培养基(pH7.0，于120℃灭菌15分钟)培养飘软古字状菌(Runella slithyformis)ATCC 29530(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA20110，the United States of America)。将在此培养基上于25℃接种培养48小时的飘软古字状菌(Runella slithyformis)ATCC 29530(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于25℃主培养48小时。
使用在1L蒸馏水中含0.2g次氮基三乙酸、2ml 0.03％FeCl3溶液、0.12g CaSO4·2H2O、0.2g MgSO4·7H2O、0.016g NaCl、0.21gKNO3、1.4g NaNO3、0.22g Na2HPO4、2ml微量元素溶液和15g琼脂的琼脂固体培养基(pH8.2，于120℃灭菌15分钟)培养死亡栖热线菌(Thermonema lapsum)ATCC 43542((保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the UnitedStates of America)。应当注意的是微量元素溶液包含0.5ml H2SO4、2.2g MnSO4、0.5g ZnSO4、0.5g H3BO3、0.016g CuSO4、0.025gNa2MoO4和0.046g CoCl2)。将在此培养基上于60℃接种培养48小时的死亡栖热线菌(Thermonema lapsum)ATCC 43542(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA20110，the United States of America)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于25℃主培养48小时。
使用海洋琼脂(Marine Agar)2216(由Difco生产)培养凉冰冷杆菌(Gelidibacter algens)ATCC 700364(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the UnitedStates of America)、连接赖文氏菌(Lewinella cohaerens)ATCC 23123(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)、伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpens burtonensis)ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，theUnited States of America)或Salegentibacter salegens DSMZ 5424(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址MascheroderWeg 1b，38124 Braunschweig，Germany)。对于凉冰冷杆菌(Gelidibacteralgens)ATCC 700364(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States ofAmerica)或伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpens burtonensis)ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)，将在此培养基上于10℃接种培养72小时的凉冰冷杆菌(Gelidibacter algens)ATCC700364或伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpens burtonensis)ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)微生物细胞涂布，接着于10℃主培养72小时。对于连接赖文氏菌(Lewinella cohaerens)ATCC 23123(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)，将在此培养基上于30℃接种培养48小时的连接赖文氏菌(Lewinellacohaerens)ATCC 23123(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States ofAmerica)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于30℃主培养48小时。对于Salegentibacter salegens DSMZ 5424(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)，将在此培养基上于25℃接种培养48小时的Salegentibacter salegens DSMZ 5424(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于25℃主培养48小时。
使用在1L蒸馏水中含0.8g NH4Cl、0.25g KH2PO4、0.4gK2HPO4、0.505g KNO3、15mg CaCl2·2H2O、20mg MgCl2·6H2O、7mgFeSO4·7H2O、5mg Na2SO4、5mg MnCl2·4H2O、0.5mg H3BO3、0.5mgZnCl2、0.5mg CoCl2·6H2O、0.5mg NiSO4·6H2O、0.3mg CuCl2·2H2O、10mg Na2MoO4·2H2O、0.5g酵母提取物、0.5g蛋白胨、0.5g酪蛋白氨基酸、0.5g葡萄糖、0.5g可溶性淀粉、0.5g丙酮酸钠和15g琼脂的琼脂固体培养基(pH7.0，120℃灭菌15分钟)培养Dyadobacterfermentans ATCC 700827(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States ofAmerica)。将在此培养基上于25℃接种培养48小时的Dyadobacterfermentans ATCC 700827(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States ofAmerica)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于25℃主培养48小时。
使用在1L Daigo人工海水SP中含2g胰蛋白胨、0.5g肉膏、0.5g酵母提取物、0.2g乙酸钠和15g琼脂的琼脂固体培养基(pH7.2，于120℃灭菌15分钟)培养喜光火色杆菌(Flammeovirga aprica)NBRC15941(保藏机构日本技术评价研究所NITE生物资源中心，保藏机构地址5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)。将在此培养基上于25℃接种培养48小时的喜光火色杆菌(Flammeovirga aprica)NBRC 15941(保藏机构日本技术评价研究所NITE生物资源中心，保藏机构地址5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于25℃主培养48小时。
使用在1L蒸馏水中含1g葡萄糖、1g蛋白胨、1g酵母提取物和15g琼脂的琼脂固体培养基(pH7.0，120℃灭菌15分钟)培养舌螺状菌(Spirosoma linguale)DSMZ 74(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)或大弯杆菌(Flectobacillus major)DSMZ 103(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，Germany)。将在此培养基上于25℃接种培养48小时的舌螺状菌(Spirosoma linguale)DSMZ 74(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，Germany)或大弯杆菌(Flectobacillus major)DSMZ 103(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，Germany)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于25℃主培养48小时。
使用在300ml蒸馏水和700ml Daigo人工海水SP中含0.5g胰蛋白胨、0.5g酵母提取物、0.2g肉膏、0.2g乙酸钠和15g琼脂的琼脂固体培养基(pH7.0，于120℃灭菌15分钟)培养海洋屈挠杆菌(Tenacibaculum maritimum)ATCC 43398(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，theUnited States of America)。将在此培养基上于25℃接种培养48小时的海洋屈挠杆菌(Tenacibaculum maritimum)ATCC 43398(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于25℃主培养48小时。
使用在1L中含2.5g酵母提取物、2.5g胰蛋白胨、100mg次氮基三乙酸、40mg CaSO4·2H2O、200mg MgCl2·6H2O、0.5ml的0.01M柠檬酸铁、0.5ml微量元素溶液、100ml磷酸缓冲液、900ml蒸馏水和28g琼脂的琼脂固体培养基(pH7.2，120℃灭菌15分钟)培养海洋红嗜热盐菌(Rhodotermus marinus)DSMZ 4252((保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，Germany)。注意所述微量元素溶液包含12.8g次氮基三乙酸、1g FeCl2·4H2O、0.5g MnCl2·4H2O、0.3g CoCl2·4H2O、50mg CuCl2·2H2O、50mg Na2MoO4·2H2O、20mg H3BO3和20mgNiCl2·6H2O)。将在此培养基上于60℃接种培养48小时的海洋红嗜热盐菌(Rhodotermus marinus)DSMZ 4252(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于60℃主培养48小时。
使用含BACTO MARINE BROTH(DIFCO 2216)的琼脂固体培养基(1.5％琼脂，pH7.6，120℃灭菌15分钟)培养Zobellia galactanivoransDSMZ 12802(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，Germany)。将在此培养基上于30℃接种培养48小时的Zobellia galactanivoransDSMZ 12802(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，Germany)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于30℃主培养48小时。
使用在1L蒸馏水中含1.5g酵母提取物、2.5g蛋白胨、2g十六烷、17.7g NaCl、0.48g KCl、3.4g MgCl2·6H2O、4.46g MgSO4·7H2O、0.98g CaCl2和15g琼脂的琼脂固体培养基(pH7.2，120℃灭菌15分钟)培养Muricauda ruestringensis DSMZ 13258(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)。将在此培养基上于30℃接种培养48小时的Muricauda ruestringensis DSMZ 13258(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于30℃主培养48小时。
使用在1L蒸馏水中含3g酪胨、1g酵母提取物、1.36gCaCl2·2H2O和15g琼脂的琼脂固体培养基(pH7.2，120℃灭菌15分钟)培养整形杆菌(Taxeobacter gelupurpurascens)DSMZ 11116(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址MascheroderWeg 1b，38124 Braunschweig，Germany)。将在此培养基上于30℃接种培养48小时的整形杆菌(Taxeobacter gelupurpurascens)DSMZ 11116(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，Germany)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于30℃主培养48小时。
使用在1L蒸馏水中含3g酪胨、1g酵母提取物、1.36gCaCl2·2H2O、5g纤维二糖和15g琼脂的琼脂固体培养基(pH7.2，于120℃灭菌15分钟)培养哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)NBRC15051(保藏机构日本技术评价研究所NITE生物资源中心，保藏机构地址5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)。将在此培养基上于30℃接种培养48小时的哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)NBRC 15051(保藏机构日本技术评价研究所NITE生物资源中心，保藏机构地址5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于30℃主培养48小时。
使用在250ml蒸馏水和750ml Daigo人工海水SP中含10g蛋白胨、2g酵母提取物、0.5g MgSO4·7H2O和15g琼脂的琼脂固体培养基(pH7.2，于120℃灭菌15分钟)培养鲑肉色海滑菌(Marinilabiliasalmonicolor)NBRC 15948(保藏机构日本技术评价研究所NITE生物资源中心，保藏机构地址5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)。将在此培养基上于30℃接种培养48小时的鲑肉色海滑菌(Marinilabilia salmonicolor)NBRC 15948(保藏机构日本技术评价研究所NITE生物资源中心，保藏机构地址5-8Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于30℃主培养48小时。
使用在1L Daigo人工海水SP中含0.5g KNO3、0.1g甘油磷酸钠、1g三羟甲基氨基甲烷、2g胰蛋白胨、2g酵母提取物、15g琼脂和1ml微量元素溶液的琼脂固体培养基(pH7.0，于120℃灭菌15分钟)培养大腐败螺旋菌(Saprospira grandis)ATCC 23119((保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)。注意所述微量元素溶液包含2.85g H3BO4、1.8g MnCl2·4H2O、1.36g FeSO4·7H2O、26.9mgCuCl2·2H2O、20.8mg ZnCl2、40.4mg CoCl2·6H2O、25.2mgNa2MoO4·2H2O和1.77g酒石酸钠)。将在此培养基上于30℃接种培养48小时的大腐败螺旋菌(Saprospira grandis)ATCC 23119(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于30℃主培养48小时。
使用在1L蒸馏水中含27mg KH2PO4、40mg K2HPO4、40mgNa2HPO4·2H2O、50mg CaCl2·2H2O、75mg MgSO4·7H2O、5mgFeCl3·6H2O、3mg MnSO4·H2O、1.31g谷氨酸、2.5mg无葡萄糖的胰胨豆胨培养液、0.4mg硫胺素、0.01mg维生素B 12、2g葡萄糖和1ml微量元素溶液的琼脂固体培养基(pH7.5，于120℃灭菌15分钟)培养水束缚杆菌(Haliscomenobacter hydrossis)ATCC 27775((保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)。注意所述微量元素溶液包含0.1g ZnSO4·7H2O、0.03g MnCl2·4H2O、0.3g H3BO3、0.2gCoCl2·6H2O、0.01g CuCl2·2H2O、0.02g NiCl2·6H2O和0.03gNa2MoO4·H2O)。将在此培养基上于25℃接种培养48小时的水束缚杆菌(Haliscomenobacter hydrossis)ATCC 27775(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，theUnited States of America)微生物细胞涂布于相同培养基上，接着于25℃主培养48小时。
因此获得的微生物细胞各自从所述琼脂培养基收集，并在含10mM EDTA的0.1M硼酸盐缓冲液(pH9.0)中悬浮至100g/L(以微生物细胞湿重计)。
向0.1ml这些微生物的各种微生物细胞悬浮液中加入0.1ml含10mM EDTA、100mM盐酸L-天冬氨酸-α，β-二甲酯和200mM L-苯丙氨酸的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)，使总量为0.2ml。然后，当使用表1-1所示微生物时，反应于20℃进行3小时，当使用表1-2所示微生物时，反应于20℃进行1小时。α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-甲酯(α-AMP)的产量(mM)示于表1-1和1-2。要指出的是，在使用所述微生物的所有情况下，都没有检测到β-AMP。
表1-1

表1-2

参考实施例1生产β-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯的微生物以类似于实施例1表1细菌的方法培养表2所示微生物。培养完成后，通过离心将微生物细胞与培养液分离，并在含10mM EDTA的0.1M硼酸盐缓冲液(pH9.0)中悬浮至100g/L(以微生物细胞湿重计)。向这些微生物各自的0.1ml微生物细胞悬浮液中加入0.1ml含10mM EDTA、100mM盐酸L-天冬氨酸-α，β-二甲酯和200mM L-苯丙氨酸的100mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)，使总量为0.2ml，接着于30℃反应2小时。在此情况下β-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯(β-AMP)的产量(mM)示于表2。要指出的是，在所有所述微生物中都没有检测到α-AMP。
表2

实施例2短稳杆菌(Empedobacter brevis)中酶的纯化将1L中含5g葡萄糖、5g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、3g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁、10g酵母提取物和10g蛋白胨的50ml培养基(pH6.2)转移至500ml Sakaguchi摇瓶中，并于115℃灭菌15分钟。然后用已经在相同培养基中于30℃培养16小时的2ml短稳杆菌(Empedobacter brevis)菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏物转移日2002年7月8日)接种该培养基，接着于30℃以120次/分钟振荡培养16小时。
随后，于冰上或者于4℃进行离心分离后的步骤。离心所得培养液来收集微生物细胞。用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)清洗16g微生物细胞后，将其悬浮在40ml相同缓冲液中，再以195瓦特进行45分钟超声波破碎处理。然后离心(10,000rpm，30分钟)此超声波破碎液，以去除破碎的细胞碎片，获得超声波破碎液的上清液。使此超声波破碎液的上清液对50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)透析过夜，接着通过超速离心(50,000rpm，30分钟)去除不溶组分，获得为上清液形式的可溶组分。将所得可溶组分上样于用Tris-HCl缓冲液(pH8.0)预平衡的Q-Sepharose HP柱(Amersham生产)，由未吸附的组分中收集活性组分。将此活性组分对50mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)透析过夜，接着通过离心分离(10,000rpm，30分钟)去除不溶组分，获得为上清液形式的透析组分。然后将此透析组分上样于用50mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)预平衡的Mono S柱(Amersham生产)，用含0-1M NaCl线性浓度的相同缓冲液梯度洗脱酶。将活性组分中含最低水平杂蛋白的组分上样于用含1M NaCl的50mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)预平衡的Superdex 200pg柱(Amersham生产)，使含1M NaCl的相同缓冲液(pH4.5)经过该柱进行凝胶过滤，获得活性组分溶液。进行这些步骤之后，根据电泳实验结果，证实用于本发明的成肽酶已均一纯化。前述纯化过程的酶收率为12.2％，纯化度为707倍。
实施例3使用短稳杆菌(Empedobacter brevis)酶组分生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-甲酯将在实施例2中获得的10μl Mono S组分酶(约20U/ml)加入190μl含105.3mM盐酸L-天冬氨酸-α，β-二甲酯、210.5mM L-苯丙氨酸和10.51mM EDTA的硼酸盐缓冲液(pH9.0)中，于20℃进行反应。α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-甲酯(α-AMP)的生产过程示于表3。要指出的是，经证实，未添加酶的批次几乎没有形成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-甲酯。
此外，将在实施例2中获得的10μl Mono S组分酶(约20U/ml)加入190μl含各105.3mM盐酸L-天冬氨酸-α-甲酯和盐酸L-天冬氨酸-β-甲酯、210.5mM L-苯丙氨酸和10.51mM EDTA的硼酸盐缓冲液(pH9.0)中，于20℃进行反应。结果，没有观察到形成相应的肽。
表3

实施例4鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)的酶的纯化使用实施例2所示培养基，以和实施例2相同的方式，培养鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)菌株FERM BP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日2002年7月22日)。离心分离后的步骤或者于冰上或者于4℃进行。离心(10,000rpm，15分钟)所得培养液来收集微生物细胞。用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.6)清洗2g微生物细胞后，将其悬浮在8ml相同缓冲液中，以195W进行45分钟超声波破碎处理。然后离心(10,000rpm，30分钟)此超声波破碎液，以去除破碎的细胞碎片，获得超声波破碎液的上清液。使此超声波破碎液的上清液对20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.6)透析过夜，接着通过超速离心(50,000rpm，30分钟)去除不溶组分，获得为上清液形式的可溶组分。将所得可溶组分上样于用Tris-HCl缓冲液(pH7.6)预平衡的Q-SepharoseHP柱(Amersham生产)，由未吸附的组分中收集活性组分。将此活性组分对20mM乙酸盐缓冲液(pH5.0)透析过夜，接着通过离心分离(10,000rpm，30分钟)去除不溶组分，获得为上清液形式的透析组分。然后将此透析组分上样于用20mM乙酸盐缓冲液(pH5.0)预平衡的SP-Sepharose HP柱(Amersham生产)，以获得活性组分，其中酶用含0-1M NaCl相同缓冲液的线性浓度梯度洗脱。
实施例5使用鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)酶组分生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-甲酯和α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-乙酯在生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-甲酯(α-AMP)时，将在实施例4中获得的15μl SP-Sephrose HP组分浓缩液(约15U/ml)加入到185μl含108.1mM盐酸L-天冬氨酸-α，β-二甲酯、216.2mM L-苯丙氨酸和10.8mM EDTA的硼酸盐缓冲液(pH9.0)中，于20℃进行反应。同样，在生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-乙酯(α-AEP)时，将在实施例4中获得的10μl SP-Sephrose HP组分浓缩液(约15U/ml)加入到190μl含52.6mM盐酸L-天冬氨酸-α，β-二乙酯、105.2mM L-苯丙氨酸和10.8mM EDTA的硼酸盐缓冲液(pH9.0)中，于20℃进行反应。AMP或AEP的形成过程示于表4。要指出的是，经证实，在未添加酶的批次几乎没有形成AMP或AEP。对于AEP的形成，描述用AMP标准品所获数值。
表4

实施例6来源于短稳杆菌(Empedobacter brevis)的成肽酶基因的分离下文将阐述成肽酶基因的分离。使用短稳杆菌(Empedobacterbrevis)菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏物转移日2002年7月8日)作为微生物。分离基因时，大肠杆菌JM-109用作宿主，而pUC118用作载体。
(1)根据确定的内部氨基酸序列生产PCR引物由来源于短稳杆菌(Empedobacter brevis)菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏物转移日2002年7月8日)的成肽酶赖氨酰内肽酶消化产物用Edman降解法确定氨基酸序列(SEQ ID NO1和2)，分别生产具有SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示碱基序列的混合引物。
(2)微生物细胞的获得将短稳杆菌(Empedobacter brevis)菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏物转移日2002年7月8日)在CM2G琼脂培养基(含50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/l NaCl和20g/l琼脂，pH7.0)上于30℃培养24小时。将一菌环量所得微生物细胞接种入含50ml CM2G液体培养基(不含琼脂的前述培养基)的500mlSakaguchi摇瓶中，于30℃振荡培养。
(3)从微生物细胞获得染色体DNA离心(12,000rpm，4℃，15分钟)50ml培养液收集微生物细胞。然后，使用QIAGEN Genomic-Tip System(QIAGEN)，根据其说明书中描述的步骤，由微生物细胞获得染色体DNA。
(4)通过PCR获得含部分成肽酶基因的DNA片段使用LA-Taq(Takara Shuzo生产)，通过PCR法获得含部分短稳杆菌(Empedobacter brevis)菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址ChuoDai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏物转移日2002年7月8日)来源的成肽酶基因的DNA片段。然后使用具有SEQ ID NO3和4的碱基序列的引物，对由短稳杆菌(Empedobacter brevis)菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏物转移日2002年7月8日)获得的染色体DNA进行PCR反应。
在以下条件下，使用Takara PCR热循环仪PERSONAL(TakaraShuzo生产)进行30个循环的PCR反应。
94℃30秒52℃1分钟72℃1分钟反应完成后，用3μl反应液上样于0.8％琼脂糖电泳。结果证实约1.5千碱基(kb)的DNA片段扩增。
(5)由基因文库克隆成肽酶基因为了获得全长成肽酶基因，使用在PCR步骤中扩增的DNA片段作为探针进行DNA杂交。DNA杂交的步骤阐述于分子克隆，第2版，Cold Spring Harbor Press(1989)。
通过0.8％琼脂糖电泳分离PCR步骤扩增的约1.5kb DNA片段。然后切出目标条带并纯化。使用DIG High Prime(Boehringer-Mannheim生产)，根据其说明书中描述的使用DIG High Prime(Boehringer-Mannheim生产)的方法，用探针地高辛(digoxinigen)标记该DNA片段。
通过与限制酶HindIII于37℃反应16小时，完全消化本发明实施例6步骤(3)获得的短稳杆菌(Empedobacter brevis)染色体DNA，之后产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。电泳后，将电泳的染色体DNA由琼脂糖凝胶转印至带正电尼龙滤膜(Roche Diagnostics生产)上，接着进行包括碱变性、中和和固定化的处理。使用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)进行杂交。滤膜于50℃预杂交1小时后，加入如上所述制备的地高辛标记探针，并于50℃杂交16小时。随后，用含0.1％SDS的2×SSC于室温漂洗滤膜20分钟。此外，再两次用含0.1％SDS的0.1×SSC于65℃漂洗滤膜15分钟。
使用DIG核苷酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据其说明书中描述的DIG核苷酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)使用步骤，检测与所述探针杂交的条带。结果检测到能够与所述探针杂交的条带大约为4kb。
然后，用HindIII完全消化本发明实施例6步骤(3)制备的5μg染色体DNA。通过0.8％琼脂糖电泳分离约4kb的DNA，接着使用Gene Clean II试剂盒(Funakoshi生产)纯化DNA，将DNA溶解在10μlTE中。然后将4μl该产物与pUC118 HindIII/BAP(Takara Shuzo生产)混合，使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo生产)进行连接反应。混合5μl连接反应混合物和100μl大肠杆菌JM109感受态细胞(Toyobo生产)，以转化大肠杆菌。然后将其涂布在合适的固体培养基上创建染色体DNA文库。
为获得完整的全长成肽酶基因，使用前述探针通过菌落杂交筛选染色体DNA文库。菌落杂交的步骤阐述于分子克隆，第2版，ColdSpring Harbor Press(1989)。
将染色体DNA文库的菌落转移至尼龙滤膜(用于菌落和噬菌斑杂交的尼龙膜)(Roche Diagnostics生产)上，接着进行包括碱变性、中和和固定化的处理。使用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)进行杂交。滤膜于37℃预杂交1小时后，加入前述地高辛标记探针，接着于50℃杂交16小时。随后，用含0.1％SDS的2×SSC于室温漂洗滤膜20分钟。此外，再两次用含0.1％SDS的0.1×SSC于65℃漂洗滤膜15分钟。
使用DIG核苷酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据其说明书中描述的DIG核苷酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)使用说明，检测与所述标记探针杂交的菌落。结果证实菌落中有两个菌株与标记探针杂交。
(6)短稳杆菌(Empedobacter brevis)来源的成肽酶基因的碱基序列使用Wizard Plus Minipreps DNA纯化系统(Promega生产)，由上述证实与标记探针杂交的两株微生物细胞制备大肠杆菌JM109具有的质粒，并测定与所述探针发生杂交的部分及附近的碱基序列。使用CEQ DTCS-Quick Start试剂盒(Beckman-Coulter生产)，根据其说明书描述的方法进行测序反应。另外，使用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生产)进行电泳。
结果证实，编码含成肽酶内部氨基酸序列(SEQ ID NO1和2)的蛋白的可读框确实存在，因此证实该可读框是成肽酶的编码基因。全长成肽酶基因的碱基序列以及对应的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO5。用BLASTP程序分析获得的可读框的同源性，结果发现与两种酶同源显示在氨基酸序列水平上与巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)的α-氨基酸酯水解酶具有34％同源性(参见Appl.Environ.Microbiol.，68(1)，211-218(2002))，在氨基酸序列水平上与侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporum)的戊二酰-7ACA酰化酶具有26％同源性(参见J.Bacteriol.，173(24)，7848-7855(1991))。
(7)在大肠杆菌中表达短稳杆菌(Empedobacter brevis)来源的成肽酶基因使用SEQ ID NO7和8中列出的寡核苷酸作为引物，通过进行PCR扩增大肠杆菌W3110染色体DNA上trp操纵子的启动子区上的靶基因区，将获得的DNA片段连接至pGEM-Teasy载体(Promega生产)。然后在此连接溶液中转化大肠杆菌JM109，由氨苄青霉素抗性菌株中选择具有目标质粒的菌株，所述目标质粒中插入的trp启动子的插入方向与lac启动子的方向相反。下一步，用EcoO109I/EcoRI处理该质粒获得含trp启动子的DNA片段，将其连接至pUC19(Takara生产)的EcoO109I/EcoRI处理产物。然后用此连接溶液转化大肠杆菌JM109，由氨苄青霉素抗性菌株中选择具有目标质粒的那些菌株。下一步，将用HindIII/PvuII处理质粒获得的DNA片段与通过用HindIII/HincII处理pKK223-3(Amersham Pharmacia生产)获得的含rmB终止子的DNA片段连接。然后用此连接缓冲液转化大肠杆菌JM109，由氨苄青霉素抗性菌株中选择具有目标质粒的菌株，将该质粒命名为pTrpT。
使用短稳杆菌菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏物转移日2002年7月8日)的染色体DNA作为模板，SEQ ID NO9和10列出的寡核苷酸作为引物，通过PCR扩增目标基因。然后用NdeI/PstI处理此DNA片段，将获得的DNA片段与pTrpT的NdeI/PstI处理产物连接。然后用此转化溶液转化大肠杆菌JM109，由氨苄青霉素抗性菌株中选择具有目标质粒的菌株，将该质粒命名为pTrpT_Gtg2。
将具有pTrpT_Gtg2的大肠杆菌JM109在含100mg/l氨苄青霉素的LB培养基中于30℃接种培养24小时。将1ml所得培养液接种在含50ml培养基(2g/l D-葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸铵、3g/l磷酸二氢钾、1g/l磷酸氢二钾、0.5g/l七水硫酸镁和100mg/l氨苄青霉素)的500ml Sakaguchi摇瓶中，接着于25℃培养24小时。培养液的α-L-天冬氨酰-苯丙氨酸-β-甲酯形成活性为0.11U/ml，证实大肠杆菌表达克隆基因。而且，作为对照仅导入pTrpT的转化体未检测到活性。
信号序列的预测在用Signal Pv 1.1程序(参见Protein Engineering，Vol.12，No.1，3-9页，1999)分析序列表SEQ ID NO6所述的氨基酸序列时，预测氨基酸序数1-22起分泌到周质中的信号作用，而估计成熟蛋白位于氨基酸序数23的下游。
分泌的证实将具有pTrpT_Gtg2的大肠杆菌JM109在含100mg/l氨苄青霉素的LB培养基中于30℃接种培养24小时。将1ml所得培养液接种在含50ml培养基(2g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸铵、3g/l磷酸二氢钾、1g/l磷酸氢二钾、0.5g/l七水硫酸镁和100mg/l氨苄青霉素)的500ml Sakaguchi摇瓶中，接着于25℃培养24小时，以获得培养的微生物细胞。
使用20g/dl蔗糖溶液通过渗透压休克法将培养的微生物细胞分级成周质组分和细胞质组分。将浸入20g/dl蔗糖溶液中的微生物细胞浸入5mM MgSO4水溶液中。离心的上清液叫做周质组分(“Pe”)。另外，离心的沉淀重悬浮，并进行超声波破碎。产物叫做细胞质组分(“Cy”)。将已知存在于细胞质中的葡糖6-磷酸脱氢酶活性用作指示剂，来证实细胞质已经分离。通过向反应溶液(含1mM葡糖6-磷酸、0.4mM NADP、10mM MgSO4和50mM Tris-Cl(pH8))中加入合适量的酶于30℃进行该检测，接着通过检测340nm吸光度检测NADPH的产生。
当将单独制备的无细胞提取物的活性定为100％时，图1显示了周质组分和细胞质组分中的酶量。周质组分没有混入葡糖6-磷酸脱氢酶活性，这表明周质组分没有与细胞质组分混合。周质组分回收约60％的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-甲酯(α-AMP)形成活性，证实正如使用Signal Pv1.1程序由氨基酸序列所预测的，Ala-Gln-形成酶分泌到周质中。
实施例7鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)来源的成肽酶基因的分离下文将阐述成肽酶基因的分离。使用鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)菌株FERM BP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日2002年7月22日)作为微生物。分离基因时，大肠杆菌DH5α用作宿主，而pUC118用作载体。
(1)微生物细胞的获得将鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)菌株FERM BP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日2002年7月22日)在CM2G琼脂培养基(含50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/l NaCl和20g/l琼脂，pH7.0)上于25℃培养24小时。将一菌环量所得微生物细胞接种入含50ml CM2G液体培养基(不含琼脂的前述培养基)的500ml Sakaguchi摇瓶中，接着于25℃振荡培养。
(2)微生物细胞中染色体DNA的获得离心(12,000rpm，4℃，15分钟)50ml培养液收集微生物细胞。然后，使用QIAGEN Genomic-Tip System(QIAGEN)，根据其说明书中描述的步骤，由微生物细胞获得染色体DNA。
(3)通过PCR获得探针DNA片段使用LA-Taq(Takara Shuzo生产)，通过PCR法获得含部分短稳杆菌(Empedobacter brevis)菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址ChuoDai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏物转移日2002年7月8日)来源的成肽酶基因的DNA片段。然后使用具有SEQ ID NO3和4碱基序列的引物，对由短稳杆菌(Empedobacter brevis)菌株FERM BP-8113(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏物转移日2002年7月8日)获得的染色体DNA进行PCR反应。
在以下条件下，使用Takara PCR热循环仪-PERSONAL(TakaraShuzo)进行30个循环的PCR反应。
94℃30秒52℃1分钟72℃1分钟反应完成后，用3μl反应液上0.8％琼脂糖电泳。结果证实扩增约1.5kb的DNA片段。
(4)由基因文库克隆成肽酶基因为了获得全长成肽酶基因，使用在前述PCR步骤中扩增的DNA片段作为探针进行DNA杂交。DNA杂交的操作阐述于分子克隆，第2版，Cold Spring Harbor Press(1989)。
通过0.8％琼脂糖电泳分离前述PCR步骤扩增的约1.5kb DNA片段。然后切出目标条带并纯化。使用DIG High Prime(Boehringer-Mannheim生产)，根据其说明书描述的方法，用探针地高辛标记该DNA片段。
使本发明实施例7步骤(2)获得的鞘氨醇杆菌种(Sphingobacteriumsp.)染色体DNA与限制酶SacI于37℃反应16小时，以完全消化所述DNA，之后产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。将电泳的染色体DNA由电泳后的琼脂糖凝胶转印至带正电尼龙滤膜(Roche Diagnostics生产)上，接着进行包括碱变性、中和和固定化的处理。使用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)进行杂交。滤膜于37℃预杂交1小时后，加入如上所述制备的地高辛标记探针，于37℃杂交16小时。随后，用含0.1％SDS的1×SSC于60℃漂洗滤膜两次。
使用DIG核苷酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim)，根据其说明书中描述的步骤，检测与所述探针杂交的条带。结果成功检测到与所述探针杂交的大约为3kb的条带。
用SacI完全消化5μg本发明实施例7步骤(2)制备的染色体DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离约3kb的DNA，使用Gene CleanII试剂盒(Funakoshi生产)纯化DNA，将DNA溶解在10μl TE中。然后将4μl所得溶液与pUC118混合，使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo生产)进行连接反应，其中所述pUC118混合前用碱性磷酸酶(大肠杆菌C75)于37℃处理30分钟，再于50℃处理30分钟，与SacI于37℃反应16小时以完全消化。混合5μl该连接反应液和100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞(Takara Shuzo生产)，以转化大肠杆菌。然后将其涂布在合适的固体培养基上创建染色体DNA文库。
为获得全长成肽酶基因，使用前述探针通过菌落杂交筛选染色体DNA文库。菌落杂交的步骤阐述于分子克隆，第2版，Cold SpringHarbor Press(1989)。
将染色体DNA文库的菌落转移至尼龙滤膜(用于菌落和噬菌斑杂交的尼龙膜，Roche Diagnostics生产)上，接着进行包括碱变性、中和和固定化的处理。使用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)进行杂交。滤膜于37℃预杂交1小时后，加入前述地高辛标记探针，接着于37℃杂交16小时。随后，用含0.1％SDS的1×SSC于60℃漂洗滤膜两次。
使用DIG核苷酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据其说明书中描述的使用说明，检测与所述标记探针杂交的菌落。结果证实菌落中有六个菌株与标记探针杂交。
(5)鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)来源的成肽酶基因的碱基序列使用Wizard Plus Minipreps DNA纯化系统(Promega生产)，由证实与标记探针杂交的六株微生物细胞制备大肠杆菌DH5α具有的质粒，以确定与所述探针发生杂交的部分及附近的碱基序列。使用CEQDTCS-Quick Start试剂盒(Beckman-Coulter生产)，根据其说明书描述的方法进行测序反应。另外，使用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生产)进行电泳。
结果揭示编码成肽酶的可读框确实存在。鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)来源的成肽酶基因的全长碱基序列以及对应的氨基酸序列示于SEQ ID NO11。鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)来源的成肽酶在氨基酸序列水平上与短稳杆菌(Empedobacter brevis)来源的成肽酶63.5％同源(用BLASTP程序测定)。
(6)鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)来源的成肽酶基因在大肠杆菌中的表达使用鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)菌株FERM BP-8124(保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏机构地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，国际保藏日2002年7月22日)的染色体DNA作为模板，使用SEQ ID NO13和14中列出的寡核苷酸作为引物，通过PCR扩增目标基因。用NdeI/XbaI处理此DNA片段，将获得的DNA片段与pTrpT的NdeI/XbaI处理产物连接。然后用此连接溶液转化大肠杆菌JM109，由氨苄青霉素抗性菌株中选择具有目标质粒的菌株。将该质粒命名为pTrpT_Sm_aet。
将一菌环量具有pTrpT_Sm_aet的大肠杆菌JM109接种入含3ml培养基(2g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸铵、3g/l磷酸二氢钾、1g/l磷酸氢二钾、0.5g/l七水硫酸镁和100mg/l氨苄青霉素)的普通试管中，于25℃培养20小时。培养液的α-AMP产生活性为0.53U/ml，证实大肠杆菌表达克隆基因。而且，作为对照的仅含pTrpT的转化体未检测到活性。
信号序列的预测在用Signal Pv1.1程序(Protein Engineering，Vol.12，No.1，3-9页，1999)分析序列表所述SEQ ID NO12的氨基酸序列时，预测氨基酸序数1-20起分泌入周质中的信号作用，而估计成熟蛋白位于氨基酸序数21的下游。
信号序列的证实将一菌环量具有pTrpT_Sm_aet的大肠杆菌JM109接种入含50ml培养基(2g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸铵、3g/l磷酸二氢钾、1g/l磷酸氢二钾、0.5g/l七水硫酸镁和100mg/l氨苄青霉素)的普通试管中，于25℃主培养20小时。
在下文中，离心分离后的步骤或者于冰上或者于4℃进行。培养完成后，通过离心将微生物细胞与培养液分离，用100mM磷酸盐缓冲液(pH7)清洗，然后悬浮在相同缓冲液中。然后，以195W对微生物细胞进行20分钟超声波破碎处理，离心(12,000rpm，30分钟)超声波破碎液，以去除破碎的细胞碎片，获得可溶组分。将所得可溶组分上样于用100mM磷酸盐缓冲液(pH7)预平衡的CHT-II柱(Biorad生产)，用500mM磷酸盐缓冲液以线性浓度梯度洗脱酶。将活性组分与5倍体积的2M硫酸铵和100mM磷酸盐缓冲液混合，所得溶液上样于用2M硫酸铵和100mM磷酸盐缓冲液预平衡的Resource-PHE柱(Amersham生产)，用2-0M硫酸铵以线性浓度梯度洗脱酶，获得活性组分溶液。证实这些步骤生产的所述成肽酶是电泳均一纯的。
当使用Edman降解法测定前述成肽酶的氨基酸序列时，获得SEQID NO15的氨基酸序列，证实正如使用Signal Pv1.1程序所预测的，成熟蛋白位于氨基酸序数21的下游。
实施例8解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)IFO 12017来源的成肽酶基因的分离下文将阐述成肽酶基因的分离。使用的微生物是解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)IFO 12017(保藏机构大阪发酵研究所，保藏机构地址2-17-85 Jusanbon-cho，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)。分离基因时，大肠杆菌JM109用作宿主，pUC118用作载体。
(1)微生物细胞的获得将解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)IFO 12017(保藏机构大阪发酵研究所，保藏机构地址2-17-85 Jusanbon-cho，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)在CM2G琼脂培养基(含50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/lNaCl和20g/l琼脂，pH7.0)上于25℃培养24小时。将一菌环量所得微生物细胞接种入含50mlCM2G液体培养基(不含琼脂的前述培养基)的500ml Sakaguchi摇瓶中，接着于25℃振荡培养。
(2)微生物细胞中染色体DNA的获得离心50ml培养液(12,000rpm，4℃，15分钟)收集微生物细胞。然后，使用QIAGEN Genomic-Tip System(QIAGEN)，根据其说明书中描述的步骤，由微生物细胞获得染色体DNA。
(3)通过PCR获得探针DNA片段使用LA-Taq(Takara Shuzo生产)，通过PCR法获得含部分解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)IFO 12017(保藏机构大阪发酵研究所，保藏机构地址2-17-85 Jusanbon-cho，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)来源的成肽酶基因的DNA片段。然后使用具有SEQ ID NO15和16碱基序列的引物，对由解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)IFO 12017(保藏机构大阪发酵研究所，保藏机构地址2-17-85Jusanbon-cho，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)获得的染色体DNA进行PCR反应。通过0.8％琼脂糖电泳分离由PCR法扩增的约1kb DNA片段。然后切出目标条带并纯化。使用DIG High Prime(Boehringer-Mannheim生产)，根据其说明书描述的方法，用探针地高辛标记DNA片段。
(4)由基因文库克隆成肽酶基因为获得全长成肽酶基因，使用在前述PCR步骤中扩增的DNA片段作为探针进行DNA杂交。DNA杂交的操作阐述于分子克隆，第2版，Cold Spring Harbor Press(1989)。
使解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)IFO 12017(保藏机构大阪发酵研究所，保藏机构地址2-17-85 Jusanbon-cho，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)的染色体DNA与限制酶HindIII于37℃反应16小时，以完全消化所述DNA，之后产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。将电泳的染色体DNA由电泳后的琼脂糖凝胶转印至带正电尼龙滤膜(Roche Diagnostics生产)上，接着进行包括碱变性、中和和固定化的处理。使用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)进行杂交。滤膜于50℃预杂交1小时后，加入如上所述制备的地高辛标记探针，于50℃杂交16小时。随后，用含0.1％SDS的1×SSC于60℃漂洗滤膜两次。
使用DIG核苷酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim)，根据其说明书中描述的步骤，检测与所述探针杂交的条带。结果成功检测到与所述探针杂交的条带大约为5kb。
用HindIII完全消化5μg解肝磷脂土地杆菌(Pedobacterheparinus)IFO 12017染色体DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离约5kb的DNA，使用Gene Clean II试剂盒(Funakoshi生产)纯化DNA，将DNA溶解在10μl TE中。然后将4μl所得溶液与pUC118HindIII/BAP混合，使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo生产)进行连接反应。混合5μl该连接反应液和100μl大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuzo生产)，以转化大肠杆菌。然后将其涂布在合适的固体培养基上创建染色体DNA文库。
为获得全长成肽酶基因，使用前述探针通过菌落杂交筛选染色体DNA文库。菌落杂交的步骤阐述于分子克隆，第2版，Cold SpringHarbor Press(1989)。
将染色体DNA文库的菌落转移至尼龙滤膜(用于菌落和噬菌斑杂交的尼龙膜，Roche Diagnostics生产)上，接着进行碱变性、中和和固定化处理。使用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)进行杂交。滤膜于37℃预杂交1小时后，加入前述地高辛标记探针，接着于37℃杂交16小时。随后，用含0.1％SDS的1×SSC于60℃漂洗滤膜两次。
使用DIG核苷酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据其说明书中描述的使用说明，检测与所述标记探针杂交的菌落。结果观察到有一个菌株其菌落与标记探针杂交。
(5)解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)IFO 12017来源的成肽酶基因的碱基序列由证实与标记探针杂交的菌落制备大肠杆菌JM109具有的质粒，并测定与所述探针发生杂交的部分及附近的碱基序列。使用CEQDTCS-Quick Start试剂盒(Beckman-Coulter生产)，根据其说明书描述的方法进行测序反应。另外，使用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生产)进行电泳。
结果揭示编码成肽酶的可读框确实存在。解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)IFO 12017(保藏机构大阪发酵研究所；2-17-85 Jusanbon-cho，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)来源的成肽酶基因的全长碱基序列以及对应的氨基酸序列示于SEQ ID NO17。
实施例9解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)IFO 12017来源的成肽酶基因在大肠杆菌中的表达使用解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)IFO 12017(保藏机构大阪发酵研究所；2-17-85 Jusanbon-cho，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)的染色体DNA作为模板，SEQ ID NO19和20列出的寡核苷酸作为引物，通过PCR扩增目标基因。用NdeI/HindIII处理此DNA片段，将获得的DNA片段与pTrpT的NdeI/HindIII处理产物连接。然后用此转化溶液转化大肠杆菌JM109，由氨苄青霉素抗性菌株中选择具有目标质粒的菌株。该质粒命名为pTrpT_Ph_aet。
将一菌环量具有pTrpT_Ph_aet的大肠杆菌JM109接种入含3ml培养基(2g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸铵、3g/l磷酸二氢钾、1g/l磷酸氢二钾、0.5g/l七水硫酸镁和100mg/l氨苄青霉素)的普通试管中，于25℃主培养20小时。培养液的α-AMP产生活性为0.01U/ml，由此证实了大肠杆菌表达克隆基因。而且，作为对照的仅导入pTrpT的转化体未检测到活性。
实施例10整形杆菌(Taxeobacter gelupurpurascens)DSMZ 11116来源的成肽酶基因的分离下文将阐述成肽酶基因的分离。使用的微生物是整形杆菌(Taxeobacter gelupurpurascens)DSMZ 11116(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)。分离基因时，大肠杆菌JM109用作宿主，pUC118用作载体。
(1)微生物细胞的获得将整形杆菌(Taxeobacter gelupurpurascens)DSMZ 11116(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址MascheroderWeg 1b，38124 Braunschweig，Germany)在CM2G琼脂培养基(含50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/l NaCl和20g/l琼脂，pH7.0)上于25℃培养24小时。将一菌环量所得微生物细胞接种入含50ml CM2G液体培养基(不含琼脂的前述培养基)的500ml Sakaguchi摇瓶中，接着于25℃振荡培养。
(2)微生物细胞中染色体DNA的获得离心(12,000rpm，4℃，15分钟)50ml培养液收集微生物细胞。然后，使用QIAGEN Genomic-Tip System(QIAGEN)，根据其说明书中描述的步骤，由微生物细胞获得染色体DNA。
(3)通过PCR获得探针DNA片段使用LA-Taq(Takara Shuzo生产)，通过PCR法获得含部分整形杆菌(Taxeobacter gelupurpurascens)DSMZ 11116(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，Germany)来源的成肽酶基因的DNA片段。然后使用具有SEQ ID NO21和16碱基序列的引物，对由整形杆菌(Taxeobacter gelupurpurascens)DSMZ 11116(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)获得的染色体DNA进行PCR反应。通过0.8％琼脂糖电泳分离由PCR法扩增的约1kb DNA片段。然后切出目标条带并纯化。使用DIG High Prime(Boehringer-Mannheim生产)，根据其说明书描述的方法，用探针地高辛标记DNA片段。
(4)由基因文库克隆成肽酶基因为获得全长成肽酶基因，使用在前述PCR步骤中扩增的DNA片段作为探针进行DNA杂交。DNA杂交的操作阐述于分子克隆，第2版，Cold Spring Harbor Press(1989)。
使整形杆菌(Taxeobacter gelupurpurascens)DSMZ 11116(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址MascheroderWeg 1b，38124 Braunschweig，Germany)的染色体DNA与限制酶PstI于37℃反应16小时，以完全消化所述DNA，之后产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。将电泳的染色体DNA由电泳后的琼脂糖凝胶转印至带正电尼龙滤膜(Roche Diagnostics生产)上，接着进行包括碱变性、中和和固定化的处理。使用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)进行杂交。滤膜于50℃预杂交1小时后，加入如上所述制备的地高辛标记探针，于50℃杂交16小时。随后，用含0.1％SDS的1×SSC于60℃漂洗滤膜两次。
使用DIG核苷酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim)，根据其说明书中描述的步骤，检测与所述探针杂交的条带。结果成功检测到与所述探针杂交的大约为5kb的条带。
用PstI完全消化5μg整形杆菌(Taxeobacter gelupurpurascens)DSMZ 11116(保藏机构德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏机构地址Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，Germany)染色体DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离约5kb的DNA，使用GeneClean II试剂盒(Funakoshi生产)纯化DNA，将DNA溶解在10μl TE中。然后将4μl所得溶液与pUC118 PstI/BAP(Takara Shuzo生产)混合，使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo生产)进行连接反应。混合5μl该连接反应液和100μl大肠杆菌JM109感受态细胞(TakaraShuzo生产)，以转化大肠杆菌。然后将其涂布在合适的固体培养基上创建染色体DNA文库。
为获得全长成肽酶基因，使用前述探针通过菌落杂交筛选染色体DNA文库。菌落杂交的步骤阐述于分子克隆，第2版，Cold SpringHarbor Press(1989)。
将染色体DNA文库的菌落转移至尼龙滤膜(用于菌落和噬菌斑杂交的尼龙膜)(Roche Diagnostics生产)上，接着进行碱变性、中和和固定化处理。使用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)进行杂交。滤膜于37℃预杂交1小时后，加入前述地高辛标记探针，接着于37℃杂交16小时。随后，用含0.1％SDS的1×SSC于60℃漂洗滤膜。
使用DIG核苷酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据其说明书中描述的使用说明，检测与所述标记探针杂交的菌落。结果观察到有一个菌株其菌落与标记探针杂交。
(5)整形杆菌(Taxeobacter gelupurpurascens)DSMZ 11116来源的成肽酶基因的碱基序列由证实与标记探针杂交的菌株制备大肠杆菌JM109具有的质粒，并测定与所述探针发生杂交的部分及附近的碱基序列。使用CEQDTCS-Quick Start试剂盒(Beckman-Coulter生产)，根据其说明书描述的方法进行测序反应。另外，使用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生产)进行电泳。
结果揭示编码成肽酶的可读框确实存在。整形杆菌(Taxeobactergelupurpurascens)DSMZ 11116来源的成肽酶基因的全长碱基序列以及对应的氨基酸序列示于SEQ ID NO22。
实施例11海圆杆菌(Cyclobacterium marinum)ATCC 25205来源的成肽酶基因的分离下文将阐述成肽酶基因的分离。使用的微生物是海圆杆菌(Cyclobacterium marinum)ATCC 25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，theUnited States of America)。分离基因时，大肠杆菌JM109用作宿主，pUC118用作载体。
(1)微生物细胞的获得将海圆杆菌(Cyclobacterium marinum)ATCC 25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)在CM2G琼脂培养基(含50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/l NaCl和20g/l琼脂，pH7.0)上于25℃培养24小时。将一菌环量所得微生物细胞接种入含50ml CM2G液体培养基(不含琼脂的前述培养基)的500ml Sakaguchi摇瓶中，接着于25℃振荡培养。
(2)微生物细胞中染色体DNA的获得离心(12,000rpm，4℃，15分钟)50ml培养液收集微生物细胞。然后，使用QIAGEN Genomic-Tip System(QIAGEN)，根据其说明书中描述的步骤，由微生物细胞获得染色体DNA。
(3)通过PCR获得探针DNA片段使用LA-Taq(Takara Shuzo生产)，通过PCR法获得含部分海圆杆菌(Cyclobacterium marinum)ATCC 25205来源的成肽酶基因的DNA片段。然后使用具有SEQ ID NO15和16碱基序列的引物，对由海圆杆菌(Cyclobacterium marinum)ATCC 25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA20110，the United States of America)获得的染色体DNA进行PCR反应。通过0.8％琼脂糖电泳分离由PCR法扩增的约1kb DNA片段。然后切出目标条带并纯化。使用DIG High Prime(Boehringer-Mannheim生产)，根据其说明书描述的方法，用探针地高辛标记DNA片段。
(4)由基因文库克隆成肽酶基因为获得全长成肽酶基因，使用在前述PCR步骤中扩增的DNA片段作为探针进行DNA杂交。DNA杂交的操作阐述于分子克隆，第2版，Cold Spring Harbor Press(1989)。
使海圆杆菌(Cyclobacterium marinum)ATCC 25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)的染色体DNA与限制酶PstI或HincII于37℃反应16小时，以完全消化所述DNA，之后产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。将电泳的染色体DNA由电泳后的琼脂糖凝胶转印至带正电尼龙滤膜(Roche Diagnostics生产)上，接着进行包括碱变性、中和和固定化的处理。使用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)进行杂交。滤膜于50℃预杂交1小时后，加入如上所述制备的地高辛标记探针，于50℃杂交16小时。随后，用含0.1％SDS的1×SSC于60℃漂洗滤膜两次。
使用DIG核苷酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim)，根据其说明书中描述的步骤，检测与所述探针杂交的条带。结果成功检测到PstI消化产物中与所述探针杂交的7kb条带，并成功检测到HincII消化产物中与所述探针杂交的2kb条带。
用PstI或HincII完全消化5μg海圆杆菌(Cyclobacterium marinum)ATCC 25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)染色体DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离约7kb或2kb的DNA。使用Gene Clean II试剂盒(Funakoshi生产)纯化DNA，将DNA溶解在10μl TE中。将4μl所得溶液与pUC118 PstI/BAP(Takara Shuzo生产)或pUC118 HincII/BAP(Takara Shuzo生产)混合，使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo生产)进行连接反应。混合5μl该连接反应液和100μl大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuzo生产)，以转化大肠杆菌。然后将其涂布在合适的固体培养基上创建染色体DNA文库。
为获得全长成肽酶基因，使用前述探针通过菌落杂交筛选染色体DNA文库。菌落杂交的步骤阐述于分子克隆，第2版，Cold SpringHarbor Press(1989)。
将染色体DNA文库的菌落转移至尼龙滤膜(用于菌落和噬菌斑杂交的尼龙膜)(Roche Diagnostics生产)上，接着进行碱变性、中和和固定化处理。使用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)进行杂交。滤膜于37℃预杂交1小时后，加入前述地高辛标记探针，接着于37℃杂交16小时。随后，用含0.1％SDS的1×SSC于60℃漂洗滤膜两次。
使用DIG核苷酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据其说明书中描述的使用说明，检测与所述标记探针杂交的菌落。结果观察到各有一个菌株其菌落与标记探针杂交。
(5)海圆杆菌(Cyclobacterium marinum)ATCC 25205来源的成肽酶基因的碱基序列由证实与标记探针杂交的各个菌株制备大肠杆菌JM109具有的质粒，并测定与所述探针发生杂交的部分及附近的碱基序列。使用CEQ DTCS-Quick Start试剂盒(Beckman-Coulter生产)，根据其说明书描述的方法进行测序反应。另外，使用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生产)进行电泳。
结果揭示编码成肽酶的可读框确实存在。海圆杆菌(Cyclobacterium marinum)ATCC 25205(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，theUnited States of America)来源的成肽酶基因的全长碱基序列以及对应的氨基酸序列示于SEQ ID NO24。
实施例12
伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpens burtonensis)ATCC 700359来源的成肽酶基因的分离下文将阐述成肽酶基因的分离。使用的微生物是伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpens burtonensis)ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，theUnited States of America)。分离基因时，大肠杆菌JM109用作宿主，pUC118用作载体。
(1)微生物细胞的获得将伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpens burtonensis)ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)在CM2G琼脂培养基(含50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/l NaCl和20g/l琼脂，pH7.0)上于25℃培养24小时。将一菌环量所得微生物细胞接种入含50ml CM2G液体培养基(不含琼脂的前述培养基)的500ml Sakaguchi摇瓶中，接着于10℃振荡培养。
(2)微生物细胞中染色体DNA的获得离心(12,000rpm，4℃，15分钟)50ml培养液收集微生物细胞。然后，使用QIAGEN Genomic-Tip System(QIAGEN)，根据其说明书中描述的步骤，由微生物细胞获得染色体DNA。
(3)通过PCR获得探针DNA片段使用LA-Taq(Takara Shuzo生产)，通过PCR法获得含部分伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpens burtonensis)ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA20110，the United States of America)来源的成肽酶基因的DNA片段。然后使用具有SEQ ID NO15和16碱基序列的引物，对由伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpens burtonensis)ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)获得的染色体DNA进行PCR反应。通过0.8％琼脂糖电泳分离由PCR法扩增的约1kb DNA片段。然后切出目标条带并纯化。使用DIG High Prime(Boehringer-Mannheim生产)，根据其说明书描述的方法，用探针地高辛标记DNA片段。
(4)由基因文库克隆成肽酶基因为获得全长成肽酶基因，使用在前述PCR步骤中扩增的DNA片段作为探针进行DNA杂交。DNA杂交的操作阐述于分子克隆，第2版，Cold Spring Harbor Press(1989)。
使伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpens burtonensis)ATCC 700359的染色体DNA与限制酶EcoRI于37℃反应16小时，以完全消化所述DNA，之后产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。将电泳的染色体DNA由电泳后的琼脂糖凝胶转印至带正电尼龙滤膜(Roche Diagnostics生产)上，接着进行包括碱变性、中和和固定化的处理。使用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)进行杂交。滤膜于50℃预杂交1小时后，加入如上所述制备的地高辛标记探针，于50℃杂交16小时。随后，用含0.1％SDS的1×SSC于60℃漂洗滤膜两次。
使用DIG核苷酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim)，根据其说明书中描述的步骤，检测与所述探针杂交的条带。结果成功检测到与所述探针杂交的大约为7kb的条带。
用EcoRI完全消化5μg伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpensburtonensis)ATCC 700359染色体DNA。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离约7kb的DNA，使用Gene Clean II试剂盒(Funakoshi生产)纯化DNA，将DNA溶解在10μl TE中。然后将4μl所得溶液与pUC118EcoRI/BAP(Takara Shuzo生产)混合，使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo生产)进行连接反应。混合5μl该连接反应液和100μl大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuzo生产)，以转化大肠杆菌。然后将其涂布在合适的固体培养基上创建染色体DNA文库。
为获得全长成肽酶基因，使用前述探针通过菌落杂交筛选染色体DNA文库。菌落杂交的步骤阐述于分子克隆，第2版，Cold SpringHarbor Press(1989)。
将染色体DNA文库的菌落转移至尼龙滤膜(用于菌落和噬菌斑杂交的尼龙膜)(Roche Diagnostics生产)上，接着进行碱变性、中和和固定化处理。使用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生产)进行杂交。滤膜于37℃预杂交1小时后，加入前述地高辛标记探针，接着于37℃杂交16小时。随后，用含0.1％SDS的1×SSC于60℃漂洗滤膜两次。
使用DIG核苷酸检测试剂盒(Boehringer-Mannheim生产)，根据其说明书中描述的使用说明，检测与所述标记探针杂交的菌落。结果观察到有一个菌株其菌落与标记探针杂交。
(5)伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpens burtonensis)ATCC 700359来源的成肽酶基因的碱基序列由证实与标记探针杂交的菌株制备大肠杆菌JM109具有的质粒，并测定与所述探针发生杂交的部分及附近的碱基序列。使用CEQDTCS-Quick Start试剂盒(Beckman-Coulter生产)，根据其说明书描述的方法进行测序反应。另外，使用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生产)进行电泳。
结果揭示编码成肽酶的可读框确实存在。伯顿湖冷蛇菌(psychroserpens burtonensis)ATCC 700359(保藏机构美国典型培养物保藏中心，保藏机构地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，theUnited States of America)来源的成肽酶基因的全长碱基序列连同对应的氨基酸序列一起示于SEQ ID NO26。
尽管以具体实施方案阐述了本发明，以完整清晰地公开，但所附权利要求并没有因此受限，而是应看作是包括本领域技术人员可实施的所有修改和变化方案，这些修改和变化方案完全属于本文所提出的基本理论。
序列表独立文本
SEQ ID NO3合成引物1SEQ ID NO4合成引物2SEQ ID NO5成肽酶编码基因SEQ ID NO7用于制备pTrpT的合成引物SEQ ID NO8用于制备pTrpT的合成引物SEQ ID NO9用于制备pTrpT_Gtg2的合成引物SEQ ID NO10用于制备pTrpT_Gtg2的合成引物SEQ ID NO11成肽酶编码基因SEQ ID NO13用于制备pTrpT_Sm_aet的合成引物SEQ ID NO14用于制备pTrpT_Sm_aet的合成引物SEQ ID NO15用于Aet的混合引物1SEQ ID NO16用于Aet的混合引物2SEQ ID NO19用于构建土地杆菌属(Pedobacter)来源的aet表达载体的引物1SEQ ID NO20用于构建土地杆菌属(Pedobacter)来源的aet表达载体的引物2SEQ ID NO21用于Aet的混合引物3
序列表<110>味之素株式会社(AJINOMOTO CO.LTD.)<120>α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的生产方法和α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯的生产方法<130>PAMA-15899<150>JP2003-016764<151>2003-01-24<150>JP2003-201819<151>2003-07-25<150>US60/491,546<151>2003-08-01<160>27<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>9<212>PRT<213>短稳杆菌(Empedobacter brevis)<220>
<223>发明人横关健三(YOKOZEKI，Kenzo)发明人大野绫子(OHNO，Ayako)发明人原诚一(HARA，Seiichi)发明人阿部巧(ABE，Isao)<400>1Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Gln Pro Lys1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>短稳杆菌(Empedobacter brevis)<400>2Thr Asn Val Thr Tyr Thr Met Pro Asp1 5
<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成引物1<400>3ttyacngcna thtaycarcc 20<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成引物2<400>4tcnggcatng trtangtnac rtt 23<210>5<211>2024<212>DNA<213>短稳杆菌(Empedobacter brevis)<220>
<221>CDS<222>(61)..(1908)<223>成肽酶编码基因<400>5atttcttaat aaaaactgaa atcttaatac atttatacta tcgtaaaatt tattgaacac 60gtg aaa aaa tta aca tta aaa gta act cta ctt aca ctt ttg ttg gga 108Val Lys Lys Leu Thr Leu Lys Val Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Gly1 5 10 15agt aca gtt gga ttt gcg caa gat gca aaa gca gat tct gct tat gtg 156Ser Thr Val Gly Phe Ala Gln Asp Ala Lys Ala Asp Ser Ala Tyr Val20 25 30cgc gac aat tac gaa aaa ata gaa caa gta att ccg atg cgc gat ggt 204Arg Asp Asn Tyr Glu Lys Ile Glu Gln Val Ile Pro Met Arg Asp Gly35 40 45
aca aag tta ttt aca gct att tat cag cca aaa gat aaa aca aaa caa252Thr Lys Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Gln Pro Lys Asp Lys Thr Lys Gln50 55 60tat ccc gtt ttg tta aat cgt acg cct tat aca gtt gcg cct tat ggt300Tyr Pro Val Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Val Ala Pro Tyr Gly65 70 75 80gta aat gaa tac aag aaa tcg tta gga aat ttt cct aca gaa atg cgc 348Val Asn Glu Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Thr Glu Met Arg85 90 95gaa ggt ttt att ttt gtt tac caa gat gtg aga gga aaa tgg atg agc396Glu Gly Phe Ile Phe Val Tyr Gln Asp Val Arg Gly Lys Trp Met Ser100 105 110gaa ggc gaa ttt gaa gat gtt cga cct ata aat cct tca aaa agt aaa444Glu Gly Glu Phe Glu Asp Val Arg Pro Ile Asn Pro Ser Lys Ser Lys115 120 125aag gca att gac gaa agc aca gat aca ttt gat acg cta gaa tgg ctt492Lys Ala Ile Asp Glu Ser Thr Asp Thr Phe Asp Thr Leu Glu Trp Leu130 135 140gct aaa aac ttg aag aat tac acg aaa aaa gct gga att tat gga att540Ala Lys Asn Leu Lys Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Gly Ile Tyr Gly Ile145 150 155 160tcg tat cct ggt ttt tat tcg aca atg agt ttg gtt aat tcg cat cca588Ser Tyr Pro Gly Phe Tyr Ser Thr Met Ser Leu Val Asn Ser His Pro165 170 175act cta aaa gcc gtt tcg cca caa gcg ccc gtt acc aat tgg ttt tta636Thr Leu Lys Ala Val Ser Pro Gln Ala Pro Val Thr Asn Trp Phe Leu180 185 190ggt gac gat ttt cat cat aat gga gtt tta ttc ttg aat gat tct ttc684Gly Asp Asp Phe His His Asn Gly Val Leu Phe Leu Asn Asp Ser Phe195 200 205tca ttt atg act ttt ttt ggt gta aaa cgt ccg caa cca att acg cca732Ser Phe Met Thr Phe Phe Gly Val Lys Arg Pro Gln Pro Ile Thr Pro210 215 220gat aaa ggt ccg aaa cgt ttt gaa tat cca ata aaa gat aat tat aga780Asp Lys Gly Pro Lys Arg Phe Glu Tyr Pro Ile Lys Asp Asn Tyr Arg225 230 235 240
ttt tat gca agt ggc tct gta aaa gag ttg aaa gat aaa tat ttg caa828Phe Tyr Ala Ser Gly Ser Val Lys Glu Leu Lys Asp Lys Tyr Leu Gln245 250 255gat aat atc aag ttt tac aat gat tta ttt gcg cat cca gat tac gat876Asp Asn Ile Lys Phe Tyr Asn Asp Leu Phe Ala His Pro Asp Tyr Asp260 265 270caa ttt tgg caa gat cgt aat gtt tta cca cat tta act aac gtg caa924Gln Phe Trp Gln Asp Arg Asn Val Leu Pro His Leu Thr Asn Val Gln275 280 285cct gct gta atg acg gtt gga ggt ttt ttt gat gca gaa gat gtc tac972Pro Ala Val Met Thr Val Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Val Tyr290 295 300ggc gct ttc gaa acg tat aaa gca att gag aaa caa aat ccg aaa gca1020Gly Ala Phe Glu Thr Tyr Lys Ala Ile Glu Lys Gln Asn Pro Lys Ala305 310 315 320aca aat att atg gtt gcc gga cct tgg ttt cat ggt ggt tgg gtt cgt1068Thr Asn Ile Met Val Ala Gly Pro Trp Phe His Gly Gly Trp Val Arg325 330 335agc aac gga agt act ttt gga gat atg caa ttt gca tcg aat aca agt1116Ser Asn Gly Ser Thr Phe Gly Asp Met Gln Phe Ala Ser Asn Thr Ser340 345 350gag cat tat cag caa gaa ata gaa ttg cct ttt ttt aat tat tac tta1164Glu His Tyr Gln Gln Glu Ile Glu Leu Pro Phe Phe Asn Tyr Tyr Leu355 360 365aaa gat aaa ggt aat ttt aaa cca acc gaa gct aca att ttt att acg1212Lys Asp Lys Gly Asn Phe Lys Pro Thr Glu Ala Thr Ile Phe Ile Thr370 375 380gga tct aac gaa tgg aaa caa ttt gat gct tgg cca cca aaa aat gta1260Gly Ser Asn Glu Trp Lys Gln Phe Asp Ala Trp Pro Pro Lys Asn Val385 390 395 400aca aca caa aaa att tat ttg caa caa aat ggt aaa ata gct ttt aat1308Thr Thr Gln Lys Ile Tyr Leu Gln Gln Asn Gly Lys Ile Ala Phe Asn405 410 415aaa acc aat aca aca act act ttt gac gaa tat gtt gca gat cca aat1356Lys Thr Asn Thr Thr Thr Thr Phe Asp Glu Tyr Val Ala Asp Pro Asn420 425 430tct cca gtt cct tat tca gga gga gtt tta gaa act cgt tca aga gaa1404
Ser Pro Val Pro Tyr Ser Gly Gly Val Leu Glu Thr Arg Ser Arg Glu435 440 445tat atg gtc gat gat caa cgc ttt gct tct act cgt cct gat gtt atg1452Tyr Met Val Asp Asp Gln Arg Phe Ala Ser Thr Arg Pro Asp Val Met450 455 460gtg tat caa tct gat att ttg aca gaa gat att acg ctt gct ggt cct1500Val Tyr Gln Ser Asp Ile Leu Thr Glu Asp Ile Thr Leu Ala Gly Pro465 470 475 480gtt atc aat cat tta gtg gtt tct act acg gga aca gac gct gat tat1548Val Ile Asn His Leu Val Val Ser Thr Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr485 490 495gtt gta aaa ttg att gat gtt tat cct gaa aac acg cca aaa ttt aat1596Val Val Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Glu Asn Thr Pro Lys Phe Asn500 505 510aac aaa tta atg gct gga tat caa aat ttg att cgt gca gaa att atg1644Asn Lys Leu Met Ala Gly Tyr Gln Asn Leu Ile Arg Ala Glu Ile Met515 520 525cgc gga aaa tat aga aat agt ttc tct aac ccc gaa gct atg gtt ccg1692Arg Gly Lys Tyr Arg Asn Ser Phe Ser Asn Pro Glu Ala Met Val Pro530 535 540aat aaa gaa aca aat gta acg tac acg atg cca gat gtt gga cat aca1740Asn Lys Glu Thr Asn Val Thr Tyr Thr Met Pro Asp Val Gly His Thr545 550 555 560ttt aag aaa gga cat cgc att atg att caa gtt cag aac agt tgg ttt1788Phe Lys Lys Gly His Arg Ile Met Ile Gln Val Gln Asn Ser Trp Phe565 570 575cct tta gca gat cgc aat ccg caa caa ttt atg aat gtt tac gaa gca1836Pro Leu Ala Asp Arg Asn Pro Gln Gln Phe Met Asn Val Tyr Glu Ala580 585 590act tct aaa gat tat tta aaa caa acg caa cga att tat cat act tct1884Thr Ser Lys Asp Tyr Leu Lys Gln Thr Gln Arg Ile Tyr His Thr Ser595 600 605tat atc gaa att ccg gta ttg aaa taacaaaaaa atccagctaa ttagctggat 1938Tyr Ile Glu Ile Pro Val Leu Lys610 615tttttttata atgttacttt tcctattttt cctttatttc caactaaaat tacatatttt 1998
ttatcgggcg aaaccgtaca agtatg 2024<210>6<211>616<212>PRT<213>短稳杆菌(Empedobacter brevis)<400>6Val Lys Lys Leu Thr Leu Lys Val Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Gly1 5 10 15Ser Thr Val Gly Phe Ala Gln Asp Ala Lys Ala Asp Ser Ala Tyr Val20 25 30Arg Asp Asn Tyr Glu Lys Ile Glu Gln Val Ile Pro Met Arg Asp Gly35 40 45Thr Lys Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Gln Pro Lys Asp Lys Thr Lys Gln50 55 60Tyr Pro Val Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Val Ala Pro Tyr Gly65 70 75 80Val Asn Glu Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Thr Glu Met Arg85 90 95Glu Gly Phe Ile Phe Val Tyr Gln Asp Val Arg Gly Lys Trp Met Ser100 105 110Glu Gly Glu Phe Glu Asp Val Arg Pro Ile Asn Pro Ser Lys Ser Lys115 120 125Lys Ala Ile Asp Glu Ser Thr Asp Thr Phe Asp Thr Leu Glu Trp Leu130 135 140Ala Lys Asn Leu Lys Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Gly Ile Tyr Gly Ile145 150 155 160Ser Tyr Pro Gly Phe Tyr Ser Thr Met Ser Leu Val Asn Ser His Pro165 170 175Thr Leu Lys Ala Val Ser Pro Gln Ala Pro Val Thr Asn Trp Phe Leu180 185 190Gly Asp Asp Phe His His Asn Gly Val Leu Phe Leu Asn Asp Ser Phe195 200 205Ser Phe Met Thr Phe Phe Gly Val Lys Arg Pro Gln Pro Ile Thr Pro
210 215 220Asp Lys Gly Pro Lys Arg Phe Glu Tyr Pro Ile Lys Asp Asn Tyr Arg225 230 235 240Phe Tyr Ala Ser Gly Ser Val Lys Glu Leu Lys Asp Lys Tyr Leu Gln245 250 255Asp Asn Ile Lys Phe Tyr Asn Asp Leu Phe Ala His Pro Asp Tyr Asp260 265 270Gln Phe Trp Gln Asp Arg Asn Val Leu Pro His Leu Thr Asn Val Gln275 280 285Pro Ala Val Met Thr Val Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Val Tyr290 295 300Gly Ala Phe Glu Thr Tyr Lys Ala Ile Glu Lys Gln Asn Pro Lys Ala305 310 315 320Thr Asn Ile Met Val Ala Gly Pro Trp Phe His Gly Gly Trp Val Arg325 330 335Ser Asn Gly Ser Thr Phe Gly Asp Met Gln Phe Ala Ser Asn Thr Ser340 345 350Glu His Tyr Gln Gln Glu Ile Glu Leu Pro Phe Phe Asn Tyr Tyr Leu355 360 365Lys Asp Lys Gly Asn Phe Lys Pro Thr Glu Ala Thr Ile Phe Ile Thr370 375 380Gly Ser Asn Glu Trp Lys Gln Phe Asp Ala Trp Pro Pro Lys Asn Val385 390 395 400Thr Thr Gln Lys Ile Tyr Leu Gln Gln Asn Gly Lys Ile Ala Phe Asn405 410 415Lys Thr Asn Thr Thr Thr Thr Phe Asp Glu Tyr Val Ala Asp Pro Asn420 425 430Ser Pro Val Pro Tyr Ser Gly Gly Val Leu Glu Thr Arg Ser Arg Glu435 440 445Tyr Met Val Asp Asp Gln Arg Phe Ala Ser Thr Arg Pro Asp Val Met450 455 460Val Tyr Gln Ser Asp Ile Leu Thr Glu Asp Ile Thr Leu Ala Gly Pro465 470 475 480
Val Ile Asn His Leu Val Val Ser Thr Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr485 490 495Val Val Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Glu Asn Thr Pro Lys Phe Asn500 505 510Asn Lys Leu Met Ala Gly Tyr Gln Asn Leu Ile Arg Ala Glu Ile Met515 520 525Arg Gly Lys Tyr Arg Asn Ser Phe Ser Asn Pro Glu Ala Met Val Pro530 535 540Asn Lys Glu Thr Asn Val Thr Tyr Thr Met Pro Asp Val Gly His Thr545 550 555 560Phe Lys Lys Gly His Arg Ile Met Ile Gln Val Gln Asn Ser Trp Phe565 570 575Pro Leu Ala Asp Arg Asn Pro Gln Gln Phe Met Asn Val Tyr Glu Ala580 585 590Thr Ser Lys Asp Tyr Leu Lys Gln Thr Gln Arg Ile Tyr His Thr Ser595 600 605Tyr Ile Glu Ile Pro Val Leu Lys610 615<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于制备pTrpT的合成引物<400>7gtatcacgag gccctagctg tggtgtcatg gtcggtgatc 40<210>8<211>40<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述用于制备pTrpT的合成引物<400>8ttcggggatt ccatatgata ccctttttac gtgaacttgc40<210>9<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于制备pTrpT_Gtg2的合成引物<400>9gggaattcca tatgaaaaaa ttaacattaa aagtaact 38<210>10<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于制备pTrpT_Gtg2的合成引物<400>10gggggctgca gtacttgtac ggtttcgccc gataaa36<210>11<211>1935<212>DNA<213>鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)<220>
<221>CDS<222>(61)..(1917)<223>成肽酶基因<400>11gaaaccaagt gtaaaattat aatttacacc aaagaatgta ctgaacaaat aattatctga 60atg aaa aat aca att tcg tgc cta act tta gcg ctt tta agc gca agc 108Met Lys Asn Thr Ile Ser Cys Leu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Ala Ser1 5 10 15cag tta cat gct caa aca gct gcc gac tcg gct tat gtt aga gat cat 156
Gln Leu His Ala Gln Thr Ala Ala Asp Ser Ala Tyr Val Arg Asp His20 25 30tat gaa aag acc gaa gta gca att ccc atg cga gat ggg aaa aaa tta204Tyr Glu Lys Thr Glu Val Ala Ile Pro Met Arg Asp Gly Lys Lys Leu35 40 45ttt act gcg atc tac agt cca aaa gac aaa tcc aag aaa tat cca gtt252Phe Thr Ala Ile Tyr Ser Pro Lys Asp Lys Ser Lys Lys Tyr Pro Val50 55 60ttg ctc aat aga acg ccc tac acg gtt tca cct tat ggg cag aac gaa300Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Val Ser Pro Tyr Gly Gln Asn Glu65 70 75 80tat aaa aaa agc ttg gga aac ttt ccc caa atg atg cgt gaa ggc tat348Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Gln Met Met Arg Glu Gly Tyr85 90 95att ttc gtt tac cag gat gtc cgt ggc aag tgg atg agc gaa ggt gat396Ile Phe Val Tyr Gln Asp Val Arg Gly Lys Trp Met Ser Glu Gly Asp100 105 110ttt gaa gat ata cgt ccg acc acg tac agc aaa gat aaa aaa gca atc444Phe Glu Asp Ile Arg Pro Thr Thr Tyr Ser Lys Asp Lys Lys Ala Ile115 120 125gat gaa agt acg gat acc tat gat gcg ctt gaa tgg tta cag aaa aat492Asp Glu Ser Thr Asp Thr Tyr Asp Ala Leu Glu Trp Leu Gln Lys Asn130 135 140ctc aaa aac tat aat ggc aaa gcc ggg ctc tat ggg att tcc tat cca540Leu Lys Asn Tyr Asn Gly Lys Ala Gly Leu Tyr Gly Ile Ser Tyr Pro145 150 155 160ggc ttc tat tct acc gtc gga ttg gtc aaa aca cac ccg agc ttg aag588Gly Phe Tyr Ser Thr Val Gly Leu Val Lys Thr His Pro Ser Leu Lys165 170 175gca gtc tcc cca cag gct ccc gta aca gac tgg tat atc ggc gac gac636Ala Val Ser Pro Gln Ala Pro Val Thr Asp Trp Tyr Ile Gly Asp Asp180 185 190ttc cac cat aat ggc gta ttg ttt ctt cag gat gca ttt aca ttc atg684Phe His His Asn Gly Val Leu Phe Leu Gln Asp Ala Phe Thr Phe Met195 200 205
tca acc ttt ggt gtc cct cgt cca aaa ccc att aca ccg gat caa ttt732Ser Thr Phe Gly Val Pro Arg Pro Lys Pro Ile Thr Pro Asp Gln Phe210 215 220aag ggc aaa att cag atc aaa gaa gcc gat aaa tat aac ttt ttt gca780Lys Gly Lys Ile Gln Ile Lys Glu Ala Asp Lys Tyr Asn Phe Phe Ala225 230 235 240gaa gca gga aca gcg cgg gaa ctc aaa gaa aag tat ttt ggt gac tcc828Glu Ala Gly Thr Ala Arg Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Phe Gly Asp Ser245 250 255gta caa ttt tgg aat gac ctg ttt aag cat ccc gac tat gat gat ttt876Val Gln Phe Trp Asn Asp Leu Phe Lys His Pro Asp Tyr Asp Asp Phe260 265 270tgg aaa tcg cgt gtg atc acg aat tct tta cag gag gta aaa cca gct924Trp Lys Ser Arg Val Ile Thr Asn Ser Leu Gln Glu Val Lys Pro Ala275 280 285gtg atg gtg gtt ggt ggt ttc ttt gac gcg gaa gat gct tat gga aca972Val Met Val Val Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Ala Tyr Gly Thr290 295 300ttt aag acc tac caa tcg att gag gat aaa agc aaa aaa aac aac tcg1020Phe Lys Thr Tyr Gln Ser Ile Glu Asp Lys Ser Lys Lys Asn Asn Ser305 310 315 320att tta gtc gcg gga cct tgg tat cat ggc ggt tgg gtt cgt gca gaa1068Ile Leu Val Ala Gly Pro Trp Tyr His Gly Gly Trp Val Arg Ala Glu325 330 335gga aac tat tta ggt gat atc caa ttt gag aaa aaa acc agt att act1116Gly Asn Tyr Leu Gly Asp Ile Gln Phe Glu Lys Lys Thr Ser Ile Thr340 345 350tat cag gaa caa ttt gaa caa cca ttt ttc aaa tat tac cta aaa gat1164Tyr Gln Glu Gln Phe Glu Gln Pro Phe Phe Lys Tyr Tyr Leu Lys Asp355 360 365gaa gga aac ttc gcc cct tcc gaa gct aac att ttt gtt tca ggc agc1212Glu Gly Asn Phe Ala Pro Ser Glu Ala Asn Ile Phe Val Ser Gly Ser370 375 380aac gaa tgg aaa cat ttc gaa cag tgg cca cca aaa aat gta gag aca1260Asn Glu Trp Lys His Phe Glu Gln Trp Pro Pro Lys Asn Val Glu Thr385 390 395 400aaa aaa cta tac ttc caa cct cag ggg aaa ctt gga ttt gac aaa gtt1308
Lys Lys Leu Tyr Phe Gln Pro Gln Gly Lys Leu Gly Phe Asp Lys Val405 410 415caa cgt aca gat tcc tgg gat gaa tat gta aca gac cct aat aaa cct1356Gln Arg Thr Asp Ser Trp Asp Glu Tyr Val Thr Asp Pro Asn Lys Pro420 425 430gtt ccg cat caa ggt ggg gta att caa aac cga aca cgg gag tat atg1404Val Pro His Gln Gly Gly Val Ile Gln Asn Arg Thr Arg Glu Tyr Met435 440 445gta gat gat caa cgt ttc gcg gct agt cgc cct gat gtc atg gtt tat1452Val Asp Asp Gln Arg Phe Ala Ala Ser Arg Pro Asp Val Met Val Tyr450 455 460caa acg gaa ccg ttg acg gag gac ctg acg ata gta ggc cca atc aaa1500Gln Thr Glu Pro Leu Thr Glu Asp Leu Thr Ile Val Gly Pro Ile Lys465 470 475 480aac ttt ctc aaa gtt tct tca aca gga aca gac gcg gac tat gtt gtc1548Asn Phe Leu Lys Val Ser Ser Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr Val Val485 490 495aaa ctg att gac gtt tat ccg aat gat gca gca agt tat caa gga aaa1596Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Asn Asp Ala Ala Ser Tyr Gln Gly Lys500 505 510aca atg gct gga tat caa atg atg gta cgt ggt gag atc atg gcg ggg1644Thr Met Ala Gly Tyr Gln Met Met Val Arg Gly Glu Ile Met Ala Gly515 520 525aaa tac cga aat ggt ttc gat aaa gcg cag gcc ttg act cca ggt atg1692Lys Tyr Arg Asn Gly Phe Asp Lys Ala Gln Ala Leu Thr Pro Gly Met530 535 540gtc gaa aag gtg aat ttt gaa atg cca gac gtt gcg cat acc ttc aaa1740Val Glu Lys Val Asn Phe Glu Met Pro Asp Val Ala His Thr Phe Lys545 550 555 560aaa gga cat cgc att atg gtt cag gta caa aac tca tgg ttt ccg ctg1788Lys Gly His Arg Ile Met Val Gln Val Gln Asn Ser Trp Phe Pro Leu565 570 575gca gaa cga aat cca cag gtg ttt tta gca cct tat aca gct acc aaa1836Ala Glu Arg Asn Pro Gln Val Phe Leu Ala Pro Tyr Thr Ala Thr Lys580 585 590gct gat ttc cgc aaa gct acc caa cgt att ttt cac gat gtg aac aat1884Ala Asp Phe Arg Lys Ala Thr Gln Arg Ile Phe His Asp Val Asn Asn
595 600 605gcc aca tac atc gaa ttt tct gtc ctc aaa gat tagcaggtaa attcgaaa 1935Ala Thr Tyr Ile Glu Phe Ser Val Leu Lys Asp610 615<210>12<211>619<212>PRT<213>鞘氨醇杆菌种(Sphingobacterium sp.)<400>12Met Lys Asn Thr Ile Ser Cys Leu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Ala Ser1 5 10 15Gln Leu His Ala Gln Thr Ala Ala Asp Ser Ala Tyr Val Arg Asp His20 25 30Tyr Glu Lys Thr Glu Val Ala Ile Pro Met Arg Asp Gly Lys Lys Leu35 40 45Phe Thr Ala Ile Tyr Ser Pro Lys Asp Lys Ser Lys Lys Tyr Pro Val50 55 60Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Val Ser Pro Tyr Gly Gln Asn Glu65 70 75 80Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Gln Met Met Arg Glu Gly Tyr85 90 95Ile Phe Val Tyr Gln Asp Val Arg Gly Lys Trp Met Ser Glu Gly Asp100 105 110Phe Glu Asp Ile Arg Pro Thr Thr Tyr Ser Lys Asp Lys Lys Ala Ile115 120 125Asp Glu Ser Thr Asp Thr Tyr Asp Ala Leu Glu Trp Leu Gln Lys Asn130 135 140Leu Lys Asn Tyr Asn Gly Lys Ala Gly Leu Tyr Gly Ile Ser Tyr Pro145 150 155 160Gly Phe Tyr Ser Thr Val Gly Leu Val Lys Thr His Pro Ser Leu Lys165 170 175Ala Val Ser Pro Gln Ala Pro Val Thr Asp Trp Tyr Ile Gly Asp Asp180 185 190
Phe His His Asn Gly Val Leu Phe Leu Gln Asp Ala Phe Thr Phe Met195 200 205Ser Thr Phe Gly Val Pro Arg Pro Lys Pro Ile Thr Pro Asp Gln Phe210 215 220Lys Gly Lys Ile Gln Ile Lys Glu Ala Asp Lys Tyr Asn Phe Phe Ala225 230 235 240Glu Ala Gly Thr Ala Arg Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Phe Gly Asp Ser245 250 255Val Gln Phe Trp Asn Asp Leu Phe Lys His Pro Asp Tyr Asp Asp Phe260 265 270Trp Lys Ser Arg Val Ile Thr Asn Ser Leu Gln Glu Val Lys Pro Ala275 280 285Val Met Val Val Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Ala Tyr Gly Thr290 295 300Phe Lys Thr Tyr Gln Ser Ile Glu Asp Lys Ser Lys Lys Asn Asn Ser305 310 315 320Ile Leu Val Ala Gly Pro Trp Tyr His Gly Gly Trp Val Arg Ala Glu325 330 335Gly Asn Tyr Leu Gly Asp Ile Gln Phe Glu Lys Lys Thr Ser Ile Thr340 345 350Tyr Gln Glu Gln Phe Glu Gln Pro Phe Phe Lys Tyr Tyr Leu Lys Asp355 360 365Glu Gly Asn Phe Ala Pro Ser Glu Ala Asn Ile Phe Val Ser Gly Ser370 375 380Asn Glu Trp Lys His Phe Glu Gln Trp Pro Pro Lys Asn Val Glu Thr385 390 395 400Lys Lys Leu Tyr Phe Gln Pro Gln Gly Lys Leu Gly Phe Asp Lys Val405 410 415Gln Arg Thr Asp Ser Trp Asp Glu Tyr Val Thr Asp Pro Asn Lys Pro420 425 430Val Pro His Gln Gly Gly Val Ile Gln Asn Arg Thr Arg Glu Tyr Met435 440 445
Val Asp Asp Gln Arg Phe Ala Ala Ser Arg Pro Asp Val Met Val Tyr450 455 460Gln Thr Glu Pro Leu Thr Glu Asp Leu Thr Ile Val Gly Pro Ile Lys465 470 475 480Asn Phe Leu Lys Val Ser Ser Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr Val Val485 490 495Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Asn Asp Ala Ala Ser Tyr Gln Gly Lys500 505 510Thr Met Ala Gly Tyr Gln Met Met Val Arg Gly Glu Ile Met Ala Gly515 520 525Lys Tyr Arg Asn Gly Phe Asp Lys Ala Gln Ala Leu Thr Pro Gly Met530 535 540Val Glu Lys Val Asn Phe Glu Met Pro Asp Val Ala His Thr Phe Lys545 550 555 560Lys Gly His Arg Ile Met Val Gln Val Gln Asn Ser Trp Phe Pro Leu565 570 575Ala Glu Arg Asn Pro Gln Val Phe Leu Ala Pro Tyr Thr Ala Thr Lys580 585 590Ala Asp Phe Arg Lys Ala Thr Gln Arg Ile Phe His Asp Val Asn Asn595 600 605Ala Thr Tyr Ile Glu Phe Ser Val Leu Lys Asp610 615<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于制备pTrpT_Sm_aet的合成引物<400>13gggaattcca tatgaaaaat acaatttcgt 30<210>14
<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于制备pTrpT_Sm_aet的合成引物<400>14gctctagact aatctttgag gacagaaaa 29<210>15<211>17<212>DNA<213>人工<220>
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<223>用于Aet的混合引物2<220>
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<221>CDS<222>(29)..(1888)<223>
<400>24cccaaagcat taacaaaata atttagtc atg aaa cac tgt tac aaa ctt ctg 52Met Lys His Cys Tyr Lys Leu Leu1 5gtc ttt tac aca tta ttt ttg atg acc aca aac tgg gct tta tca caa100Val Phe Tyr Thr Leu Phe Leu Met Thr Thr Asn Trp Ala Leu Ser Gln10 15 20gcc att aat gga tat gat aag gca gcc tat gac att cct atg cga gat148Ala Ile Asn Gly Tyr Asp Lys Ala Ala Tyr Asp Ile Pro Met Arg Asp25 30 35 40gga gtt cac ctt cac acc atc gtc tat agc ccc aaa gat tta tcg cag196Gly Val His Leu His Thr Ile Val Tyr Ser Pro Lys Asp Leu Ser Gln45 50 55ccc tat cct ata ttg atg caa agg aca cct tac agc gcc ggc cct tat244Pro Tyr Pro Ile Leu Met Gln Arg Thr Pro Tyr Ser Ala Gly Pro Tyr60 65 70ggt cct gga aat atg aaa aat aag ctt ggc cct tct cag ttt tta atg292Gly Pro Gly Asn Met Lys Asn Lys Leu Gly Pro Ser Gln Phe Leu Met75 80 85aac gat ggc tat ata ttt gtt tac cag gat gta aga ggg cgg tgg atg340Asn Asp Gly Tyr Ile Phe Val Tyr Gln Asp Val Arg Gly Arg Trp Met90 95 100tcg gaa gga tcc tat gac aac atg cgc cct acc cta tcc aaa tca gaa388Ser Glu Gly Ser Tyr Asp Asn Met Arg Pro Thr Leu Ser Lys Ser Glu105 110 115 120aga aat tcc aac caa ata gac gaa agc aca gac acc tat gat acc ata 436Arg Asn Ser Asn Gln Ile Asp Glu Ser Thr Asp Thr Tyr Asp Thr Ile125 130 135gaa tgg ttg ctc gcc aat atc aaa aat cac aat gaa aaa gta ggc cta 484Glu Trp Leu Leu Ala Asn Ile Lys Asn His Asn Glu Lys Val Gly Leu140 145 150
tgg gga atc agc tat ccc gga ttt tat agt gct gca gcc ctt cct ttt532Trp Gly Ile Ser Tyr Pro Gly Phe Tyr Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe155 160 165gcc cat cca aac ctg aaa gcc gtt tcc cct caa gca ccc ata ggg gat580Ala His Pro Asn Leu Lys Ala Val Ser Pro Gln Ala Pro Ile Gly Asp170 175 180ttt tac ttt gat gat ttt cat cat aac ggt gct tac tta tta agt tat628Phe Tyr Phe Asp Asp Phe His His Asn Gly Ala Tyr Leu Leu Ser Tyr185 190 195 200tgg ttg gcc act tct gtt ttc ggc tac caa aaa gac ggc cct aca cag676Trp Leu Ala Thr Ser Val Phe Gly Tyr Gln Lys Asp Gly Pro Thr Gln205 210 215gaa gca tgg tat ggc atg gtg aat ccg gaa aca aat gac ggc tat cag724Glu Ala Trp Tyr Gly Met Val Asn Pro Glu Thr Asn Asp Gly Tyr Gln220 225 230ttt ttt atg gat atg ggg cca tta aaa aat gcc gat aaa tgg tat ggt772Phe Phe Met Asp Met Gly Pro Leu Lys Asn Ala Asp Lys Trp Tyr Gly235 240 245gaa gac aat ttt ttc tgg caa caa ctt aaa aac aat cct gat tac aac820Glu Asp Asn Phe Phe Trp Gln Gln Leu Lys Asn Asn Pro Asp Tyr Asn250 255 260gct ttc tgg caa aag aga agt att att cct cac tta aaa gaa gtg aag868Ala Phe Trp Gln Lys Arg Ser Ile Ile Pro His Leu Lys Glu Val Lys265 270 275 280cct gca gtt tta acc gtt ggg ggc tgg ttt gat gca gaa gat ctc tat916Pro Ala Val Leu Thr Val Gly Gly Trp Phe Asp Ala Glu Asp Leu Tyr285 290 295gga cca ctt aca att tat aaa acc att gaa aaa aat aat cct gag acc964Gly Pro Leu Thr Ile Tyr Lys Thr Ile Glu Lys Asn Asn Pro Glu Thr300 305 310tac aat acc att gtc atg ggc cct tgg tcc cac gga gat tgg tca agg 1012Tyr Asn Thr Ile Val Met Gly Pro Trp Ser His Gly Asp Trp Ser Arg315 320 325gaa cct gga tca cag gtc att tca aat att tat ttt ggt gat tct atc 1060Glu Pro Gly Ser Gln Val Ile Ser Asn Ile Tyr Phe Gly Asp Ser Ile330 335 340
tcc aca tgg tat caa aaa aat ata gaa cgt gtt ttt ttc aat cat ttt1108Ser Thr Trp Tyr Gln Lys Asn Ile Glu Arg Val Phe Phe Asn His Phe345 350 355 360cta aaa gaa tcc gaa aat agc aat cct gcc ctt cct gaa gcc tac atg1156Leu Lys Glu Ser Glu Asn Ser Asn Pro Ala Leu Pro Glu Ala Tyr Met365 370 375ttt gat acc gga aaa cat aaa tgg gaa aaa ttt gac gat tgg cct cct1204Phe Asp Thr Gly Lys His Lys Trp Glu Lys Phe Asp Asp Trp Pro Pro380 385 390aaa gaa agc caa tgg aaa agc ttt tac ttt caa gag aaa gga gag tta1252Lys Glu Ser Gln Trp Lys Ser Phe Tyr Phe Gln Glu Lys Gly Glu Leu395 400 405act gag gta aca cct gag gga aat agg ttt act acc tat gtc tca gac1300Thr Glu Val Thr Pro Glu Gly Asn Arg Phe Thr Thr Tyr Val Ser Asp410 415 420ccc tct aat cct gtc ccc tat agt caa gat att aaa cta aac ttc act1348Pro Ser Asn Pro Val Pro Tyr Ser Gln Asp Ile Lys Leu Asn Phe Thr425 430 435 440ccg aga aaa tac atg gcc gat gac cag cga ttt gca gcc aga aga ccg1396Pro Arg Lys Tyr Met Ala Asp Asp Gln Arg Phe Ala Ala Arg Arg Pro445 450 455gac gta ctg acc ttt acg agc gaa gta tta agt caa gac atg acg ctt1444Asp Val Leu Thr Phe Thr Ser Glu Val Leu Ser Gln Asp Met Thr Leu460 465 470gcg ggg gaa gtc atg gca aac tta aaa gtt gcc act tca caa act gat1492Ala Gly Glu Val Met Ala Asn Leu Lys Val Ala Thr Ser Gln Thr Asp475 480 485gct gat tgg gta gtt aaa atc atc gat ata ttt ccc gga gat cag cca1540Ala Asp Trp Val Val Lys Ile Ile Asp Ile Phe Pro Gly Asp Gln Pro490 495 500aat cat gcc tat gtt tta gat ggg gtg gac atg ggc aat tac cac cta1588Asn His Ala Tyr Val Leu Asp Gly Val Asp Met Gly Asn Tyr His Leu505 510 515 520atg gtt cgt tca gag gta att aga ggg agg tat aga gaa agt ttt gag1636Met Val Arg Ser Glu Val Ile Arg Gly Arg Tyr Arg Glu Ser Phe Glu525 530 535ttt cct aaa ccc ttt gtt cct gat caa atc act gct gtt gat ttc agg1684
Phe Pro Lys Pro Phe Val Pro Asp Gln Ile Thr Ala Val Asp Phe Arg540 545 550tta caa gat ctt ttc cat act ttc aaa aag ggg cat aaa att caa ata1732Leu Gln Asp Leu Phe His Thr Phe Lys Lys Gly His Lys Ile Gln Ile555 560 565caa ata caa agt act tgg ttt ccc cta att gat cga aat ccc caa aaa1780Gln Ile Gln Ser Thr Trp Phe Pro Leu Ile Asp Arg Asn Pro Gln Lys570 575 580tat gta caa aac ata ttt gaa gct gag gaa gcc gat ttt gtc aaa gcc1828Tyr Val Gln Asn Ile Phe Glu Ala Glu Glu Ala Asp Phe Val Lys Ala585 590 595 600acc cat agg gtt ttt cat aca gaa aag ttt gcc agc aaa att gaa gta1876Thr His Arg Val Phe His Thr Glu Lys Phe Ala Ser Lys Ile Glu Val605 610 615atg gtt ctt cct tagaattaga atggtttaaa attactattt gtagcagaag ata1931Met Val Leu Pro620<210>25<211>620<212>PRT<213>海圆杆菌(Cyclobacterium marinum)<400>25Met Lys His Cys Tyr Lys Leu Leu Val Phe Tyr Thr Leu Phe Leu Met1 5 10 15Thr Thr Asn Trp Ala Leu Ser Gln Ala Ile Asn Gly Tyr Asp Lys Ala20 25 30Ala Tyr Asp Ile Pro Met Arg Asp Gly Val His Leu His Thr Ile Val35 40 45Tyr Ser Pro Lys Asp Leu Ser Gln Pro Tyr Pro Ile Leu Met Gln Arg50 55 60Thr Pro Tyr Ser Ala Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Asn Met Lys Asn Lys65 70 75 80
Leu Gly Pro Ser Gln Phe Leu Met Asn Asp Gly Tyr Ile Phe Val Tyr85 90 95Gln Asp Val Arg Gly Arg Trp Met Ser Glu Gly Ser Tyr Asp Asn Met100 105 110Arg Pro Thr Leu Ser Lys Ser Glu Arg Asn Ser Asn Gln Ile Asp Glu115 120 125Ser Thr Asp Thr Tyr Asp Thr Ile Glu Trp Leu Leu Ala Asn Ile Lys130 135 140Asn His Asn Glu Lys Val Gly Leu Trp Gly Ile Ser Tyr Pro Gly Phe145 150 155 160Tyr Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ala His Pro Asn Leu Lys Ala Val165 170 175Ser Pro Gln Ala Pro Ile Gly Asp Phe Tyr Phe Asp Asp Phe His His180 185 190Asn Gly Ala Tyr Leu Leu Ser Tyr Trp Leu Ala Thr Ser Val Phe Gly195 200 205Tyr Gln Lys Asp Gly Pro Thr Gln Glu Ala Trp Tyr Gly Met Val Asn210 215 220Pro Glu Thr Asn Asp Gly Tyr Gln Phe Phe Met Asp Met Gly Pro Leu225 230 235 240Lys Asn Ala Asp Lys Trp Tyr Gly Glu Asp Asn Phe Phe Trp Gln Gln245 250 255Leu Lys Asn Asn Pro Asp Tyr Asn Ala Phe Trp Gln Lys Arg Ser Ile260 265 270
Ile Pro His Leu Lys Glu Val Lys Pro Ala Val Leu Thr Val Gly Gly275 280 285Trp Phe Asp Ala Glu Asp Leu Tyr Gly Pro Leu Thr Ile Tyr Lys Thr290 295 300Ile Glu Lys Asn Asn Pro Glu Thr Tyr Asn Thr Ile Val Met Gly Pro305 310 315 320Trp Ser His Gly Asp Trp Ser Arg Glu Pro Gly Ser Gln Val Ile Ser325 330 335Asn Ile Tyr Phe Gly Asp Ser Ile Ser Thr Trp Tyr Gln Lys Asn Ile340 345 350Glu Arg Val Phe Phe Asn His Phe Leu Lys Glu Ser Glu Asn Ser Asn355 360 365Pro Ala Leu Pro Glu Ala Tyr Met Phe Asp Thr Gly Lys His Lys Trp370 375 380Glu Lys Phe Asp Asp Trp Pro Pro Lys Glu Ser Gln Trp Lys Ser Phe385 390 395 400Tyr Phe Gln Glu Lys Gly Glu Leu Thr Glu Val Thr Pro Glu Gly Asn405 410 415Arg Phe Thr Thr Tyr Val Ser Asp Pro Ser Asn Pro Val Pro Tyr Ser420 425 430Gln Asp Ile Lys Leu Asn Phe Thr Pro Arg Lys Tyr Met Ala Asp Asp435 440 445Gln Arg Phe Ala Ala Arg Arg Pro Asp Val Leu Thr Phe Thr Ser Glu450 455 460
Val Leu Ser Gln Asp Met Thr Leu Ala Gly Glu Val Met Ala Asn Leu465 470 475 480Lys Val Ala Thr Ser Gln Thr Asp Ala Asp Trp Val Val Lys Ile Ile485 490 495Asp Ile Phe Pro Gly Asp Gln Pro Asn His Ala Tyr Val Leu Asp Gly500 505 510Val Asp Met Gly Asn Tyr His Leu Met Val Arg Ser Glu Val Ile Arg515 520 525Gly Arg Tyr Arg Glu Ser Phe Glu Phe Pro Lys Pro Phe Val Pro Asp530 535 540Gln Ile Thr Ala Val Asp Phe Arg Leu Gln Asp Leu Phe His Thr Phe545 550 555 560Lys Lys Gly His Lys Ile Gln Ile Gln Ile Gln Ser Thr Trp Phe Pro565 570 575Leu Ile Asp Arg Asn Pro Gln Lys Tyr Val Gln Asn Ile Phe Glu Ala580 585 590Glu Glu Ala Asp Phe Val Lys Ala Thr His Arg Val Phe His Thr Glu595 600 605Lys Phe Ala Ser Lys Ile Glu Val Met Val Leu Pro610 615 620<210>26<211>2036<212>DNA<213>伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpens burtonensis)<220>
<221>CDS<222>(61)..(1992)<223>
<400>26catattcgta aaatagctat aagtttttgt aaatttagtc aatcaaaatt ttaaatgtaa 60atg aag act ctt ttt aaa ttg ttg ctc cta ttt gta ttt gtt cta acg108Met Lys Thr Leu Phe Lys Leu Leu Leu Leu Phe Val Phe Val Leu Thr1 5 10 15tct tgt aat aag gcc aac aaa gac gct act gaa att gtg aaa acc gaa156Ser Cys Asn Lys Ala Asn Lys Asp Ala Thr Glu Ile Val Lys Thr Glu20 25 30gta gaa gat act tac gtt aaa gat aat tat aac aaa caa gag gtg act204Val Glu Asp Thr Tyr Val Lys Asp Asn Tyr Asn Lys Gln Glu Val Thr35 40 45att gaa atg cgc gat ggt ata aaa ctt cac acg acc att tat tca cca252Ile Glu Met Arg Asp Gly Ile Lys Leu His Thr Thr Ile Tyr Ser Pro50 55 60aaa gat gaa agt cag acc tat cct att tta atg atg aga aca cca tat300Lys Asp Glu Ser Gln Thr Tyr Pro Ile Leu Met Met Arg Thr Pro Tyr65 70 75 80agt tct caa cct tat ggt gac aat gag ttt aag acg aaa att ggt cct348Ser Ser Gln Pro Tyr Gly Asp Asn Glu Phe Lys Thr Lys Ile Gly Pro85 90 95aat gtt cat tta atg aaa gaa ggg aat att gtt gtg tat caa gat gta396Asn Val His Leu Met Lys Glu Gly Asn Ile Val Val Tyr Gln Asp Val100 105 110cga ggt cgt tgg atg agt gaa ggt gtc tat gat aat atg cgt gct tat444Arg Gly Arg Trp Met Ser Glu Gly Val Tyr Asp Asn Met Arg Ala Tyr115 120 125atc cca aat aaa aca gag gat tct caa att gat gag gca tca gac act492Ile Pro Asn Lys Thr Glu Asp Ser Gln Ile Asp Glu Ala Ser Asp Thr130 135 140tat gac acg att gac tgg ctg gta aat aac gta gaa aat aat aac ggg540Tyr Asp Thr Ile Asp Trp Leu Val Asn Asn Val Glu Asn Asn Asn Gly145 150 155 160aat gtt ggt act tgg gga att tca tat cct ggt ttt tat gct aca tat588Asn Val Gly Thr Trp Gly Ile Ser Tyr Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Tyr165 170 175tct act ata gac gca cac cca gct tta aaa gca gca tcg cct caa gcg636
Ser Thr Ile Asp Ala His Pro Ala Leu Lys Ala Ala Ser Pro Gln Ala180 185 190tgt att gga gat ttc ttt ttt gac gat ttt cat cat aat ggt gct ttt684Cys Ile Gly Asp Phe Phe Phe Asp Asp Phe His His Asn Gly Ala Phe195 200 205tta tta agt tat ttt aga gca gtg tct tta ttt ggt acg aca aaa gat732Leu Leu Ser Tyr Phe Arg Ala Val Ser Leu Phe Gly Thr Thr Lys Asp210 215 220aaa cct aca gat tct gct tgg tat aag ttt cca gaa atg aaa aca caa780Lys Pro Thr Asp Ser Ala Trp Tyr Lys Phe Pro Glu Met Lys Thr Gln225 230 235 240gat caa tat caa ttt ttt ctt gat gct gga cct tta agt aat ttg aac828Asp Gln Tyr Gln Phe Phe Leu Asp Ala Gly Pro Leu Ser Asn Leu Asn245 250 255aag tat ttc caa tat gac aca cca gac gac aca tct gta tcc aag tct876Lys Tyr Phe Gln Tyr Asp Thr Pro Asp Asp Thr Ser Val Ser Lys Ser260 265 270gat agg ata gat gat gtg ttt tgg aaa gaa att gta gag cat cca aac924Asp Arg Ile Asp Asp Val Phe Trp Lys Glu Ile Val Glu His Pro Asn275 280 285tac gat acg ata tgg aaa tct aaa ggt tta att caa aac cta aaa gat972Tyr Asp Thr Ile Trp Lys Ser Lys Gly Leu Ile Gln Asn Leu Lys Asp290 295 300att aag cca agt gta gcg aca atg att gtg gga ggg tta ttt gat gcc1020Ile Lys Pro Ser Val Ala Thr Met Ile Val Gly Gly Leu Phe Asp Ala305 310 315 320gaa gat tta tat ggg cca ttt gaa act tat aaa acg ata gaa aaa cat1068Glu Asp Leu Tyr Gly Pro Phe Glu Thr Tyr Lys Thr Ile Glu Lys His325 330 335aat cct gat aat tat aat att atg gtt ttt ggg cct tgg gat cat ggt1116Asn Pro Asp Asn Tyr Asn Ile Met Val Phe Gly Pro Trp Asp His Gly340 345 350cgt tgg gct agg agt gac gtt aaa aat tat gtt gga aat tat ttc ttc1164Arg Trp Ala Arg Ser Asp Val Lys Asn Tyr Val Gly Asn Tyr Phe Phe355 360 365gga gat tct ata tct cta aaa ttt caa cgt gat gtt gaa acg aag ttt1212Gly Asp Ser Ile Ser Leu Lys Phe Gln Arg Asp Val Glu Thr Lys Phe
370 375 380ttt aat cat ttt tta aaa gga aaa ggc gac aag aac tca ggg tta cca1260Phe Asn His Phe Leu Lys Gly Lys Gly Asp Lys Asn Ser Gly Leu Pro385 390 395 400gaa gca tat gta ttt gat tct ggt aaa aag gaa tgg agt agc ttt gac1308Glu Ala Tyr Val Phe Asp Ser Gly Lys Lys Glu Trp Ser Ser Phe Asp405 410 415agc tgg cct cca aag caa gca gaa aaa caa gcc atg tat ctt aat gcc1356Ser Trp Pro Pro Lys Gln Ala Glu Lys Gln Ala Met Tyr Leu Asn Ala420 425 430aac caa gag cta tca gat tca aaa aaa gga aat act agt gag aca ttt1404Asn Gln Glu Leu Ser Asp Ser Lys Lys Gly Asn Thr Ser Glu Thr Phe435 440 445gtt agt gat tta aaa cgc cct gta cct tat tcc gaa gat att aaa aca1452Val Ser Asp Leu Lys Arg Pro Val Pro Tyr Ser Glu Asp Ile Lys Thr450 455 460gtt ttc aca cca cga aaa tac atg aca gac gat cag cgt ttt gca gca1500Val Phe Thr Pro Arg Lys Tyr Met Thr Asp Asp Gln Arg Phe Ala Ala465 470 475 480cga cgt cct gat gtt ctt ata ttt gag acc gat att ctt gag gaa gat1548Arg Arg Pro Asp Val Leu Ile Phe Glu Thr Asp Ile Leu Glu Glu Asp485 490 495ata acc tta gct ggt gat att tta gcg cag ctt aat gtg tca act aca1596Ile Thr Leu Ala Gly Asp Ile Leu Ala Gln Leu Asn Val Ser Thr Thr500 505 510ggg aca gat gca gat tgg att gtc aaa ata gta gat gtt cat cca gca1644Gly Thr Asp Ala Asp Trp Ile Val Lys Ile Val Asp Val His Pro Ala515 520 525gat gct gag gag caa aaa gaa ggt atg caa gac cat tta tca atg agt1692Asp Ala Glu Glu Gln Lys Glu Gly Met Gln Asp His Leu Ser Met Ser530 535 540aat tat cat ttg atg gtg agg agt gaa gtg atg cgc ggt cgt ttt aga1740Asn Tyr His Leu Met Val Arg Ser Glu Val Met Arg Gly Arg Phe Arg545 550 555 560aat agt ttt gaa aac cca gag cca ttt gtg cca aac caa cca aca gat1788Asn Ser Phe Glu Asn Pro Glu Pro Phe Val Pro Asn Gln Pro Thr Asp565 570 575
gtc aat atc aag tta caa gat gta cat cat aca ttt aaa aaa ggt cac1836Val Asn IIe Lys Leu Gln Asp Val His His Thr Phe Lys Lys Gly His580 585 590aaa tta caa gtg caa gtt cag agt acg tgg ttt cca ctt att gat ttg1884Lys Leu Gln Val Gln Val Gln Ser Thr Trp Phe Pro Leu Ile Asp Leu595 600 605aac ccg caa aca ttt gtg cct aat att tat aaa gca aaa gaa agc gat1932Asn Pro Gln Thr Phe Val Pro Asn Ile Tyr Lys Ala Lys Glu Ser Asp610 615 620ttt aaa acc caa aca cat tcg gtt ttt aac gat tct aaa att gag ttt1980Phe Lys Thr Gln Thr His Ser Val Phe Asn Asp Ser Lys Ile Glu Phe625 630 635 640acg gtt ttg aaa taagagtaga tgactaaatt tgccaaggta gatttagtct tttt2036Thr Val Leu Lys<210>27<211>644<212>PRT<213>伯顿湖冷蛇菌(Psychroserpens burtonensis)<400>27Met Lys Thr Leu Phe Lys Leu Leu Leu Leu Phe Val Phe Val Leu Thr1 5 10 15Ser Cys Asn Lys Ala Asn Lys Asp Ala Thr Glu Ile Val Lys Thr Glu20 25 30Val Glu Asp Thr Tyr Val Lys Asp Asn Tyr Asn Lys Gln Glu Val Thr35 40 45Ile Glu Met Arg Asp Gly Ile Lys Leu His Thr Thr Ile Tyr Ser Pro50 55 60Lys Asp Glu Ser Gln Thr Tyr Pro Ile Leu Met Met Arg Thr Pro Tyr65 70 75 80
Ser Ser Gln Pro Tyr Gly Asp Asn Glu Phe Lys Thr Lys Ile Gly Pro85 90 95Asn Val His Leu Met Lys Glu Gly Asn Ile Val Val Tyr Gln Asp Val100 105 110Arg Gly Arg Trp Met Ser Glu Gly Val Tyr Asp Asn Met Arg Ala Tyr115 120 125Ile Pro Asn Lys Thr Glu Asp Ser Gln Ile Asp Glu Ala Ser Asp Thr130 135 140Tyr Asp Thr Ile Asp Trp Leu Val Asn Asn Val Glu Asn Asn Asn Gly145 150 155 160Asn Val Gly Thr Trp Gly Ile Ser Tyr Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Tyr165 170 175Ser Thr Ile Asp Ala His Pro Ala Leu Lys Ala Ala Ser Pro Gln Ala180 185 190Cys Ile Gly Asp Phe Phe Phe Asp Asp Phe His His Asn Gly Ala Phe195 200 205Leu Leu Ser Tyr Phe Arg Ala Val Ser Leu Phe Gly Thr Thr Lys Asp210 215 220Lys Pro Thr Asp Ser Ala Trp Tyr Lys Phe Pro Glu Met Lys Thr Gln225 230 235 240Asp Gln Tyr Gln Phe Phe Leu Asp Ala Gly Pro Leu Ser Asn Leu Asn245 250 255Lys Tyr Phe Gln Tyr Asp Thr Pro Asp Asp Thr Ser Val Ser Lys Ser260 265 270Asp Arg Ile Asp Asp Val Phe Trp Lys Glu Ile Val Glu His Pro Asn
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Arg Arg Pro Asp Val Leu Ile Phe Glu Thr Asp Ile Leu Glu Glu Asp485 490 495Ile Thr Leu Ala Gly Asp Ile Leu Ala Gln Leu Asn Val Ser Thr Thr500 505 510Gly Thr Asp Ala Asp Trp Ile Val Lys Ile Val Asp Val His Pro Ala515 520 525Asp Ala Glu Glu Gln Lys Glu Gly Met Gln Asp His Leu Ser Met Ser530 535 540Asn Tyr His Leu Met Val Arg Ser Glu Val Met Arg Gly Arg Phe Arg545 550 555 560Asn Ser Phe Glu Asn Pro Glu Pro Phe Val Pro Asn Gln Pro Thr Asp565 570 575Val Asn Ile Lys Leu Gln Asp Val His His Thr Phe Lys Lys Gly His580 585 590Lys Leu Gln Val Gln Val Gln Ser Thr Trp Phe Pro Leu Ile Asp Leu595 600 605Asn Pro Gln Thr Phe Val Pro Asn Ile Tyr Lys Ala Lys Glu Ser Asp610 615 620Phe Lys Thr Gln Thr His Ser Val Phe Asn Asp Ser Lys Ile Glu Phe625 630 635 640Thr Val Leu Lys
权利要求
1.一种生产α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的方法，所述方法包括使用能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的酶或含酶物质，由L-天冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸生成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯。
2.权利要求1的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生产方法，其中所述酶或含酶物质选自以下的一种或两种或多种能够通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的微生物培养物、分离自所述培养物的微生物细胞以及处理过的所述微生物的微生物细胞产物。
3.权利要求2的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生产方法，其中所述微生物属于选自以下的属气单胞菌属(Aeromonas)、固氮菌属(Azotobacter)、产碱菌属(Alcaligenes)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、稳杆菌属(Empedobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、拟威尔酵母属(Williopsis)、假丝酵母属(Candida)、地霉属(Geotrichum)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、噬细胞菌属(Cellulophaga)、威克斯氏菌属(Weeksella)、土地杆菌属(Pedobacter)、桃色杆菌属(Persicobacter)、柔发菌属(Flexithrix)、噬几丁质菌属(Chitinophaga)、圆杆菌属(Cyclobacterium)、古字状菌属(Runella)、栖热线菌属(Thermonema)、冷蛇菌属(Psychroserpens)、冰冷杆菌属(Gelidibacter)、Dyadobacter、火色杆菌属(Flammeovirga)、螺状菌属(Spirosoma)、弯杆菌属(Flectobacillus)、屈挠杆菌属(Tenacibaculum)、红嗜热盐菌属(Rhodotermus)、Zobellia、Muricauda、Salegentibacter、整形杆菌属(Taxeobacter)、噬纤维菌属(Cttophaga)、海滑菌属(Marinilabilia)、赖文氏菌属(Lewinella)、腐败螺旋菌属(Saprospira)和束缚杆菌属(Haliscomenobacter)。
4.权利要求2的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生产方法，其中所述微生物是能够表达以下(A)或(B)蛋白质的转化微生物(A)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-616的氨基酸序列的蛋白质，(B)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-616的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质。
5.权利要求2的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯的生产方法，其中所述微生物是能够表达以下(C)或(D)蛋白质的转化微生物(C)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列的氨基酸残基序数21-619的氨基酸序列的蛋白质，(D)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列的氨基酸残基序数21-619的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质。
6.权利要求2的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生产方法，其中所述微生物是能够表达以下(E)或(F)蛋白质的转化微生物(E)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-625的氨基酸序列的蛋白质，(F)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-625的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质。
7.权利要求2的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生产方法，其中所述微生物是能够表达以下(G)或(H)蛋白质的转化微生物(G)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-645的氨基酸序列的蛋白质，(H)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-645的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质。
8.权利要求2的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生产方法，其中所述微生物是能够表达以下(I)或(J)蛋白质的转化微生物(I)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列的氨基酸残基序数26-620的氨基酸序列的蛋白质，(J)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列的氨基酸残基序数26-620的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质。
9.权利要求2的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生产方法，其中所述微生物是能够表达以下(K)或(L)蛋白质的转化微生物(K)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列的氨基酸残基序数18-644的氨基酸序列的蛋白质，(L)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列的氨基酸残基序数18-644的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质。
10.权利要求2的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生产方法，其中所述微生物是能够表达以下(M)或(N)蛋白质的转化微生物(M)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列的蛋白质，(N)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质。
11.权利要求2的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生产方法，其中所述微生物是能够表达以下(O)或(P)蛋白质的转化微生物(O)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列的蛋白质，(P)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质。
12.权利要求2的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生产方法，其中所述微生物是能够表达以下(Q)或(R)蛋白质的转化微生物(Q)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列，含有成熟蛋白区的蛋白质，(R)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质。
13.权利要求2的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生产方法，其中所述微生物是能够表达以下(S)或(T)蛋白质的转化微生物(S)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列的蛋白质，(T)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质。
14.权利要求2的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生产方法，其中所述微生物是能够表达以下(U)或(V)蛋白质的转化微生物(U)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列的蛋白质，(V)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质。
15.权利要求2的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生产方法，其中所述微生物是能够表达以下(W)或(X)蛋白质的转化微生物(W)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列的蛋白质，(X)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质。
16.权利要求1的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生产方法，其中所述酶选自以下(A)-(X)中的至少一种(A)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-616的氨基酸序列的蛋白质，(B)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-616的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质，(C)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列的氨基酸残基序数21-619的氨基酸序列的蛋白质，(D)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列的氨基酸残基序数21-619的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质，(E)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-625的氨基酸序列的蛋白质，(F)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-625的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质，(G)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-645的氨基酸序列的蛋白质，(H)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列的氨基酸残基序数23-645的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质，(I)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列的氨基酸残基序数26-620的氨基酸序列的蛋白质，(J)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列的氨基酸残基序数26-620的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质，(K)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列的氨基酸残基序数18-644的氨基酸序列的蛋白质，(L)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列的氨基酸残基序数18-644的氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性的蛋白质，(M)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列的蛋白质，(N)具有序列表中SEQ ID NO6所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质，(O)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列的蛋白质，(P)具有序列表中SEQ ID NO12所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质，(Q)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列的蛋白质，(R)具有序列表中SEQ ID NO18所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质，(S)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列的蛋白质，(T)具有序列表中SEQ ID NO23所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质。(U)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列的蛋白质，(V)具有序列表中SEQ ID NO25所述氨基酸序列，其中有一个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加和/或倒位，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质，(W)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列的蛋白质，(X)具有序列表中SEQ ID NO27所述氨基酸序列，并具有通过肽键将L-苯丙氨酸选择性连接至L-天冬氨酸-α，β-二酯的α-酯位点的活性，含有成熟蛋白区的蛋白质。
17.一种α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯的生产方法，所述方法包括利用权利要求1-16中任何一项的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-酯生产方法合成α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-甲酯的反应步骤；以及将α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-β-甲酯转变为α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-α-甲酯的反应步骤。
全文摘要
本发明提供一种简便、高产、廉价且不用经历复杂合成路线的α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸－β－酯(也称为α－L－(β－o－取代天冬氨酰)－L－苯丙氨酸)生产方法，α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸－β－酯是α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸－α－甲酯(也称为α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸甲酯，产品名阿斯巴甜)的一种中间体。此外，本发明提供一种简便、廉价且高产的α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸－α－甲酯生产方法。使用能够催化以下反应的酶或含酶物质由L－天冬氨酸－α，β－二酯和L－苯丙氨酸生产α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸－α－甲酯在所述反应中，L－苯丙氨酸不对L－天冬氨酸－α，β－二酯的β－酯位点进行亲核攻击，而对其α－酯位点进行亲核攻击。
文档编号C07K5/00GK1742089SQ200480002519
公开日2006年3月1日 申请日期2004年1月23日 优先权日2003年1月24日
发明者横关健三, 大野绫子, 原诚一, 阿部巧 申请人:味之素株式会社