专利名称：编码人癌胚抗原的合成基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及癌症的治疗。更为具体而言，本发明涉及编码人肿瘤相关多肽癌胚抗原的合成多核苷酸，本文将其命名为hCEAopt，其中该多核苷酸为在人体细胞环境中表达进行了密码子优化。本发明也提供了包含该合成多核苷酸的重组载体和宿主。本发明也涉及携带有hCEAopt的腺病毒载体和质粒，及它们在用于预防和治疗癌症的疫苗和药物组合物中的用途。
背景技术：
免疫球蛋白(IgSF)由众多编码具有不同功能的蛋白质的基因组成，其中一种功能即细胞间粘附。IgSF蛋白质含有至少一个Ig相关区域，该区域对于维持正常的分子间结合作用而言是重要的。由于该相互作用对于IgSF成员的不同生物学功能而言是必须的，因此多种IgSF粘附分子的破坏或异常表达与多种人类疾病相关。
癌胚抗原(CEA)属于由细胞表面糖蛋白组成的Ig超家族的亚家族。已知的CEA亚家族成员如CEA相关的细胞粘附分子(CEACAMs)。在最近的科学文献中，CEA基因被重新命名为CEACAM5，虽然相应蛋白质的命名仍然为CEA。研究显示CEACAMs在功能上同时作为同型和异型的分子间粘附分子(Benchimol等，Cell57327-334(1989))。除了细胞粘附，CEA还抑制由于细胞从胞外基质解离而引起的细胞死亡，并有助于与某些原癌基因如Bcl2和C-Myc相关的细胞转化。
在胚胎发育和成人结肠粘膜中已检测到CEA的正常表达。CEA过量表达在三十多年前首先于人结肠癌中被检测到(Gold和Freedman，J.Exp.Med.121439-462(1965))且之后几乎发现于所有的结直肠癌中。此外，在高比例的胰腺、乳腺和肺部的腺癌中检测到CEA的过量表达。由于CEA表达在这些肿瘤类型中普遍存在，CEA被临床广泛地用于这些癌症的处理和预后中。
编码人CEA的序列已被克隆和表征(美国专利No.5,274,087、美国专利No 5,571,710和美国专利No 5,843,761.也参见Beauchemin等，Mol.Cell.Biol.73221-3230(1987)；Zimmerman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84920-924(1987)；Thompson等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(9)2965-69(1987))。
CEA表达和转移生长的相关性已经导致将其鉴定为分子和免疫干涉的目标，用于结直肠癌的治疗。
以CEA为目标的一种治疗方法即采用抗CEA抗体(参见Chester等.，Cancer Chemother.Pharmacol.46(Suppl)S8-S 12(2000))，而另一种方法采用基于CEA的疫苗激活免疫系统以攻击表达CEA的肿瘤(参见上文引用的Berinstein的综述)。
多种疫苗的研发和商业化已受阻于与在成功转化的宿主细胞中获得高水平的外源基因表达相关的难题。因此，尽管编码上述CEA蛋白质的野生型核酸序列已被确定，还非常需要开发一种可方便更新的人CEA蛋白质来源，该来源利用了被优化用于在所需宿主细胞中表达的编码CEA的核酸序列，该来源容许开发一种有效且不受自体耐受性影响的癌症疫苗。
发明概述本发明涉及引发或增强针对CEA基因表达的蛋白质产物的免疫性的组合物和方法，所述CEA基因与多种腺癌相关，包括结直肠癌。具体而言，本发明提供了编码人CEA蛋白质的多核苷酸，其中为在人体细胞内高水平表达，对该多核苷酸进行了密码子优化。本发明进一步提供了包含合成多核苷酸的基于腺病毒和质粒的载体并公开了该载体在用于预防和/或治疗CEA相关癌症的免疫组合物和疫苗中的用途。
本发明也涉及包含编码如SEQ ID NO.2所示人癌胚抗原(下文中表示为hCEA)的核苷酸序列的合成核酸分子(多核苷酸)，其中该合成核酸分子为在人体细胞内高水平表达进行了密码子优化(下文中表示为hCEAopt)。本文公开的核酸分子可被转染到选定的宿主细胞中，其中该重组宿主细胞提供了显著水平的表达功能性hCEA蛋白质(SEQ ID NO2)的来源。
本发明进一步涉及编码了表达人CEA蛋白质的mRNA的合成核酸分子；该DNA分子包含如本文公开的SEQ ID NO1的核苷酸序列。本发明该部分的优选方面公开在
图1中，该图显示了编码hCEA蛋白质(SEQ ID NO2或SEQ ID NO16)的DNA分子。本发明优选的核酸分子为在人体细胞内高水平表达，进行了密码子优化。
本发明另一种优选的DNA分子包含编码缺失了C末端锚定区域(AD)的人CEA的核苷酸序列，该区域位于人全长CEA(SEQ ID NO2)的约第679个氨基酸到约第702个氨基酸，其中该核苷酸序列为在人体细胞内高水平表达进行了密码子优化。编码锚定区域被截短的CEA变体的代表性DNA分子如SEQ ID NO15所示(如图10A中所示)。相应的hCEA-hAD的氨基酸序列如SEQ ID NO16所示(如图10B中所示)。
本发明也涉及重组载体和真核和原核的重组宿主细胞，均包含贯穿本说明书公开的核酸分子。
本发明进一步涉及用于在重组宿主细胞内表达经密码子优化的人CEA蛋白质的方法，包括(a)将包含如SEQ ID NO1或SEQ ID NO15所示核酸分子的载体导入合适的宿主细胞中；并(b)在容许该经密码子优化的蛋白质表达的条件下培养该宿主细胞。
本发明的另一方面是一种预防和治疗癌症的方法，包括给哺乳动物施用包含合成核酸分子的疫苗载体，该合成核酸分子包含编码如SEQ ID NO2或SEQ ID NO16所示人癌胚抗原(hCEA)蛋白质的核苷酸序列，其中该合成核酸分子为在人体细胞内高水平表达进行了密码子优化。
本发明进一步涉及腺病毒疫苗载体，该载体包含具E1区缺失和E1区的插入的腺病毒基因组，其中该插入包含表达盒，该表达盒包含(a)经密码子优化的编码人CEA蛋白质的多核苷酸；和(b)与该多核苷酸可操作连接的启动子。
本发明也涉及包含质粒部分和表达盒部分的疫苗质粒，该表达盒部分包含(a)编码人CEA蛋白质的合成多核苷酸，其中该多核苷酸为在人体细胞内高水平表达进行了密码子优化；和(b)与该多核苷酸可操作连接的启动子。
本发明的另一方面是保护哺乳动物免患癌症或治疗患CEA相关癌症的哺乳动物的方法，包括(a)将第一种载体导入哺乳动物，该载体包含(i)经密码子优化的编码人癌胚抗原(CEA)蛋白质或其变体的多核苷酸；和(ii)与该多核苷酸可操作连接的启动子；(b)允许经过一段预定时间；和(c)将第二种载体导入哺乳动物，该载体包含(i)经密码子优化的编码人CEA蛋白质或其变体的多核苷酸；和(ii)与该多核苷酸可操作连接的启动子。
贯穿本说明书及在附录权利要求中所用的单数形式″一个″″一种″和″该″如上下文未明确指出均包括复数形式。
贯穿本说明书及附录的权利要求中所用的下列定义和缩写适用于术语“启动子”指DNA链上RNA多聚酶结合的识别位点。启动子与RNA多聚酶形成起始复合物以起始并驱动转录活性。该复合物可被称为“增强子”的激活序列或称为“沉默子”的抑制序列所修饰。
术语“盒”指本发明中含有待表达核苷酸序列的序列。盒在概念上类似盒式录音带；每个盒具有本身的序列。因此通过互相交换盒，载体将表达不同的序列。由于限制位点在5’和3’末端，盒可被方便的插入，移除或用其它盒替代。
术语“载体”指可将DNA片段导入到宿主器官或宿主组织中一些方式。目前有多种类型的载体，包括质粒、病毒(包括腺病毒)、噬菌体和粘粒。
关于腺病毒载体所用的术语“第一代”描述了复制缺陷型的腺病毒载体。第一代腺病毒载体典型地具有缺失或失活的E1基因区，且优选地具有缺失或失活的E3基因区。
名称“pV1J/hCEAopt”指此处公开的质粒构建体，包含具内含子A的人CMV立即早期(IE)启动子、全长的经密码子优化的人CEA基因、牛生长激素来源的聚腺苷酸化和转录终止序列和最小pUC主链(参见实施例2)。名称“pV 1J/hCEA”指上述构建体，除了该构建体包含野生型人CEA基因而不是经过密码子优化的人CEA基因。
名称“MRKAdS/hCEAopt”和“MRKAdS/hCEA”指此处公开的两种构建体，均含有缺失了E1和E3区的Ad5腺病毒基因组。在“MRKAdS/hCEAopt”构建体中，E1区被经密码子优化的人CEA基因以与E1并行的方向取代，且位于无内含子A的人CMV启动子控制下，之后为牛生长激素聚腺苷酸化信号。“MRKAdS/hCEA”构建体基本如上所述，除了Ad5基因组的E1区被野生型人CEA序列取代(参见实施例2)。
术语“有效量”指足够的疫苗组合物被导入以产生足够水平的多肽，从而发生免疫反应。本领域的技术人员应认可该水平会发生变化。
“保守的氨基酸取代”指一个氨基酸残基被另一个化学上类似的氨基酸残基替代。这样的保守取代的实例为一个疏水性氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或蛋氨酸)被另一个疏水性氨基酸取代；一个极性氨基酸被另一个具有相同电荷的极性氨基酸取代(如精氨酸被赖氨酸取代；谷氨酸被天冬氨酸取代)。
“hCEA”和“hCEAopt”分别指人癌胚抗原和经密码子优化的人癌胚抗原。
术语“hCEA-ΔAD”指缺失了C末端锚定区域(AD)的人CEA变体，该锚定区域位于人全长CEA(SEQ ID NO2)的从约第679个氨基酸到约第702个氨基酸。编码本发明hCEA-ΔAD的核苷酸序列为在人细胞环境中高水平表达进行了密码子优化(此处命名为hCEAopt-ΔAD)。编码锚定区域被截短的CEA变体的代表性DNA分子如SEQ ID NO15(如图10A中所示)。相应的hCEA-ΔAD的氨基酸序列如SEQ ID NO16(如图10B中所示)。编码hCEA-ΔAD的核苷酸可用于癌症疫苗的开发以治疗和/或预防癌症。
术语“哺乳动物”指包括人类在内的任何哺乳动物。
缩写“Ag”指抗原。
缩写“Ab”和“mAb”分别指抗体和单克隆抗体。
缩写“ORF”指基因的开放读码框架。
附图简述图1显示了野生型人CEA cDNA(SEQ ID NO3)和经过密码子优化克隆(hCEAopt，SEQ ID NO1)的核苷酸序列。相应推断的氨基酸序列显示在上方(SEQ ID NO2)。经过密码子优化的合成cDNA的取代核苷酸显示在hCEA cDNA序列下方。参见实施例2。
图2显示了经注射小鼠体内的hCEA表达。10只C57BL/6小鼠组成的实验组被在四头肌注射不同剂量的MRKAdS-hCEA和MRKAd5-hCEAopt(图A)或注射25或50毫克的pV1J/hCEA和pV1J/hCEAopt质粒(图B)。
注射后3天收集血液样品并测定CEA水平。实心三角形代表个体小鼠的CEA测定结果。同时也显示了几何平均值(实心圆形)。
图3显示了密码子优化提高了针对人CEA的免疫反应。8只C57BL/6小鼠组成的实验组被通过四头肌注射不同剂量的MRKAd5-hCEA和MRKAd5-hCEAopt。在第0天和第21天进行病毒注射。图A.加强注射后两周，利用覆盖氨基酸569-583且包含CD8+表位的肽143在来源于个体小鼠的脾细胞上通过ELISPOT试验测定特异性针对hCEA的分泌IFNγ的CD8+T细胞的数量(实心三角形)。实验采用了两种不同数量的脾细胞(2.5×105和5×105)，且每种数量的脾细胞均设两组平行。通过扣除在不存在肽的情况下测定的背景值(通常低于10SFC/106总脾细胞)计算平均值，并将结果表示为SFC数量/106总脾细胞。个体小鼠的数值(实心三角形)及几何平均值(实心圆形)均被显示。图B利用加强后10天的血清样品测定个体小鼠血清的抗CEA抗体滴度(实心三角形)。同时也显示了几何平均滴度(GMT)(实心圆形)。Ad/hCEAopt与Ad/hCEA有显著差异。
图4。不同免疫方案的比较。用pV1J/hCEA质粒(按50tg/剂量电注射到四头肌)和MRKAd5/hCEA质粒(1×109pp/剂量)的不同组合免疫C57BL/6(A)或BALB/c(B)小鼠实验组。采用如材料和方法及图3的图例中描述的覆盖氨基酸497-703(合并物D)的肽合并物测定在每只个体小鼠的脾细胞中分泌IFNγ的T细胞的数量。同时也显示了几何平均值(实心圆形)。在C57BL/6小鼠中D/D和D/A与Ad/Ad组有显著差异。在BALB/c小鼠中所有3个实验组均有显著差异。
图5显示了将T细胞反应定位到hCEA蛋白质特定区域的结果。用50μg pV1J/hCEA质粒免疫C57BL/6(图A)或BALB/c(图B)小鼠实验组并于三周后用1×109pp的Ad/hCEA加强免疫。采用如材料和方法及图3的图例中描述的覆盖整个蛋白质的肽合并物于加强免疫后2周测定在每只个体小鼠的脾细胞中分泌IFNγ的T细胞的数量。同时也显示了几何平均值(实心圆形)。
图6。hCEA免疫反应肽的确定。通过ELISPOT试验分析从4只经免疫的C57BL/6(图片A)或BALB/c(图片B)小鼠收集的脾细胞针对每种所示肽的IFNγ分泌(参见实施例8)。
图7显示了在C57BL/6小鼠(图片A)和BALB/c小鼠(图片B)(参见实施例xx)中含表位的肽的序列。右侧所列为产生IFNγ的CD8+(CD4+)CD3+细胞的比例。
图8显示了如实施例9所描述的经免疫的CEA转基因小鼠的IFNγ-ELISPOT试验结果。采用每次间隔一周的4次电注射质粒DNA，及一次腺病毒注射免疫小鼠。对每种免疫原，用三只经注射小鼠的脾细胞收集物获取数据。利用肽143测定CD8特异性反应。
图9显示了经免疫的CEA.tg.小鼠的IFNγ细胞内染色结果。用每次间隔2周的2次1×1010vp腺病毒注射免疫小鼠。显示了从三只经注射小鼠的脾细胞收集物获得的数据。右侧所列为CD8+或CD4+细胞的比例。
图10，图A显示了如SEQ ID NO15所示的代表性的编码锚着区域被截短的CEA变体、经过密码子优化的DNA分子。hCEA-ΔAD相应的氨基酸序列如图B(SEQ ID NO16)所示。
发明详述癌胚抗原(CEA)通常与腺癌的发展有关。本发明涉及组合物和方法，用于引发和增强针对CEA肿瘤相关抗原表达的蛋白质产物的免疫性，其中异常的CEA表达与腺癌或其发展相关联。异常的CEA表达与癌症的相关性并不要求CEA蛋白质在肿瘤组织生长的全部时间点均被表达，因为异常的CEA表达可能仅存在与肿瘤初始阶段且在肿瘤发展后期无法被检测到，反之亦然。
为此目的，提供了编码人CEA蛋白质的合成DNA分子。
合成分子的密码子经过设计使其被所计划的宿主细胞，在优选的实施方案中为人类细胞，所首选。合成分子可用于开发重组腺病毒或基于质粒的疫苗，以通过中和抗体或细胞介导的免疫性提供针对CEA相关癌症的有效免疫预防。合成分子可被用作免疫原性组合物。本发明提供了多核苷酸，当其被直接导入到包括哺乳动物如灵长类和人类在内的脊椎动物体内时，可诱导编码蛋白质在动物体内的表达。
野生性人CEA核苷酸序列已被报导(参见，如美国专利No.5,274,087；美国专利No.5,571,710号；美国专利No.5,843,761)。本发明提供了编码人CEA蛋白质的合成DNA分子。本发明的合成分子包含核酸序列，其中部分核苷酸被改变以使用被哺乳动物所首选的密码子，从而使CEA在人宿主细胞内高水平表达。该合成分子可被用作CEA蛋白质来源，用于癌症疫苗以通过中和抗体和细胞介导的免疫性提供针对CEA相关癌症的有效免疫预防。
四种可能核苷酸碱基的三联体密码可存在超过60种变体形式。
由于这些密码子仅为20种不同氨基酸提供编码信息(以及转录起始和终止)，因此部分氨基酸可被超过一个密码子所编码，该现象被称为密码子冗余。由于某些不完全了解的原因，可选密码子并不均一地存在于不同类型细胞的内源DNA中。实际上，在某些类型的细胞中对某些密码子似乎存在可变的天然等级或偏好性。例如，亮氨酸可被包括CTA，CTC，CTG，CTT，TTA和TTG在内的6个DNA密码子中任一个所确定。对微生物基因组密码子频率的详尽研究已发现大肠杆菌的内源DNA大部分通常含有CTG亮氨酸指定密码子，而酵母和粘液菌的DNA大部分通常含有TTA亮氨酸指定密码子。考虑到这种等级性，通常认为由大肠杆菌宿主获得富亮氨酸多肽的高水平表达的可能性将某种程度上依赖于所用密码子的频率。例如，富含TTA密码子的基因在大肠杆菌中很可能表达较差，而富含CTG基因在该宿主中很可能高水平表达。类似地，优选的用于在酵母宿主细胞中表达的密码子将是TTA。
密码子偏好性现象对重组DNA技术的意义是显而易见的，并且该现象可用于解释很多之前的失败以实现在成功转化的宿主体内外源基因的高水平表达-偏好性较低的密码子可能重复存在于插入的基因中，宿主细胞的表达机制可能无法有效地发挥作用。该现象说明被设计用来包括所计划的宿主细胞的偏好密码子的合成基因可提供外源遗传物质用于重组DNA技术操作的优化形式。因此，本发明的一个方面是为在人细胞内表达而经过密码子优化的人CEA基因。在本发明的优选实施方案中，已发现采用编码相同蛋白质序列的可选密码子可消除外源CEA蛋白质在人体细胞中表达的限制。
根据本发明，人CEA基因序列被转化为具有相同翻译后序列但使用可选密码子的多核苷酸序列，如Lathe在《从氨基酸序列数据推导的合成寡核苷酸探针理论和实践考量》，J.Molec.Biol.1831-12(1985)中的描述，该文在此引入作为参考。该方法一般由鉴定在野生型序列中通常不与高水平表达的人类基因相关的密码子并将它们替换为优化用于在人体细胞中表达的密码子组成。然后检查新的基因序列中是否存在由于这些密码子替换产生了非所需的序列(例如，”ATTTA”序列，疏忽产生的内含子剪接识别位点，不需要的限制酶位点等)。非所需序列可通过将已存在的密码子用编码相同氨基酸的不同密码子替代而得以消除。然后测试合成基因片段的改善表达情况。
上述方法被用于产生人CEA的合成基因序列，从而得到了包含为高效表达而优化的密码子的基因。尽管上述步骤概述了发明人用于设计经密码子优化基因的方法，该基因用于设计癌症疫苗，本领域技术人员应理解的是类似的疫苗功效或提高的基因表达可通过操作步骤的略微改变或序列的少量变化而得以实现。本领域的技术人员同样应认识到其它的DNA分子也可被构建以在人体细胞内提供CEA的高水平表达，其中仅一部分DNA分子的密码子经过了密码子优化。
相应地，本发明涉及合成多核苷酸，该合成多核苷酸包含编码人CEA蛋白质(SEQ ID NO2)或编码人CEA蛋白质具生物学活性的片段或突变体形式的核苷酸序列，包括但不限于hCEA-ΔAD(SEQ IDNO16)，该多核苷酸序列包含经优化用于在人宿主内表达的密码子。该CEA蛋白质的突变体形式包括但不限于保守氨基酸取代，氨基末端截短，羧基末端截短，缺失或插入，此处总称为“变体”。任何该生物学活性片段和\或突变体将编码特定蛋白质或蛋白质片段，这些蛋白质或蛋白质片段基本上模拟了如SEQ ID NO2所示的CEA蛋白质的免疫学属性。本发明的合成多核苷酸编码表达功能性人CEA蛋白质的mRNA分子，从而可用于治疗性或预防性癌症疫苗的开发。
如上所述，本发明涉及编码人CEA蛋白质(SEQ ID NO2)或生物学活性片段或其突变体形式的核苷酸。为此目的，本发明提供了编码hCEA-ΔAD(SEQ ID NO16，图10B)的核苷酸，该蛋白包含缺失了C末端锚定序列的人CEA蛋白质。本发明编码hCEA-ΔAD的核酸分子为增强在人体细胞内的表达而进行了密码子优化。
编码hCEA-ΔAD的代表性核酸分子包含如SEQ ID NO15(图10A)所示的核苷酸序列。
本发明涉及包括特定核苷酸序列的合成核酸分子(多核苷酸)，该核苷酸序列编码了表达如SEQ ID NO2所示的新型hCEA蛋白质的mRNA，其中该合成核酸分子为在人体细胞内高水平表达而进行了密码子优化。本发明的核酸分子基本不含其它核酸。
本发明也涉及包含本说明书公开核酸分子的重组载体和真核和原核的重组宿主细胞。本发明合成核酸分子，相关载体和宿主可用于癌症疫苗的开发。
本发明优选的DNA分子包含如此处公开为SEQ ID NO1，如图1所示的核苷酸序列，该序列编码如图2和SEQ ID NO2所示的人CEA蛋白质。
本发明进一步优选的DNA分子包含如此处公开为SEQ ID NO15，如图10A所示的核苷酸序列，该序列编码缺失了C末端锚定序列的人CEA变体，如SEQ ID NO16和图10B所示。
本发明也包括SEQ ID NO1的生物学活性片段或突变体，该序列编码可表达人CEA蛋白质的mRNA。任何该生物学活性片段和/或突变体将编码至少基本模拟了hCEA蛋白质药理学属性的蛋白质或蛋白质片段，包括但不限于如SEQ ID NO2所示的hCEA蛋白质。任意该多核苷酸包括但不限于核苷酸取代，缺失，添加，氨基末端截短和羧基末端截短。本发明突变体编码mRNA分子，该分子在真核细胞中表达功能性hCEA蛋白质，使其可用于开发癌症疫苗。
本发明也涉及编码hCEA蛋白质、经密码子优化的合成DNA分子，其中该合成DNA的核苷酸序列显著异于SEQ ID NO1的核苷酸序列，但仍编码了如SEQ ID NO2所示的hCEA蛋白质。
该合成DNA被确定属于本发明范畴。因此，本发明公开了密码子冗余，可导致多种表达相同蛋白质的DNA分子。同样包括在本发明范畴的是DNA序列的突变，该突变基本不改变表达蛋白质的最终物理属性。例如，将缬氨酸取代为亮氨酸、精氨酸取代为赖氨酸或天冬酰胺取代为谷酰胺不会引起多肽的功能性改变。
已知编码肽的DNA序列可被改变以使其编码的肽具有不同于天然存在肽的属性。改变DNA序列的方法包括但不限于定点诱变。所改变属性的实施例包括但不限于酶对底物或受体对配体亲和性的改变。
本发明也涉及hCEAopt融合构建体，包括但不限于表达连接到不同标记的部分人CEA蛋白质的融合构建体，该标记包括但决不限于GFP(绿色荧光蛋白)，MYC表位，GST和Fc。任意该融合构建体可在感兴趣的细胞系中表达并用于筛选此处公开的人CEA蛋白质的调节剂。也考虑了被构建用于增强对人CEA免疫反应的融合构建体，包括但不限于DOM和hsp70和LTB。
本发明进一步涉及包含贯穿本说明书所公开的合成核酸分子的重组载体。这些载体由DNA或RNA组成。对大多数克隆而言，优选DNA载体。典型的载体包括质粒、经过修饰的病毒、杆状病毒、噬菌体、粘粒、酵母人工染色体和其它形式的可编码hCEA蛋白质的游离或整合的DNA。确定适合特定基因转移或其它用途的载体属于本领域技术人员的范围。
含有编码hCEA蛋白质、经密码子优化DNA的表达载体可被用于在重组宿主体内高水平表达hCEA。表达载体可包括但不限于克隆载体、经修饰的克隆载体、特别设计的质粒或病毒。同样，如果需要，多种细菌表达载体可被用于在细菌细胞内表达重组hCEA。另外，多种真菌细胞表达载体可被用于在真菌细胞中表达重组hCEA。此外，多种昆虫细胞表达载体可被用于在昆虫细胞内表达重组蛋白质。
本发明也涉及用包含本发明核酸分子的载体转化或转染的宿主细胞。重组宿主细胞可以是真核或原核的，包括但不限于细菌如大肠杆菌，真菌细胞如酵母，哺乳动物细胞包括但不限于牛、猪、猴和啮齿动物来源的细胞系以及昆虫细胞包括但不限于果蝇和蚕来源的细胞系。这样的重组宿主细胞可于合适的条件下培养以产生hCEA或生物学等效形式。在本发明的优选实施方案中，宿主细胞是人。如此处所定义的，术语“宿主细胞”不打算包括转基因人类、转基因胎儿或转基因胚胎体内的宿主细胞。
如上所述，包含hCEA蛋白质的编码DNA的表达载体可被用作在重组宿主体内表达hCEA。因此，本发明另一方面是在重组宿主体内表达人CEA蛋白质或蛋白质变体的方法，包括(a)将包含如ID NO1或ID NO15所示核酸的载体导入合适的人细胞系；并(b)在容许该人CEA蛋白质或CEA蛋白质变体表达的条件下培养该宿主细胞。
在hCEA于宿主细胞内表达后，hCEA蛋白质可被回收以提供活性形式的hCEA蛋白质。已有多种可用的hCEA蛋白质纯化步骤。重组hCEA蛋白质可通过盐分级、离子交换层析、尺寸排阻层析、羟基磷灰石吸附层析和疏水相互作用层析的单一或多种组合应用而从细胞裂解液中被纯化。此外，重组hCEA蛋白质可通过使用免疫亲和柱从其他细胞蛋白中被分离，该免疫亲和柱用特异性针对全长hCEA蛋白质或hCEA蛋白质的多肽片段的单克隆或多克隆抗体制备。
本发明核酸可被组装进表达盒，该表达盒包含被设计用来提供蛋白质在人体细胞内有效表达的序列。
该表达盒优选含有全长、经密码子优化的hCEA基因，和与之可操作连接的相关转录和翻译控制序列，如启动子和终止序列。
在优选实施方案中，启动子是无内含子A序列的巨细胞病毒启动子(CMV)，尽管本领域技术人员将认识到任意其它已知启动子如强免疫球蛋白、或其它真核基因启动子也可被采用。优选的转录终止子是牛生长激素终止子，尽管其它已知转录终止子也可被采用。CMV-BGH终止子的的组合是尤其优选的。
根据本发明，hCEAopt表达盒被插入到载体中。载体优选为腺病毒载体，虽然连接到启动子或其它载体如腺相关病毒或修饰的牛痘病毒、逆转录或慢病毒载体的线性DNA也可被采用。
如果所选载体为腺病毒，则优选被称为第一代腺病毒载体。这些腺病毒载体特征在于具有无功能E1基因区和优选的被缺失的腺病毒E1基因区。在一些实施方案中，表达盒被插入到正常腺病毒E1区定位的位置上。此外，这些载体任选地具有无功能或被缺失的E3区。所用腺病毒基因组的E1和E3区均被缺失是优选的(AE1AE3)。腺病毒可于表达病毒E1基因的已知细胞系，如293细胞或PERC.6细胞或来源于293或PERC.6细胞内被扩增，这些细胞系被短暂或稳定转化以表达额外的蛋白质。例如，当采用具有受控基因表达，如四环素可调节启动子系统的构建体时，细胞系可表达参与调节系统的组分。该细胞系的一个实例是T-Rex-293；其它实例为本领域所知。
为腺病毒载体的操作方便性，腺病毒可以是穿梭质粒形式。本发明也指向包含质粒部分和腺病毒部分的穿梭质粒载体，腺病毒部分包含具E1和可选E3缺失的腺病毒基因组，并具有包含经密码子优化的人hCEA的插入表达盒。在优选实施方案中，质粒的腺病毒部分侧翼具有限制位点，使得腺病毒载体可被方便移除。该穿梭质粒可在原核或真核细胞内复制。
在本发明优选的实施方案中，表达盒被插入pMRKAd5-HVO腺病毒质粒(参见Emini等，WO 02/22080，在此引入作为参考)。该质粒包含缺失了E1和E3区的Ad5腺病毒基因组。通过将5’顺式作用包装区域延伸到E1基因区以并入对优化病毒包装重要的元件对pMRKAd5-HVO质粒的设计进行改良，从而增强了病毒的复制。该加强的腺病毒载体能够方便地在高代繁殖后维持遗传稳定性。
用于制备和纯化DNA构建体的标准分子生物学技术使本发明腺病毒、穿梭质粒和DNA免疫原得以制备。
根据本发明已经确定此处所述的合成cDNA分子(SEQ ID NO1)比相应野生型序列具有更高的表达效率，该合成cDNA分子为在人体细胞内高水平表达进行了密码子优化。令人惊讶地，经密码子优化的hCEA的cDNA比野生型序列更为有效地打破了对hCEA的耐受性。此外，此处已显示hCEAopt比hCEA免疫原性更高，且在引发细胞和体液免疫反应方面更为有效。
因此，上述载体可被用于免疫原性组合物和疫苗，以预防与异常CEA表达相关的腺癌和\或治疗现有癌症。通过消除与获得在成功转化宿主生物体内外源CEA高水平相关的难题，本发明载体有助于疫苗的开发和商业化。为此目的，本发明的一个方面是一种预防或治疗癌症的方法，包括给哺乳动物施用包含经密码子优化的合成核酸分子的疫苗载体，该经密码子优化的合成核酸分子包含编码了如SEQ IDNO2所示人CEA蛋白质的核酸序列。
根据上述方法，为预防或治疗任意哺乳动物体内的癌症，疫苗载体可被施用。在本发明的优选实施方案中，哺乳动物是人类。
本领域技术人员可进一步选择用于上述治疗和预防方法的任意类型的载体。该载体优选为腺病毒载体或质粒载体。在本发明优选实施方案中，该载体为腺病毒载体，包含具腺病毒E1区缺失和腺病毒E1区插入的腺病毒基因组，其中该插入包含表达盒，该表达盒包含(a)经密码子优化、编码人CEA蛋白质的合成多核苷酸；和(b)与该多核苷酸可操作连接的启动子。
本发明进一步涉及包含具E1区缺失和E1区插入的腺病毒基因组的腺病毒疫苗载体，其中该插入包含表达盒，该表达盒包含(a)经密码子优化、编码人CEA蛋白质的合成多核苷酸；和(b)与该多核苷酸可操作连接的启动子。
本发明该方面的优选实施方案中，腺病毒载体是Ad 5载体。
在本发明另一优选实施方案中，腺病毒载体是Ad 6载体。
在又一优选实施方案中，腺病毒载体是Ad 24载体。
在另一方面，本发明涉及包含质粒部分和表达盒部分的疫苗质粒，该表达盒部分包含(a)经密码子优化的编码人CEA蛋白质或其变体的合成多核苷酸；和(b)与该多核苷酸可操作连接的启动子。
在本发明的一些优选实施方案中，此处公开的重组腺病毒疫苗与基于质粒的多核苷酸疫苗一起被用于各种激发\加强组合中，以诱导增强的免疫反应。因此，这两种载体以“激发和加强”方案被施用。例如，第一种载体被施用后，经过一段预定时间，例如2周、1个月、2个月、6个月或其它适当间隔后，施用第二种载体。载体优选地携带编码相同多核苷酸或多核苷酸组合的表达盒。在也使用了质粒DNA的实施方案中，优选的载体含有一个或多个可被哺乳动物或昆虫细胞识别的启动子。在优选实施方案中，质粒将含有强启动子，例如，但不限于CMV启动子。合成的人CEA基因或其它待表达基因将被连接到该启动子。该质粒的实例是如(J.Shiver等.在《DNA疫苗》，M.Liu等编辑，N.Y.Acad.Sci.，N.Y.，772198-208(1996)，在此引入作为参考)描述的哺乳动物表达质粒Vains。
如上所述，腺病毒载体疫苗和质粒疫苗可被作为单一治疗方案的组成部分，施用给脊椎动物以诱导免疫反应。为此目的，本发明涉及保护哺乳动物免患癌症的方法，包括(a)将第一种载体导入哺乳动物，该载体包含i)经密码子优化的编码人CEA蛋白质或人CEA蛋白质变体的合成多核苷酸；和ii)与该多核苷酸可操作连接的启动子；(b)允许经过一段预定时间；和(c)将第二种载体导入哺乳动物；该载体包含i)经密码子优化的编码人CEA蛋白质或人CEA蛋白质变体的合成多核苷酸；和ii)与该多核苷酸可操作连接的启动子；在上述保护方法的一个实施方案中，第一种载体是质粒，第二种载体是腺病毒载体。在可选实施方案中，第一种载体是腺病毒载体，第二种载体是质粒。
本发明进一步涉及治疗患有腺癌的哺乳动物的方法，包括(a)将第一种载体导入哺乳动物，该载体包含i)经密码子优化的编码人CEA蛋白质或人CEA蛋白质变体的合成多核苷酸；和ii)与该多核苷酸可操作连接的启动子；(b)允许经过一段预定时间；和(c)将第二种载体导入哺乳动物；该载体包含i)经密码子优化的编码人CEA蛋白质或人CEA蛋白质变体的合成多核苷酸；和ii)与该多核苷酸可操作连接的启动子；在上述保护方法的一个实施方案中，第一种载体是质粒，第二种载体是腺病毒载体。在可选实施方案中，第一种载体是腺病毒载体，第二种载体是质粒。
待导入到疫苗受者的可表达DNA或转录RNA数量将部分依赖于所用启动子的强度和所表达基因产物的免疫原性。一般而言，约1ng到100gm，优选约10μg到300μg质粒疫苗载体的免疫学或预防性有效剂量被直接使用到肌肉组织中。对重组腺病毒的有效剂量是约106-1012个颗粒，优选约107-1011个颗粒。皮下注射、真皮内导入、皮肤压迫和其它给药方式如腹膜内、静脉内或吸入送递也被考虑。同样也考虑了提供加强接种。结合佐剂如白细胞介素12蛋白质的非肠道给药，如静脉内、肌肉内、皮下或其它给药方式与本发明疫苗的非肠道给药同时或随后进行也具有优势。
本发明的疫苗载体可以是裸露的，即不与任何对受者免疫系统有影响的蛋白质、佐剂或其它药剂结合。为此，理想的疫苗载体是在生理学可接受溶剂内，例如，但不限于无菌生理盐水或无菌缓冲盐水。可选地，与本发明疫苗或免疫原组合物同时施用免疫刺激剂，如佐剂、细胞因子、蛋白质或其它载体也是有优势的。因此，本发明包括与本发明组合物和方法联合应用该免疫刺激剂。此处所用的免疫刺激剂，基本上指任何增强或加强针对外源抗原的免疫反应(抗体和\或细胞介导的)的任何物质。该免疫刺激剂可以DNA或蛋白质形式被施用。多种免疫刺激剂的任一种均可被与本发明的疫苗和免疫原组合物联合应用，包括但不限于GM-CSF、IFNγ、破伤风类毒素、IL12、B7.1、LFA-3和ICAM-1。该免疫刺激剂为本领域所熟知。
可辅助DNA细胞摄取的药剂，例如但不限于钙离子，也可被应用。这些药剂通常指作为转染促进剂和药学可接受载体。本领域技术人员将能够确定特定的免疫刺激剂或药学可接受载体以及合适的时间和给药模式。
为了描述和公开可能连同本发明应用的方法和材料，此处提及的所有出版物均被引入作为参考。此处无任何内容可以被认为承认本发明由于之前的发明而未被授权将本公开内容提前。
在参考附图描述了本发明优选实施方案后，应理解本发明不受限于那些准确的实施方案，且在不偏离如在附录权利要求中定义的本发明范围和精神前提下，本领域技术人员可实施各种改变和修正。
下列实施例例证了但不限制本发明。
实施例1人CEA优化的密码子序列完整的hCEAopt编码序列通过BIONEXIS(Oakland，CA)合成和组装。采用由PCR组装的寡核苷酸构建在5’末端携带有经优化的Kozak序列的hCEAopt cDNA。组装的cDNA被插入到pCR-钝端载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)，以产生pCR-hCEAopt。hCEAopt cDNA的完整性通过对两条链的测序确定。
实施例2质粒构建体和腺病毒载体pV1J/hCEAopt用EcoRI于37℃消化pCR-hCEAopt质粒1小时。得到的2156bp插入序列经纯化并克隆到pV1JnsB质粒(Montgomery等，DNA Cell Biol.，12(9)777-83(1993)的EcoRI位点。
pV1J/hCEA用EcoRI消化pCI/hCEA质粒(Song等，通过组合的基于DNA的免疫接种和非病毒细胞因子基因转移调节T-辅助-1对T-辅助-2活性及增强肿瘤免疫性。Gene Therapy 7481-492(2000))。得到的2109bp插入序列被克隆到pV1JnsA质粒(Montgomery等，如前)的EcoRI位点。
Ad5/hCEAopt用EcoRI消化pCR-hCEAopt质粒。得到的2156bp的插入序列经纯化并克隆到polyMRK-Ad5穿梭质粒的EcoRI(参见Emini等，WO02/22080，在此引入作为参考)。
Ad5/CEA用于产生Ad5载体的pMRK-hCEA穿梭质粒获得自采用SspI和EcoRV消化pDeltalsplB/hCEA质粒。然后将9.52kb的片段连接到来自polyMRK质粒、BglII-BamHI限制性、1272bp的Klenow处理产物上。在大肠杆菌BJ5183细胞中将来自pMRK-hCEA和pMRK-hCEAopt、包含用于hCEA的表达盒和E1侧翼Ad5区域的Pacl/StuI片段与ClaI线性化的pAd5质粒重组。得到的质粒分别为pAdS-hCEA和pAd5-hCEAopt。两种质粒均用Pad酶切以释放Ad反转末端重复(ITRs)并转染PerC-6细胞。采用系列传代进行Ad5载体的扩增。通过标准CsCl梯度纯化方法纯化并用A105缓冲液(5mMTris-Cl pH 8.0，1mM MgCl2，75mM NaCI，5％蔗糖，0.005Tween20)充分透析MRKAdS/hCEA和MRKAdS/hCEAopt。
实施例3CEA表达和检测采用蛋白质印迹分析检测由质粒和Ad载体的hCEA表达。采用Lipofectamine 2000(Life Technologies，Carlsbad，CA)将质粒转染到Hela细胞或Perc.6细胞中。Perc.6细胞的腺病毒感染在37℃下于无血清培养基中进行30分钟，然后加入新鲜培养基。温育48小时后，收集全细胞裂解物和培养上清。通过蛋白质印迹分析采用兔多克隆抗体检测细胞裂解物中存在的CEA蛋白质。蛋白质被检测为180-220kDa条带。采用直接酶联免疫吸附试验CEA试剂盒(DBC-DiagnosticsBiochem Canada Inc.，Ontario，Canada)检测在细胞上清和经注射小鼠(注射后3天)外周血中分泌的CEA。
实施例4小鼠免疫雌性C57BL/6小鼠(H-2b)购自Charles River(Lecco，Italy)。CEA.tg小鼠(H-2b)由J.Primus(Vanderbilt University)提供并与标准条件下保存。按照以前所描述的方法(Rizzuto等，.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(11)6417-22(1999))将50μg质粒DNA以50μl体积电注射到小鼠四头肌中。在小鼠四头肌中以50μl体积进行Ad注射。在指定时间分析体液和细胞介导的免疫反应。
实施例5经密码子优化的hCEA的cDNA显著提高hCEA的表达人CEA(hCEAopt)的合成基因被设计以并入针对每种氨基酸(下文表示为aa)残基的人类首选密码子。经密码子优化的cDNA被修饰以维持与原始克隆76.8％的同一性(参见图1)。经密码子优化的cDNA被克隆到pV 1J载体中(Montgomery等，如前)，并置于Kozak优化序列(5′-GCCGCCACC-3′，SEQ ID NO13)之前，且位于人巨细胞(CMV)/内含子A启动子和牛生长激素(BGH)终止信号的控制下。
该构建体被命名为pV 1J/hCEAopt(参见实施例2)。此外，构建了携带hCEAopt序列的腺病毒5型载体(Ad5/hCEAopt)，该hCEAopt序列由CMV/内含子和BGH终止信号位于侧翼。为进行比较，携带有野生型hCEA序列的相应的质粒和Ad5载体被构建并产生pV1J/hCEA和Ad5/hCEA。与含有经密码子优化cDNA的载体类似，这些载体携带有位于CMV/int A启动子和BGH终止信号控制下的野生型基因。
对用pV1J/hCEAopt转染的Hela细胞进行的蛋白质印迹分析产生了具有较大分子量(180-200kDa)的蛋白质，该蛋白质在体积上与在pV1J/hCEA构建体转染细胞中所检测的难以区别。类似地，用Ad5/hCEA或Ad5H7hCEAopt转染的PerC-6细胞的上清液中检测到的蛋白质在体积上也没有明显差异(数据未显示)。
为比较hCEAopt和hCEA的表达效率，用1×107到1×104pfu的不同剂量的Ad5/hCEAopt载体注射到10只C57BL/6小鼠的实验组的四头肌内。注射后三天，测定CEA蛋白质水平并与对照组的蛋白质水平进行比较，该对照组被注射了相同剂量的Ad5/hCEA。与注射Ad5/hCEA的小鼠相比，观察到注射1×107pfu Ad/hCEAopt(48.2μg/l)后，hCEA水平的几何平均值提高了6倍，而注射了1×106pfu相同病毒(19.1μg/l)后蛋白质水平提高了10倍(图2A)。与之对照，与Ad5/hCEA相比，注射较低剂量的Ad5/hCEAopt基本未导致循环CEA水平的提高。相对于pV 1J/hCEA，在电注射20或50μgpV1J/hCEAopt质粒后CEA蛋白质水平的增加虽然程度稍低，但也很显著(图2B)。因此，这些结果说明，经密码子优化的cDNA与相应的野生型序列相比具有更高的表达效率，不受所用基因转移载体的限制。
实施例6IFN-γELISPOT分析用在无菌PBS中稀释为2.5μg/ml的纯化兔抗鼠IFN-γ((IgGl，克隆R4-6A2，Pharmingen，San Diego，CA)按100μl/孔包被96孔MAIP平板(Millipore，Bedford，MA)。经PBS洗涤后，用220μl/孔的R10培养基于37℃封闭平板2小时。
通过以无菌方式从无痛致死小鼠移除脾脏以获得脾细胞。通过在金属网上磨碎经分割的脾脏进行脾脏粉碎。通过在细胞沉淀物中加入1ml 0.1×PBS进行渗透裂解并旋涡振荡不超过15秒以除去红细胞。然后加入1ml 2×PBS并用1×PBS将体积调整为4ml。
通过室温下1200rpm离心10分钟以沉淀细胞，并于1ml RIO培养基中重新悬浮沉淀物。用Turks染色计数活细胞。
脾细胞以5×105和2×105细胞/孔浓度铺培养板，每个浓度设两组平行，并与1μg/ml每种肽的悬液于37℃温育20小时。对每只小鼠用5μg/ml的Concanavalin A(ConA)作为阳性内参。用含0.05％Tween20的PBS洗涤后，用50μl/孔、于试验缓冲液中按1∶2500稀释的生物素偶联的兔抗鼠IFN-γ(RatIgGl，clone XMG 1.2，PharMingen)于4℃温育平板过夜。经充分洗涤后，加入50μl/孔NBT-CIP(PierceBiotechnology Inc.，Rockford，IL)显影平板，直到斑点显影清晰可见为止。
通过用蒸馏水充分洗涤细胞平板以终止反应。将平板在空气中干燥并用自动ELISPOT读板机计数斑点。
实施例7细胞内细胞因子染色将1ml RPMI 10％FCS中的一到两百万个小鼠脾细胞或PBMC与肽合并物(每种肽终浓度为5-6μg/ml)、brefeldin A(1μg/ml，BD Pharmingen cat #555028/2300kk)和5％CO2一起于37℃温育12-16小时。然后用FACS缓冲液(PBS 1％ FBS，0.01％ NaN3)洗涤细胞并将细胞与纯化抗鼠CD16/CD32 Fc block(BD Pharmingen cat #553142)一起于4℃温育15分钟。接着洗涤细胞并用表面抗体CD4-PE偶联抗鼠(BD Pharmingen，cat.# 553049)、PercP CD8偶联抗鼠(BD Pharmingen cat# 553036)和APC偶联抗鼠CD3e(BDPharmingen cat# 553066)，于暗处室温对细胞进行30分钟染色。经洗涤后，用Cytofix-Cytoperm溶液(BD Pharmingen cat#555028/2300kk)固定化并渗透细胞。用PermWash溶液(BDPharmingen cat #555028/2300kk)洗涤细胞后，将细胞与IFNγ-FITC抗体(BD Pharmingen)温育。然后洗涤细胞、用含1％甲醛的PBS进行固定化并于FACS-Calibur流式细胞仪上用CellQuest软件(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行分析。
实施例8用于CEA特异性T细胞直接计数的含表位的肽的鉴定和表征为更好的表征在小鼠内针对CEA的遗传接种所引发的免疫反应，对C57BL/6和BALB/c进行ELISPOT分析以鉴定CD4+和CD8+CEA特异性表位。为此目的，比较了不同的免疫程式以产生高度免疫的小鼠，该小鼠可被用于鉴定对覆盖整个蛋白质的个体肽的反应。考虑到最近的报导显示通过采用质粒DNA初次免疫-Ad加强免疫程式可诱导针对病毒和细菌抗原的高水平细胞免疫，本研究中采用了相同的免疫模式。用不同的方式肌肉内免疫小鼠i)两剂1×109vp的Ad/hCEA(Ad/Ad)；ii)两剂pV1J/hCEA质粒(DNA/DNA)和iii)一剂质粒DNA，之后一剂Ad/hCEA(DNA/Ad)。免疫时间间隔为两周。
在加强免疫两周后通过ELISPOT测定由不同免疫方案引发的细胞免疫。为比较不同接种方案的免疫原性效率，采用覆盖氨基酸497-703、重叠11个氨基酸的15mer肽合并物(合并物D)激发由脾细胞分泌的抗原特异性细胞因子。在DNA/Ad注射组的C57BL/6和BALB/c小鼠中观察到由较高的SFC几何平均值所显示的最强的反应(图4)。因此，该方法被用于进一步分析免疫反应。
为确定免疫反应是否等量分布于整个CEA蛋白质上，用完全覆盖整个蛋白质序列的4个15mer肽合并物中的1个于体外激发来自经免疫的C57BL/6和BALB/c小鼠的脾细胞。每个合并物由重叠11个残基、15个氨基酸长的肽组成。冻干的hCEA肽购自Bio-Synthesis(Lewisville，TX)并以40mg/ml重悬于DMSO中。除了合并物D以外，合并物A(氨基酸1到47)、B(氨基酸137到237)和C(氨基酸317到507)也都被用于本研究。终浓度如下合并物A＝1.2mg/ml、合并物B＝0.89mg/ml、合并物C＝0.89mg/ml、合并物D＝0.8mg/ml。肽保存于-80℃。
在C57BL/6小鼠中由DNA/Ad接种方案引发的免疫反应明显地偏向蛋白质的C末端区域(参见图5A)。用肽合并物C和D获得了显著的SFC数值(几何平均值分别为170和244SFC/106脾细胞)，而合并物A和B产生了低得多的数值(分别为10和27SFC/106脾细胞)。相反地，在BALB/c小鼠中用合并物B得到的免疫反应最高(几何平均值1236SFC/106脾细胞)，尽管合并物A、C和D也显示了显著的SFC数值(分别为93、263和344)(图5B)。在两组小鼠中针对无关肽合并物无显著的反应(数据未显示)。
为确定肽合并物中引发反应的个体肽，针对每种个体肽用IFNγ-ELISPOT试验分析4只用DNA/Ad接种方案免疫的小鼠的脾脏，这些肽包含了观察到显著免疫反应的肽合并物。针对包括在合并物C和D中的肽80到173测试了来自C57BL/6小鼠的脾细胞。对包含合并物B、C和D的肽35到173测试了来自BALB/c小鼠的脾细胞。C57BL/6小鼠中的CEA特异性反应被定位到4对具有重叠序列的15mer肽(氨基酸431到435和425到439；529到543，和533到547；565到579，和569到593；613到627和617到631)(图6A)。在BALB/c小鼠中免疫反应被定位到22个不同的肽，其中17个具有重叠序列(氨基酸213到227，和213到227；229到243，和233到247；409到423和413到427；421到435和425到439；565到579和569到583；573到587；613到627和617到631；和621到635和625到639；637到651和641到655)(图6B)。
为定义所选肽中含有的表位的T细胞特异性，在来自经注射小鼠的脾细胞上进行IFNγ细胞内染色试验。获得的结果如图7所示。数据说明已鉴定了C57BL/6和BALB/c小鼠的CD8+和CD4+特异性表位，可被用于定量T淋巴细胞的循环水平。
实施例9经密码子优化的hCEA cDNA打破了hCEA转基因小鼠的耐受性为确定经密码子优化的hCEA cDNA增强的免疫原属性是否会更为有效地打破对人CEA的耐受性，用携带有野生型或经密码子优化的hCEA序列的载体免疫hCEA转基因小鼠。这些转基因小鼠携带有完整的人CEA基因以及侧翼序列且在盲肠和结肠表达hCEA蛋白质。因此，该小鼠细胞系对研究针对该肿瘤自身抗原的免疫治疗策略的安全性和有效性而言是有用的模型(Clarke等.人CEA转基因小鼠作为免疫治疗模型，Cancer Res.58(7)1469-77(1998))。
首先，用4次50μg质粒DNA电注射处理5到10只转基因小鼠的实验组，随后终注射1×1010pp腺病毒。用IFNγ-ELISPOT实验在收集自4只经注射小鼠的脾细胞上分析对hCEA的免疫反应。仅用来自hCEAopt cDNA免疫小鼠的脾细胞检测到了对hCEA的免疫反应(参见图8)。用肽143和合并物D检测到免疫反应，说明免疫已引发了对C末端表位引发显著的Cd8+反应。
在用间隔两周的两次1×1010pp腺病毒载体注射的转基因小鼠中也测试了经密码子优化的hCEA cDNA的增强的免疫原性。用IFNγ细胞内染色在收集自4只经免疫小鼠的PBMC上测定CEA特异性免疫反应。仅在Ad/CEAopt免疫的小鼠中检测到了对hCEA的免疫反应(图9)。如在DNA加Ad组中所观察到的，用肽合并物D检测到CD8+T细胞的诱导；但用肽合并物A也观察到显著的CD8+反应。因此，这些结果说明经密码子优化的hCEA cDNA比野生型序列免疫原性更高且更为有效地打破对hCEA的耐受性。
实施例10抗体检测和滴定用于抗体滴定的血清获得自后眼眶取血。用稀释于包被缓冲液(50mM NaHCO3，pH 9.4)中的CEA蛋白质(高纯CEA；FitzgeraldIndustries International Inc.，Concord MA)按100ng/孔包被ELISA平板((Nunc maxisorpTM)并于4℃温育过夜。然后用含有5％BSA的PBS于37℃封闭平板1小时。于5％BSA的PBS中稀释小鼠血清(稀释50倍以评估血清转化率；稀释度从1∶10到1∶31，2150以评估滴度)。免疫前血清用作背景。稀释的血清于4℃温育过夜。
用含1％BSA、0.05％Tween 20的PBS进行洗涤。二级抗体(羊抗鼠，IgG过氧化物酶，Sigma)于含5％BSA的PBS中稀释2000倍并于室温下在摇床上温育2-3小时。洗涤后，将平板用TMB底物(PierceBiotechnology，Inc.，Rockford，IL)按100μl/孔显影。用25μl/孔的1M H2SO4溶液终止反应并于450nm/620nm读板。抗CEA血清滴度被计算为血清极限稀释度的倒数，在该极限稀释度下血清产生的吸光度比相同稀释度自体免疫前血清的吸光度至少大3倍。
实施例11提高的hCEAopt免疫原性为检测由野生型和经密码子优化CEA表达载体诱导的体内免疫反应，用1×105到1×103pfu范围内不同剂量的Ad5/hCEAopt肌肉内免疫C57BL/6小鼠。作为比较，用1×106到1×104pfu范围内剂量的Ad5/hCEA免疫8到10只小鼠的实验组。用间隔3周的两次注射处理小鼠。第二次免疫后2周，从每只小鼠中分离脾细胞。为定量由腺病毒介导的免疫产生的分泌IFNγ的CEA特异性CD8T细胞前体频率，用于H-2b限制T细胞表位CGIQNSVSA(SEQ ID NO14，参见下文)的ELISPOT实验被采用。1×104pfu的免疫引发了可测量的免疫反应，产生了53个特异于CGIQNSVSA表位(SEQ ID NO14)的IFNγ斑点形成细胞(SFC，几何平均值)，而注射1×103pfu仅引发了可忽略的SFC数值(图3A)。SFC在用1×105pfu Ad/hCEAopt免疫的实验组中增加到302。相反地，至少需要1×105pfu Ad5/hCEA才能引发显著的CD8T细胞前体频率，该频率在用1×106pfu剂量免疫的小鼠实验组中增加到168SFC。在Ad5免疫的小鼠中未检测到肽特异性IFNγ(数据未显示)。
在ELISA中用纯化的人CEA蛋白质作为底物测试来自用1×105pfu每种hCEA腺病毒载体免疫的小鼠的血清(图3B)。在所有经免疫小鼠中均检测到Ad5/hCEAopt免疫小鼠的CEA特异性抗体滴度，且Ab滴度的几何平均值为46，474。相反地，Ad5/hCEA免疫的实验组显示了约低100倍的CEA特异性抗体滴度几何平均值(454)。因此，这些数据证明经密码子优化的CEA cDNA在引发细胞和体液免疫反应方面更为有效。
实施例12统计学分析该实施例所示结果是通过斯氏t检验分析的。小于0.05的p值被认为是显著的。
序列表<110>Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolar P.Angeletti S.P.A.
Lamonica，NicolaMennuni，CarmelaSavino，RoccoLahm，Armin<120>编码人癌胚抗原的合成基因及其用途<130>ITR0044Y<150>60/467,971<151>2003-05-05<150>未知的<151>2004-02-11<160>16<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>2109<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hCEAopt<400>1atggagagcc ccagcgcccc cccccaccgc tggtgcatcc cctggcagcg cctgctgctg 60accgccagcc tgctgacctt ctggaacccc cccaccaccg ccaagctgac catcgagagc 120acccccttca acgtggccga gggcaaggag gtgctgctgc tggtgcacaa cctgccccag 180cacctgttcg gctacagctg gtacaagggc gagcgcgtgg cggcaaccg ccagatcatc 240ggctacgtga tcggcaccca gcaggccacc cccggccccg cctacagcgg ccgcgagatc 300atctacccca acgccagcct gctgatccag aacatcatcc agaacgacac cggcttctac 360accctgcacg tgatcaagag cgacctggtg aacgaggagg ccaccggcca gttccgcgtg 420taccccgagc tgcccaagcc cagcatcagc agcaacaaca gcaagcccgt ggaggacaag 480gacgccgtgg ccttcacctg cgagcccgag acccaggacg ccacctacct gtggtgggtg 540aacaaccaga gcctgcccgt gagcccccgc ctgcagctga gcaacggcaa ccgcaccctg 600accctgttca acgtgacccg caacgacacc gccagctaca agtgcgagac ccagaacccc 660gtgagcgccc gccgcagcga cagcgtgatc ctgaacgtgc tgtacggccc cgacgccccc 720accatcagcc ccctgaacac cagctaccgc agcggcgaga acctgaacct gagctgccac 780gccgccagca acccccccgc ccagtacagc tggttcgtga acggcacctt ccagcagagc 840acccaggagc tgttcatccc caacatcacc gtgaacaaca gcggcagcta cacctgccag 900gcccacaaca gcgacaccgg cctgaaccgc accaccgtga ccaccatcac cgtgtacgcc 960gagcccccca agcccttcat caccagcaac aacagcaacc ccgtggagga cgaggacgcc 1020gtggccctga cctgcgagcc cgagatccag aacaccacct acctgtggtg ggtgaacaac 1080
cagagcctgc ccgtgagccc ccgcctgcag ctgagcaacg acaaccgcac cctgaccctg 1140ctgagcgtga cccgcaacga cgtgggcccc tacgagtgcg gcatccagaa cgagctgagc 1200gtggaccaca gcgaccccgt gatcctgaac gtgctgtacg gccccgacga ccccaccatc 1260agccccagct acacctacta ccgccccggc gtgaacctga gcctgagctg ccacgccgcc 1320agcaaccccc ccgcccagta cagctggctg atcgacggca acatccagca gcacacccag 1380gagctgttca tcagcaacat caccgagaag aacagcggcc tgtacacctg ccaggccaac 1440aacagcgcca gcggccacag ccgcaccacc gtgaagacca tcaccgtgag cgccgagctg 1500cccaagccca gcatcagcag caacaacagc aagcccgtgg aggacaagga cgccgtggcc 1560ttcacctgcg agcccgaggc ccagaacacc acctacctgt ggtgggtgaa cggccagagc 1620ctgcccgtga gcccccgcct gcagctgagc aacggcaacc gcaccctgac cctgttcaac 1680gtgacccgca acgacgcccg cgcctacgtg tgcggcatcc agaacagcgt gagcgccaac 1740cgcagcgacc ccgtgaccct ggacgtgctg tacggccccg acacccccat catcagcccc 1800cccgacagca gctacctgag cggcgccaac ctgaacctga gctgccacag cgccagcaac 1860cccagccccc agtacagctg gcgcatcaac ggcatccccc agcagcacac ccaggtgctg 1920ttcatcgcca agatcacccc caacaacaac ggcacctacg cctgcttcgt gagcaacctg 1980gccaccggcc gcaacaacag catcgtgaag agcatcaccg tgagcgccag cggcaccagc 2040cccggcctga gcgccggcgc caccgtgggc atcatgatcg gcgtgctggt gggcgtggcc 2100ctgatctga 2109<210>2<211>702<212>PRT<213>智人<400>2Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln1 5 10 15Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr20 25 30Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly35 40 45Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly50 55 60Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile65 70 75 80Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser85 90 95Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile100 105 110Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp115 120 125Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu130 135 140Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys145 150 155 160Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr165 170 175Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln180 185 190Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn195 200 205Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg210 215 220Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro
225 230 235 240Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn245 250 255Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe260 265 270Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn275 280 285Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser290 295 300Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala305 310 315 320Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu325 330 335Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr340 345 350Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg355 360 365Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr370 375 380Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser385 390 395 400Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp405 410 415Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn420 425 430Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser435 440 445Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile450 455 460Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn465 470 475 480Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val485 490 495Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro500 505 510Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln515 520 525Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser530 535 540Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn545 550 555 560Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser565 570 575Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly580 585 590Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly595 600 605Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln610 615 620Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu625 630 635 640Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe645 650 655Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile660 665 670
Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr675 680 685Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile690 695 700<210>3<211>2109<212>DNA<213>智人<400>3atggagtctc cctcggcccc tccccacaga tggtgcatcc cctggcagag gctcctgctc 60acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg ccaagctcac tattgaatcc 120acgccgttca atgtcgcaga ggggaaggag gtgcttctac ttgtccacaa tctgccccag 180catctttttg gctacagctg gtacaaaggt gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattata 240ggatatgtaa taggaactca acaagctacc ccagggcccg catacagtgg tcgagagata 300tatacccca atgcatccct gctgatccag aacatcatcc agaatgacac aggattctac 360accctacacg tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caactggcca gttccgggta 420tacccggagc tgcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaacccgt ggaggacaag 480gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcaggacg caacctacct gtggtgggta 540aacaatcaga gcctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa caggaccctc 600actctattca atgtcacaag aaatgacaca gcaagctaca aatgtgaaac ccagaaccca 660gtgagtgcca ggcgcagtga ttcagtcatc ctgaatgtcc tctatggccc ggatgccccc 720accatttccc ctctaaacac atcttacaga tcaggggaaa atctgaacct ctcctgccac 780gcagcctcta acccacctgc acagtactct tggtttgtca atgggacttt ccagcaatcc 840acccaagagc tctttatccc caacatcact gtgaataata gtggatccta tacgtgccaa 900gcccataact cagacactgg cctcaatagg accacagtca cgacgatcac agtctatgca 960gagccaccca aacccttcat caccagcaac aactccaacc ccgtggagga tgaggatgct 1020gtagccttaa cctgtgaacc tgagattcag aacacaacct acctgtggtg ggtaaataat 1080cagagcctcc cggtcagtcc caggctgcag ctgtccaatg acaacaggac cctcactcta 1140ctcagtgtca caaggaatga tgtaggaccc tatgagtgtg gaatccagaa cgaattaagt 1200gttgaccaca gcgacccagt catcctgaat gtcctctatg gcccagacga ccccaccatt 1260tccccctcat acacctatta ccgtccaggg gtgaacctca gcctctcctg ccatgcagcc 1320tctaacccac ctgcacagta ttcttggctg attgatggga acatccagca acacacacaa 1380gagctcttta tctccaacat cactgagaag aacagcggac tctatacctg ccaggccaat 1440aactcagcca gtggccacag caggactaca gtcaagacaa tcacagtctc tgcggagctg 1500cccaagccct ccatctccag caacaactcc aaacccgtgg aggacaagga tgctgtggcc 1560ttcacctgtg aacctgaggc tcagaacaca acctacctgt ggtgggtaaa tggtcagagc 1620ctcccagtca gtcccaggct gcagctgtcc aatggcaaca ggaccctcac tctattcaat 1680gtcacaagaa atgacgcaag agcctatgta tgtggaatcc agaactcagt gagtgcaaac 1740cgcagtgacc cagtcaccct ggatgtcctc tatgggccgg acacccccat catttccccc 1800ccagactcgt cttacctttc gggagcgaac ctcaacctct cctgccactc ggcctctaac 1860ccatccccgc agtattcttg gcgtatcaat gggataccgc agcaacacac acaagttctc 1920tttatcgcca aaatcacgcc aaataataac gggacctatg cctgttttgt ctctaacttg 1980gctactggcc gcaataattc catagtcaag agcatcacag tctctgcatc tggaacttct 2040cctggtctct cagctggggc cactgtcggc atcatgattg gagtgctggt tggggttgct 2100ctgatatag 2109<210>4<211>15<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>肽<400>4Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu Ser Leu Ser Cys His Ala1 5 10 15<210>5<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>5Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val1 5 10 15<210>6<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>6Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp1 5 10 15<210>7<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>7Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly1 5 10 15<210>8
<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>8Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile Ser1 5 10 15<210>9<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>9Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser Val Asp His1 5 10 15<210>10<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>10Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu Ser Leu1 5 10 15<210>11<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>11Pro Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln1 5 10 15
<210>12<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>12Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr1 5 10 15<210>13<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Kozak序列<400>13gccgccacc9<210>14<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>T-细胞表位<400>14Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala1 5<210>15<211>2034<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hCEA-ΔAD<400>15atggagagcc ccagcgcccc cccccaccgc tggtgcatcc cctggcagcg cctgctgctg 60accgccagcc tgctgacctt ctggaacccc cccaccaccg ccaagctgac catcgagagc 120
acccccttca acgtggccga gggcaaggag gtgctgctgc tggtgcacaa cctgccccag 180cacctgttcg gctacagctg gtacaagggc gagcgcgtgg acggcaaccg ccagatcatc 240ggctacgtga tcggcaccca gcaggccacc cccggccccg cctacagcgg ccgcgagatc 300atctacccca acgccagcct gctgatccag aacatcatcc agaacgacac cggcttctac 360accctgcacg tgatcaagag cgacctggtg aacgaggagg ccaccggcca gttccgcgtg 420taccccgagc tgcccaagcc cagcatcagc agcaacaaca gcaagcccgt ggaggacaag 480gacgccgtgg ccttcacctg cgagcccgag acccaggacg ccacctacct gtggtgggtg 540aacaaccaga gcctgcccgt gagcccccgc ctgcagctga gcaacggcaa ccgcaccctg 600accctgttca acgtgacccg caacgacacc gccagctaca agtgcgagac ccagaacccc 660gtgagcgccc gccgcagcga cagcgtgatc ctgaacgtgc tgtacggccc cgacgccccc 720accatcagcc ccctgaacac cagctaccgc agcggcgaga acctgaacct gagctgccac 780gccgccagca acccccccgc ccagtacagc tggttcgtga acggcacctt ccagcagagc 840acccaggagc tgttcatccc caacatcacc gtgaacaaca gcggcagcta cacctgccag 900gcccacaaca gcgacaccgg cctgaaccgc accaccgtga ccaccatcac cgtgtacgcc 960gagcccccca agcccttcat caccagcaac aacagcaacc ccgtggagga cgaggacgcc 1020gtggccctga cctgcgagcc cgagatccag aacaccacct acctgtggtg ggtgaacaac 1080cagagcctgc ccgtgagccc ccgcctgcag ctgagcaacg acaaccgcac cctgaccctg 1140ctgagcgtga cccgcaacga cgtgggcccc tacgagtgcg gcatccagaa cgagctgagc 1200gtggaccaca gcgaccccgt gatcctgaac gtgctgtacg gccccgacga ccccaccatc 1260agccccagct acacctacta ccgccccggc gtgaacctga gcctgagctg ccacgccgcc 1320agcaaccccc ccgcccagta cagctggctg atcgacggca acatccagca gcacacccag 1380gagctgttca tcagcaacat caccgagaag aacagcggcc tgtacacctg ccaggccaac 1440aacagcgcca gcggccacag ccgcaccacc gtgaagacca tcaccgtgag cgccgagctg 1500cccaagccca gcatcagcag caacaacagc aagcccgtgg aggacaagga cgccgtggcc 1560ttcacctgcg agcccgaggc ccagaacacc acctacctgt ggtgggtgaa cggccagagc 1620ctgcccgtga gcccccgcct gcagctgagc aacggcaacc gcaccctgac cctgttcaac 1680gtgacccgca acgacgcccg cgcctacgtg tgcggcatcc agaacagcgt gagcgccaac 1740cgcagcgacc ccgtgaccct ggacgtgctg tacggccccg acacccccat catcagcccc 1800cccgacagca gctacctgag cggcgccaac ctgaacctga gctgccacag cgccagcaac 1860cccagccccc agtacagctg gcgcatcaac ggcatccccc agcagcacac ccaggtgctg 1920ttcatcgcca agatcacccc caacaacaac ggcacctacg cctgcttcgt gagcaacctg 1980gccaccggcc gcaacaacag catcgtgaag agcatcaccg tgagcgccag cggc2034<210>16<211>678<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>hCEA-ΔAD<400>16Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln1 5 10 15Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr20 25 30Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly35 40 45Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly50 55 60Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile65 70 75 80Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser85 90 95
Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile100 105 110Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp115 120 125Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu130 135 140Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys145 150 155 160Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr165 170 175Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln180 185 190Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn195 200 205Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg210 215 220Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro225 230 235 240Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn245 250 255Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe260 265 270Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn275 280 285Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser290 295 300Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala305 310 315 320Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu325 330 335Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr340 345 350Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg355 360 365Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr370 375 380Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser385 390 395 400Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp405 410 415Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn420 425 430Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser435 440 445Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile450 455 460Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn465 470 475 480Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val485 490 495Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro500 505 510Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln515 520 525Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser
530 535 540Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn545 550 555 560Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser565 570 575Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly580 585 590Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly595 600 605Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln610 615 620Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu625 630 635 640Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe645 650 655Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile660 665 670Thr Val Ser Ala Ser Gly67权利要求
1.合成的核酸分子，包含编码如SEQ ID NO2所示人癌胚抗原(CEA)蛋白质的核苷酸序列，该合成核酸分子为在人体细胞内高水平表达进行了密码子优化。
2.权利要求1的合成核酸分子，其中核酸是DNA。
3.权利要求1的合成核酸分子，其中核酸是mRNA。
4.权利要求1的合成核酸分子，其中核酸是cDNA。
5.权利要求1的合成核酸分子，其中核苷酸序列包含如SEQ IDNO1所示的核苷酸序列。
6.包含权利要求1的核酸分子的载体。
7.包含权利要求6的载体的宿主细胞。
8.在重组宿主细胞中表达人癌胚抗原(CEA)蛋白质的方法，包括(a)将包含权利要求1的核酸的载体导入到合适的宿主细胞中；并(b)在允许该人CEA蛋白质表达的条件下培养该宿主细胞。
9.预防或治疗癌症的方法，包括给哺乳动物施用包含经密码子优化的合成核酸分子的疫苗载体，核酸分子包含编码如SEQ ID NO2所示人癌胚抗原(hCEA)蛋白质或如SEQ ID NO16所示人癌胚抗原变体的核苷酸序列。
10.权利要求9的方法，其中哺乳动物为人类。
11.权利要求9的方法，其中载体为腺病毒载体或质粒载体。
12.根据权利要求9的方法，其中载体为腺病毒载体，包含具腺病毒E1区缺失和腺病毒E1区插入的腺病毒基因组，其中该插入包含表达盒，所述表达盒包含(a)经密码子优化的编码人CEA蛋白质或其变体的多核苷酸；和(b)与该多核苷酸可操作连接的启动子。
13.权利要求9的方法，其中载体为质粒疫苗载体，包含质粒部分和可表达盒，该可表达盒包含(a)经密码子优化的编码人CEA蛋白质或其变体的多核苷酸；和(b)与该多核苷酸可操作连接的启动子。
14.腺病毒疫苗载体，包含具E1区缺失和E1区插入的腺病毒基因组，其中该插入包含表达盒，所述表达盒包含(a)经密码子优化的编码人CEA蛋白质或其变体的多核苷酸；和(b)与该多核苷酸可操作连接的启动子。
15.权利要求14的腺病毒载体，其为Ad5载体。
16.权利要求14的腺病毒载体，其为Ad6载体。
17.权利要求14的腺病毒载体，其为Ad24载体。
18.包含质粒部分和表达盒部分的疫苗质粒，表达盒部分包含(a)经密码子优化的编码人CEA蛋白质或其变体的多核苷酸；和(b)与该多核苷酸可操作连接的启动子。
19.保护哺乳动物免患癌症的方法，包括(a)将第一种载体导入哺乳动物，该载体包含(i)经密码子优化的编码人癌胚抗原(CEA)蛋白质或其变体的多核苷酸；和(ii)与该多核苷酸可操作连接的启动子；(b)允许经过一段预定时间；和(c)将第二种载体导入哺乳动物，该载体包含(i)经密码子优化的编码人CEA蛋白质或其变体的多核苷酸；和(ii)与该多核苷酸可操作连接的启动子。
20.根据权利要求19的方法，其中第一种载体是质粒而第二种载体是腺病毒载体。
21.根据权利要求19的方法，其中第一种载体是腺病毒载体而第二种载体是质粒。
22.治疗患结直肠癌的哺乳动物的方法，包括(a)将第一种载体导入哺乳动物，该载体包含(i)经密码子优化的编码人癌胚抗原(CEA)蛋白质或其变体的多核苷酸；和(ii)与该多核苷酸可操作连接的启动子；(b)允许经过一段预定时间；和(c)将第二种载体导入哺乳动物，该载体包含(i)经密码子优化的编码人CEA蛋白质或其变体的多核苷酸；和(ii)与该多核苷酸可操作连接的启动子。
23.根据权利要求22的方法，其中第一种载体是质粒而第二种载体是腺病毒载体。
24.根据权利要求22的方法，其中第一种载体是腺病毒载体而第二种载体是质粒。
25.包含编码如SEQ ID NO16所示人癌胚抗原(CEA)蛋白质变体的核苷酸序列的合成核酸分子，该合成核酸分子为在人体细胞内高水平表达而进行了密码子优化；
26.权利要求25的合成核酸分子，其中核苷酸序列包含如SEQ IDNO15所示的核苷酸序列。
27.包含权利要求25的核酸分子的载体。
28.包含权利要求27的载体的宿主细胞。
全文摘要
本发明提供了编码人癌胚抗原(CEA)的合成多核苷酸，该合成多核苷酸为在人体细胞环境中表达经过了密码子优化。编码CEA的基因通常与人类肿瘤的发展有关。本发明提供了引发或增强针对由CEA肿瘤相关抗原表达的蛋白质产物的免疫性的组合物和方法，其中，异常的CEA表达与癌或其发展有关。具体而言，本发明提供了携带有经密码子优化的人CEA的腺病毒载体和质粒，且公开了它们在用于预防和治疗癌症的疫苗和药物组合物方面的用途。
文档编号C07K14/47GK1784424SQ200480012115
公开日2006年6月7日 申请日期2004年5月3日 优先权日2003年5月5日
发明者N·拉莫尼卡, A·拉姆, C·门努尼, R·萨维诺 申请人:P.安杰莱蒂分子生物学研究所