专利名称：含配糖物的脂质体的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有可以用作抗癌剂的配糖物的脂质体。
背景技术：
例如在使胆甾醇B环的双键饱和而得到的胆甾烷醇上结合特定的糖链的下述胆甾烷醇配糖物(1)具有抑制癌细胞增殖的作用，是可以作为抗癌剂的化合物(参考专利文献1和2)。
[式中，G表示GlcNAc-Gal-、GlcNAc-Gal-Glc-、Fuc-Gal-、Gal-Glc-或Gal-。]像胆甾烷醇这样的疏水性化合物由于与细胞膜具有亲和性，容易进入细胞，所以这些配糖物可以容易地进入各种癌细胞，充分发挥其效果。然而，由于该配糖物溶解性低，所以难以使用，对于有些肿瘤无法充分发挥其效果。
专利文献1日本专利特开平11-60592号公报专利文献1日本专利特开2000-191685号公报发明的揭示本发明的目的在于提供能够使具有抗肿瘤活性的配糖物更有效地发挥该化合物本身具有的抗肿瘤效果的制剂。
本发明人鉴于所述实际情况，对于具有抗肿瘤活性的疏水性化合物的配糖物进行了其投与方式的各种研究后，发现了可以更有效地发挥该化合物本身具有的抗肿瘤效果的制剂，在至少使用磷脂作为膜脂质、并且使其与正电荷给予物质共存而将该配糖物脂质体化的情况下，由于溶解性低而难以使用的化合物变得可以使用，而且即使对以往直接投与配糖物时几乎不显示出效果的肿瘤株也显示出强的抗肿瘤活性。
即，本发明提供含有配糖物、磷脂和正电荷给予物质的脂质体，所述配糖物为具有抗肿瘤活性且具有GlcNAc-Gal-、GlcNAc-Gal-Glc-、Fuc-Gal-、Gal-Glc-或Gal-作为糖的可以脂质体化的疏水性化合物。
此外，本发明提供含有从下述的式(1)～(3) [式中，G表示GlcNAc-Gal-、GlcNAc-Gal-Glc-、Fuc-Gal-、Gal-Glc-或Gal-，n表示12～26的整数。]中选出的配糖物、磷脂和正电荷给予物质的脂质体。
另外，本发明提供具有该脂质体的抗癌剂。
若采用本发明，则可以提供提高了具有抗肿瘤活性的配糖物的溶解性、该配糖物能更有效地发挥该化合物本身具有的抗肿瘤效果的制剂。尤其，使用胆甾烷醇配糖物(1)的制剂即使对以往直接投与时难以发挥作用的癌细胞也显示出强的抗肿瘤活性，可以最大限度地发挥该化合物所具有的抗肿瘤作用。
附图的简单说明[
图1]脂质体化GlcNAcβ1，4GalChol的抑制癌细胞增殖的效果的示意图。图中，-Lipo表示脂质体。
脂质体化Fucα1，3GalChol的抑制癌细胞增殖的效果的示意图。图中，-Lipo表示脂质体。
脂质体化GalβChol的抑制癌细胞增殖的效果的示意图。图中，-Lipo表示脂质体。
脂质体化GlcNAcβ1，3Galβ1，1NM和脂质体化GlcNAcβ1，3Galβ1，4Glcβ1，1神经酰胺的抑制癌细胞增殖的效果的示意图。图中，-Lipo表示脂质体。
不同粒径的脂质体化Fucα1，3GalChol产生的抑制腹膜播散的效果的示意图。
表示脂质体化GlcNAcβ1，4GalChol的抑制腹膜播散的效果，特别测定了肿瘤形成数的图。
表示脂质体化GlcNAcβ1，4GalChol的抑制腹膜播散的效果，特别测定了肿瘤重量(g)的图。
比较脂质体化FucGalChol和单独投与FucGalChol的抑制腹膜播散的效果，特别测定了肿瘤形成数的图。
实施发明的最佳方式本发明脂质体所含的配糖物为具有GlcNAc-Gal-、GlcNAc-Gal-Glc-、Fuc-Gal-、Gal-Glc-或Gal-作为糖、以可以脂质体化的疏水性化合物作为苷元的化合物，而且具有抗肿瘤活性。
在这里，可以脂质体化的疏水性化合物可以例举例如胆甾醇、神经酰胺、疏水性氨基酸、脂肪酸(油酸、亚油酸、亚麻酸等)、脂溶性维生素等生物体结构成分等和例如萘衍生物(例如萘甲醇)等具有芳环的化合物、胆甾醇衍生物(例如胆甾烷醇)等。其中，较好是神经酰胺、萘衍生物、胆甾醇衍生物，特别好是使胆甾醇B环的双键饱和得到的胆甾烷醇。
此外，糖部分中，GlcNAc-Gal-较好是GlcNAcβ1，3-Galβ-或GlcNAcβ1，4-Galβ-，GlcNAc-Gal-Glc-较好是GlcNAcβ1，3-Galβ1，4-Glc-，Fuc-Gal-较好是Fucα1，3-Gal-，Gal-Glc-较好是Galβ1，4Glcβ-，Gal-较好是Galβ-。
另外，优选的配糖物可以例举以下的胆甾烷醇配糖物(1)、萘甲醇配糖物(2)和神经酰胺配糖物(3)。
[式中，G表示GlcNAc-Gal-、GlcNAc-Gal-Glc-、Fuc-Gal-、Gal-Glc-或Gal-，n表示12～26的整数。]其中，从抗癌作用的角度来看，胆甾烷醇配糖物(1)是特别理想的，另外，式(1)中优选的化合物可以例举以下所示的化合物。
(1)G＝GlcNAc-Gal-3-β-胆甾烷基3-O-(2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃半乳糖苷、3-β-胆甾烷基4-O-(2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃半乳糖苷、(2)G＝GlcNAc-Gal-Glc-3-β-胆甾烷基4-O-{3-O-(2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃半乳糖基}-β-D-吡喃葡萄糖苷、(3)G＝Fuc-Gal-3-β-胆甾烷基3-O-(α-L-吡喃岩藻糖基)-β-D-吡喃半乳糖苷、(4)G＝Gal-Glc-3-β-胆甾烷基4-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、(5)G＝Glc-3-β-胆甾烷基β-D-吡喃半乳糖苷、本发明的配糖物可以通过从生物体内提取、公知的化学反应或者将它们组合来制造。例如，上述胆甾烷醇配糖物(1)可以通过日本专利特开平11-60592号公报或日本专利特开2000-191685号公报所记载的方法制造，萘甲醇配糖物(2)可以通过J.Biol.Chem.272(41)25608，1997记载的方法制造，神经酰胺配糖物(3)可以通过从人红血球、肝脏、消化管粘膜、胎粪等提取得到。
该配糖物具有抗肿瘤活性，本说明书中具有抗肿瘤活性，在体内是指对至少1种癌症可以发挥抗肿瘤效果；在体外是指对至少1种癌细胞株具有阻碍增殖的活性或抑制增殖的活性。
本发明脂质体中，配糖物相对1摩尔磷脂较好是含有0.3～2.0摩尔，更好是0.8～1.5摩尔。
本发明的脂质体中，至少使用磷脂作为膜成分脂质。
所述磷脂可以例举二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰棕榈酰磷脂酰胆碱、肉豆蔻酰硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酰花生酰磷脂酰胆碱等磷脂酰胆碱类，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，磷脂酸等，它们可以是天然的，或通过半合成或者全合成得到。此外，还可以使用加氢磷脂等终修饰的磷脂。所述磷脂可以单独使用，也可以2种以上混合使用。
其中，从可以形成电中性且稳定的脂质体的角度来看，较好是使用磷脂酰胆碱类，特别好是使用1α二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。
正电荷给予物质是为了使脂质膜的表面带有正电荷而添加的物质。通过使脂质体的表面带有正电荷，可以期望能容易与膜表面处于负电荷状态的细胞接触。
正电荷给予物质可以例举硬脂胺、油胺等脂肪族胺，芴乙基胺等芳族胺，其中较好是脂肪族胺，特别好是使用硬脂胺。
正电荷给予物质相对1摩尔磷脂较好是含有0.04～0.15摩尔，更好是0.1～0.15摩尔。
本发明的脂质体中，除了上述成分之外，可以根据需要加入胆甾醇、脂肪酸、二乙酰磷酸酯等作为膜结构的稳定剂。
分散膜成分的水溶液较好是使用水、生理盐水、各种缓冲液、糖类的水溶液或它们的混合物。缓冲液可以适当地使用不论有机类或无机类的在体液氢离子浓度附近具有缓冲作用的缓冲液，可以列举例如磷酸缓冲液。
本发明脂质体的制备没有特别限定，根据常规方法进行即可。按照例如日本专利特开昭57-82310号公报、日本专利特开昭60-12127号公报、日本专利特开昭60-58915号公报、日本专利特开平1-117824号公报、日本专利特开平1-167218号公报、日本专利特开平4-29925号公报、日本专利特开平9-87168号公报、Methods of Biochemical Analysis(1988)33，p337或者《脂质体(リポソ一ム)》(南江堂)中所记载的方法进行即可。
以下，对基于日本专利特开平9-87168号公报所记载的方法的本发明脂质体的制备工序进行说明。
首先，向本发明的配糖物、磷脂和正电荷给予物质加有机溶剂和水混合后，用旋转蒸发器等将有机溶剂完全除去，接着进行水分的除去。这时，膜成分物质、正电荷给予物质和配糖物的混合比例可以例举例如52∶8∶20(摩尔比)，只要是与其近似的混合比例都没有问题。配糖物的混合比例小的情况下，可以根据需要添加以胆甾醇为代表的膜结构稳定剂，但如果该混合比例高，则不一定需要添加膜结构的稳定剂。
有机溶剂只要是水不溶性的挥发性有机溶剂，没有特别限定，可以使用例如三氯甲烷、氯甲烷、苯和己烷等，若考虑到溶解性，可以使用适当添加乙醇或甲醇等极性较强的有机溶剂配制的混合有机溶剂。该混合有机溶剂和水的混合比例只要是达到均一的比例，没有特别限定。
此外，添加水分制备时，水分除去方法一般使用冷冻干燥法，但并不局限于此，可以在减压干燥器中干燥。水分除去后，添加前述的分散水溶液，通过用涡流混合器等浸渗而实现脂质体化。
本发明脂质体的粒径从肿瘤抑制效果方面来看，较好是在10μm以下，更好是在3μm以下。
使脂质体的尺寸一致时，可以通过例如超声波处理、经多孔滤膜的挤压处理、用高压喷射乳化装置的处理或者组合这些处理实现尺寸的均一化。此外，要得到更小的脂质体粒子的情况下，可以通过例如延长超声波处理时间来实现。
因此，如后述实施例所示，制备的本发明脂质体具有极其优异的抑制癌细胞增殖的作用。尤其，对于胆甾烷醇配糖物(1)，即使对以往直接投与时难以发挥作用的癌细胞也显示出强的抗肿瘤活性。脂质体一般是形成磷脂双层膜的小胞球，是为了以将药剂包裹在内部的形式分散、通过与细胞融合使药剂达到细胞内而制作的，所以药剂自身的性质不能因脂质体化而改变。因此，通过将该胆甾烷醇配糖物脂质体化使该化合物的抗肿瘤活性大幅提高完全是意外。
由此，含有该脂质体的制剂可以用作更有效地发挥配糖物本身具有的抗肿瘤效果的抗癌剂。
本发明的抗癌剂根据治疗部位、治疗目的可以选择适当剂型，只要是没有使用损害脂质体形状的稳定性的添加剂等，可以按照公知的制备方法制成例如口服剂、注射剂、栓剂、软膏剂、贴剂等。
制备口服用固体制剂时，可以向本发明的脂质体加入赋形剂，根据需要加入粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、调味剂、除臭剂等后，通过常规方法制造片剂、包衣片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等。这样的添加剂可以是本领域中一般所使用的，例如，赋形剂可以例举乳糖、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、淀粉、碳酸钙、高岭土、微晶纤维素、硅酸等，粘合剂可以例举水、乙醇、丙醇、单糖浆、葡萄糖液、淀粉液、明胶液、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、甲基纤维素、乙基纤维素、虫胶、磷酸钙、聚乙烯吡咯烷酮等，崩解剂可以例举干燥淀粉、藻酸钠、琼脂粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、十二烷基硫酸钠、硬脂酸甘油一酯、乳糖等，润滑剂可以例举精制滑石、硬脂酸盐、硼砂、聚乙二醇等，调味剂可以例举蔗糖、橙皮、柠檬酸、酒石酸等。
制备口服用液体制剂时，可以向本发明脂质体加入调味剂、缓冲剂、稳定剂、除臭剂等，通过常规方法制造内服液剂、糖浆剂、酏剂等。这时，调味剂可以是上述例举的，缓冲剂可以例举柠檬酸钠等，稳定剂可以例举西黄蓍胶、阿拉伯树胶、明胶等。
制备注射剂时，可以向本发明脂质体加入pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂、局部麻醉剂等，通过常规方法制造皮下、肌肉和静脉注射剂。这时的pH调节剂和缓冲剂可以例举柠檬酸钠、醋酸钠、磷酸钠等。稳定剂可以例举焦亚硫酸钠、EDTA、巯基乙酸、硫代乳酸等。局部麻醉剂可以例举盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因等。等渗剂可以例举氯化钠、葡萄糖等。
制备栓剂时，可以向本发明脂质体加入公知的制剂用载体，例如聚乙二醇、含水羊毛脂、可可豆脂、脂肪酸甘油三酯等，再根据需要加入ツイ一ン(注册商标)之类的表面活性剂等后，通过常规方法制造。
制备软膏剂时，可以向本发明脂质体根据需要加入通常所使用的基质、稳定剂、湿润剂、防腐剂等，通过常规方法混合、制剂化。基质可以例举液体石蜡、白色凡士林、白蜡、辛基十二烷醇、石蜡等，防腐剂可以例举对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯等。
制备贴剂时，通过常规方法在通常的支承体上涂布所述软膏、乳膏、凝胶、糊料等即可。作为支承体，可以是由棉、人造棉、化学纤维构成的织物、非编织物和软质聚氯乙烯、聚乙烯、聚氨酯等薄膜或者发泡体片。
本发明抗癌剂的投与量根据患者的症状、体重、年龄、性别等而不同，不能一概而论，作为胆甾烷醇配糖物(1)，通常成人每天是约0.01～200mg/Kg，较好是0.1～50mg/Kg，较好是将其一天一次或分成2～4次投与。
实施例以下，通过实施例对本发明进行详细说明。
实施例1胆甾烷醇配糖物的脂质体化胆甾烷醇配糖物使用所述式(1)中的G为GlcNAcβ1，4Gal的“GlcNAcβ1，4GalChol”、G为Fucα1，3Gal的“Fucα1，3GalChol”、G为Galβ的“GalβChol”以及作为对照的G为H的“Chol”，将它们的20μmol/ml(以三氯甲烷/甲醇＝5/1，v/v溶解)溶液作为初始物质。
将1α二棕榈酰磷脂酰胆碱、硬脂胺和上述的胆甾烷醇配糖物以52/8/20(摩尔比)的比例混合成700μl，接着添加300μl有机溶剂(三氯甲烷/甲醇＝2/1，V/V)和1ml蒸馏水，并混合。然后，用旋转蒸发器将有机溶剂完全除去后，进行冷冻干燥操作，将水分完全除去。该冷冻干燥品溶解于1mlPBS中，通过进行超声波处理(15W，15分钟)将脂质体均一化到粒径2-4μm左右，供实施例2和3使用。
实施例2萘甲醇配糖物的脂质体化萘甲醇配糖物使用所述式(2)中的G为GlcNAcβ1，4-Galβ1，1-的“GlcNAcβ1，4Galβ1，1NM”(NM萘甲醇)，以与胆甾烷醇配糖物的脂质体化同样的条件进行脂质体化。
实施例3神经酰胺配糖物的脂质体化神经酰胺配糖物使用所述式(3)中的G为GlcNAcβ1，3-Galβ1，4-Glc-的“GlcNAcβ1，3Galβ1，4Glcβ1，1神经酰胺”，以与胆甾烷醇配糖物的脂质体化同样的条件进行脂质体化。但是，该脂质体化的情况下添加胆甾醇作为稳定剂。
实施例4脂质体化胆甾烷醇配糖物产生的抑制细胞增殖的效果将培养癌细胞株(colon26wild)以1×104细胞/100μl/孔接种到96孔板中后，添加胆甾烷醇配糖物(GlcNAcβ1，4GalChol、Fucα1，3GalChol、GalβChol、Chol)和实施例1中所得到的脂质体化胆甾烷醇配糖物，在37℃下培养3天。然后，进行MTT试验确定细胞数。根据以下的式子求得增殖抑制率。
细胞增殖抑制率(CPI率)(％)＝(1-处理细胞的OD/未处理细胞的OD)×100由结果可知，单独几乎不显示效果的Fucα1，3GalChol通过脂质体化显示出了显著的抑制细胞增殖的效果。此外，以往显示出抑制细胞增殖的效果的GlcNAcβ1，4GalChol经脂质体化显示出了更强的抑制细胞增殖的效果(图1、2和3)。
实施例5脂质体化萘甲醇配糖物和脂质体化的神经酰胺配糖物产生的抑制细胞增殖的效果将培养癌细胞株(colo201)以1×104细胞/100μl/孔接种到96孔板中后，添加实施例2和3中所得到的脂质体化萘甲醇配糖物和脂质体化神经酰胺配糖物，在37℃下培养3天。然后，进行MTT试验确定细胞数。与实施例4同样地求得增殖抑制率。
由结果可知，由于不溶解而单独几乎不显示效果的GlcNAcβ1，4Galβ1，1NM和GlcNAcβ1，3Galβ1，4Glcβ1，1神经酰胺通过脂质体化显示出了显著的抑制细胞增殖的效果(图4)。
实施例6脂质体化胆甾烷醇配糖物产生的抑制腹膜播散的效果(1)脂质体化Fucα1，3GalChol的粒径产生的影响对Balb/c小鼠(8周龄，雌)将癌细胞株(colon26wild，5×104细胞/200μl)投与腹腔内。接着，在12小时、24小时和48小时后将以不同的超声波处理时间(15W×5，10，15分钟)配制的脂质体化Fucα1，3GalChol(2μmol/100μl)投与腹腔内。10天后，对肠系膜中的肿瘤数进行测定。超声波处理时间越长、脂质体粒径越小，则越表现出抑制腹膜播散的效果(图5)。
(2)脂质体化GlcNAcβ1，4GalChol的抑制腹膜播散的效果对Balb/c小鼠(8周龄，雌)将癌细胞株(colon26wild，5×104细胞/200μl)投与腹腔内。接着，在24小时和48小时后将通过超声波处理(15W，15分钟)配制的脂质体化GlcNAcβ1，4GalChol(2μmol/100μl)投与腹腔内。10天后，对肠系膜中的肿瘤数进行测定，21天后对大网膜和肠系膜上形成的肿瘤重量进行测定。由其结果可知，投与脂质体化GlcNAcβ1，4GalChol表现出良好的抑制腹膜播散的效果(图6和7)。
(3)脂质体化FucGalChol和单独投与FucGalChol的抑制腹膜播散的效果的比较对Balb/c小鼠(8周龄，雌)将癌细胞株(colon26wild，5×104细胞/200μl)投与腹腔内。接着，在0、24和48小时后将通过超声波处理(15W，15分钟)配制的脂质体化FucGalChol和FucGalChol(都是2μmol/100μl)分别投与腹腔内。10天后，对肠系膜中形成的肿瘤数进行测定。
由其结果可知，与未处理、FucGalChol投与组相比，脂质体化FucGalChol投与组中，肿瘤的形成被更强地抑制(图8)。
权利要求
1.脂质体，其特征在于，含有配糖物、磷脂和正电荷给予物质，所述配糖物为具有抗肿瘤活性、且具有GlcNAc-Gal-、GlcNAc-Gal-Glc-、Fuc-Gal-、Gal-Glc-或Gal-作为糖的可以脂质体化的疏水性化合物。
2.脂质体，其特征在于，含有从下述的式(1)～(3) 中选出的配糖物、磷脂和正电荷给予物质，式中，G表示GlcNAc-Gal-、GlcNAc-Gal-Glc-、Fuc-Gal-、Gal-Glc-或Gal-，n表示12～26的整数。
3.如权利要求1或2所述的脂质体，其特征还在于，正电荷给予物质是脂肪族胺。
4.抗癌剂，其特征在于，含有权利要求1～3中的任一项所述的脂质体。
全文摘要
本发明提供能够用作抗肿瘤剂的、可以最大限度地发挥胆甾烷醇配糖物的效果的制剂。即，本发明涉及含有配糖物、磷脂和正电荷给予物质的脂质体，所述配糖物为具有抗肿瘤活性、且具有GlcNAc－Gal－、GlcNAc－Gal－Glc－、Fuc－Gal－、Gal－Glc－或Gal－作为糖的可以脂质体化的疏水性化合物。
文档编号C07J17/00GK1822844SQ20048002040
公开日2006年8月23日 申请日期2004年7月15日 优先权日2003年7月17日
发明者矢泽伸, 高井泉, 西村东洋 申请人:大塚制药株式会社