含有磷酸胆碱基的化合物及包含该化合物的表面改性剂的制作方法

专利名称：含有磷酸胆碱基的化合物及包含该化合物的表面改性剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有磷酸胆碱基的新型化合物，以及包含该化合物的表面改性剂、用该表面改性剂改性了的改性粉末、利用该改性粉末作为载体的色谱用填充剂、用该表面改性剂改性了的过滤器以及玻璃实验器具。
包含本发明化合物的表面改性剂赋予物体生物适合性、保湿性、以及多种有用的其它功能。
背景技术：
已经进行了将含有磷酸胆碱基的聚合物作为生物适合性高分子的研究，并开发了将该聚合物被覆在各种基质上的生物适合性材料。
例如，专利文献1中，公开了将用2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱的均聚合物和共聚物被覆的粉末用作化妆品用粉末而改善了保湿性或皮肤粘附性的化妆品。
此外，专利文献2及专利文献3中，公开了用含有磷酸胆碱基的聚合物被覆的医疗用材料或分离剂。
上述材料主要是通过使具有羟基的丙烯类单体与2-氯-1，3，2-二氧杂正膦-2-氧化物反应，进一步通过三甲基胺形成季铵，由此合成具有磷酸胆碱结构的单体，将该单体聚合得到聚合物，将该聚合物被覆材料的表面(关于聚合物的制备方法，参照专利文献4和5)。
专利文献4中，制备了2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱与甲基丙烯酸酯的共聚物，专利文献5中制备了2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱的均聚合物。
另一方面，通过尺寸排阻而将蛋白质或比蛋白质分子量小的多肽等生物样品进行分离的GFC用填充剂有很多市售品。在该GFC用填充剂中，存在以交联亲水性高分子作为载体的填充剂和以硅胶作为载体的填充剂。
以交联亲水性高分子作为载体的填充剂能适用的流动相的pH范围广，通用性高。然而，以高分子作为载体的填充剂，比以硅胶作为载体的填充剂(1)由于细孔径的控制困难，而难于得到高理论塔板数。此外，(2)在高效液相色谱法(HPLC)中使用时，由于对抗高压条件的强度不够，以及粒子由于流动相溶剂而溶胀，因此不能得到重现性好的色谱柱的情况也很多。
以硅胶作为载体的填充剂，存在蛋白质或多肽吸附在硅胶载体表面的问题。因此，为了抑制分析样品中的蛋白质或多肽吸附到硅胶上，市场上销售使用以非解离性亲水基修饰了表面的硅胶的填充剂。
例如，作为硅胶类GFC用柱，昭和电工株式会社有Shodex PROTEINKW-803(产品名)市售。该硅胶类柱，在产品目录上说明是适用于分子量数千～100万左右的蛋白质分析的硅胶类GFC模式的柱。
此外，株式会社ワイエムシイ有YMC-Pack Diol(产品名)市售。这也是硅胶类的GFC用柱，其被说明为由于使具有二醇结构的官能团化学结合到硅胶载体上，可适用于分子量1万～数十万的蛋白质的分离。
非专利文献1中，记载了通过在载体上化学接枝的磷酸胆碱基，蛋白质的吸附减少。
此外，专利文献6及7中，公开了具有已知显示有优良亲水性的甜菜碱结构的有机硅烷类表面改性剂(硅烷偶联剂)。专利文献6中，认为通过使二甲基氨基烷基硅烷在有机溶剂中与1，3-丙磺酸内酯反应，可以得到具有由季铵的正电荷和磺酸的负电荷形成的磺基甜菜碱的硅烷偶联剂。专利文献7中，记载了具有由季铵和羧基形成的羧基甜菜碱的硅烷偶联剂的制备方法。这些硅烷偶联剂，可以涂布在玻璃等上，通过使其干燥来改性物质表面。然而，用这些结构的甜菜碱尽管可以赋予物质表面良好的亲水性，但由于甜菜碱中的正电荷与负电荷强度存在有偏差，不能形成电中性。例如，磺基甜菜碱中，由于磺酸的强酸性而带负电，在羧基甜菜碱中，表现出季铵所致的正电性质。这样的甜菜碱结构中，与蛋白质之间产生过强的离子交换相互作用，导致蛋白质的不可逆性吸附。
另一方面，以生物适合性或抑制蛋白质吸附为目的而将这些硅烷偶联剂用于色谱用填充剂或过滤器类以及实验器具类的例子还没有的。
专利文献1特开平7-118123号公报专利文献2特开2000-279512号公报专利文献3特开2002-98676号公报专利文献4特开平9-3132号公报专利文献5特开平10-298240号公报专利文献6特开平5-222064号公报专利文献7特开昭63-295593号公报非专利文献1Jian R.Lu等，Langmuir 2001，17，3382-3389发明内容然而，在用含有磷酸胆碱基的聚合物被覆物体表面而进行改性的方法中，难于在全部表面上进行有效地被覆。此外，由于被覆的聚合物从物体上剥离，因此有耐久性方面产生问题的情况。而且，因为物体表面被聚合物被覆，也存在偏离通过磷酸胆碱基赋予生物适合性等目标功能的目的，而使物体自身所要求的细孔等微细结构这样的基本性质丧失的情况。
此外，在将磷酸胆碱基衍生物作为低分子导入到物体中时，在物体上先导入能与磷酸胆碱基衍生物反应的官能团，然后使磷酸胆碱基衍生物反应的方法中，由于物体表面上残留有在物体表面上未反应的官能团，因此生物适合性也较低。
例如，在首先往物体表面上导入氨基，然后使磷酸胆碱的醛衍生物与物体表面的氨基反应的情况下，有很多未反应的氨基残留。这些残留的氨基尽管可以通过与其他的低分子化合物结合而在某种程度上被封锁，但是难于维持物体表面的亲水性，而且不能完全封锁。在物体表面上残留氨基的情况下，由于氨基具有强碱性，主要是酸性蛋白质表现出明显很强的离子交换相互作用，其几乎都产生吸附。在用作色谱用填充剂的情况下，成为该蛋白质的回收率降低或峰显著拖尾的原因。而且，蛋白质的吸附导致其变性，在作为生物适合性材料使用时，成为炎症等的原因，因而不好。
本发明发现使含有磷酸胆碱基的化合物，与具有和该化合物反应的官能团并且具有与物体表面结合的官能团的物体直接反应，简便并且具有高通用性，可以直接赋予物体表面所期望的任意量的磷酸胆碱基。
由此发现，通过由该化合物形成的表面改性剂，可以容易地制备改性粉末、用该改性粉末作为载体的色谱用填充剂、经该表面改性剂改性的过滤器以及玻璃实验器具，从而完成了本发明。
即，本发明提供下式(1)表示的含有磷酸胆碱基的化合物。
式中，m是2～6，n是1～4。
X1、X2、X3各自独立地为甲氧基、乙氧基或卤素。但是，X1、X2、X3中至多2个可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基中的任意一个。
R是下式(2)～(4)结构中的任意一个(在下式(2)～(4)结构中，式(1)化合物以A-R-B表示)。
A-(CH2)L-B(2) 式(2)～(4)中，L表示1～6，P表示1～3。
此外，本发明提供下式(5)或(6)表示的含有磷酸胆碱基的化合物。
式中，m是2～6，n是1～4。X1、X2、X3各自独立地为甲氧基、乙氧基或卤素。但是，X1、X2、X3中至多2个可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基中的任意一个。
此外，本发明提供包含上述含有磷酸胆碱基的化合物的表面改性剂。
此外，本发明提供前述式(6)所示化合物的制备方法，其特征在于通过用高碘酸钠和三氯化钌氧化甘油磷酸胆碱的反应合成具有磷酸胆碱基和羧基的化合物，由具有氨基的有机硅烷化合物与具有磷酸胆碱基和羧基的化合物通过缩合剂合成上述式(6)所示的化合物。
此外，本发明提供用上述表面改性剂处理过的改性粉末。
另外，本发明提供包含用上述表面改性剂处理过的改性载体的色谱用填充剂。
还有，本发明提供用上述表面改性剂处理过的过滤器。
此外，本发明提供用上述表面改性剂进行过表面处理的玻璃实验器具。
发明效果如果使用本发明的化合物、包含该化合物的表面改性剂，通过一步极其简便的反应，可以赋予各种物体表面所需的任意量的磷酸胆碱基。其结果，通过磷酸胆碱基可以容易地制备具有所需功能的改性粉末、用该改性粉末作为载体的色谱用填充剂、用该表面改性剂改性的过滤器以及玻璃实验器具。
更详细地说，根据本发明，可以将蛋白质或多肽的吸附极少的磷酸胆碱基简便并且定量地导入而且不损伤物体表面的微细结构。此外，由于不导入磷酸胆碱基以外的未反应官能团，可以提供生物适合性极高的材料。
在适用于硅胶等色谱用载体的情况下，是极其优良的GFC用填充剂。用本发明的表面改性剂合成的色谱用填充剂的特征是利用GFC模式(GFC mode)导致的分子量差异进行分离是不言而喻的，并且由于蛋白质或多肽所具有的等电点或疏水性不同而具有优良的分离能力。
进一步地，由于离子交换性或疏水性可以根据流动相的盐浓度或pH来调节，因此可以根据蛋白质来进行独特的分离。而且，因为不引起蛋白质在粉末表面上不可逆地吸附，因此可以不伴随有蛋白质的变性、失活而进行分离、分取、分析。
在将过滤器以及玻璃实验器具用本发明的表面改性剂处理时，可以得到蛋白质吸附极少的过滤器以及玻璃实验器具。


图1合成例1中制备的化合物的结构式及1H-NMR图谱。
图2实施例2中制备的改性粉末的13C-CPMAS图谱。
图3实施例2中制备的改性粉末的31P-CPMAS图谱。
图4实施例2中制备的改性粉末的FT-IR图谱。
图5将实施例3中制备的液相色谱用填充剂以GFC模式使用时的校正曲线。
图6使用实施例3中制备的液相色谱用填充剂分离人血清蛋白时的色谱图。
图7在流动相盐浓度为500mM的条件下分离人血清蛋白时的色谱图。(a)用本发明的表面改性剂合成的填充剂。(b)Shodex PROTEINKW-803。
图8在流动相盐浓度为150mM的条件下分离人血清蛋白时的色谱图。(a)用本发明的表面改性剂合成的填充剂。(b)Shodex PROTEINKW-803。
图9使用由本发明的表面改性剂合成的填充剂分离5种有机酸时的色谱图。
图10在本发明的表面改性剂的间隔部分插入仲胺的情况下，分离人血清蛋白时的色谱图。
图11实施例9中合成的改性粉末的FT-IR图谱。
图12使用实施例10中制备的液相色谱用填充剂的色谱图。
图13使用实施例3中制备的液相色谱用填充剂的色谱图。
图14使用以对比例2中制备的式(14)表示的化合物进行表面改性的液相色谱用填充剂的色谱图。
图15使用以对比例2中制备的式(15)表示的化合物进行表面改性的液相色谱用填充剂的色谱图。
图16实施例7中制备的化合物的1H-NMR图谱。
图17实施例7中制备的化合物的Mass图谱。
图18合成例1中制备的化合物的Mass图谱。
具体实施例方式
此外，本发明化合物无论纯化或不纯化都可以进行表面改性，从而能够得到蛋白质吸附抑制等效果。
下式(1)、或(5)或(6)表示的含有磷酸胆碱基的化合物是新型化合物。
式中，m是2～6，n是1～4。
X1、X2、X3各自独立地为甲氧基、乙氧基或卤素。但是，X1、X2、X3中至多2个可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基中的任意一个。
R是下式(2)～(4)结构中的任意一种(在下式(2)～(4)结构中，式(1)化合物以A-R-B表示)。
A-(CH2)L-B(2) 式(2)～(4)中，L表示1～6，P表示1～3。
式中，m是2～6，n是1～4。X1、X2、X3各自独立地为甲氧基、乙氧基或卤素。但是，X1、X2、X3中至多2个可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基中的任意一个。
将下式(7)表示的磷酸胆碱衍生物溶解在蒸馏水中。下式(7)的磷酸胆碱衍生物是公知化合物，可以从市售品获得。
将式(7)化合物的水溶液在冰水浴中冷却，添加高碘酸钠，搅拌5小时。将反应液减压浓缩、减压干燥，用甲醇提取下式(8)所示的具有醛基的磷酸胆碱衍生物。结构式以及NMR图谱如图1所示、Mass图谱如图18所示。
然后，向式(8)的甲醇溶液中添加0.5当量的3-氨基丙基三甲氧基硅烷。将该混合物溶液在室温搅拌规定时间后，冰冷，添加适量的氰基硼氢化钠，恢复至室温，搅拌16小时。在此期间也在反应容器中持续通入干燥氮气。过滤沉淀后，得到式(5)和/或式(6)的甲醇溶液。
下面说明本发明化合物的纯化方法。本发明化合物的纯化方法不限于以下。
将得到的甲醇溶液减压浓缩，并将残渣溶于蒸馏水中。用此水溶液作为样品。将具有疏水性相互作用和阳离子交换能力的高效液相色谱柱カプセルパツクSCX UG 80 S-5(尺寸4.6mm i.d.×250mm)(株式会社资生堂)连接在HPLC装置中，使0.2mmol/L的磷酸缓冲液(pH3.5)以1mL/分的流速流过进行平衡后，注入10μL样品。通过使用示差折射计作为检测器得到色谱图，可以分离目的化合物。
然而，包含本发明化合物的表面改性剂，可以以纯化前的甲醇溶液阶段的状态直接使用。
上面的步骤，即使式(5)或(6)所示的化合物中的m、n改变，也可以同样地进行。此处显示的步骤是m＝3、n＝2的情况。此外，可以通过使用3-(2-氨基乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷等作为具有氨基的硅烷化合物，在硅烷部位和磷酸胆碱基之间插入仲胺，关于这点也可以用与上述相同的步骤进行。反应溶剂没有特别限制，除了上述的甲醇外，还可以使用水或乙醇、丙醇、丁醇等醇，N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜等非质子性溶剂。但是，为了防止反应中有机硅烷化合物的聚合，优选脱水溶剂。
此外，在式(5)或(6)中的甲氧基(OCH3)为乙氧基(OC2H5)的情况下，将甲醇更换为乙醇进行反应，为Cl的情况下，更换为二甲基甲酰胺或二甲亚砜。
此外，与Si结合的甲氧基或乙氧基或Cl之中，有2个或1个被甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基中任意一个所代替的情况下，也可与上述方法同样地进行制备。
表面改性剂上述式(5)和(6)的化合物可以作为物质的表面改性剂。即，容易在物质表面导入所需量的磷酸胆碱基而进行改性。具体地，在表面具有羟基的物质的情况下，通过该物质表面的羟基与式(5)和(6)化合物的Si-OCH3进行脱水反应形成化学键。该化学反应在几乎所有的有机溶剂中在10℃～250℃的温度范围内极容易地定量进行。通过该脱水反应，可以进行化学、物理上极稳定的通过磷酸胆碱基的表面改性。
此外，在物质表面上不存在羟基的情况下，以下方法是有效的将式(5)和(6)的化合物溶解在挥发性溶剂中，将该溶液涂布到物质表面上，并使溶剂干燥。作为具体的实例，将式(5)和(6)化合物溶解在甲醇中，并将其涂布到物质表面上。然后在10℃～250℃的温度范围内使甲醇气化，进一步根据需要进行加热处理。此时，式(5)和(6)化合物中的Si-OCH3之间发生脱水反应，生成Si-O-Si键，从而可以被覆物质表面。Si-OCH3之间发生脱水反应生成Si-O-Si键的反应是公知的。在甲醇挥发时这样形成的膜，由于与几乎所有物质表面上微量存在的羟基在各处产生结合，因此成为稳定性良好的表面改性法。本法不仅对没有羟基的物质，对有羟基的物质也是极为效的表面改性法。
用本发明的表面改性剂改性了的物质(或者是材料)，成为生物适合性及亲水性优良的材料及成形品。作为在材料表面上直接具有有生物适合性的磷酸胆碱基的材料，可以在化妆品、医用材料(人工脏器、手术用具等)、色谱用填充剂、涂料等广泛的用途中应用。
此外，本发明的表面改性剂，作为分离或分析装置用的配管、配管连接部件、取样的针、取样瓶、检测池等与试验液相接触的部件的改性方法是有用的，尤其优选用于HPLC、MS、NMR的连接配管或电泳装置的毛细配管等材料的改性。特氟隆(注册商标)管、テフゼル管、ピ一ク树脂管、熔融石英管等材料。
磷酸胆碱衍生物亲水性极高，在有机溶剂中的溶解度极低。磷酸胆碱衍生物的合成大致分为用二氧杂正膦类作为起始物质的全合成法和用通过包含在大豆等中的磷脂——磷脂酰胆碱水解而得到的甘油磷酸胆碱作为起始物质的合成法。由于溶解磷酸胆碱衍生物的有机溶剂有限，造成合成路线复杂，制备成本高而阻碍实际应用。该合成的复杂性和成本问题在全合成法中表现突出。但是根据本发明的制备方法，可以在磷酸胆碱衍生物的良溶剂中极简单且高收率地制备具有羧基的磷酸胆碱衍生物，而且可以从由可廉价大量获得的磷脂酰胆碱衍生的甘油磷酸胆碱进行制备，在成本方面也很有利。最终，式(6)所示的化合物也可以简便并且高收率地得到。
将甘油磷酸胆碱、高碘酸钠、三氯化钌(水合物)加入到乙腈水溶液中。在室温搅拌后，过滤，从滤液中除去溶剂。从得到的固体物中用甲醇提取目的物，然后通过蒸馏除去甲醇，得到下式(9)所示的具有羧基的磷酸胆碱衍生物。结构式及NMR图谱如图16所示、Mass图谱如图17所示。
此外，反应溶剂也可以是水，并且还可以使用高碘酸以外的其他高碘酸盐或高碘酸等，也可以使用三氯化钌以外的其他二价和/或三价钌化合物或这些物质的水合物等。
然后，向式(9)所示的化合物的甲醇溶液中，添加3-氨基丙基三甲氧基硅烷0.5当量、以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N’-3-二氨基丙基碳化二亚胺(EDC)各1当量。通过将该混合溶液在室温搅拌3小时，得到式(6)所示化合物。
此外，反应溶剂也可以是甲醇以外的N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、氯仿等，此外还可以使用NHS、EDC以外的二环碳化二亚胺(DCC)、羧基二咪唑(CDI)等。
上面的步骤，即使式(6)所示的化合物中的m、n改变，也可以完全同样地进行。此处显示的步骤是m＝3、n＝2的情况。但是，为了防止反应中有机硅烷化合物的聚合，优选脱水溶剂。
此外，在式(6)中的甲氧基(OCH3)变成乙氧基(OC2H5)的情况下，将甲醇更换为乙醇进行反应，变成Cl的情况下，更换为二甲基甲酰胺或二甲亚砜。
此外，与Si结合的甲氧基或乙氧基或Cl中，有2个或1个被甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基中的任意一个所代替的情况下，也可与上述方法完全同样地进行制备。
本发明的表面改性剂可以优选用于将具有羟基的粉末进行改性。
本发明的改性粉末用以下方法制备。通过该方法，可以容易地制备在粉末表面直接具有磷酸胆碱基的改性粉末，即，在粉末表面通过化学结合导入磷酸胆碱基的改性粉末。
该改性粉末，与通过用具有磷酸胆碱基的聚合物被覆而导入磷酸胆碱基的粉末相比较，具有不会因聚合物的剥落而失去磷酸胆碱基的优点。此外，由于没有被聚合物被覆，因而具有不损害粉末自身微细结构的优点。具体地，通过使用本发明的表面改性剂，可以不埋没粉末表面所具有的立体上数nm级别的微细结构(微细孔等)而用磷酸胆碱基被覆表面。
此外，在将磷酸胆碱基衍生物作为低分子导入物体的情况下，首先该物体上导入能与磷酸胆碱基衍生物反应的官能团然后使磷酸胆碱基衍生物反应的方法中，由于物体表面上未反应的官能团残留在物体表面上，因此生物适合性低。例如，在首先在物体表面上导入氨基，然后使磷酸胆碱的醛衍生物与物体表面的氨基反应的情况下，很多未反应的氨基残留。这些残留氨基尽管可以通过与其它低分子化合物结合而一定程度地封锁，但是难于维持物体表面的亲水性，而且不能完全封锁。在物体表面上残留很多氨基的情况下，由于氨基具有强碱性，主要是酸性蛋白质表现出明显很强的电相互作用，其几乎所有产生吸附。在用作色谱用填充剂的情况下，成为该蛋白质的回收率降低或峰显著拖尾的原因。而且，蛋白质的吸附导致其变性，在用作生物适合性材料的情况下，成为炎症等的原因，因而不好。
在合成本发明的表面改性剂时，相对于具有氨基的有机硅烷化合物，添加过量的磷酸胆碱的醛衍生物，使二者在液相中反应。已知氨基与醛基的反应性非常高，在添加过量醛的情况下几乎100％的氨基与醛反应。因此，本发明的表面改性剂中没有检出未反应的氨基。因此，采用本发明的表面改性，可以在物体表面只导入磷酸胆碱基而不混有未反应的氨基。据此，与在固相上进行2步反应的方法相比，可以得到生物适合性极高，蛋白质吸附少的粉末。
向式(5)或(6)化合物的0.3mmol/mL浓度的甲醇溶液20mL中加入蒸馏水20mL，添加进行表面改性的粉末。粉末的质量必须根据其比表面积进行调整。例如当为100m2/g的粉末时，其添加量为10g左右是适当的。将该粉末分散液在油浴中80℃回流，5小时后将粉末过滤，用甲醇洗净，在80℃减压干燥3小时，由此得到改性粉末。
所用的粉末没有特别的限制，是指根据用途一般平均粒径为0.01～10μm或者0.01～1000μm左右的任意物体。作为具体的粉末，可以列举例如无机粉末(例如滑石粉、高岭土、云母、绢云母、白云母、金云母、合成云母、红云母、黑云母、蛭石、碳酸镁、碳酸钙、硅酸铝、硅酸钡、硅酸钙、硅酸镁、硅酸锶、钨酸金属盐、镁、硅、沸石、硫酸钡、煅烧硫酸钙(熟石膏)、磷酸钙、氟磷灰石、羟基磷灰石、陶瓷粉、金属皂(例如肉豆蔻酸锌、棕榈酸钙、硬脂酸铝)、氮化硼、氧化铈等)；有机粉末(例如聚酰胺树脂粉末(尼龙粉末)、聚乙烯粉末、聚甲基丙烯酸甲酯粉末、苯并鸟粪胺树脂粉末、聚四氟乙烯粉末、聚甲基硅倍半氧烷粉末、硅酮弹性体粉末、纤维素粉末等)；无机白色颜料(例如二氧化钛、氧化锌等)；无机红色系颜料(例如氧化铁(氧化铁红)、钛酸铁等)；无机褐色系颜料(例如γ-氧化铁等)；无机黄色系颜料(例如黄色氧化铁、黄土等)；无机黑色系颜料(例如黑色氧化铁、低次氧化钛(低次酸化チタン)等)；无机紫色系颜料(例如锰紫、钴紫等)；无机绿色系颜料(例如氧化铬、氢氧化铬、钛酸钴等)；无机蓝色系颜料(例如群青、普鲁士青等)；珍珠颜料(例如氧化钛包衣的云母、氧化钛包衣的氯氧化铋、氧化钛包衣的滑石粉、着色氧化钛包衣的云母、氯氧化铋、鱼鳞箔等)；金属粉末颜料(例如铝粉、铜粉等)；锆、钡或铝色淀等有机颜料(例如红色201号、红色202号、红色204号、红色205号、红色220号、红色226号、红色228号、红色405号、橙色203号、橙色204号、黄色205号、黄色401号以及蓝色404号等有机颜料，红色3号、红色104号、红色106号、红色227号、红色230号、红色401号、红色505号、橙色205号、黄色4号、黄色5号、黄色202号、黄色203号、绿色3号以及蓝色1号等)；天然色素(例如叶绿素、β-胡萝卜素等)等。
通过上述的制备方法，可以简便地得到含有任意量的亲水性磷酸胆碱基的粉末。此外，在粉末是合成聚合物的情况下，作为其亲水部分，也可以含有羧酸基、羟基、伯～叔氨基、磺酸基、磷酸基、聚氧乙烯基、铵基、酰氨基、羧基甜菜碱、糖类等，可以通过这些物质的种类以及含量来设计粉末的功能。此外，作为其疏水部分，也可以含有碳原子数2～22的直链或支链烷基、胆固醇等环状烷基、含有油烯基等不饱和键的烃基、以苯环、萘环、芘为首的烃类芳香族、吡啶环、咪唑、噻唑、吲哚等杂环类芳香族、全氟烷基、聚烷基硅氧烷等疏水基，可以根据粉末的用途进行选择、设计。合成聚合物粉末的疏水基的结合形态，可以通过酯、醚、酰胺、尿烷、尿素键等，直接结合到聚合物主链上，也可以通过间隔物与主链结合。作为间隔物的种类，可以列举亲水性的聚氧化乙烯、疏水性的聚氧化丙烯、直链烷基(碳原子数2～22)等。
本发明的改性粉末是亲水性和保湿性优良的粉末。作为具有生物适合性的粉末，可以应用到化妆品、医用材料、色谱用填充剂、涂料等广泛的用途中。
通过本发明的表面改性剂，可以将载体表面改性从而容易地制备具有所需量的磷酸胆碱基的色谱用填充剂。
具体地，通过载体表面上存在的羟基与式(5)以及(6)化合物中的Si-OCH3的脱水反应，将磷酸胆碱基导入到载体表面。
向式(5)和(6)化合物的甲醇溶液(0.3mmol/mL)20mL中，加入蒸馏水20mL，添加平均粒径5μm、平均细孔径300埃、比表面积100m2/g的球状高纯度硅胶4g。将该粉末分散液在油浴中于80℃回流，5小时后将粉末过滤，以甲醇洗净，在80℃减压干燥3小时，由此可以容易地得到表面上直接具有磷酸胆碱基的粉末。
反应溶剂除了水-甲醇混合溶剂以外，还可以使用水、乙醇、2-丙醇等质子性溶剂，或二甲亚砜、二甲基甲酰胺、甲苯、乙醚等非质子性溶剂，这些可以单独或组合使用。
此外，在载体表面上不存在羟基的情况下，以下方法是有效的将式(5)和(6)的化合物溶解在挥发性溶剂中，将该溶液涂布在物质表面上，然后干燥溶剂。作为具体的实例，将式(5)和(6)化合物的甲醇溶液(0.3mmol/mL)，根据物质的比表面积将其适量直接涂布在物质上。然后在10℃～250℃的温度范围内使甲醇气化。此时，式(5)和(6)化合物中的Si-OCH3之间发生脱水反应，生成Si-O-Si键，从而可以被覆物质表面。该脱水反应是公知的。在甲醇挥发时这样形成的膜，由于与几乎所有物质表面上微量存在的羟基在各处产生结合，因此可以进行稳定性良好的表面改性。本法不仅对没有羟基的物质，对有羟基的物质也是极为效的表面改性法。
与首先向载体表面导入氨基、然后将含有通过甘油磷酸胆碱的氧化分解反应而得到的醛体的化合物导入的方法相比，使用本发明表面改性剂的方法的最大不同点是在物体表面上有无未反应的氨基。
即，在使用本发明的表面改性剂的情况下，可以在物质表面上只导入磷酸胆碱基而不混有未反应的氨基。在首先将氨基导入到粉末表面的情况下，第二步导入磷酸胆碱基的反应由于液相中的甘油磷酸胆碱的醛化物必须与固相表面的氨基反应，因而由于扩散速率或固相表面的立体结构导致的立体障碍、磷酸胆碱基自身的立体性等而使反应率低。在只有大约30％的氨基上可以导入磷酸胆碱基。尽管残留的氨基可以通过与其它低分子化合物结合而一程度地封锁，但是维持物体表面的亲水性很困难，而且不能完全封锁。
此外，在物体表面上残留很多氨基的情况下，由于氨基具有强碱性，主要是酸性蛋白质表现出明显很强的电相互作用，其几乎都产生吸附。用作色谱用填充剂时，成为该蛋白质的回收率降低或峰显著拖尾的原因。而且，蛋白质的吸附导致其变性，在用作生物适合性材料时，成为炎症等的原因，因而不好。
相反，本发明的表面改性剂在合成时相对于具有氨基的有机硅烷化合物添加过量的磷酸胆碱的醛衍生物，使二者在液相中反应。已知氨基与醛基的反应性非常高，一般在添加过量醛的情况下几乎100％的氨基与醛反应。
因此，在本发明的表面改性剂中没有检出未反应的氨基。因此，使用本发明的表面改性，可以在物体表面只导入磷酸胆碱基而不混有未反应的氨基。据此，与在固相上进行2步反应的方法相比，可以得到生物适合性极好、蛋白质吸附少的粉末。
此外，已知在通过将球状粉末分散于液相中而进行表面改性时，强度弱的粉末存在搅拌中粉末崩解的现象。在本法中，由于可以一步并且短时间地直接将磷酸胆碱基导入到粉末上，因此与在固相上进行2步反应的方法相比，粉末的搅拌时间节省了1/4或以下，可以适用于更广泛的结构、材料的粉末。具体地，就连对细孔径超过1000埃的这样的机械强度弱的粉末，也可以不损害粉末形状而进行表面改性。
本发明中使用的载体包括二氧化硅、硅胶、活性炭、沸石、氧化铝、粘土矿物等无机多孔体、多孔有机高分子树脂。载体优选粉末。优选球型或破碎型多孔硅胶。球状多孔硅胶的平均粒径是1～200μm，优选1～10μm，球状多孔硅胶的细孔平均径是10～2000埃，优选80～1000埃，比表面积是0.01～800m2/g，优选80～600m2/g。
本发明的色谱用填充剂用于GFC用柱时，蛋白质或多肽的吸附极少，发挥高分离能力。
即，是在蛋白质及多肽的吸附抑制方面优良的柱填充剂。因此，可以适用于利用分子量的差异分离蛋白质和多肽的模式(GFC模式)。
而且，本发明的色谱用填充剂由于磷酸胆碱基带有双电荷，因此是不仅基于样品分子量的不同，而且基于样品所带有的微弱的电荷差异而具有更高分离能力的柱填充剂。像这样为了抑制蛋白质的吸附而导入具有双电荷的官能团的例子还没有，用本发明的表面处理剂制备的色谱用填充剂是迄今没有的新的GFC用柱填充剂。利用具有该电荷的这一特征，不仅能够根据分子量的不同和其所带的电荷来分离蛋白质或多肽，而且表明，通过改变流动相的pH或盐浓度，也可以控制填充剂表面与蛋白质或多肽的相互作用强度。因此，通过使流动相的pH或盐浓度最优化，可以自如地保留目的蛋白质或多肽。
GFC模式由于可以不使蛋白质或酶失活而将其分离、纯化，因此在未知生物样品的分离或医疗用途方面，也期待本发明的柱填充剂的高分离能力发挥作用。
本发明的色谱用填充剂，具体地，作为蛋白质及多肽的吸附极少的高分离能力柱填充剂，在例如人血清中的蛋白质的分离，或者在胰蛋白酶消化蛋白质所得的样品中含有的多肽的分离，或者以生物中含有的未知蛋白质的活性评价为基础的分离、分取方面是优良的。
当对生物样品中含有的蛋白质等进行分析时，必须进行除去来自生物的杂质的预处理。具体地，在测定血液中蛋白质的浓度时，为了得到溶解有蛋白质的血清，必须预先采用过滤、或者离心分离等除去血细胞或血小板等。在血液等的过滤过程中，存在由于所用的过滤器吸附蛋白质而导致蛋白质的定量性降低的问题。此外，用离心力使其通过有细孔的膜的双层结构的容器，在蛋白质样品的浓缩或脱盐、溶剂置换等目的中已经被广泛应用。例如可以列举Ultrafree-MC离心式フイルタ一ユニツト(产品名)(日本ミリポア株式会社)。该フイルタ一ユニツト是在上部装入浓缩前的样品，下部设置为朝向离心分离器的外侧，通过施加5000G左右的离心力完成过滤。就连这样的器具的过滤膜，也存在蛋白质的回收率下降到接近50％的情况，存在不良好的课题。
通过用式(5)和(6)的化合物对过滤器进行表面改性，可以得到蛋白质吸附极少的过滤器。由于式(5)和(6)中的Si-OCH3与过滤器表面的羟基发生脱水反应而结合，可以简便地导入蛋白质吸附抑制能力优良的磷酸胆碱基。由于所用的金属、玻璃、玻璃纤维等材质的过滤器的几乎所有表面上都具有来自氧化物的羟基，因此对广泛的材料都有效。
此外，在没有羟基的材料的情况下，以下方法是有效的将式(5)和(6)的化合物溶解在挥发性溶剂中，将过滤器或其他材料浸渍在该溶液中，然后干燥溶剂，洗净。具体地，将式(5)和(6)化合物的甲醇溶液(0.3mmol/mL)根据物质的比表面积适量地直接浸渍物质，然后在10℃～250℃的温度范围内使甲醇气化。此时，式(5)和(6)化合物中的Si-OCH3之间发生脱水反应，生成Si-O-Si键，从而可以被覆物质表面。该脱水反应是公知的。在甲醇挥发时这样形成的膜，由于与在几乎所有物质表面上微量存在的羟基在各处形成结合，因此可以进行比较强韧的表面改性。本法不仅对没有羟基的物质，对有羟基的物质也是极为效的表面改性法。
在通过磷酸胆碱基对如过滤器一样具有微细孔的物体进行表面改性时，用已经公知的具有磷酸胆碱基的聚合物进行被覆是困难的。主要原因是聚合物堵塞微细孔，降低作为过滤器的能力。通过使用式(5)和(6)这样的低分子，可以使载体表面改性而不损害载体的微细孔结构特性。而且，由于与载体表面不是物理吸附而可以形成化学键，在耐久性方面非常优良。
玻璃实验器具是指保存容器、计量用器具、比色杯(cell)、分馏管(fractionation tip)、样品分级(sample fractionation)用注射器等实验器具。在用本发明的表面改性剂进行处理的情况下，可以得到蛋白质吸附极少的实验器具。
实施例以下以实施例为基础进一步详细说明本发明。本发明不受这些实施例的限制。
合成例1含有磷酸胆碱基的醛化合物将L-α-甘油磷酸胆碱(450mg)溶解在蒸馏水15mL中，在冰水浴中冷却。添加高碘酸钠(750mg)(和光纯药工业株式会社)，搅拌5小时。将反应液减压浓缩，减压干燥，用甲醇提取目的物。结构如下述化合物(8)所示。式(8)化合物的1H NMR图谱如图1所示、Mass图谱如图18所示。
实施例1 式(5)和(6)化合物的制备将合成例1的化合物7.5g溶解在脱水甲醇30mL中，将容器内用干燥氮气置换。然后在化合物1的甲醇溶液中添加3-氨基丙基三甲氧基硅烷(信越化学工业株式会社)3.6g。将该混合物溶液在室温搅拌5小时后，冰冷，添加氰基硼氢化钠(和光纯药工业株式会社)2.5g，恢复至室温，并搅拌16小时。在此期间在反应容器中持续通入干燥氮气。过滤沉淀后，得到目的物质，即下式(10)和式(11)化合物的甲醇溶液。

实施例2 改性粉末的制备向含有实施例1中制备的式(10)和(11)化合物的甲醇溶液中加入蒸馏水35mL，进一步添加平均粒径5μm、平均细孔径30nm、比表面积140m2/g的硅胶14g。将该粉末分散溶液在80℃回流5小时。回流后用甲醇100mL过滤洗净，得到目的物质。
按照以上的步骤，用实施例1的表面改性剂处理过的改性粉末的元素分析值如表1所示。表中的C％或N％表示粉末中所含的碳元素或氮元素的质量％。从该值可知，用实施例1的表面改性剂处理后的粉末的碳和氮原子数之比(C/N)是5.08。由于式(10)和(11)的表面改性剂的甲氧基位置部位结合后的C/N是5，所以表明表面改性剂被导入到了粉末中而未被破坏。
表1

此外，该硅胶的13C-CPMAS图谱以及13C-PSTMAS图谱如图2所示。所谓PSTMAS图谱，是选择性得到自由运动的分子链的图谱的方法，是在粉末表面的修饰链的解析中广泛应用的方法。图2中在54.2ppm处观测到由胆碱基的碳产生的图谱。
另一方面，在图3所示的相同硅胶的31P-CPMAS图谱中，由于在与作为对象测定的NaH2PO4几乎相同的化学位移值上检测出峰，因此可以确认磷酸基的存在。由于根据图2确认了胆碱基的存在，又根据图3确认了磷酸基的存在，因此认为可以将磷酸胆碱基导入到载体硅胶表面。
此外，图2在9ppm、23ppm附近观测到由在硅原子和磷酸胆碱基之间存在的丙基的碳产生的图谱，在60ppm、69ppm附近观测到由磷酸胆碱内的乙基产生的图谱。由以上可知，式(5)和(6)的结构可以不被破坏而导入到硅胶中。此外，磷酸胆碱基与丙基三甲氧基硅烷的结合部分，与式(5)中所示的仲胺的结合部分、式(6)中所示的酰胺键的结合部分混在一起。
图4中显示了在本实施例中合成的改性粉末的FT-IR图谱。可以在1650cm-1附近观测到酰胺键所特有的吸收。
实施例3色谱用填充剂将在实施例2中制备的改性粉末作为载体，通过常规淤浆法填充在内径4.6mm、长250mm的空柱中。获得色谱图的条件如下流动相50mmol/L磷酸缓冲液+500mmol/L NaCl pH6.8流速100μL/min温度25℃检测UV 280nm在本条件下使用实施例3的柱时的校正曲线如图5中所示。图5所示的校正曲线在测定范围内线性极好。由于蛋白质的吸附少，因此填充剂表面与蛋白质的相互作用极小，作为其结果，可知进行分子量大的分子较早洗脱的GFC模式分离。其次，在上述条件下分离人血清蛋白质的结果如图6所示。
作为样品使用的是用蒸馏水稀释2倍的コンセ一ラN(产品名)，注入2μL。可知人血清这样的实验样品也是以分子量顺序的GFC模式进行分离，实用性非常高。
对比例1
接下来，将市售的色谱用柱(Shodex PROTEIN KW803，昭和电工株式会社制)以市售状态直接使用，尝试分离人血清样品(将コンセ一ラN(产品名)用蒸馏水稀释2倍)中的蛋白质。对比例中列举的该柱与实施例3中所述的柱有相同的内径和长度。
该填充剂被说明成是使亲水性基团化学结合到多孔性硅胶的表面上的尺寸排阻模式用的填充剂。平均细孔径是300埃，平均粒径5μm，适合与实施例1中所述的填充剂比较。被说明成适合于分子量1万～数十万的蛋白质的分离。
Shodex PROTEIN KW803由于使用非解离性亲水性基团，与用本发明的表面改性剂制备的填充剂不同，没有带电荷的官能团。因此，认为几乎没有与蛋白质的离子相互作用。
与实施例3同样，使用向50mmol/L磷酸缓冲液(由Na2HPO4及KH2PO4配制)中加入500mmol/L氯化钠的流动相，在流速100μL/min，柱温25℃的条件下，尝试分离人血清样品(将纯コンセ一ラN(产品名)用纯水稀释2倍)中的蛋白质。检测在UV 280nm处进行。结果如图7(b)所示。
此外，为了比较，在图7(a)中显示用实施例3中得到的本发明的表面改性剂制备的填充剂在相同条件下用相同样品获得的色谱图。
此外，在图(8)(a)中显示用本发明的表面改性剂制备的填充剂以盐浓度150mM使用时的色谱图；图8(b)中显示Shodex PROTEIN KW803以盐浓度150mM使用时的色谱图。图8中除了盐浓度外其他条件与图7相同。
在使用了用本发明的表面改性剂制备的填充剂的色谱图中(图7(a))，人血清中除了是主要蛋白质的γ-球蛋白和白蛋白以外，转铁蛋白的峰被确认为肩峰状是很大的特征。峰的归属使用分离的各种蛋白质的市售品进行。
相反，在使用现有的GFC用填充剂的情况下(图7(b))，白蛋白和转铁蛋白完全没有被分离。这由与分离的市售品的各种蛋白质的洗脱时间相同而确认。
白蛋白和转铁蛋白的分子量分别是大约69,000和75,000，非常相似。用现有的GFC用柱不能分离象白蛋白和转铁蛋白这样分子量相近的样品。可知使用本发明的表面改性剂配制的填充剂，不仅蛋白质的吸附极少，而且由于磷酸胆碱基带有双电荷而与蛋白质具有微弱的离子相互作用，即使是分子量相近的蛋白质也可以基于等电点和疏水性的不同而分离。
即，本发明的色谱用填充剂，在GFC模式中，不仅可以利用分子量的不同，而且可以根据蛋白质所具有的等电点和疏水性的不同来分离样品。
用本发明的表面改性剂制备的填充剂具有微弱的离子交换相互作用，这可以通过减小流动相的盐浓度来确认。
流动相的盐浓度是500mM的图7(a)中，即使使用以本发明的表面改性剂制备的填充剂，转铁蛋白也只是作为白蛋白峰的肩峰而确认的程度，流动相的盐浓度减小到150mM的图8(a)中，转铁蛋白与白蛋白的峰达到基线分离。
此外，在图8(a)中可以确认大量蛋白质产生的峰。一般地，已知在填充剂表面和流动相内的物质之间发生作用的离子交换相互作用是随着流动相盐浓度的减小而变强。这是指通过减小流动相盐浓度，受离子交换相互作用的物质就会被更强地保留。用本发明的表面改性剂制备的填充剂，通过减小流动相的盐浓度，形成尤其是对白蛋白的强保留，达到与转铁蛋白的完全分离。
由像图7、图8这样中性pH下在低盐浓度下保留带负电的白蛋白，推测用本发明的表面改性剂制备的填充剂具有阴离子交换模式。
因此，随后用乳酸、醋酸、琥珀酸、丙二酸、枸橼酸5种有机酸，评价了用本发明的表面改性剂制备的填充剂所具有的阴离子交换能力。评价条件如下。结果如图9所示。
柱4.6×150mm流动相50mmol/L磷酸缓冲液(pH6.8)流速1000mL/min检测UV 210nm由图9可知，用本发明的表面改性剂制备的填充剂可以根据羧酸的数量分离各种有机酸。
具体地，对由5种有机酸产生的各个峰进行归属时，2种具有1个羧酸的有机酸最早被洗脱分离，然后是2种具有2个羧酸的有机酸被洗脱分离，最后是具有三个羧酸的枸橼酸被洗脱分离。由于确认了随着羧酸数量的增加保留变大的趋势，就明确了该填充剂具有阴离子交换能力。因此可以说，用本发明的表面改性剂处理过的粉末作为阴离子交换用填充剂也是非常有效的。以上所示的离子交换性，适合用于进行没有使蛋白质吸附、变性程度的强度，回收率良好的独特分离。
另一方面，作为一般GFC用柱的Shodex PROTEIN KW803，如图8(b)中所示，在150mM的盐浓度时也不能分离转铁蛋白和白蛋白。
用本发明的表面改性剂制备的填充剂，是因具有抑制蛋白质吸附的优良功能而致的GFC模式(尺寸排阻模式)而且也存在离子交换模式的极独特的填充剂。由于蛋白质的吸附极少，因此可以在不使蛋白质变性而保持其酶活性状态的条件下分离、纯化蛋白质。而且，由于不仅有GFC模式还混有离子交换模式，因此是可以根据流动相的盐浓度或pH来控制分离的划时代的填充剂。
实施例4色谱用填充剂(用在硅原子和磷酸胆碱基之间具有2个氮原子、式(1)中R是式(4)p＝1所表示的化合物进行表面改性)将合成例1的化合物7.5g溶解在脱水甲醇30mL中，将容器内用干燥氮气置换。然后在化合物1的甲醇溶液中添加3-(2-氨基乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷(信越化学工业株式会社)3.6g。
将该混合溶液在室温搅拌5小时后，冰冷，添加氰基硼氢化钠2.5g，恢复至室温，搅拌16小时。在此期间在反应容器中持续通入干燥氮气。
过滤沉淀后，得到作为目的物质的下式(12)、(13)化合物的甲醇溶液。

向含有式(12)及(13)化合物的甲醇溶液中加入蒸馏水35mL，进一步添加平均粒径5μm、平均细孔径30nm、比表面积140m2/g的硅胶14g。将该粉末分散溶液在80℃回流5小时。回流后以甲醇100mL过滤洗净，得到目的物质。
在图10(b)中显示将导入了式(12)和(13)的硅胶按常规淤浆法进行填充，注入人血清样品(将コンセ一ラN(产品名)用蒸馏水稀释2倍)时的色谱图。
图10(a)是使用实施例3中制备的粉末时的色谱图。
实施例3与本实施例的不同是，表面改性剂的间隔物部分的仲胺数量不同。此外，在图10(a)和(b)中使用的硅胶是同一物质。
在硅原子与磷酸胆碱基之间的仲胺比图10(a)多1个的图10(b)中，可知转铁蛋白与白蛋白的分离进一步改善。这被认为是由于在硅原子与磷酸胆碱基之间插入了仲胺，由此增大了修饰基团的碱性，作为酸性蛋白质的白蛋白被更强地保留。
像这样，本发明的表面改性剂，因磷酸胆碱基产生蛋白质吸附抑制效果，而且可以通过改变硅原子与磷酸胆碱基之间间隔物的性质，赋予所谓离子交换性、疏水性、亲水性、氢结合性的相互作用。
实施例5硼硅酸玻璃纤维过滤材料<结合有磷酸胆碱基的硼硅酸玻璃纤维过滤材料的制备>
在100mL三角瓶中加入蒸馏水20g、含有实施例1中制备的式(10)和(11)化合物(大约0.4mmol)的甲醇溶液1.0mL，振荡混合。在其中添加8张ワツトマンジヤパン株式会社制的硼硅酸玻璃纤维过滤片(玻璃纤维滤纸グレ一ドGF/F，直径25mmΦ，每1片大约0.70g)后，于100℃加热煮沸回流5小时。冷却到室温后，将过滤器滤过，洗净，在80℃减压干燥3小时，得到在表面上直接具有磷酸胆碱基的硼硅酸玻璃纤维过滤片。
<过滤材料对蛋白质吸附的抑制效果的测定>
将牛血清白蛋白(BSA)10mg溶于100mL磷酸缓冲液中(将タカラバイオ社制的PBS片1片溶解在蒸馏水中，使总量为100mL。pH7.4～7.5)作为BSA溶液。分别取配制的BSA溶液2.0g到3支聚丙烯制的30mL取样管中，其中1支取样管中浸渍实施例6中制备的硼硅酸玻璃纤维过滤片，另1支取样管中浸渍未处理过的硼硅酸玻璃纤维过滤片。将其在室温(25℃)放置24小时，通过Lowry法分别对3支取样管中的BSA溶液进行发色、吸光光度分析，由此定量分析每1个过滤片的BSA吸附量。
可知本发明的硼硅酸玻璃纤维过滤片与未处理品相比较，BSA吸附量降低。
表2

由上述结果可知，本发明可以提供蛋白质或多肽的吸附极少的过滤材料。
本发明的过滤材料在抗体、酶等的分离、浓缩或血液透析、血液过滤等血液净化、分析等广泛的生物物质的过滤中有用。
实施例6玻璃瓶<结合有磷酸胆碱基的玻璃瓶的制作>
在100mL三角瓶中加入蒸馏水20g、含有实施例1中制备的式(10)和(11)化合物(大约0.4mmol)的甲醇溶液1.0mL，振荡混合。在其中添加10个日本ウオ一タ一ズ株式会社制的玻璃瓶(12×32mm螺旋式玻璃瓶)后，在100℃加热煮沸回流5小时。冷却到室温后，用甲醇洗净所述瓶，在80℃减压干燥3小时，得到在表面上直接具有磷酸胆碱基的玻璃瓶。
像这样，通过本发明的表面改性剂，可以得到蛋白质吸附极少的玻璃实验器具。已知用不能抑制蛋白质吸附的普通管瓶时，实验操作中蛋白质的样品浓度随着时间而减少。具体地，已知当从保存容器向高效液相色谱中注入样品时，存在尽管每次注入相同量的体积，但峰面积随时间减少的现象。本实施例中制造的玻璃瓶，由于在蛋白质吸附抑制方面优良，因此可以避免这样的现象。
此外，已知在使容器内壁吸附高分子从而抑制蛋白质的吸附的情况下，样品中含有有机溶剂时，会发生高分子的脱吸附，从而存在耐久性的问题。用高分子进行的表面被覆，是通过高分子与聚丙烯容器这样的基材之间的疏水性相互作用导致的吸附而实现的。样品溶剂中含有有机溶剂时，高分子与基材之间的疏水性相互作用减弱，高分子剥离。另一方面，本发明的表面改性剂(硅烷偶联剂)，由于通过化学结合进行表面修饰，因此不会实质性地受到样品中溶剂的影响，可以保持效果。
实施例7具有羧基的磷酸胆碱衍生物的制备向200mL烧瓶中加入甘油磷酸胆碱5g(19.4mmol)、高碘酸钠17g(79.7mmol，4.1当量)(和光纯药工业株式会社)、三氯化钌(水合物)81mg(0.39mmol，0.02mol当量)(和光纯药工业株式会社)以及离子交换水70g、乙腈30g。在室温搅拌2小时后，过滤，从滤液中除去溶剂。从得到的固体物中用甲醇提取目的物，然后通过除去甲醇得到下式(9)所示的具有羧基的磷酸胆碱衍生物。式(9)化合物的1H NMR图谱如图16所示、Mass谱如图17所示。
实施例8在硅原子和磷酸胆碱基之间具有酰胺键、式(1)中R是式(3)L＝2所表示的有机硅烷化合物(硅烷偶联剂)
将上式(9)化合物3g(12.4mmol)溶解在脱水甲醇100mL中，将容器内用干燥氮气置换。然后添加3-氨基丙基三甲氧基硅烷1.1g(6.2mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺1.4g(12.4mmol)以及N-乙基-N’-3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺2.4g(12.4mmol)，在-10℃反应16小时，得到含有下式(11)所示的间隔物中具有酰胺键、在末端具有磷酸胆碱基的有机硅烷化合物的溶液。
此外，代替上式(9)所示的化合物，通过使用在磷酸胆碱基和羧基之间具有碳原子数为5的饱和烷基链的O-磷酸胆碱羟基己酸，以同样的步骤可以得到式(1)中R是式(3)L＝6所示的化合物。
本发明的表面改性剂，不用纯化也可以将磷酸胆碱基固定在基材上。然而，也可以用例如下述的方法进行纯化。
纯化方法将得到的溶液减压浓缩，将其溶于蒸馏水中。以此水溶液作为样品。将具有疏水性相互作用和阳离子交换能力的高效液相色谱用柱-カプセルパツクSCX UG80 S-5(尺寸4.6mm i.d.×250mm)(株式会社资生堂)连接在HPLC装置中，使其用0.2mmol/L的磷酸缓冲液(pH3.5)以1mL/分的流速流过进行平衡后，注入10μL样品。使用示差折射计作为检测器得到色谱图，由此可以分离目的化合物。
实施例9用间隔物中具有酰胺键、在末端具有磷酸胆碱基的有机硅烷化合物处理的改性粉末向含有实施例8中制备的式(11)化合物的溶液30mL(0.25mmol/mL)中，加入蒸馏水35mL，进一步添加平均粒径5μm、平均细孔径30nm、比表面积140m2/g的硅胶14g。将该粉末分散液在80℃回流5小时。回流后用甲醇100mL过滤洗净，得到目的物质。通过上述步骤得到的用实施例8的表面改性剂处理过的改性粉末(处理前的碳含量是0.15％)的碳含量是2.49％。
对实施例9中制备的在表面上具有磷酸胆碱基的粉末中的磷元素进行了含量测定。在本发明的制备方法中，磷元素是磷酸胆碱基固有的元素，可以通过测定粉末表面上存在的磷元素量，确认实际上导入的磷酸胆碱基。
磷元素的含量测定通过钼酸发色法进行。以下说明含量测定方法。
(1)将所测定的粉末计量到充分洗净的试管中。
(2)向1的粉末中添加60％高氯酸水溶液(和光纯药工业株式会社)3mL。
(3)为了避免液体的气化扩散，在2的试管上部安装冷凝管，于120℃加热1小时，然后于180℃加热2小时。在本操作中，使粉末表面的修饰链全部被氧化，特别地，使磷元素以磷酸形式游离。
(4)将3的溶液放入离心分离机中(3000r pm，5分钟)，将上清液转移至1mL的取样管中。
(5)向4的溶液中添加蒸馏水1mL，和0.5M的钼酸钠(和光纯药工业株式会社)500μL以及0.5M的抗坏血酸500μL。
(6)将5的溶液在95℃的热水浴中加热5分钟，然后用冷水冷却。
(7)将6中发色完毕的溶液200μL滴加到96孔板中，在读板器中测定710nm处的发色强度。
(8)以由预先已知浓度的磷酸溶液的发色强度得到的校正曲线为基础，对样品中所含的磷元素的量进行定量。磷酸的标准溶液可以从和光纯药工业株式会社得到。
其结果是，实施例9中制备的在表面上具有磷酸胆碱基的改性粉末的磷元素是0.13mmol/ggel。即，可知可将0.13mmol/ggel的磷酸胆碱基固定在粉末表面上。
图11中显示本实施例中合成的改性粉末的FT-IR谱。
在1650cm-1附近可以观测到酰胺键所特有的吸收。
实施例10用间隔物中具有酰胺键、在末端具有磷酸胆碱基的表面改性剂(硅烷偶联剂)处理过的液相色谱用填充剂用在实施例9中合成的改性粉末作为载体，通过常规淤浆法填充在内径4.6mm、长250mm的空柱中。获得色谱图的条件如下流动相50mmol/L磷酸缓冲液+500mmol/L NaCl pH6.9流速200μL/min温度25℃检测UV 280nm首先，在图12中显示注入2μL混合有α2巨球蛋白0.67mg/mL(分子量约800,000，缩写α2M)、γ-球蛋白1.3mg/mL(分子量约160,000，缩写γG)、人血清白蛋白1.7mg/mL(分子量约70,000，缩写HSA)、溶菌酶0.3mg/mL(分子量约14,000，缩写LYZ)、尿嘧啶0.017mg/mL(分子量112，缩写U)的水溶液样品时的色谱图。α2M、γ-G、HSA、LYZ从シグマアルドリツチジヤパン株式会社得到、尿嘧啶从ナカライテスク株式会社得到。5个峰被明确地确认，以市售的单个样品的洗脱时间对其进行鉴定，结果按照洗脱早晚的顺序依次是α2M、γG、HSA、LYZ、U。5个峰之外观测到的小峰是市售标准样品中含有的杂质。可知通过酰胺键将磷酸胆碱基固定在硅胶上使蛋白质的吸附少，填充剂表面与蛋白质的相互作用极小，结果以分子量大的分子早洗脱的GFC模式进行分离。
酰胺键亲水性良好。从抑制蛋白质吸附的观点考虑，优选物质表面被覆亲水性并且非离子性的官能团。磷酸胆碱基有两性离子固有的极优良的亲水性、由于两性离子的电荷平衡的均衡，实质上离子性非常微弱，可以说是抑制蛋白质吸附方面优良的官能团。然而，将磷酸胆碱基固定到物质表面所用的间隔物的疏水性很高时，会诱发蛋白质的非特异性不可逆吸附。因此，在间隔物上存在酰胺键是极重要的，它实现更亲水的表面改性。连该间隔物所含的亲水性在蛋白质的吸附抑制中也极有效果。
<与甜菜碱结构的表面改性剂相比的对比例(与现有技术的比较)>
对比例2关于具有与磷酸胆碱基不同的甜菜碱结构的有机硅烷类表面改性剂，日本特开平5-222064号公报中公开了式(14)所示的具有磺基甜菜碱的硅烷化合物。此外，在日本特开昭63-295593号公报中公开了式(15)所示的具有羧基甜菜碱的硅烷化合物。
将式(14)及(15)的硅烷化合物与实施例1的式(10)及(11)化合物进行比较。
式(14)及(15)化合物的制备方法按照公知的文献进行。
向式(14)化合物2.0g中加入甲醇20mL和蒸馏水20mL，进一步添加平均粒径5μm、平均细孔径30nm、比表面积140m2/g的硅胶5.0g。将该粉末分散溶液在80℃回流5小时，使式(14)所示的化合物固定到硅胶上。回流后用甲醇50mL过滤洗净，得到被式(14)所示化合物表面改性的硅胶。
关于式(15)所示化合物，也进行同样的操作，得到被式(15)所示化合物表面改性的硅胶。
然后，将得到的表面改性硅胶分别通过常规淤浆法填充在内径4.6mm、长250mm的空柱中。获得色谱图的条件如下流动相50mmol/L磷酸缓冲液+500mmol/L NaClpH6.9流速200μL/min温度25℃检测UV 280nm首先，在图13中显示往填充了实施例3的在表面具有磷酸胆碱基的填充剂的柱中注入2μL混合有α2巨球蛋白0.67mg/mL(分子量约800,000，缩写α2M)、γ-球蛋白1.3mg/mL(分子量约160,000，缩写γG)、人血清白蛋白1.7mg/mL(分子量约70,000，缩写HSA)、溶菌酶0.3mg/mL(分子量约14,000，缩写LYZ)、尿嘧啶0.017mg/mL(分子量112，缩写U)的水溶液样品时的色谱图。α2M、γ-G、HSA、LYZ从シグマアルドリツチジヤパン株式会社得到、尿嘧啶从ナカライテスク株式会社得到。
5个峰被明确地确认，由市售的单个样品的洗脱时间对其进行鉴定，结果按照洗脱早晚的顺序依次是α2M、γG、HSA、LYZ、U。是此前所述的从分子量大的物质开始洗脱的GFC模式。5个峰之外观测到的小峰是市售标准样品中含有的杂质。
另一方面，向用固定有式(14)所示的磺基甜菜碱的填充剂填充的柱中注入相同样品时的色谱图如图14所示。5种物质中，只观测到人血清白蛋白和尿素的峰，尤其是溶菌酶，在该样品浓度下不能确认洗脱。在构成磺基甜菜碱的季铵和磺酸之间没有达到电中性，发现在端部存在作为强酸的磺酸引起的阳离子交换能力，结果是由于与中性且带正电的溶菌酶之间产生极强的离子交换相互作用。
向用固定有式(15)所示的羧基甜菜碱的填充剂填充的柱中注入相同样品时的色谱图如图15所示。5种物质的峰与固定有磺基甜菜碱的柱的情况相比，洗脱良好。按照α2M、γ-球蛋白、溶菌酶、尿素、人血清白蛋白的顺序洗脱。应当注意的是，中性流动相下，带负电的人血清白蛋白被特征性地保留，洗脱比低分子的尿素还在后。这是因为在构成羧基甜菜碱的季铵与羧基之间没有达到电中性，由于发现了离子性相对强的季铵的强阴离子交换性，因此与中性且具有负电荷的人血清白蛋白之间产生极强的离子交换相互作用。
像这样，一般已知的甜菜碱并不完全是离子中性的。列举的磺基甜菜碱或羧基甜菜碱这样的甜菜碱结构具有优良的亲水性，但由于过强的离子交换性会诱发蛋白质的吸附。其中，已知磷酸胆碱基中磷酸与季铵的电荷平衡适当，在甜菜碱结构固有的极优良的亲水性和非离子性的抑制蛋白质吸附功能方面是优良的。
由以上可以说，迄今没有报告例的具有磷酸胆碱基的有机硅烷类表面改性剂(硅烷偶联剂)，在以不吸附蛋白质为目的的物质表面改性方面极为有效。通过使用本发明的表面改性剂，可以实施蛋白质的吸附少、生物适合性优良的表面改性。
产业实用性本发明含有磷酸胆碱基的新型化合物，可以作为表面改性剂。本发明的表面改性剂赋予物体生物适合性、保湿性、以及其它多种有用的功能。通过本发明的表面改性剂可以容易地制造用磷酸胆碱基改性的改性粉末、用该改性粉末作为载体的色谱用填充剂、用该表面改性剂改性的过滤器、用该表面改性剂改性的玻璃器具。
权利要求
1.下式(1)表示的含有磷酸胆碱基的化合物， 式中，m是2～6，n是1～4，X1、X2、X3各自独立地为甲氧基、乙氧基或卤素，但是，X1、X2、X3中至多2个可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基中的任意一个，R是下式(2)～(4)所示结构中的任意一个(在下式(2)～(4)结构中，式(1)化合物以A-R-B表示)， 式(2)～(4)中，L表示1～6，P表示1～3。
2.下式(5)或(6)表示的含有磷酸胆碱基的化合物， 式中，m是2～6，n是1～4，X1、X2、X3各自独立地为甲氧基、乙氧基或卤素，但是，X1、X2、X3中至多2个可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基中的任意一个。
3.一种表面改性剂，其包含权利要求1或2所述的含有磷酸胆碱基的化合物。
4.上述式(6)所示化合物的制备方法，其特征在于通过用高碘酸钠和三氯化钌氧化甘油磷酸胆碱的反应合成具有羧基的磷酸胆碱衍生物，由具有氨基的有机硅烷化合物与具有羧基的磷酸胆碱衍生物通过缩合剂合成上述式(6)所示的化合物。
5.用权利要求3所述的表面改性剂处理过的改性粉末。
6.色谱用填充剂，其包含用权利要求3所述的表面改性剂处理过的改性载体。
7.用权利要求3所述的表面改性剂处理过的过滤器。
8.用权利要求3所述的表面改性剂进行过表面处理的玻璃实验器具。
全文摘要
右式(1)表示的含有磷酸胆碱基的化合物。式(1)中，m是2～6，n是1～4。X
文档编号C07F9/00GK1886413SQ20048003511
公开日2006年12月27日 申请日期2004年12月1日 优先权日2003年12月2日
发明者东条洋介, 宫泽和之, 神田武利, 沓名裕, 佐久间健, 和田正良, 隅田如光 申请人:株式会社资生堂