专利名称：哌啶衍生物、含所述哌啶衍生物的药物组合物和制备方法
技术领域：
本发明涉及含从美丽决明(Cassia spectabilis(sin.C.excelsa，美洲槐(Senna spectabilis)))中分离出来的新物质及其半合成衍生物的药物组合物。具体而言，源于本发明的组合物表现出乙酰胆碱酯酶抑制作用，因此可用于治疗记忆相关的病症和神经变性疾病，例如阿尔茨海默病和帕金森病。本发明还涉及获得所述化合物的方法。
背景技术：
阿尔茨海默病(AD)是一种具有重大社会经济影响的神经变性疾病，它是65岁以上患痴呆人群总数的约50-60％的患病原因(Francis，P.T.；Palmer，A.M.；Snape，M.；Wilcock，G.K.；J.Neurol NeurosurgPsychiatry 1999，66，137)。AD侵染了约1.5％的65-69岁人群，21％的85-86岁人群和39％的90岁或以上人群，侵染了全世界约一千五百万人。由于AD患者半数为卫生医疗机构中的住院病人而且剩余的一半患者在家接受家人、亲戚和朋友的护理治疗，因此该病由于对患者、家庭、对卫生系统及对整个社会产生巨大影响而被认为是主要的健康问题之一。由于治疗昂贵而且患者逐渐失去运动和认知功能——甚至达到不能认出近亲的程度，因此AD患者的护理治疗常给所涉及的家庭带来巨大的感情、心理和经济压力。科学家们估计约400万人患有AD而且每5年65岁以上人群的AD发病率加倍。此外，在高度工业化的国家，65岁以上的人群为人口中增长最多的部分之一，到2050年可能达到至少1900万。估计该人群中的一半会患上某些形式的AD。
最初由德国病理学家Alois Alzheimer于1907年记载的精神运动功能和认知功能的渐进性退化过程，从第一个症状出现至死亡会持续约8.5至10年。与高级功能相关的脑区域——特别是新皮质区和海马区——最易受到由AD所致的生物化学改变的危害(Francis，P.T.；Palmer，A.M.；Shape，M.；Wilcock，G.K.；J.Neurol NeurosurgPsychiatry 1999，66，137；Michaelis，M.L.；J.Pharm.Exper.Ther.2003，304，897；Gooch，M.D.；Stennett，D.J.；Am.J.Health Syst.Pharm.1996，53，1545)。β-淀粉样肽(源于淀粉样蛋白质前体-APP)在衰老的血小板中的细胞外沉积和细胞内神经原纤维的无规则形成(含微管相关蛋白的异常磷酸化形式-TAU)(Gooch，M.D.；Stennett，D.J.；Am.J.HealthSyst.Pharm.1996，53，1545；Francis，P.T.；Palmer，A.M.；Snape，M.；Wilcock，G.K.；J.Neurol Neurosurg Psychiatry1999，66，137)是导致AD发生的最明显原因。该过程导致了神经元功能的丧失和突触损伤，和随后的记忆、运动协调和推理能力的损害，以及认知能力的丧失和痴呆。
在细胞水平上，AD除与其它神经递质如去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、谷氨酸和较低水平的P物质有关外，还与乙酰胆碱(ACh)在突触过程中的减少有关，减少了皮质胆碱能神经传递(Rufani，M.；Filocamo，L.；Lappa，S.；Maggi，A.；Drugs in the Future 1997，22，397；Tabarrini，O.；Cecchetti，V.；Temperini，A.；Filipponi，E.；Lamperti，M.G.；Fravolini，A.；Bioorg.and Med.Chem.2001，9，2921)。最近研究证实了烟碱型ACh受体和毒蕈碱(M2)型ACh受体数目减少，它们大多数存在于突触前胆碱能末端，并且突触后保留有毒蕈碱型(M1和M2)受体(Francis，P.T.；Palmer，A.M.；Snape，M.；Wilcock，G.K.；J.Neurol Neurosurg Psychia try 1999，66，137)。
乙酰胆碱由乙酰辅酶A(乙酰coA)和胆碱在乙酰胆碱转移酶的作用下生物合成，该酶将乙酰基转移到胆碱，重新生成辅酶-A。该神经递质存在于脑和神经肌肉接头中，构成了副交感神经系统的一部分。平滑肌的收缩、血管扩张和心搏的控制为ACh的直接作用；在脑中，它参与了突触过程并且与运动控制、记忆和认知有关。乙酰胆碱在突触间隙中的活性和持久性由乙酰胆碱酯酶(AChE)催化的水解作用调节，水解作用使其前体即胆碱再生。AChE的水解过程的活性位点由丝氨酸(SER 200)、组氨酸(HIS 440)和谷氨酸(GLU 327)的催化性三联体构成。AChE水解机制按下述过程进行丝氨酸亲核攻击ACh的羰基碳，产生通过氢键稳定的四平面(tetraedric)中间体，生成游离的胆碱和乙酰化的丝氨酸。最后，通过水使丝氨酸乙酰基团水解来恢复酶位点。
胆碱能假说的基础与药物能够通过增强中枢胆碱能功能来改善认知以及可能改善疾病所致的某些行为效应的能力相关联。有许多可选的方法可用来弥补胆碱能缺乏，其中大多数关注于ACh前体(胆碱或卵磷脂)的取代。然而，这些药剂并没有提高中枢胆碱能的活性(Francis，P.T.；Palmer，A.M.；Snape，M.；Wilcock，G.K.；J.Neurol NeurosurgPsychiatry 1999，66，137)。其它研究工作对使用胆碱酯酶抑制剂(ChE)如毒扁豆碱(phisostigmine)来减少ACh水解进行了研究。最近，已对涉及毒蕈碱受体(M1)的特异性激动剂和烟碱或毒蕈碱拮抗剂(M2)的治疗方法进行了探索(Francis，P.T.；Palmer，A.M.；Snape，M.；Wilcock，G.K.；J.Neurol Neurosurg Psychiatry 1999，66，137；Gooch，M.D.；Stennett，D.J.；Am.J.Health Syst.Pharm.1996，53，1545)。对AD的进展过程和分子病理学的进一步了解表明AChE抑制剂的使用可能是最有效的AD治疗方法(Francis，P.T.；Palmer，A.M.；Snape，M.；Wilcock，G.K.；J.Neurol Neurosurg Psychiatry 1999，66，137；Rufani，M.；Filocamo，L.；Lappa，S.；Maggi，A.；Drugs in the Future1997，22，397；Tabarrini，O.；Cecchetii，V.；Temperini，A.；Filipponi，E.；Lamperti，M.G.；Fravolini，A.；Bioorg.and Med.Chem.2001，9，2921；Maelicke，A.；Schrattenholz，A.；Samochocki，M.；Radina，M.；Albuquerque，E.X.；Behavioural Brain Res.2000，113，199；Quik，M.；Jeyarasasingam，G.；Eur.J.Pharmacol.2000，393，223)。
AD的治疗方法之一为M1突触后毒蕈碱受体的直接激动剂的开发。作为该研究线路的具体实例，可引用US 4,211,867、US 4,414,211和US6,093,733，它们都描述了新的毒蕈碱激动剂化合物。对这些受体的刺激提高了动物的认知能力。然而，尽管在M1激动剂的开发过程中作出了很多努力，很多受试化合物却表现出除了由于肠、膀胱和肺中M3受体的激活导致的多种副作用外的低选择性。M1非选择性激动剂也可与中枢神经系统(CNS)中的M4受体和M5受体相互作用，其结果尚未完全确定。另一种可能的胆碱能方法为突触后M2自身受体拮抗剂的开发。动物模型的药理学数据表明对这些受体的阻断有助于ACh水平的提高并可促使在认知能力测量试验中取得更好的结果。尽管公开了许多有效的M2拮抗剂，但仅极少数表现出与其它毒蕈碱型受体亚型相比时的较强的选择性(Greenlee，W.；Clader，J.；Asberom，T.et al.；II Farmaco 2001，56，247)。
最初的观测到毒蕈碱拮抗剂如东莨菪碱产生了短时记忆缺失的情况，导致了认为胆碱能缺乏主要是毒蕈碱性的观点。然而，一系列证据使这种观点发生了改变，上述证据包括对于脑组织解剖的放射自显影和组织化学研究、以及对患者的脑影像的研究，这些证据证明与毒蕈碱型受体相比，AD患者中存在着更为广泛的烟碱型受体的特异性丢失(Maelicke，A.；Schrattenholz，A.；Samochocki，M.；Radina，M.；Albuquerque，E.X.；Behavioural Brain Res.2000，113，199；Maelicke，A.；Albuquerque，E.X.；Eur.J.Pharmacol.2000，393，165；Maelicke，A.；Samochocki，M.；Jostock，R.；Fehrenbacher，A.；Ludwig，J.；Albuquerque，E.X.；Zerlin，M.；Biol.Psych.2001，49，279)。
现在，有很多证据表明烟碱类药物影响学习和记忆。尼古丁和其它烟碱类激动剂可改善认知和精神运动功能，而烟碱类拮抗剂可造成认知缺陷。此外，吸烟者中AD的发病率低于不吸烟者，这可能与在吸烟者的脑中观察到的烟碱型ACh受体(nAChR)的过度表达有关。因此，烟碱类药物在认知功能方面可显示出慢性作用和急性作用，并且神经保护可能是一种慢性作用(Maelicke，A.；Albuquerque，E.X.；Eur.J.Pharmacol.2000，393，165)。基于这些发现，如WO 02/44176、WO 94/04152和WO03/022856中所述，一些科学家正在寻找新的烟碱类激动剂，并取得了一些成功。
烟碱型受体在哺乳动物中以多种亚型表达，其中α4β2和α7亚型是最主要的，它们存在于突触后、突触前、突触周围和突触外部位。nAChRα7亚型受体的作用与α4β2亚型十分相似，但表现出高得多的Ca++渗透性、更快的脱敏作用和不同的药理学，包括被Ch激活和被α-银环蛇毒素(一种蛇毒素)阻断(Maelicke，A.；Samochocki，M.；Jostock，R.；Fehrenbacher，A.；Ludwig，J.；Albuquerque，E.X.；Zerlin，M.；Biol.Psych.2001，49，279)。由于胆碱敏感性，烟碱型受体α7甚至在天然神经递质裂解之后还可被化学刺激。因此，该受体亚型不仅对ACh的释放所引起的突触活动作出应答，而且还可对ACh/Ch浓度的量改变作出应答。此外，由于它对Ca++离子的高渗透性，α7受体的激活可在受刺激的细胞中产生代谢型(metabotropic)应答，包括Ca++控制的递质释放和对基因转录和蛋白质生物合成的刺激(Maelicke，A.；Samochocki，M.；Jostock，R.；Fehrenbacher，A.；Ludwig，J.；Albuquerque，E.X.；Zerlin，M.；Biol.Psych.2001，49，279；Maelicke，A.；Albuquerque，E.X.；Eur.J.Pharmacol.2000，393，165；Maelicke，A.；Schrattenholz，A.；Samochocki，M.；Radina，M.；Albuquerque，E.X.；Behavioural Brain Res.2000，113，199)。
最近，已经运用了三种主要方案以平衡烟碱型胆碱能缺乏刺激ACh合成、抑制ACh降解和给予烟碱型受体激动剂。实际上，通过给予ACh前体还未获得治疗上的突破；给予胆碱酯酶抑制剂为最常用的治疗替代方案，它产生的效果最好。然而，这些抑制剂的治疗价值有限，并且在绝大多数情况下根本不能阻止AD发展(Maelicke，A.；Samochocki，M.；Jostock，R.；Fehrenbacher，A.；Ludwig，J.；Albuquerque，E.X.；Zerlin，M.；Biol.Psych.2001，49，279；Maelicke，A.；Albuquerque，E.X.；Eur.J.Pharmacol.2000，393，165；Maelicke，A.；Schrattenholz，A.；Samochocki，M.；Radina，M.；Albuquerque，E.X.；Behavioural Brain Res.2000，113，199)。
很多烟碱型受体激动剂正在进行临床和临床前试验，但剂量难以确定；较高水平可能导致比激活烟碱受体更强的脱敏化作用。现在尚未解决的其它难题包括药物向目标脑烟碱受体(受体特异性亚型)的转运和受体亚型选择性(Maelicke，A.；Albuquerque，E.X.；Eur.J.Pharmacol.2000，393，165)。
考虑到在烟碱受体方面的最新突破(生理学、生物化学和基因表达)和它在AD相关事件中的有效参与，这些受体的变构调节剂的施用成为一种治疗AD的新方案。变构调节剂为通过结合位点与受体相互作用的物质，所述结合位点并不被ACh和烟碱类拮抗剂与烟碱类激动剂所作用。鉴于AD与烟碱类神经传递的减少有关，变构调节剂提高了烟碱型受体通道对ACh作出反应的活性。这些特性产生了一类新的nACHR配体——变构增效剂配体(APL)(Maelicke，A.；Samochocki，M.；Jos tock，R.；Fehrenbacher，A.；Ludwig，J.；Albuquerque，E.X.；Zerlin，M.；Biol.Psych.2001，49，279；Maelicke，A.；Albuquerque，E.X.；Eur.J.Pharmacol.2000，393，165；Maelicke，A.；Schrattenholz，A.；Samochocki，M.；Radina，M.；Albuquerque，E.X.；Behavioural BrainRes.2000，113，199)。
胆碱能假说是最为人们所接受的生物化学理论，并且是AD治疗中最有效的治疗策略之一。在增加胆碱能传递的各种机制中，对乙酰胆碱酯酶(AChE)——一种造成ACh代谢性裂解的四聚蛋白质——的抑制，成为通过提高中枢神经系统(CNS)中ACh水平、导致症状改善从而改善胆碱能缺乏的最有效方法。
尽管重症肌无力(MG)与神经肌肉接头的胆碱能受体数目的减少相关，且这一点与发现神经递质缺乏的阿尔茨海默病有所不同，但仍存在这样一种假说，即抑制通过AChE的神经递质代谢阶段也可缓解MG症状。因此，无关乎与所涉及机理是否被完全所知，获得新的分子——如本发明的新分子——在MG的治疗中可能是有益的。
市场上现有的AD治疗药剂中，他克林(tacrine(THA，Congnex))为第一种经美国FDA(食品与药物管理局)批准用于治疗的(合成)药物，它表现出的效果温和，但在缓解中、轻度AD的症状方面却意义重大。然而，由于具有迫使病人中断治疗的严重副作用，例如肝毒性，它的用途受到限制(Rufani，M.；Filocamo，L.；Lappa，S.；Maggi，A.；Drugsin the Future 1997，22，397)。除了他克林外，目前还有其它三种药物在美国和欧洲被商品化用于治疗AD多奈哌齐(donepezi(Aricept))、利凡斯的明(rivastigmine(Exelon))和加兰他敏(galanthamine(Reminyl))。其中，THA、多奈哌齐和加兰他敏为可逆AChE抑制剂，加兰他敏为最近获得FDA批准的天然产物并且用作抗胆碱酯酶药物开发的原型(Rufani，M.；Filocamo，L.；Lappa，S.；Maggi，A.；Drugs in the Future 1997，22，397；Michaelis，M.L.；J.Pharm.Exper.Ther.2003，304，897)。
已知IAChE的结构多样性和探究几种作用机制的可能，促进了对各种植物种及对微生物的植物化学研究，该研究可为抗胆碱酯酶物质提供新的模型。在这个意义上，已基于各种植物和微生物种的普遍应用或民族植物学数据而对它们进行了研究。植物药的最著名实例之一为银杏(Ginkco)提取物。银杏(Ginkco biloba(银杏科(Ginkgoaceae)))为一种在中药中数百年来用以改善机敏性的树。现在，银杏可能是最常用的用于改善认知功能的植物提取物。其使用在欧洲尤为盛行，最近获得German Bundesgesundheit Association批准用于痴呆的治疗。大多数证据表明认知功能的增强与标准提取物——EGb761——的使用有关。已在注意力、学习能力、短时记忆力、反应时间和选择时间测试方面进行了认知作用的检测，但是似乎结果在不同人群之间不可重现。此外，很多研究已在发行量有限的期刊上发表，这使得信息的获取更加困难；大多数的动物和人类体内试验只限于少数个体，以致于损害了对结果的结论性和普适性评估(Gold，P.E.；Cahill，L.；Wenk，G.L.；Psych.Sci.Publ.Int.2002，3，2)。
一些经银杏标准提取物的治疗和经安慰剂治疗的患者的研究，揭示了与多奈哌齐药效相比较的药效，其中多奈哌齐为治疗AD的备选药物。显然，很多伴随着长期使用银杏提取物的对CNS的保护效果，与具有抗氧化和抗炎特性的萜类成分和黄酮类化合物的存在有关。这些物质可通过以下不同的形式作用，有利于神经元组织的完整性(a)抑制超氧化物歧化酶和单胺氧化酶的活性，这会在大脑和体内中产生自由基；(b)俘获可能造成神经元损伤的自由基，从而延迟与衰老过程相关的脑的改变；(c)减少花生四烯酸的释放，所述花生四烯酸是在发生缺血之后很快就出现在脑中的脂质代谢的毒性副产物(Gold，P.E.；Cahill，L.；Wenk，G.L.；Psych.Sci.Publ.Int.2002，3，2)。
使植物化学组分、动物和微生物的研究针对性更强且更廉价的必要性，使得开发出许多化学和生物化学分析技术用来监测和筛选生物学上和药理学上有益的提取物、提取物部分和纯物质。就寻找AChE抑制剂而言，最近已开发出两种在薄层色谱中生物自显影的测定方法(Hostettmann，K.；Queiroz，E.F.；Vieira，P.C.；Princípios Ativosde Plantas Superiores，1a.ed.，EdUFSCar Carlos，2003)。Marston和他的同事(Marston，A.；Kissiling，J.；Hostettmann，K.A.；Phytochem.Anal.2002，13，51)使用偶氮染料鉴定AChE作用于乙酸-1-萘酯的活性；在另一例子中Rhee和其同事(Rhee，I.K.；van derMeent，M.；Ingkaninan，K.；Verpoorte，R.；J.Chromatography A 2001，915，217)使用5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(Ellmann’s试剂)以使酶的活性可视。显然，使用Ellmann’s试剂的唯一不便之处就是可视测定的局限，因为两种情况下白色的抑制环均在蓝色的平板(Marston及其同事测定)(Marston，A.；Kissiling，J.；Hostettmann，K.A.；Phytochem.Anal.2002，13，51)和黄色平板(Rhoe及其同事测定)(Hostettmann，K.；Queiroz，E.F.；Vieira，P.C.；Princípios Ativosde Plantas Superiores，1a.ed.，EdUFSCar Carlos，2003)上形成。
最近对巴西植物的研究(Trevisan，M.T.S.；Macede，F.V.V.；vande Meent，M.；Rhee，I.K.；Verpoorte，R.；Química Nova，2003，26，301)在微孔板中使用了Rhee及其同事的生物自显影测定和Ellmann’s测定以鉴定可能含AChE抑制物质的提取物(Rhee，I.K.；van der Meent，M.；Ingkaninan，K.；Verpoorte，R.；J.Chromatography A 2001，915，217；Ellmann，G.L.；Biochem.Pharmacol.1961，7，88)。对不同植物属的30个种的58种提取物进行了研究，其中作者把等于或者大于50％的抑制因子看作化学分级分离的筛选标准。初步工作中，瓜拉拿泡林藤(Paullinia cupana(guaraná))、Amburana cearensis(cumaru)和Lippia sidoide为表现出最佳结果的种，在两种生物测定中抑制65至100％的酶活性。瓜拉拿长期和短期给药后，观察到它对记忆获得的积极效果；至今，通过对A.cearensis和L.sidoides的提取物的生物导向分级分离，已分离出12种香豆素，这证明了这种新抗胆碱酯酶药物的生物预测分析方法的有用性。
加兰他敏是一种从石蒜科(Amaryllidaceae)的各种植物种中分离出来的生物碱，它已显示出为一种长效、选择性、可逆的且具竞争性作用的AChE抑制剂，其治疗效果甚至在治疗结束以后还在持续(López，S.；Bastida，J.；Viladomat，F.；Codina，C.；Life Sciences 2002，71，2521)。这是由于其双重作用机制作为AChE抑制剂起作用并且作用于脑的烟碱型受体。这些受体的调节放大了AChE信号的神经传递，标志着药物设计方面和通过烟碱型受体变构调节药物治疗AD方面的突破(Rufani，M.；Filocamo，L.；Lappa，S.；Maggi，A.；Drugs in theFuture 1997，22，397；Maelieke，A.；Schrattenholz，A.；Samochocki，M.；Radina，M.；Albuquerque，E.X.；Behavioural Brain Res.2000，113，199；Quik，M.；Jeyarasasingam，G.；Eur.J. Pharmacol.2000，393，223)。加兰他敏通过结合到脑AChE的活性位点上发挥作用，并且还刺激突触前和突触后烟碱型受体以增加神经递质例如ACh和谷氨酸的释放，直接刺激神经元功能(Fennel，C.W.；van Staden，J.；J.Ethnopharm.2001，78，15)。可与受体通过变构机制结合的加兰他敏类似物的相关专利中的一个极好的实例可在文献WO 01/43697中找到。
已证实从水仙(Narcissus L.(石蒜科))分离出来的另一种生物碱sanguinine(9-O-去甲基加兰他敏)在体外试验中其活性比加兰他敏本身活性高10倍。在这种植物属中寻找其它的AChE抑制剂(IAChE)，分离出了其它两种具有生物活性的加兰他敏衍生物——11-羟基加兰他敏和epinorgalanthamine。另一种结构类型的生物碱——类石蒜碱，已经从该属中分离出来，其中oxoassoanine、assoanine和pseudolicorine为最具有生物活性的组分(López，S.；Bastida，J.；Viladomat，F.；Codina，C.；Life Sciences 2002，71，2521)。
对中国民间医学(Chinese popular medicine)和中东民间医学中通常使用的各植物种进行研究，分离出了各种活性生物碱。其中的一个实例为蛇足石杉(Huperzia serrata(同义语千层塔(Lycopodiumserratum)))，它用于中国数百年来的一个治疗发热和炎症处方的茶制剂中。对这种植物进行植物化学研究，分离出了石杉碱甲(HuperzineA)，石杉碱甲是一种引人关注的用于治疗CNS病症和癫痫的备选药物，它可减少由高浓度的谷氨酸所致的神经元损失。石杉碱甲为一种选择性的IAChE，十分有效，其全身作用增加了ACh、多巴胺和去甲肾上腺素的释放，且ACh浓度的增长可持续最多达6小时，对丁酰胆碱酯酶(BuChE)几乎没有作用(Chang，J.；Biochem.Pharmacol.2000，59，211；Rajendran，V.；Saxena，A.；Doctor，B.P.；Kozikowski，A.P.；Bioorg.Med.Chem.2002，10，599)。从同一植物中还获得了一种新的类石松属(lycopodium)生物碱——石杉碱P。然而，其活性比石杉碱甲的活性低。
由石杉碱甲获得的结果鼓励了Orhan和他的同事对其它5个石松属种植物进行了研究以寻找其它的AChE抑制剂代谢物(Orhan，I.；Terzioglu，S.；Sener，B.；Planta Medica 2003，69，265)。在通过Ellmann’s测定对提取物进行初步评估后(Ellmann，G.L.；Biochem.Pharmacol.1961，7，88)，选择了石松(L.clavatum)地上部分的萃取物，对其进行生物导向分级分离，分离出了α-芒柄花萜醇(α-onocerin)。抗胆碱酯酶活性得到的结果显示出，IC50等于5.2μM的α-芒柄花萜醇在1至3mg/mL浓度下优于多奈哌齐，并且浓度为5mg/mL时几乎与多奈哌齐等效，但是它不能在所有测试剂量下均达到加兰他敏的效果。这种表现引起了对石杉碱的更多关注，促使人们加强了对结构类似物的寻找，并由此产生了大量专利申请，例如WO 99/11625、WO92/19238和EP 806 416。
从Buxus hyrcana中分离出来一些三萜生物碱，例如homomoenjodaramine和moenjodaramine，已证实这些生物碱为有前途的AChE抑制剂(Ur-Rahman，A.；Choudhary，M.I.；Pure Appl.Chem.1999，71，1079)。此科中，Buxus papillosa提供了另外三种甾体生物碱——选择性的AChE抑制剂环原黄杨星C、环维黄杨碱A(cyclovirobuxeine A)和环小叶黄杨碱A(Ur-Rahman，A.；Parveen，S.；Khalid，A.；Farroq，A.；Choudhary，M.I.；Phytochemistry 2001，58，963)。
从Fiatoua villosa中分离出来的玉米素(zeatine)，最初被描述为是一种胚芽生长的诱导剂，在进行了抑制AChE活性的筛选之后选择了其甲醇提取物。纯的玉米素以剂量依赖性模式抑制AChE活性，其IC50为1.09×10-4M(Heo，H-J.；Hong，S-C.；Cho，H-Y.；Hong，B.；Kim，H-K.；Kim，E-K.；Shim，D-H.；Mol.Cells 2002，13，113)。
在番茄皮(马铃薯(Solanum tuberosum L.))中以高浓度存在的生物碱苷类(glycoalkaloid)是造成很多食物中毒事件的原因。对中毒患者的观察结果表明了如精神错乱、抑郁和衰弱症状。这些效应与α-龙葵碱和α-卡茄碱对AChE的抑制作用相关，所述α-龙葵碱和α-卡茄碱占马铃薯中生物碱苷类的95％(Smith，D.B.；Roddick，J.G.；Jones，J.L.；Trends in Foods and Tech.1996，7，126)。
微生物培养物，尤其是各科和属的真菌培养物，作为寻找用于治疗严重疾病——例如癌症、疟疾和细菌感染等——的药物的重要来源，已经得到系统的研究。Otoguro、Kuno和他们的同事(Kuno，F.；Otoguro，K.；Shiomi，K.；Iwai，Y.；Omura，S.；J.Antibiot.1996，49，742；Kuno，F.；Shiomi，K.；Otoguro，K.；Sunazuka，T.；Omura，S.；J.Antibiot.1996，49，748；Otoguro，K.；Kuno，F.；Omura，S.；Pharmacol.Ther.1997，76，45)通过对由真菌产生的天然产物进行系统性筛选来寻找可恢复神经传递系统的候选新药，已经发现了新的AChE抑制剂——arisugacine。从土壤真菌培养物WK-4164和FO-4259中获得了cyclophostin和arisugacine A及arisugacine B，以及已知的土曲颤素(territrem)B和C，及圆弧菌素(cyclopenine)。其中，IC50为1.0nM的arisugacine A和IC50为25.8nM的arisugacine B，甚至在浓度高于抑制AChE活性50％的20,000倍情况下也不抑制BuChE，由此表明了其高选择性，并且导致了一些研究和创新被授予专利权，例如美国专利US 6,384,045。
另一方面，尽管土曲颤素B和C的IC50较低——分别为7.6nM和6.8nM，但它们表现出的选择性较低。圆弧菌素IC50为2,040nM，活性较低；然而，其选择性较好，在浓度最高达高于其IC502,000倍的情况下仍不抑制BuChE。尽管cyclophostin IC50为1.3nM且十分有效，但选择性较低，在剂量为其IC5035倍的情况下就可抑制BuChE(Shiomi，K.；Tomoda，H.；Otoguro，K.；Omura，S.；Pure Appl.Chem.1999，71，1059；Kuno，F.；Otoguro，K.；Shiomi，K.；Iwai，Y.；Omura，S.；J.Antibiot.1996，49，742；Kuno，F.；Shiomi，K.；Otoguro，K.；Sunazuka，T.；Omura，S.；J.Antibiot.1996，49，748；Otoguro，K.；Kuno，F.；Omura，S.；Pharmacol.Ther.1997，76，45)。
土曲颤素A、B和C已从土曲霉(Aspergillus terreus)培养物中分离出来；尽管Otoguro及其同事的研究显示土曲颤素B的选择性较低(Otoguro，K.；Kuno，F.；Omura，S.；Pharmacol.Ther.1997，76，45)，但是土曲颤素B比新施的明(neostigmine)的AChE抑制效果强约20倍。这些结果鼓励了Peng(Peng，F-C.；J.Nat.Prod.1995，58，857)制备出土曲颤素衍生物以进行结构-活性的研究。虽然通过Ellmann’s测定对酶活性的评估并未揭示任何半合成土曲颤素衍生物的任何效力增长，但却鉴定出C-2的双键、C-1的羰基和完整的吡喃酮体系为该系列化合物中抗胆碱酯酶活性的主要的药效基团。
出于对来自微生物代谢物的AChE抑制剂(通过Ellmann测定监测)的兴趣，Kim及其同事(Kim，W-G.；Song，N-K.；Yoo，I-D.；J.Antibiot.2001，54，831)对一种新真菌的培养物，即桔青霉90648(Penicilliumcitrinum 90648)培养物，进行了研究。从该微生物的固体发酵物中分离出了非对映异构体quinolactacin A1和A2。对这些物质的抗胆碱酯酶活性评估揭示了异构体A2表现出比非对映异构体A1高出14倍的抑制AChE活性。异构体A2的效果具有剂量依赖性，表现出的IC50为19.8μM，而异构体A1表现出的IC50仅为280μM。此外，通过使用他克林作为所有试验中的阳性对照，IC50为650μM的优性异构体(eutomer)表现出对基质的竞争性抑制活性，并且相对于丁酰胆碱酯酶(BuChE)而言具有AChE选择性(IC50 BuChE＝0.006μM，IC50 AChE＝0.12μM，选择性极低)。
为了寻找具有生物活性和药理学活性的哌啶类生物碱，我们的研究团队对一种源自巴西中西部的十分著名的豆科(leguminosae)植物，美丽决明，进行了广泛研究。对这种豆科植物的叶、果实和花进行植物化学研究，得到了大约12种2，6-烷基-哌啶-3-醇和衍生物，所述醇和衍生物在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的突变谱系中表现出较弱的选择性细胞毒性。这些生物碱的不显著的细胞毒性活性使得我们去探究其它的可确证决明(Cassia)属的一些民间药学数据的药理学测定法。因此，对中枢和周围镇痛活性、抗炎活性和AChE抑制活性进行了测定(Bolzani，V.S.；Gunatilaka，A.A.L.；Kingston，D.G.I.，“Bioactive and other piperidine alkaloids from Cassialeptophylla”，Tetrahedron 1995，51(21)，5929-5934；Moreira，M.S.A.；Viegas Jr.，C.；Miranda，A.L.P.Bolzani，V.S.；Barreiro，E.J.，“Analgesic profile of(-)-spectalinea piperidine alkaloidfrom Cassia leptophylla Vog.(Leguminosae)”，Planta Medica 2003，已提交；Viegas Jr.，C.，博士论文，UNESP-Araraquara/SP，2003，未发表数据；Viegas Jr.，C.；Young，M.C.M.；Bolzani，V.S.；Rezende，A.；Barreiro，E.J.，“Estudo Fitoquímico de Cassia leptophyllabiompnitorado por linhagens transgenicas de S.cerevisiae”，24a Anual da Sociedade Brasi1eira de Química，Pocos deCaldas-MG，2001，PN-075；Barreiro，E.J.；Bolzani，V.S.；ViegasJr.C.，“Novos Alcalóides Piperidínicos Isolados das Flores deCassia leptophylla(Leguminosae)，25a Anual da SociedadeBrasileira de Química， de Caldas-MG，2002，PN-058)。最多量的(-)-3-O-acetylspectaline和(-)-spectaline来自于该植物的花，将所述化合物进行几种化学修饰以获得新的衍生物。对氯化(chloridrate)衍生物LASSBio-767、LASSBio-768和LASSBio-822进行先体外后体内(ex vivo)AChE抑制能力评估，所述衍生物表现出显著的抗胆碱酯酶活性。尽管这些新衍生物的分子结构是新的，但很多其它的表现出抗胆碱酯酶活性的哌嗪类化合物(关注的化合物是哌啶生物碱)作为本领域现有技术的一部分已有记载。该智力成果的实例在文献WO 00/33788以及WO 92/17475、EP 1 300 395和EP 1 116 716中均有记载；其中，文献WO 00/33788记载了可在神经障碍中起作用的含氮杂环化合物，尽管文中说明了该化合物是较弱的AChE抑制剂，但未揭示其作用机理；文献WO 92/17475、EP 1 300 395和EP 1 116 716记载了不同于本文所述化合物的抗胆碱酯酶的哌啶衍生物和哌嗪衍生物。然而，并无报道将本发明目标分子用作抗胆碱酯酶物质或者用于治疗记忆障碍、神经变性疾病或中枢作用物质引起的中毒。
发明内容
本发明一个目的是提供抑制AChE的药物组合物。在本发明的一方面，这些药物组合物获自源于美丽决明的哌啶生物碱和它们的半合成衍生物，尤其是化合物2-(R)-甲基-3-(R)-O-乙酰基-6-(S)-(十四烷基-13’-酮)-哌啶、2-(R)-甲基-6-(S)-(十四烷基-13’-酮)-哌啶-3-(R)-醇和2-(R)-甲基-3-(R)-O-叔丁氧基羰基-6-(S)-(十四烷基-13’-酮)-哌啶和其各自的氯化物(cloridrate)。
本发明的药物组合物由于具有抑制AChE的能力，因而可用于治疗胆碱能传递相关病状——例如神经变性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病——和其他与记忆缺失相关的病症。
在另一方面，本发明的药物组合物由于具有抑制AChE的能力，因而还可用于治疗与胆碱能传递有关的其它疾病，例如肌肉疾病如重症肌无力和由生物药剂和/或化学药剂的军用所致的肌肉麻痹病症。
本发明的另一目的是提供获得本发明药物组合物的方法。
图1表示水迷宫试验中他克林(1mg/kg)对东莨菪碱所致遗忘症的逆转效果。该直方图表示用对照组(-μ-)、东莨菪碱(-λ-)和他克林+东莨菪碱(-◇-)进行4天试验期间的逃避潜伏期(escape latency(以秒计))。数值以平均值和标准偏差表示；*p＜0.05；**p＜0.01曼-怀二氏检验(Mann-Whitney test)。
图2表示水迷宫试验中浓度为1mg/kg的半合成生物碱LASSBio-767对东莨菪碱所致遗忘症的逆转效果。该直方图表示用对照组(-μ-)、东莨菪碱(-λ-)和LASSBio-767+东莨菪碱(-◇-)进行4天试验期间的逃避潜伏期(以秒计)。数值以平均值和平均标准差表示；*p＜0.05；**p＜0.01曼-怀二氏检验。
图3表示水迷宫试验中浓度为10mg/kg的半合成生物碱LASSBio-767对东莨菪碱所致遗忘症的逆转效果。该直方图表示用对照组(-μ-)、东莨菪碱(-λ-)和LASSBio-767+东莨菪碱(-◇-)进行4天试验期间的逃避潜伏期(以秒计)。数值以平均值和平均标准差表示；*p＜0.05；**p＜0.01曼-怀二氏检验。
图4表示水迷宫试验中浓度为1mg/kg的半合成生物碱LASSBio-822对东莨菪碱所致遗忘症的逆转效果。该直方图表示用对照组(-μ-)、东莨菪碱(-λ-)和LASSBio-822+东莨菪碱(-◇-)进行4天试验期间的逃避潜伏期(以秒计)。数值以平均值和平均标准差表示；*p＜0.05；**p＜0.01曼-怀二氏检验。
图5表示小鼠抑制性躲避试验(inhibitory avoidance assay)中不存在浓度为1和10mg/kg的半合成生物碱LASSBio-767时对东莨菪碱所致遗忘症的逆转作用。所示潜伏期从试验第一天(训练)和第二天(保持(retention))起算。注意经LASSBio-767处理的动物与仅经东莨菪碱处理的动物并无不同。数值以平均值和平均标准差表示。
图6表示小鼠抑制性躲避试验中浓度为1和3mg/kg的生物碱LASSBio-822对东莨菪碱所致遗忘症的逆转作用。所示潜伏期从试验第一天(训练)和第二天(保持)起算。注意先前经LASSBio-822处理的动物显示出对东莨菪碱所致遗忘症的显著的部分逆转作用。数值以平均值和平均标准差表示；*p＜0.05；**p＜0.01曼-怀二氏检验。
图7表示抑制性躲避试验中浓度为5.6mg/kg的他克林对诱导的遗忘症的逆转效果。所示潜伏期从试验第一天(训练)和第二天(保持)起算。注意先前经他克林处理的动物显示出对东莨菪碱所致遗忘症的完全的逆转作用。数值以平均值和平均标准差表示；***p＜0.001曼-怀二氏检验。
图8表示对他克林进行的LD50研究。该直方图表示在给予不同浓度他克林后10至30分钟的死亡小鼠百分率。
图9表示在给予盐水 LASSBio-767 10mg/kg他克林 30mg/kg他克林 和50mg/kg他克林 10至30分钟后，上述给药所致的胆碱能副作用。数值以平均值和平均标准差表示。
具体实施例方式
为了达到本发明目的，“药物组合物”应理解为下述的任何含活性成份的组合物，它们通过局部、肠胃外、肠内和/或鞘内形式给药，为了维持和/或恢复内环境稳定而发挥作用，并且具有预防、缓解和/或治疗性能。还是为了达到本发明的目的，“活性成份”应理解为式(I)或(II)表示的所有或任何物质，或者其可接受的药用盐。
本发明目的的新物质属于哌啶生物碱类，具有以下通式(I) 其中n等于2至16的整数R1为氢、酰基、烷基、烷氧基(alcoxyl)、环烷基；呋喃基、硫代苯基(tiophenyl)、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻唑基、喹唑啉基、异喹啉基或者苯基-W；其中W为氢、邻-烷基、邻-环烷基、邻-烷氧基、邻-环烷氧基、邻-硫氧基(thioxy)、邻-芳氧基、邻-砜、邻-硫醚、邻-亚砜、邻-磺酸酯/盐、邻-磺酰胺、邻-氨基、邻-酰氨基、邻-卤代、邻-烷氧羰基、邻-硫代烷氧羰基(carbothioalkoxy)、邻-三卤代烷、邻-氰基、邻-硝基、间-烷基、间-环烷基、间-烷氧基、间-环烷氧基、间-硫氧基、间-芳氧基、间-砜、间-硫醚、间-亚砜、间-磺酸酯/盐、间-磺酰胺、间-氨基、间-酰氨基、间-卤代、间-烷氧羰基、间-硫代烷氧羰基、间-三卤代烷、间-氰基、间-硝基、对-烷基、对-环烷基、对-烷氧基、对-环烷氧基、对-硫氧基、对-芳氧基、对-砜、对-硫醚、对-亚砜、对-磺酸酯/盐、对-磺酰胺、对-氨基、对-酰氨基、对-卤代、对-烷氧羰基、对-硫代烷氧羰基、对-三卤代烷、对-氰基或对-硝基。
本发明目的的一种新物质属于通式(I)的衍生物，它具有通式(II) 其中n等于2至16的整数R1为氢、酰基、烷基、烷氧基、环烷基；呋喃基、硫代苯基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻唑基、喹唑啉基、异喹啉基或者苯基-W；其中W为氢、邻-烷基、邻-环烷基、邻-烷氧基、邻-环烷氧基、邻-硫氧基、邻-芳氧基、邻-砜、邻-硫醚、邻-亚砜、邻-磺酸酯/盐、邻-磺酰胺、邻-氨基、邻-酰氨基、邻-卤代、邻-烷氧羰基、邻-硫代烷氧羰基、邻-三卤代烷、邻-氰基、邻-硝基、间-烷基、间-环烷基、间-烷氧基、间-环烷氧基、间-硫氧基、间-芳氧基、间-砜、间-硫醚、间-亚砜、间-磺酸酯/盐、间-磺酰胺、间-氨基、间-酰氨基、间-卤代、间-烷氧羰基、间-硫代烷氧羰基、间-三卤代烷、间-氰基、间-硝基、对-烷基、对--环烷基、对-烷氧基、对-环烷氧基、对-硫氧基、对-芳氧基、对-砜、对-硫醚、对-亚砜、对-磺酸酯/盐、对-磺酰胺、对-氨基、对-酰氨基、对-卤代、对-烷氧羰基、对-硫代烷氧羰基、对-三卤代烷、对-氰基或对-硝基。
R2为氢或具有1至9个碳原子的烷基，并且
X为卤素；本发明目的的另一种新物质属于通式(I)的衍生物，它具有通式(III) 其中n等于2至16的整数R1为氢、酰基、烷基、烷氧基、环烷基；呋喃基、硫代苯基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻唑基、喹唑啉基、异喹啉基或者苯基-W；其中W为氢、邻-烷基、邻-环烷基、邻-烷氧基、邻-环烷氧基、邻-硫氧基、邻-芳氧基、邻-砜、邻-硫醚、邻-亚砜、邻-磺酸酯/盐、邻-磺酰胺、邻-氨基、邻-酰氨基、邻-卤代、邻-烷氧羰基、邻-硫代烷氧羰基、邻-三卤代烷、邻-氰基、邻-硝基、间-烷基、间-环烷基、间-烷氧基、间-环烷氧基、间-硫氧基、间-芳氧基、间-砜、间-硫醚、间-亚砜、间-磺酸酯/盐、间-磺酰胺、间-氨基、间-酰氨基、间-卤代、间-烷氧羰基、间-硫代烷氧羰基、间-三卤代烷、间-氰基、间-硝基、对-烷基、对-环烷基、对-烷氧基、对-环烷氧基、对-硫氧基、对-芳氧基、对-砜、对-硫醚、对-亚砜、对-磺酸酯/盐、对-磺酰胺、对-氨基、对-酰氨基、对-卤代、对-烷氧羰基、对-硫代烷氧羰基、对-三卤代烷、对-氰基或对-硝基。
R2为氢或具有1至9个碳原子的烷基，并且X为卤素；为了清楚起见，氯化物衍生物将采用以下命名LASSBio-767为通式(II)的衍生物，其中R1为乙酰基、R2为氢、X为氯(chloride)并且n等于9；LASSBio-768为通式(II)的衍生物，其中R1为H、R2为氢、X为氯并且n等于9；LASSBio-822为通式(II)的衍生物，其中R1为叔丁氧羰基、R2为氢、X为氯并且n等于9；LASSBio-795为通式(II)的衍生物，其中R1为乙酰基、R2为甲基、X为碘并且n等于9；LASSBio-783为通式(III)的衍生物，其中R1为乙酰基、R2为氢、X为氯并且n等于9。
以下实施例仅为示例说明目的，而非限制实施本发明的不同方式。
实施例1通式(I)的天然底物的制备和结构鉴定浓缩美丽决明的花和芽的乙醇提取物，得到39.7g的粗产物，将其溶于甲醇-水8∶2的混合物中。将该混合物进行超声处理，通过纸过滤除去重10.4g的不溶残余物。将该水醇溶液进行液-液萃取，由此获得以下细分的馏份己烷(2.0g)、二氯甲烷(7.96g)、乙酸乙酯(0.34g)、正丁醇(2.5g)和水(11.9g)。
将重3.25g的一部分二氯甲烷细分馏份溶于100mL氯仿中，随后用50mL的多份40％HCl水溶液连续萃取，各部分均磁力搅拌15分钟，总共制得四份。合并含水萃取物，并用浓NH4OH水溶液使其碱化至pH 9-11，随后依次用氯仿(3×50mL)和乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将氯仿和乙酸乙酯萃取物合并，得到1.45g生物碱混合物。将该混合物在色谱柱中分级分离，以44g中性氧化铝为固定相。加入该生物碱混合物(1.45g)，随后用氯仿/己烷(9∶1至9.5∶0.5)混合物和氯仿/甲醇/己烷(8∶0.5∶1.5至9∶1∶0)混合物洗脱，得到910mg其中R为氢的通式(I)化合物(espectaline)以及151mg其中R为乙酰基的通式(I)化合物(3-O-乙酰基-乙基espectaline)。
该色谱方法获得的espectaline产量为二氯甲烷细分馏份的28％，为美丽决明的花和芽的粗提取物的5％，而3-O-乙酰-espectaline的产量为二氯甲烷细分馏分的4.6％。
化合物spectaline和3-O-乙酰基-espectaline的化学结构已由旋光数据、熔点和1H和13C一维和二维核磁共振谱数据、红外(IR)和质谱(MS)确证。通过与实验室提供的数据的比较，该espcatline被鉴定为(-)-espectaline；3-O-乙酰-espectaline被鉴定为是espectaline的天然衍生物，即(-)-3-O-乙酰-espectaline。
实施例2通式(II)的盐酸盐(chlorhydrate)半合成衍生物的制备a)制备2-(R)-甲基-3-(R)-O-叔丁氧基羰基-6-(S)-(十四烷基-13’-酮)-哌啶的合成方法向N2气氛下的15mL espectaline(0.5g；1.54mmol)的干燥CH2Cl2溶液中加入0.3mL干燥的Et3N(2.156mmol)，室温下搅拌5分钟。然后，加入15mL(Boc)2O(369mg；1.694mmol)的CH2Cl2溶液并在室温下搅拌24小时，由TLC监测。然后加入催化量的4-DMAP，再另加入100mg的(Boc)2O，在N2气氛下再继续搅拌4天。
在原料完全转化后，加入10mL水，随后用CHCl3(4×10mL)萃取。然后合并有机相并用HCl 2N水溶液(3×10mL)洗涤，随后用盐水(2×10mL)洗涤。然后有机相经MgSO4干燥、过滤并在减压下浓缩。
粗产物在中性Al2O3柱中以CHCl3/Hex/MeOH为洗脱剂纯化，得到280.5mg所需的3-O-Boc-espectaline碳酸盐以及相应的氨基甲酸酯副产物，产率为60％。
反应产物通过1H NMR和13C NMR表征。3-O-Boc-espectaline衍生物熔点为57.5-60℃。
b)2-(R)-甲基-3-(R)-O-乙酰基-6-(S)-(十四烷基-13’-酮)-哌啶盐酸盐(LASSBio-767)的制备在单颈烧瓶中，将15mg 2-(R)-甲基-3-(R)-O-乙酰基-6-(R)-(十四烷基-13’-酮)-哌啶(0.041mmol)溶于3mL干燥的二氯甲烷。在Keeper体系中，加入浓HCl，然后缓慢加入浓H2SO4，使HCl(气体)通过该反应体系。反应维持45分钟，不断加入二氯甲烷以维持初始的溶剂水平。最后，蒸发溶剂，在烧瓶壁上形成固体物质。将该物质再溶解于二氯甲烷中，并用旋转蒸发仪浓缩。定量获得LASSBio-767，并通过1H NMR和13C NMR和物理化学数据表征。该水溶性衍生物具有142.8-147.5℃的熔点。
espectaline盐酸盐用相同的实验方法制备，从天然底物(-)-espectaline定量获得。通过1H NMR和13C NMR和物理化学数据对其进行表征。该水溶性衍生物具有149.1-151.1℃的熔点。
c)由2-(R)-甲基-6-(S)-(十四烷基-13’-酮)-哌啶-3-(R)-醇制备espectaline盐酸盐(LASSBio-768)的合成方法在装有回流冷凝器的单颈烧瓶中，将375mg(1.15mmol)2-(R)-甲基-6-(S)-(十四烷基-13’-酮)-哌啶-3-(R)-醇溶解于10mL乙酸乙酯，随后加入4mL发烟HCl。将该反应体系在室温下保持10h，并回流4h。最后，蒸发溶剂，并将产物再溶解于甲醇中，用无水MgSO4干燥，过滤并蒸发溶剂。真空干燥后，定量地获得化合物LASSBio-768。
在装有回流冷凝器的双颈烧瓶中且在N2气氛下，将化合物LASSBio-767(114mg，0.31mmol)溶解于5mL无水氯仿。借助于注射器，加入新蒸馏的乙酰氯(0.1mL，1.42mmol)并在50℃下反应12h。最后，蒸发溶剂并真空干燥剩余物，以93％的产率获得化合物LASSBio-767。
d)制备2-(R)-甲基-3-(R)-O-叔丁氧基羰基-6-(S)-(十四烷基-13’-酮)-哌啶盐酸盐(LASSBio-822)的合成方法采用与LASSBio-767盐酸盐制备相同的实验方法由3-O-Boc-espectaline制备LASSBio-822盐酸盐。定量获得衍生物LASSBio-822，并用1H NMR和13C NMR对其进行表征。该水溶性衍生物LASSBio-822具有126-129.5℃的熔点。
e)制备(2R，3R，6S)-3-乙酰氧基-6-(13-羟基-十四烷基2-甲基)-哌啶盐酸盐(LASSBio-783)的合成方法制备该衍生物的实验方法基于简单的羟基还原反应，该反应可通过本领域技术人员已知的许多反应，例如室温下NaBH4在H2O中的反应，而实现。。
实施例3药理学评价a)抗胆碱酯酶活性测定本发明化合物各种效果之中的抗胆碱酯酶效果在此由化合物LASSBio-767、LASSBio-768和LASSBio-822的结果得到证明。本发明的化合物的研究在大鼠的脑组织中进行，类似在人体中，该组织中表达的酶的主要形式为T型亚单元的四聚体，该四聚体通过疏水链连接到膜上(Boschetti，N.；Liao，J.；Brodbeck，U.The Membrane Form ofAcetylcholinesterase From Rat Brain Contains a 20 KDa HydrophobicAnchor.Neurochem.Res.1994，19，359-365；Fernandez，H.L.；Moreno，R.D.；Ines trosa，N.C.Tetrameric(G4)AcetylcholinesteraseStructure，Localization，andPhysiological Regulation.J.Neurochem.1996，66，1335-1346)。采用Ellman’s比色测定法(Ellman，G.L.；Courtney，K.D.；Andres，V.；Featherstone，J.；Featherstone，R.M.A New and Rapid ColorimetricDetermination of Acetylcholinesterase Activity.Biochem.Pharmacol.1961，7，88-95)测定大鼠脑匀浆中胆碱酯酶的总活性。将Wistar大鼠的脑组织在2％v/v 0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)中匀浆，并加入NaCl 58.5g/L和Triton X-1000.05％v/v。将匀浆混合物的各部分(20μL)与抗胆碱酯酶化合物在pH 8的磷酸盐缓冲液中培育10分钟，随后加入5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲)酸和1mM的碘化乙酰硫代胆碱(SIGMA，美国)。室温(22-25℃)下在96孔微量培养板中以235μL进行反应，随后用酶标仪(microplate reader)(SpectraMAX 250，Molecular Devices，美国)在412nm下5分钟内进行测定。在所有实验中，通过引入经20μm THA处理的实验组来测定非胆碱酯酶依赖性底物水解(非特异性)。还包括合适的组织和试剂(em branco)。根据情况重复测定反应速率3或4次；计算平均值，并将其表示为减去非特异性水解速率后相对于对照组(溶剂)的相对活性百分比。各物质以至少五种不同的浓度测定。对于得到的抑制曲线而言，考虑20％-80％以外的范围中的数值，浓度限于500μM。基于单位点模型，通过线性回归测定IC50。结果以独立地由2至4只动物获得的IC50的均值±SEM表示，并示于下表1中。
表1大脑胆碱酯酶抑制数据
*标准差**平均值的标准误差b)Morris水迷宫实验中对东莨菪碱所致遗忘症的评价共使用39只Wistar大鼠(雌鼠-±200g)。将动物分成5个实验组及各自的对照组对照＝盐水+盐水-11只动物盐水+东莨菪碱(1mg/kg)-8只动物他克林(1mg/kg)+东莨菪碱(1mg/kg)-4只动物LASSBio-767(1mg/kg)+东莨菪碱(1mg/kg)-4只动物LASSBio-767(3mg/kg)+东莨菪碱(1mg/kg)-4只动物LASSBio-767(10mg/kg)+东莨菪碱(1mg/kg)-4只动物LASSBio-822(1mg/kg)+东莨菪碱(1mg/kg)-4只动物腹膜内第二次给药(盐水或东莨菪碱)30分钟后，对动物进行实验，使其在含不透明水的圆形容器中(水迷宫)找到水下平台，并计算逃避潜伏期(以秒计)。若150秒内动物未找到平台，则将其置于平台上20秒，然后从水中移出。连续四天每天进行两次实验。
从图1-4中可观察到，实验第三天和第四天中对照组动物的逃避潜伏期显著减少。若在实验前30分钟用东莨菪碱处理动物，则该动物将不能意识到任务，并且在实验第4天逃避潜伏期接近最大值(150s)。注射组合物获得的结果如图1-4所示。
抗胆碱酯酶药剂他克林对抗了东莨菪碱所致遗忘症，在研究的第四天效果显著。半合成生物碱LASSBio-767结合他克林对东莨菪碱所致遗忘症的逆转效果较优，该效果在处理的第二天就可观察到并且在第三天及第四天十分显著；在此期间，动物尽管已经被给予了东莨菪碱(1mg/kg)，但其表现仍如对照组。LASSBio-767组合物的效果在10mg/kg浓度下也可观测到。然而，LASSBio-822生物碱不能在大鼠水迷宫实验中对抗东莨菪碱所致遗忘症。
c)抑制性躲避试验中对东莨菪碱所致遗忘症的评价共使用120只成年雄性Swiss小鼠(25-30g)。对动物进行抑制性躲避试验，该试验由一个带有栅格制成的基座的匣子构成，基座与电刺激器(0.6Ma/3s)相连，该匣子含一个木头平台(3cm3)。将小鼠放在该平台上；计算直至动物将四个爪子放在栅格上的潜伏期(以秒计)。在实验第一天(“训练”)，动物只要下跳到栅格上时就要接受不利的电刺激(0.6mA/3s)(下跳潜伏期-SDL)。在该阶段，淘汰在平台停留超过15秒的动物。24小时后，将动物重新置于该平台上并且计算SDL(“保持”)将小鼠分成6个实验组对照组＝盐水+盐水盐水+东莨菪碱(1mg/kg)LASSBio-767(1mg/kg)+东莨菪碱(1mg/kg)LASSBio-767(10mg/kg)+东莨菪碱(1mg/kg)-4只动物LASSBio-822(1mg/kg)+东莨菪碱(1mg/kg)-4只动物LASSBio-822(3mg/kg)+东莨菪碱(1mg/kg)-4只动物观察到生物碱LASSBio-767在两种浓度下对东莨菪碱所致遗忘症都未表现出任何效果。然而，在该测定中，半合成生物碱LASSBio-822可显著地逆转东莨菪碱所致遗忘症。在该测定中，他克林完全逆转了东莨菪碱的作用。该测定的结果见图5-7。
d)对他克林和LASSBio-767所致胆碱能副作用的评价所述药物I.P.给药后10和30分钟时，观测动物(n＝10只小鼠/组)在旷场试验(open field test)中的精神运动活性、后爪的侧向伸出、颤抖、流涎、流泪、腹泻、排尿和低体温。还验证了可致50％的动物死亡的他克林浓度(LD50)。
在给予他克林(10mg/kg)后，观察到70％的小鼠腹泻和排尿。此外，该浓度的他克林还导致了低体温并且运动活性减小。以高于30mg/kg的浓度给予他克林后，所有的被测参量均改变。
除了小鼠外，在给予他克林(n＝4)1mg/kg、LASSBio-767(n＝12)和盐水(n＝12)以及盐水(n＝12)30分钟后还对大鼠进行了观察。只有经他克林处理的动物在给药30分钟后表现出腹泻，并且在100％的动物身上都观察到了该症状。该测定的结果见图8-9。
与他克林比较，LASSBio-767和LASSBio-822在较低浓度下可逆转认知和记忆的不同模型中的东莨菪碱所致遗忘症。另外，没有观察到LASSBio-767(10mg/kg)的胆碱能副作用和对运动活性的干扰，而使用他可林时观察到了这些情况。在我们的研究中，证实了他克林的治疗窗过窄。这些结果表明被研究的化合物在阿尔茨海默病治疗和其他记忆缺失病状相关疾病的治疗方面很有前景。与现在临床使用药物相比，这些化合物似乎具有更好的药效和安全性。
权利要求
1.一种乙酰胆碱酯酶抑制剂——哌啶衍生物和/或其异构形式，其特征在于所述化合物具有通式(I) 其中n等于2至16的整数R1为氢、酰基、烷基、烷氧基、环烷基；呋喃基、硫代苯基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻唑基、喹唑啉基、异喹啉基或者苯基-W；其中W为氢、邻-烷基、邻-环烷基、邻-烷氧基、邻-环烷氧基、邻-硫氧基、邻-芳氧基、邻-砜、邻-硫醚、邻-亚砜、邻-磺酸酯/盐、邻-磺酰胺、邻-氨基、邻-酰氨基、邻-卤代、邻-烷氧羰基、邻-硫代烷氧羰基、邻-三卤代烷、邻-氰基、邻-硝基、间-烷基、间-环烷基、间-烷氧基、间-环烷氧基、间-硫氧基、间-芳氧基、间-砜、间-硫醚、间-亚砜、间-磺酸酯/盐、间-磺酰胺、间-氨基、间-酰氨基、间-卤代、间-烷氧羰基、间-硫代烷氧羰基、间-三卤代烷、间-氰基、间-硝基、对-烷基、对-环烷基、对-烷氧基、对-环烷氧基、对-硫氧基、对-芳氧基、对-砜、对-硫醚、对-亚砜、对-磺酸酯/盐、对-磺酰胺、对-氨基、对-酰氨基、对-卤代、对-烷氧羰基、对-硫代烷氧羰基、对-三卤代烷、对-氰基或对-硝基；或其药学上可接受的盐。
2.一种乙酰胆碱酯酶抑制剂——哌啶衍生物和/或其异构形式，其特征在于所述化合物具有通式(II) 其中n等于2至16的整数R1为氢、酰基、烷基、烷氧基、环烷基；呋喃基、硫代苯基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻唑基、喹唑啉基、异喹啉基或者苯基-W；其中W为氢、邻-烷基、邻-环烷基、邻-烷氧基、邻-环烷氧基、邻-硫氧基、邻-芳氧基、邻-砜、邻-硫醚、邻-亚砜、邻-磺酸酯/盐、邻-磺酰胺、邻-氨基、邻-酰氨基、邻-卤代、邻-烷氧羰基、邻-硫代烷氧羰基、邻-三卤代烷、邻-氰基、邻-硝基、间-烷基、间-环烷基、间-烷氧基、间-环烷氧基、间-硫氧基、间-芳氧基、间-砜、间-硫醚、间-亚砜、间-磺酸酯/盐、间-磺酰胺、间-氨基、间-酰氨基、间-卤代、间-烷氧羰基、间-硫代烷氧羰基、间-三卤代烷、间-氰基、间-硝基、对-烷基、对-环烷基、对-烷氧基、对-环烷氧基、对-硫氧基、对-芳氧基、对-砜、对-硫醚、对-亚砜、对-磺酸酯/盐、对-磺酰胺、对-氨基、对-酰氨基、对-卤代、对-烷氧羰基、对-硫代烷氧羰基、对-三卤代烷、对-氰基或对-硝基，R2为氢或具有1至9个碳原子的烷基，并且X为卤素；或其药学上可接受的盐。
3.一种乙酰胆碱酯酶抑制剂——哌啶衍生物和/或其异构形式，其特征在于所述化合物具有通式(III) 其中n等于2至16的整数R1为氢、酰基、烷基、烷氧基、环烷基；呋喃基、硫代苯基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻唑基、喹唑啉基、异喹啉基或者苯基-W；其中W为氢、邻-烷基、邻-环烷基、邻-烷氧基、邻-环烷氧基、邻-硫氧基、邻-芳氧基、邻-砜、邻-硫醚、邻-亚砜、邻-磺酸酯/盐、邻-磺酰胺、邻-氨基、邻-酰氨基、邻-卤代、邻-烷氧羰基、邻-硫代烷氧羰基、邻-三卤代烷、邻-氰基、邻-硝基、间-烷基、间-环烷基、间-烷氧基、间-环烷氧基、间-硫氧基、间-芳氧基、间-砜、间-硫醚、间-亚砜、间-磺酸酯/盐、间-磺酰胺、间-氨基、间-酰氨基、间-卤代、间-烷氧羰基、间-硫代烷氧羰基、间-三卤代烷、间-氰基、间-硝基、对-烷基、对-环烷基、对-烷氧基、对-环烷氧基、对-硫氧基、对-芳氧基、对-砜、对-硫醚、对-亚砜、对-磺酸酯/盐、对-磺酰胺、对-氨基、对-酰氨基、对-卤代、对-烷氧羰基、对-硫代烷氧羰基、对-三卤代烷、对-氰基或对-硝基，R2为氢或具有1至9个碳原子的烷基，并且X为卤素；或其药学上可接受的盐。
4.权利要求2的哌啶衍生物，其特征在于R1为乙酰基、R2为氢、X为氯并且n等于9。
5.权利要求2的哌啶衍生物，其特征在于R1为氢、R2为氢、X为氯并且n等于9。
6.权利要求2的哌啶衍生物，其特征在于R1为叔丁氧羰基、R2为氢、X为氯并且n等于9。
7.权利要求2的哌啶衍生物，其特征在于R1为乙酰基、R2为甲基、X为碘并且n等于9。
8.权利要求3的哌啶衍生物，其特征在于R1为乙酰基、R2为氢、X为氯并且n等于9。
9.用于治疗胆碱能传递相关病状的药物组合物，其特征在于所述组合物含有药学上可接受的赋性剂和至少一种通式(I)化合物 其中n等于2至16的整数R1为氢、酰基、烷基、烷氧基、环烷基；呋喃基、硫代苯基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻唑基、喹唑啉基、异喹啉基或者苯基-W；其中W为氢、邻-烷基、邻-环烷基、邻-烷氧基、邻-环烷氧基、邻-硫氧基、邻-芳氧基、邻-砜、邻-硫醚、邻-亚砜、邻-磺酸酯/盐、邻-磺酰胺、邻-氨基、邻-酰氨基、邻-卤代、邻-烷氧羰基、邻-硫代烷氧羰基、邻-三卤代烷、邻-氰基、邻-硝基、间-烷基、间-环烷基、间-烷氧基、间-环烷氧基、间-硫氧基、间-芳氧基、间-砜、间-硫醚、间-亚砜、间-磺酸酯/盐、间-磺酰胺、间-氨基、间-酰氨基、间-卤代、间-烷氧羰基、间-硫代烷氧羰基、间-三卤代烷、间-氰基、间-硝基、对-烷基、对-环烷基、对-烷氧基、对-环烷氧基、对-硫氧基、对-芳氧基、对-砜、对-硫醚、对-亚砜、对-磺酸酯/盐、对-磺酰胺、对-氨基、对-酰氨基、对-卤代、对-烷氧羰基、对-硫代烷氧羰基、对-三卤代烷、对-氰基或对-硝基；或其药学上可接受的盐。
10.用于治疗胆碱能传递相关病状的药物组合物，其特征在于所述组合物含有药学上可接受的赋性剂和至少一种通式(II)化合物 其中n等于2至16的整数R1为氢、酰基、烷基、烷氧基、环烷基；呋喃基、硫代苯基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻唑基、喹唑啉基、异喹啉基或者苯基-W；其中W为氢、邻-烷基、邻-环烷基、邻-烷氧基、邻-环烷氧基、邻-硫氧基、邻-芳氧基、邻-砜、邻-硫醚、邻-亚砜、邻-磺酸酯/盐、邻-磺酰胺、邻-氨基、邻-酰氨基、邻-卤代、邻-烷氧羰基、邻-硫代烷氧羰基、邻-三卤代烷、邻-氰基、邻-硝基、间-烷基、间-环烷基、间-烷氧基、间-环烷氧基、间-硫氧基、间-芳氧基、间-砜、间-硫醚、间-亚砜、间-磺酸酯/盐、间-磺酰胺、间-氨基、间-酰氨基、间-卤代、间-烷氧羰基、间-硫代烷氧羰基、间-三卤代烷、间-氰基、间-硝基、对-烷基、对-环烷基、对-烷氧基、对-环烷氧基、对-硫氧基、对-芳氧基、对-砜、对-硫醚、对-亚砜、对-磺酸酯/盐、对-磺酰胺、对-氨基、对-酰氨基、对-卤代、对-烷氧羰基、对-硫代烷氧羰基、对-三卤代烷、对-氰基或对-硝基，R2为氢或具有1至9个碳原子的烷基，并且X为卤素；或其药学上可接受的盐。
11.用于治疗胆碱能传递相关病状的药物组合物，其特征在于所述组合物含有药学上可接受的赋性剂和至少一种通式(III)化合物 其中n等于2至16的整数R1为氢、酰基、烷基、烷氧基、环烷基；呋喃基、硫代苯基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻唑基、喹唑啉基、异喹啉基或者苯基-W；其中W为氢、邻-烷基、邻-环烷基、邻-烷氧基、邻-环烷氧基、邻-硫氧基、邻-芳氧基、邻-砜、邻-硫醚、邻-亚砜、邻-磺酸酯/盐、邻-磺酰胺、邻-氨基、邻-酰氨基、邻-卤代、邻-烷氧羰基、邻-硫代烷氧羰基、邻-三卤代烷、邻-氰基、邻-硝基、间-烷基、间-环烷基、间-烷氧基、间-环烷氧基、间-硫氧基、间-芳氧基、间-砜、间-硫醚、间-亚砜、间-磺酸酯/盐、间-磺酰胺、间-氨基、间-酰氨基、间-卤代、间-烷氧羰基、间-硫代烷氧羰基、间-三卤代烷、间-氰基、间-硝基、对-烷基、对-环烷基、对-烷氧基、对-环烷氧基、对-硫氧基、对-芳氧基、对-砜、对-硫醚、对-亚砜、对-磺酸酯/盐、对-磺酰胺、对-氨基、对-酰氨基、对-卤代、对-烷氧羰基、对-硫代烷氧羰基、对-三卤代烷、对-氰基或对-硝基，R2为氢或具有1至9个碳原子的烷基，并且X为卤素；或其药学上可接受的盐。
12.权利要求10的药物组合物，其特征在于R1为乙酰基、R2为氢、X为氯并且n等于9。
13.权利要求10的药物组合物，其特征在于R1为氢、R2为氢、X为氯并且n等于9。
14.权利要求10的药物组合物，其特征在于R1为叔丁氧羰基、R2为氢、X为氯并且n等于9。
15.权利要求10的药物组合物，其特征在于R1为乙酰基、R2为甲基、X为碘并且n等于9。
16.权利要求11的药物组合物，其特征在于R1为乙酰基、R2为氢、X为氯并且n等于9。
17.权利要求9至16的药物组合物，其特征在于所述胆碱能传递相关病状为记忆功能障碍。
18.权利要求17的药物组合物，其特征在于所述记忆功能障碍为阿尔茨海默病。
19.权利要求9至16的药物组合物，其特征在于所述胆碱能传递相关病状为帕金森病。
20.权利要求9至16的药物组合物，其特征在于所述胆碱能传递相关病状为重症肌无力。
21.权利要求9至16的药物组合物，其特征在于所述胆碱能传递相关病状是CNS作用物质引起中毒所致的。
22.制备通式(I)的哌啶衍生物的方法 其中n等于2至16的整数R1为氢、酰基、烷基、烷氧基、环烷基；呋喃基、硫代苯基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻唑基、喹唑啉基、异喹啉基或者苯基-W；其中W为氢、邻-烷基、邻-环烷基、邻-烷氧基、邻-环烷氧基、邻-硫氧基、邻-芳氧基、邻-砜、邻-硫醚、邻-亚砜、邻-磺酸酯/盐、邻-磺酰胺、邻-氨基、邻-酰氨基、邻-卤代、邻-烷氧羰基、邻-硫代烷氧羰基、邻-三卤代烷、邻-氰基、邻-硝基、间-烷基、间-环烷基、间-烷氧基、间-环烷氧基、间-硫氧基、间-芳氧基、间-砜、间-硫醚、间-亚砜、间-磺酸酯/盐、间-磺酰胺、间-氨基、间-酰氨基、间-卤代、间-烷氧羰基、间-硫代烷氧羰基、间-三卤代烷、间-氰基、间-硝基、对-烷基、对-环烷基、对-烷氧基、对-环烷氧基、对-硫氧基、对-芳氧基、对-砜、对-硫醚、对-亚砜、对-磺酸酯/盐、对-磺酰胺、对-氨基、对-酰氨基、对-卤代、对-烷氧羰基、对-硫代烷氧羰基、对-三卤代烷、对-氰基或对-硝基；或其药学上可接受的盐，其特征在于所述方法含有至少一步对决明属植物的花和/或芽的醇或水醇萃取。
23.权利要求22的方法，其特征在于所述哌啶衍生物从美丽决明种的植物中获得。
24.权利要求22或23的方法，其特征在于所述方法另外还含有至少一个以下步骤-浓缩；-过滤；-液-液萃取；-碱化；-柱色谱分级分离；和-上述步骤的任何组合。
25.制备通式(II)的哌啶衍生物的方法 其中n等于2至16的整数R1为氢、酰基、烷基、烷氧基、环烷基；呋喃基、硫代苯基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻唑基、喹唑啉基、异喹啉基或者苯基-W；其中W为氢、邻-烷基、邻-环烷基、邻-烷氧基、邻-环烷氧基、邻-硫氧基、邻-芳氧基、邻-砜、邻-硫醚、邻-亚砜、邻-磺酸酯/盐、邻-磺酰胺、邻-氨基、邻-酰氨基、邻-卤代、邻-烷氧羰基、邻-硫代烷氧羰基、邻-三卤代烷、邻-氰基、邻-硝基、间-烷基、间-环烷基、间-烷氧基、间-环烷氧基、间-硫氧基、间-芳氧基、间-砜、间-硫醚、间-亚砜、间-磺酸酯/盐、间-磺酰胺、间-氨基、间-酰氨基、间-卤代、间-烷氧羰基、间-硫代烷氧羰基、间-三卤代烷、间-氰基、间-硝基、对-烷基、对-环烷基、对-烷氧基、对-环烷氧基、对-硫氧基、对-芳氧基、对-砜、对-硫醚、对-亚砜、对-磺酸酯/盐、对-磺酰胺、对-氨基、对-酰氨基、对-卤代、对-烷氧羰基、对-硫代烷氧羰基、对-三卤代烷、对-氰基或对-硝基，R2为氢或具有1至9个碳原子的烷基，并且X为卤素；或其药学上可接受的盐；其特征在于使各原料化合物经过强酸的酸化反应。
26.权利要求25的方法，其特征在于所述强酸为盐酸。
27.权利要求26的方法，其特征在于R1为乙酰基、R2为氢、X为氯并且n等于9。
28.权利要求26的方法，其特征在于R1为氢、R2为氢、X为氯并且n等于9。
29.权利要求26的方法，其特征在于R1为叔丁氧羰基、R2为氢、X为氯并且n等于9。
30.权利要求26的方法，其特征在于R1为乙酰基、R2为甲基、X为碘并且n等于9。
31.制备通式(III)的哌啶衍生物的方法 其中n等于2至16的整数R1为氢、酰基、烷基、烷氧基、环烷基；呋喃基、硫代苯基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻唑基、喹唑啉基、异喹啉基或者苯基-W；其中W为氢、邻-烷基、邻-环烷基、邻-烷氧基、邻-环烷氧基、邻-硫氧基、邻-芳氧基、邻-砜、邻-硫醚、邻-亚砜、邻-磺酸酯/盐、邻-磺酰胺、邻-氨基、邻-酰氨基、邻-卤代、邻-烷氧羰基、邻-硫代烷氧羰基、邻-三卤代烷、邻-氰基、邻-硝基、间-烷基、间-环烷基、间-烷氧基、间-环烷氧基、间-硫氧基、间-芳氧基、间-砜、间-硫醚、间-亚砜、间-磺酸酯/盐、间-磺酰胺、间-氨基、间-酰氨基、间-卤代、间-烷氧羰基、间-硫代烷氧羰基、间-三卤代烷、间-氰基、间-硝基、对-烷基、对-环烷基、对-烷氧基、对-环烷氧基、对-硫氧基、对-芳氧基、对-砜、对-硫醚、对-亚砜、对-磺酸酯/盐、对-磺酰胺、对-氨基、对-酰氨基、对-卤代、对-烷氧羰基、对-硫代烷氧羰基、对-三卤代烷、对-氰基或对-硝基，R2为氢或具有1至9个碳原子的烷基，并且X为卤素；或其药学上可接受的盐；其特征在于使各原料化合物进行还原反应。
32.权利要求31的方法，其特征在于所述还原剂选自NaBH4/H2O、乙醇中的钠、LiAlH4、H2和其混合物。
33.权利要求32的方法，其特征在于R1为乙酰基、R2为氢、X为氯并且n等于9。
全文摘要
本发明提供了含新分子的药物组合物，所述新分子可抑制乙酰胆碱酯酶，因此可用于治疗胆碱能传递相关病状例如记忆相关病症、神经变性病症如阿尔茨海默病、重症肌无力或者治疗由化学药剂的中枢作用所致的中毒；本发明还记载了所述组合物的制备方法。
文档编号C07D211/22GK101080386SQ200480044608
公开日2007年11月28日 申请日期2004年10月15日 优先权日2004年10月15日
发明者C·小维埃加斯, V·S·博尔赞尼, E·J·德·拉瑟达·巴雷伊洛, N·G·卡斯特罗, M·C·M·扬, M·S·洛查 申请人:里约热内卢联邦大学, 圣保罗州立大学