专利名称：癌症病程及治疗反应的标志物cudr的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的编码癌症标志物的哺乳动物CUDR cDNA以及CUDR基因在诊断癌症病程和治疗反应中的应用。
背景技术：
在美国，癌症引起的死亡占总死亡人数的四分之一，仅次于心血管疾病。这造成了社会和个人的严重的经济负担。一般而言，癌症病人需要进行化疗和放疗，但治疗的结果往往不尽如人意。病人对治疗耐受的原因有许多，例如，癌症的晚期阶段、药物抗性的发展。
开发癌症早期鉴定和评价癌症治疗反应有效性的标志物是非常重要的。目前有许多分子肿瘤标志物应用于临床，但发现许多这些标志物仅与一小部分肿瘤相关，这限制了其在诊断中应用的普遍性。此外，在正常细胞中同样也报道了这些基因的表达改变，这导致了假阳性结果的出现。例如，前列腺特异抗原(PSA)在美国已经应用了多年用于评价大多数男性患者前列腺癌的，但是，三分之一的有PSA升高的患者后来确定并不患有恶性类型的前列腺癌。在另外一些情况下，目前使用血清癌胚抗原(serum carcinoembryonic antigen，CEA)的水平来监测患有直肠结肠癌患者的疾病进程和对治疗的反应，但是在诊断时只有一部分直肠结肠癌患者表现升高的CEA水平。因此，需要更加可靠的改进直肠结肠癌诊断和跟踪癌症病程的血清标志物。而对于大多数其它的癌症类型来讲，目前还没有可靠的生物标志物。
为全面了解癌症的发病机理，鉴定参与癌症发展和药物抗性的新的基因是十分必要的。利用RT-PCR为基础的差异显示技术，鉴定了一种新的CUDR基因(2.2kb转录本)，并发现其在阿霉素抗性肿瘤细胞亚株例如人鳞状细胞癌A431和肝细胞癌HepG2的细胞中过度表达。此外，除胎盘外，该基因在正常组织中检测不到。利用RT-PCR方法对正常-肿瘤匹配组织中的表达进行比较，所述基因主要在结肠癌、肺癌、宫颈癌和雌激素受体α阴性乳腺癌组织中过度表达。CUDR基因在患者肿瘤组织中以及在具有药物抗性的细胞中的过度表达表明该基因可作为癌症病程和治疗反应的标志物。
发明内容
本发明涉及一种编码具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的分离的核酸及利用其作为生物标志物来诊断人癌症。
本发明的第一方面涉及编码具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的分离的核酸，优选所述的分离核酸具有序列SEQ ID NO1。
本发明的第二方面涉及具有氨基酸序列SEQ ID NO2的分离的多肽。
本发明的第三方面涉及特异结合本发明所述多肽的抗体。
本发明的第四方面涉及治疗肿瘤的药物组合物，其包括有效剂量的本发明所述的抗体、或者具有SEQ ID NO1的反义寡核苷酸序列的核酸或其片段、以及药物可接受的载体，所述的肿瘤不包括雌激素受体α阳性乳腺癌。
本发明的第五方面涉及诊断个体患有肿瘤或评价患有肿瘤个体对抗癌试剂的治疗效果的试剂盒(所述的肿瘤不包括雌激素受体α阳性乳腺癌)，其包括用于扩增来自所述个体的生物样本中本发明所述的核酸的cDNA的一对引物或用于与其杂交的探针；及使用所述引物或探针测定所述生物样本中所述cDNA的存在与否的指导性材料。
本发明的第六方面涉及诊断个体是否患有肿瘤或评价患有肿瘤个体对抗癌试剂的治疗效果的试剂盒(所述的肿瘤不包括雌激素受体α阳性乳腺癌)，其包括特异结合所述个体生物样本中本发明所述的多肽的抗体；及使用所述抗体测定所述生物样本中所述多肽的存在与否的指导性材料。
本发明的第七方面涉及检测个体患有或怀疑患有肿瘤、或者评价患有肿瘤的个体对抗癌试剂的治疗效果的方法(所述的肿瘤不包括雌激素受体α阳性乳腺癌)，其包括提供来自所述个体的生物样本；及测定所述样本中本发明所述的核酸的cDNA，其中所述样本中所述的cDNA的存在表明所述个体患有肿瘤或对所述的抗癌剂具有抗药性。
本发明的第八方面涉及检测个体患有或怀疑患有肿瘤、或者评价在患有肿瘤的个体中抗癌试剂的治疗效果的方法(所述的肿瘤不包括雌激素受体α阳性乳腺癌)，其包括提供来自所述个体的生物样本；及测定所述样本中本发明所述的多肽，其中所述样本中所述的多肽的存在表明所述个体患有肿瘤或对所述的抗癌剂具有抗药性。
本发明的第九方面涉及治疗个体肿瘤的方法，其包括给予所述个体有效剂量的本发明所述的抗体、或者反义核酸或核酸片段，所述的肿瘤不包括雌激素受体α阳性乳腺癌。
本发明的第十方面涉及将核酸以读码框架形式克隆至载体的方法，所述的核酸编码具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽或其片段，所述方法包括利用PCR扩增所述核酸的全长cDNA；及将所述全长cDNA克隆至适合的载体。
本发明的第十一方面涉及表达载体，所述的载体含有编码具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽的核酸，优选所述的载体包括pcDNA-DEST40。
本发明的第十二方面涉及获得性药物抗性的癌细胞或细胞株的离体模型，该模型通过向所述的细胞中转染核酸来制备，所述核酸编码具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽。
在本发明中，所述的肿瘤优先选自肺癌、肝细胞癌、宫颈癌、结肠癌及雌激素受体α阴性乳腺癌。
本发明的所用的生物样本优先选自血清、血浆和组织样本，但通常不包括正常的胎盘组织。
本领域所属技术人员应理解，本发明的方法中，所述的“提供来自个体的生物样本”并不是实施本发明的必要特征。因此，本发明的一些实施方案中可不包括此步骤。
图1表示通过MTT检测的不同的人鳞状细胞癌A431亚株对阿霉素的反应，其中，空心圆代表A431母细胞；空心三角代表A5A细胞；实心方块代表A10A细胞。
图2A和2B表示在RT-PCR为基础的差异显示以及Northern印记分析中CUDR(如箭头所示)的相对表达。该基因的18S与28S rRNA的结果表明每一泳道加载了等量的总RNA。PA431母细胞；5A431/A5A细胞；10A431/A10A细胞。
图3表示通过Northern印记分析的不同癌细胞株中CUDR mRNA的表达。
图4表示转染CUDR的全长和反义寡核苷酸对A431细胞的阿霉素敏感性的影响。
图5表示通过MTT分析和DNA片段分析检测稳定转染了CUDR的人鳞状细胞癌A431细胞对阿霉素和Taxol的反应，其中空心圆或AN代表转染了空载体的A431细胞；实心三角或AG代表转染了CUDR基因的A431细胞。
图6表示利用定制的12泳道人组织Northern(MTN)印记(ClonTech)对不同人组织中CUDR mRNA表达进行的Northern印记分析。
图7表示来自人宫颈组织和人结肠组织的正常与肿瘤匹配cDNA对中的CUDR mRNA表达结果，所述组织来自患者个体A-E。
图8表示来自人肺组织的正常与肿瘤匹配的cDNA对中的CUDR mRNA表达结果，所述组织来自患者个体A-E。
图9A和9B表示来自人乳腺组织的正常与肿瘤匹配cDNA对中的CUDRmRNA和雌激素受体αmRNA的表达结果，所述组织来自患者个体A-E。
具体实施例方式
先前的工作鉴定了一种新的命名为CUDR的基因，利用RT-PCR为基础的差异显示技术(Liang et al.，Cancer Res.257967-971)发现该基因在宫颈鳞状细胞癌A431的阿霉素抗性肿瘤细胞亚株A10A中表达增加。本发明提供一种应用CUDR诊断人癌症包括结肠癌、肺癌、宫颈癌和乳腺癌的新方法。
本发明所用术语“CUDR”指分离的核酸或由该核酸编码的多肽，所述的核酸具有SEQ ID NO1的序列或至少与SEQ ID NO1具有85％(包括85％-100％之间的任意百分比，例如，90％，95％，100％)的同一性的核酸。
本发明所用术语“CUDR多肽”指具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽，或者具有与SEQ ID NO2等同功能序列的多肽。
本发明所用术语“个体”指动物，优选为哺乳动物，更优选为人。
本发明所用术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸聚合体或核糖核酸聚合体，并且除非有其它限定，还包括已知的具有与天然存在的核酸相似功能的天然核酸类似物。
所述术语“引物”是指一种寡核苷酸(无论是天然的还是合成的)，在诱导合成与核酸链互补的引物扩增的产物的条件下，其能够作为DNA合成起始点，即在适合的温度条件下，在适当的缓冲液中存在4种不同的三磷酸核苷及用于聚合的试剂(如DNA聚合酶或反转录酶)。引物优选单链寡脱氧核糖核酸序列。
依据引物的用途来决定引物适合的长度，但通常为约15到约50个核苷酸。短的引物分子一般需要较低的温度来与模板形成充分稳定的杂交复合体。
所述术语“探针”是指通过互补碱基对与靶核酸中的一段序列结合的寡核苷酸。本领域所属技术人员应理解，依据杂交条件的严格性要求，探针通常能够基本结合到与探针序列缺乏完全互补性的靶序列上。通常探针可被直接标记(例如利用同位素或荧光物质)或用诸如地高辛或生物素来间接标记。可通过检测探针的存在与否，来确定靶标的存在与否。
对于多聚酶链式反应(PCR)，尽管退火温度可在约32℃与72℃间变化，但是依据引物的长度和核酸的组成其退火温度常约低于Tm 5℃。对于高度严格的PCR扩增，尽管高度严格的退火温度可在约50℃-约72℃范围内变化、并通常为72℃，但是依据引物和缓冲液的条件退火温度通常等于或略高于(约5℃)引物的Tm的温度(Ahsen等，Clin.Chem.471956-61，2001)。
本文所用术语“抗体”，如果没有特别说明，应包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体及单链抗体。
单链抗体是能够与肽或抗原决定簇特异结合的多肽序列，其中该单链抗体衍生自单克隆抗体或多克隆抗体的轻链或重链。单链抗体包括衍生自人源化抗体、嵌合抗体或完整人抗体的多肽，其中该单链抗体衍生自这些抗体的轻链或重链。
优选地，本发明使用多克隆抗体和单克隆抗体。
本文中，如果抗体或抗体片段识别并结合样本中的靶分子，但基本不识别并结合含有靶分子的样本中的其它分子，则称该抗体或抗体片段与该靶分子“特异结合”。
本发明所用术语“有效剂量”是指组合物单独或与其它制剂一起使用而达到所希望的治疗效果时的量。
所述术语“载体”指与活性成分结合以利于使用的有机或无机成分，其可以是天然的或合成的。
所述术语“药物可接受”指非毒性材料，其不干扰活性成分的生物活性的效力。
本发明所用术语“药物可接受载体”指一种或多种适合对个体给药的相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包被物质。
本发明公开了CUDR基因的全长cDNA序列(参见SEQ ID NO1)。除胎盘外，在正常人组织中检测不到所述CUDR的mRNA表达。本发明证实了所述基因在诸如结肠癌、肺癌、宫颈癌和乳腺癌组织中过度表达(与其正常对应的组织比较)。
通过PCR或免疫分析，肝细胞和宫颈鳞状细胞癌阿霉素抗性细胞亚株CUDR mRNA的表达增加，这表明CUDR cDNA或其基因产物作为标志物在癌症的诊断或癌症治疗药剂(本文中也指抗癌药剂)的效果评价中具有潜在的应用价值。
根据本发明，能够通过对来自个体的生物样本(例如组织、血清或血浆)中CUDR mRNA或其基因产物进行PCR或免疫分析来诊断患有或怀疑患有结肠癌、肺癌、宫颈癌和乳腺癌的患者。
为了鉴定癌症的存在或诊断癌症患者抗癌治疗中的预后不良，获得全长CUDR cDNA或其基因的分离的多肽是十分必要的。本发明设计了用于多聚酶链反应的特异扩增全长CUDR cDNA的一对引物。该PCR的产物代表了可能的最长序列，并且具有翻译为蛋白产物的读码框架。
利用用于离体转染和蛋白合成的克隆酶将CUDR cDNA亚克隆到Gateway进入载体可使其进一步转移到哺乳动物表达载体中变得更加容易。进入宿主细胞(诸如人癌细胞)中的稳定转染可使CUDR的表达增加。恰好位于插入的CUDR cDNA 3’末端的其V-5抗原决定簇可使其以肿瘤细胞中C末端融合蛋白的形式表达，并使得从细胞裂解液中提取CUDR多肽变得容易。CUDR多肽的纯化能够制备用于本发明诊断和治疗的抗CUDR多肽的抗体。
宿主细胞和细胞株可以是原核的(例如E.coli)或真核的(例如CHO细胞、COS细胞、Hep G2细胞、酵母表达系统及昆虫细胞中的重组杆状病毒表达系统)。优选使用诸如人、小鼠、仓鼠、猪、山羊、灵长类动物等哺乳动物的细胞。它们可以是较宽范围的各种组织细胞类型，并包括原代细胞和细胞株。具体的实施例包括肝癌细胞、人肺癌细胞、人结肠癌细胞、人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、人前列腺癌细胞、成纤维细胞、骨髓干细胞及胚胎干细胞。
本发明提供通过给予个体有效剂量的药物组合物来治疗个体肿瘤的新方法。所述组合物包括有效剂量的本发明的抗体、或者具有SEQ ID NO1的反义寡核苷酸序列的核酸或其片段、以及药物可接受的载体。离体实验表明反义CUDR核酸与有义CUDR mRNA的结合可增加癌细胞对药物的敏感性。
当给药时，本发明的治疗性组合物能以药物可接受的制剂形式来给药。此制剂可常规地含有药物可接受含量的盐、缓冲剂、防腐剂、适宜的载体或赋形剂、辅助免疫加强试剂(如佐剂)及可选择的其它治疗试剂，例如化疗试剂。
本发明的药物可通过常规途径给予。该给药可以是例如口服、静脉内、腹腔内、肌肉内、腔内、皮下或透皮给药。
为了使适合对患者给药的单位重量或体积能产生所希望的治疗效果，上述方法中使用的该药物组合物优选是无菌的并含有有效剂量的本发明的抗CUDR多肽的抗体或CUDR基因的反义寡核苷酸。该治疗效果的测量可以通过例如测定本发明药物组合物影响基因表达的下游作用、或测量该药物组合物的生理作用(例如肿瘤衰退、疾病症状的减少、凋亡的调节等等)来进行。
通常，根据本领域的任何标准方法，本发明的特异结合CUDR多肽的抗体的剂量以10ng～300mg组方和给药。当使用CUDR的反义寡核苷酸时，根据标准的方法通常组方和给予1ng～0.1mg的剂量。其它药物组合物的给药方案是本领域所属技术人员公知的，其中剂量、注射时间表、注射位点、给药方式(例如肿瘤内)等等可从上述方案中变换得到。
该药物组合物可进一步含有适合的缓冲剂，包括乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐及磷酸盐。
该药物组合物还可选择性地包括适合的防腐剂，例如氯化苄烷铵；氯丁醇；对羟基苯甲酸酯(parabens)及硫汞撒(thimerosal)。
该药物组合物可被方便地制成单位剂量的形式，并通过任何药剂学领域公知的方法制备。所有方法都包括将活性试剂与载体结合的步骤，该载体由一种或多种辅助成分组成。通常，通过将活性化合物均匀、密切地与液体载体、细分的固体载体或二者结合制备该组合物，如果需要，可成型该产品。
适合口服给药的组合物可以制成诸如胶囊、片剂、药糖块的分散的单位形式，每单位含有预定剂量的活性化合物。其它组合物包括水性液体和非水性液体中的悬浮液，诸如糖浆、酏剂或乳剂。
适合肠道外给药的药物组合物可方便地包括无菌水性或非水性的CUDR多肽或其反义寡核酸的制剂，其优选与受者的血液等张。根据公知的方法使用适合的分散剂或润湿剂及悬浮剂来制备该制剂。该无菌的注射用制剂还可以是在非毒性的肠道外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的载体和溶剂包括水、林格氏(Ringer′s)溶液及等张的氯化钠溶液。此外，无菌不易挥发的油类可作为溶剂或悬浮介质依常规使用。为实现此目的，可使用任何温和的非挥发油，包括合成的甘油单脂或甘油二脂。此外，可将诸如油酸的脂肪酸用于注射制剂中。适合口服、皮下、静脉内、肌肉内等等给药的载体组方可参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.，Easton，PA。
本发明还涉及诊断肿瘤或评价个体中抗癌试剂的治疗效果的试剂盒，其通常包括用于扩增生物样本中本发明所述的核酸的cDNA的一对引物或用于与该核酸的cDNA杂交的探针；及使用所述引物或探针测定所述生物样本中所述cDNA的存在与否的指导性材料。
本发明还提供诊断肿瘤或评价个体中抗癌试剂的治疗效果的试剂盒，其包括特异结合所述个体生物样本中所述的多肽的抗体；及使用所述抗体测定所述生物样本中所述多肽的存在与否的指导性材料。
获得生物样本从本发明所述的患者中获得生物样本。血液是本发明的普通样本，可通过常规的方法将血液吸入例如硅化玻璃管的收集小管中，在制备血清时可不抗凝，也可使用例如EDTA、柠檬酸钠或肝素的抗凝剂来制备血浆。在优选的实施方案中，在冷冻前，从全血中分离血浆或血清组分。可通过常规的方法进行新鲜血浆分离，例如可根据公知的离心方法从全血中分离新鲜的血浆或血清。在一个优选的实施方案中，离心是温和进行的。本发明的一些实施方案中，例如通过RT-PCR扩增RNA，优选使用肝素酶预处理的肝素化+血液。
从生物样本中提取核酸使用本领域公知的常规提取方法，例如凝胶提取，二氧化硅、玻璃小珠或硅藻(diatom)提取，胍或碱性胍盐的提取，化学提取方法，或分子筛或阴离子交换色谱方法，从血浆或血清中提取核酸。核酸(例如RNA)也可使用RNAimage试剂盒(GenHunter Corporation，USA)，根据制造商推荐的“血液与体液方法”或“组织方法”来提取。
核酸的检测方法在核酸(例如RNA)从血浆、血清或组织中分离后，可通过本领域所属技术人员公知的方法来检测所述的核酸。本发明的方法通常使用但不总是依赖于扩增或信号扩增的方法来对所述核酸进行检测。本领域所属技术人员应认识到可通过诸如转录扩增、反转录PCR、自我持续的序列复制等任何公知的方法来实现样本中靶序列的扩增，其中每种方法都能提供充分的扩增。
PCR的方法是本领域所属技术人员公知的。欲了解PCR的方法和方案可参见例如Innis等编辑的PCR Protocols.A Guide to Methods andApplication(Academic Press，Inc.，San Diego，CA.1990)。PCR反应试剂和方案也可从诸如Roche Molecular Systems的供应商处得到。
上述检测的核酸可以是DNA或RNA分子。在本发明特定的实施方案中，检测了RNA。扩增的第一步是所扩增区域的DNA拷贝(cDNA)的合成。可通过分开的步骤，或在同源的反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)(一种改良的扩增RNA的聚合酶链式反应)中来实现反转录。核糖核酸的PCR扩增的适合方法如Romero与Rotbart的DiagslosticMolecular BiologyPrinciples and Applications pp.401-406，Persing等编辑，(Mayo Foundation，Rochester，MN 1993)以及Egger等，J.Clin.Microbiol.331442-1447(1995)中所述。
本发明方法所使用的引物优选至少约为15个核苷酸到约50个核苷酸长度，更优选约15个到约30个核苷酸长度。
在本发明中，引物延伸用的初始模板通常为从RNA转录的第一条cDNA链。适合从RNA模板合成cDNA的反转录酶(RTs)是本领域所公知的。
PCR在热稳定酶的作用下最通常以自动处理步骤来实现。在此步骤中，通过变性过程、引物的退火过程和延伸反应过程来自动地循环反应混合物的温度。
同样可使用本领域所属技术人员公知的其它的常规技术来检测本发明中的核酸。尽管通常在检测的步骤之前进行扩增的步骤，但在本发明的方法中扩增并不是必需的。例如，可以通过大小的分离(例如，凝胶电泳来鉴定所述的核酸。
可选择地，通过公知的技术进行测序来鉴定所述靶核酸。可选择地，也可使用所述靶核酸的特异寡核苷酸探针来鉴定特异片段的存在。
序列特异探针杂交是公知的检测样本中目的核酸的方法，该样本含有细胞、组织、生物液体等等。在充分严格的杂交条件下，探针只与基本互补的序列进行特异杂交。可放宽杂交条件的严格程度以允许不同数量序列的错配。如果预先扩增靶序列，使用这种序列特异的杂交来鉴定扩增产物能够保证只有准确扩增的靶序列能被鉴定，因此降低了假阳性的产生率。
一些杂交的形式是本领域所属技术人员公知的，包括但不限于溶液相、固相、寡核苷酸芯片、混合相或原位杂交分析。在溶液(或液体)相杂交中，靶核酸与探针或引物都可在反应混合物中进行自由的相互作用。诸如实时PCR系统的技术也已经发展为能够进行PCR反应扩增产物的分析(例如定量分析)。在此反应类型中，与特异寡核苷酸探针的杂交发生在鉴定靶核酸存在的扩增阶段。因有热力学控制的两个阶段的转换，寡核苷酸探针的杂交可保证其高度特异性。此种分析类型的例子为荧光共振能量转换杂交探针(fluorescence resonance energy transfer hybridizationprobes)、分子信标(molecular beacons)、Scorpions分子标记(molecularscorpions)及核酸外切酶杂交探针(见Bustin SM.J.Mol.Endocrin.25169-93(2000)的综述)。
可根据公知的技术来检测杂交复合体，其并不是本发明的关键部分。可使用任意一个通常用于检测杂交核酸存在的方法来标记能够与靶序列特异杂交的核酸探针。一种常用的检测方法是使用由3H、125I、35S、14C或32P等等标记的探针的放射性自显影技术。
可选择地，探针可直接与诸如荧光团、化学发光剂或酶的标记物连接。根据敏感性要求、与探针连接的容易程度、稳定性要求及可使用的仪器来决定标记物的选择。
可利用公知的技术来合成和标记本发明的探针和引物。根据Beaucage，S.L.&Caruthers，M.H.，1981，Tetrahedron Letts.，22(20)1859-1862中第一次描述的固相氨基磷酸三酯(phosphoramidite trimester)方法，利用Needham-VanDevanter，D.R.，等1984，Nucleic Acids Res.，126159-6168所述自动合成仪可化学合成作为探针和引物使用的寡核苷酸。可通过例如Pearson，J.D.&Regnier，F.E.，1983，J.Chrom.，255137-149中所述的天然丙稀酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC方法，来纯化寡核苷酸。
多克隆抗体为制备多克隆抗体，应获得纯化的人或非人的CUDR蛋白或多肽。
可选择地，可在诸如细菌或真核细胞的适合的宿主中重组合成全部或部分该CUDR蛋白，或通过对插入到适合的克隆载体中的适当的DNA序列进行表达。表达、提取CUDR蛋白或多肽或其片断的方法如本文所述。
其后纯化表达的CUDR蛋白并与Freund氏佐剂(辅助刺激动物的抗原反应)混合，并将其注入家兔或其它适合的实验动物体内。每隔一周进行加强注射，采集家兔或其它实验动物的血液并分离血清。该血清可直接使用，或者在使用前通过各种方法(包括使用蛋白-A-琼脂糖、抗原琼脂糖或抗小鼠-Ig-琼脂糖的亲和层析)进行纯化。
使用CUDR的片段作为抗原可制备其多克隆抗体。可优选使用源自CUDR氨基酸序列的含有70个氨基酸的羧基末端氨基酸序列的CUDR片段或其部分。如本文所述，可选择地将片段重组生成融合蛋白。可将这种肽抗原与钥孔(虫戚)血蓝蛋白连接来增强体内的免疫原性。
单克隆抗体通过常规的方法，向小鼠体内注射纯化的CUDR或其片段(可选为融合蛋白)后，也可制备单克隆抗-CUDR抗体，所述CUDR蛋白或其片段可通过如上述多克隆抗体制备中所述的方法获得。简单说来，向小鼠体内注射与Freund佐剂混合的该纯化的蛋白或肽，例如3周的时间注射9次。取该小鼠的脾脏，并重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)中。
将脾细胞作为淋巴细胞的来源，其中一些淋巴细胞可产生具有适当特异性的抗体。随后将这些细胞与永生的骨髓瘤伙伴细胞融合，将融合产物杂交瘤细胞接种到一定数量的存在有诸如HAT的选择试剂的组织培养孔中。使用ELISA进行筛选，以识别含有能产生CUDR特异性抗体的细胞的小孔。再次接种这些细胞，培养一段时间后，再次筛选这些小孔，来识别产生抗体的细胞。进行多个克隆的步骤，直到超过90％小孔中包含能够产生抗体的单克隆。通过此步骤，建立了能够产生抗体的稳定的克隆细胞株。然后，使用蛋白A琼脂糖亲和层析或离子交换层析以及这些技术的变化和组合，来纯化该单克隆抗体。
CUDR多肽的检测可使用各种类型的免疫分析方法来分析样本中的CUDR多肽或蛋白。这些方法包括夹心ELISA、放射免疫分析、荧光免疫分析、免疫组织化学、斑点杂交(dot-blot)、试纸条法(dip-stick)及Western印记。
在优选的实施方案中，使用特异结合CUDR多肽或其片段并携带可检测标记的抗体，并通过测量该可检测标记对生成的CUDR多肽-抗体复合物进行测定，从而测定样本中CUDR多肽的水平。可选择地，使用对CUDR多肽或其片段有特异性的第一抗体，然后使用对第一抗体有特异性并携带标记的第二抗体，该标记可以是可直接检测的标记或是信号产生系统的成分。此标记抗体和系统是本领域所属技术人员公知的。
将所述标记和信号产生系统所产生信号的检测或鉴定结果与适当的校准标准比较可确定样本中存在CUDR多肽-抗体复合物，并以此确定存在CUDR多肽。
所述第二抗体携带的标记是任意适合的可直接检测的标记或任意适合的信号产生系统的成分。许多这种例子是免疫分析领域所公知的。可通过本领域所属技术人员公知的技术，使用可检测的标记物或是信号产生系统的成分对第二抗体进行标记。可用于使抗体变为可检测的标记物的例子包括放射性同位素、酶、荧光素及化学发光物质。例如，可使用放射性元素作为可直接检测的标记物；放射性标记物的例子包括γ射线发射物质(124I、125I、128I及131I)。还可使用荧光标记物作为可直接检测的标记；例如适合的荧光物质包括coumarine、稀土金属离子、鳌合物或鳌合复合物、荧光素、若丹明(rhodamine)及若丹明衍生物。
适合的标记物还包括金属配合物、稳定的自由基、囊泡(vesicles)、脂质体、胶质颗粒(colloidal particles)、乳胶颗粒(latex particles)、spin标记物(spin labels)、生物素/抗生物素蛋白(biotin/avidin)以及它们的衍生物。可使用酶联信号产生系统，包括碱性磷酸酶、淀粉酶、荧光素酶、过氧化氢酶(catalase)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、己糖激酶、辣根过氧化物酶、内酰胺酶(lactamase)、尿素酶及苹果酸脱氢酶。用适当的底物与所述酶反应，然后通过测量吸光度、荧光或发光密度来检测酶的活性。当使用酶作为标记物时，可通过诸如戊二醛、过碘酸及马来酰亚胺(maleimide)的常规方法实现酶与抗体的连接。
固体基质可作为适用于固化抗体的固体支持物，其包括各种微滴定板(microtitre plates)(如从Falcon Plastics，Oxnard，Calif.获得的微滴定板，或例如常规的ELISA微滴定板(Immulon II、Dynax、Chantilly、VA)和链霉亲和素(Streptavidin)-包被的ELISA微滴定板(Reacti-Bind、Pierce、Rockford、IL))，以及诸如从Dynatech、Alexandria、VA获得的微滴定条(microtitre strips)。
通过本领域所属技术人员公知的常规方法可在固体支持物上进行抗体的固化。
根据本发明优选的实施方案，将体液样本与可与CUDR特异结合形成复合物的第一抗体接触，该第一抗体固化在固体支持物上。通过足够长的时间来使所述样本中的CUDR与该固化的抗体结合。随后洗涤该固体支持物，然后将其与第二抗体接触，该第二抗体能够与第一抗体特异结合并已标记了可检测的标记或附加了信号产生系统。通过测定结合到固体支持物上的标记或产生的信号来测量该样本中存在的复合物，从而测定该样本中CUDR的水平。
下面结合实施例与附图对本发明做进一步描述。
实施例1通过MTT检测不同的A431细胞亚株对阿霉素的反应在本实施例中比较了A431母细胞、A5A细胞和A10A细胞对阿霉素(DOX)的反应。
A431/A5A细胞是用5μg/ml的DOX处理后存活的A431细胞，而A10A细胞是源自用10μg/ml的DOX处理后存活的A5A细胞。
将细胞接种在96孔培养板上培养2天，并用不同浓度的DOX孵育5天。在孵育结束时，所述的细胞在50μl 0.1mg/ml的3-[4，5-dimethylthiaol-2-yl]-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)溶液中在37℃孵育3h，然后用150μl二甲基亚砜在室温下裂解30min。用酶标仪在580nm处测定每孔的吸光度。用经药物处理的细胞与未经药物处理的细胞间的比值来计算细胞存活的百分比。
结果如图1所示，为5个独立实验的平均值。○A431母细胞；△A431/A5A细胞；■A431/A10A细胞。误差线标准差。如图中所示，A431/A5A细胞与A10A细胞比母细胞更具有对DOX的抗性。
此外，如图2所示，发现该药物抗性细胞过度表达CUDR基因。这说明CUDR的过度表达可诱导细胞的药物抗性。
实施例2本发明目标基因的分离与鉴定差异表达mRNA的分离使用RNAimage试剂盒(GenHunter Corporation，USA)进行A431母细胞与A5A和A10A抗药性细胞间差异表达的mRNA的分离。简而言之，将0.1μg/μl无DNA的RNA用MMLV反转录酶、20μM的dNTP和单一碱基的锚定寡-dT引物进行反转录，随后在短的随机引物、2μM dNTP及[alpha-35S]dATP存在下进行PCR反应40个循环，参数为94℃，30sec；40℃，2min；72℃，30sec；然后72℃，5min。RT-PCR产物用6％变性的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳直到二甲苯染料到达胶的底部。将凝胶转印至3M纸上，并在80℃真空干燥1h。利用放射自显影来观察不同表达的cDNA图形。
结果如图2所示，图2A所示的放射自显影表明对应CUDR的cDNA的条带；随机引物为5’-AAG CTT GCA CCA T-3’，寡dT引物为5’-AAG CTTTTT TTT TTT G-3’。将所鉴定的在A431母细胞与抗药性细胞间不同表达的条带从凝胶上切下并提取用来进行PCR再扩增。随后，用Northern印记分析验证A431母细胞与抗药性细胞间不同表达的CUDR图形(图2B)。
克隆与测序将通过PCR再扩增的差异表达的cDNA亚克隆至pBluescript II SK+载体上。该载体先用EcoRV酶以1μg∶1单位的比例在37℃酶切1h来产生平末端(blunt ending)。随后用2mM dTTP在Taq DNA聚合酶的存在下，在72℃将该线性化的载体孵育2h以产生T-的悬垂(overhang)。用苯酚-氯仿抽提纯化该混合物，用无水乙醇沉淀并重悬在超纯水中。用T4 DNA联接酶将cDNA与载体DNA在16℃联接过夜。在联接混合物中载体与PCR新鲜扩增的产物的摩尔比大约为1∶3，可产生重组DNA。然后，将5μl联接产物转化至感受态大肠杆菌E.Coli细胞中并涂布在LB/氨苄青霉素的培养板上，该培养板含有20mg/ml X-gal和200mg/ml IPTG。通过与PCR再扩增步骤相同PCR条件和参数的克隆PCR来筛选有DNA插入的阳性克隆。利用质粒DNA小规模制备试剂盒(Qiagen，USA)分离LB培养板上感兴趣的单个克隆。通过ABI PRISM dRodamine Terminator循环测序定制的反应试剂盒(AppliedBiosystem，USA)使用一对通用M13载体引物对所述的cDNA进行自动测序。所获得的序列利用BLAST搜寻与Genbank的数据库进行对比。筛选得到了CUDR的全长cDNA并通过对人微阵列胎盘cDNA文库(OrigeneTechnologies，Inc，USA)的筛选对其进行了分离。依据使用说明书来实施筛选的步骤。为鉴定任何阳性克隆，依据从差异显示分离得到的cDNA条带的序列设计一对CUDR cDNA的特异引物(正向5’-AAT GGA CAA CAG TACACG C-3’(nt800)；反向5’-AAG GTG CCA GTT AGC GTA T-3’(nt1247))。用NotI酶消化阳性克隆，并鉴定了最长的理想cDNA克隆。利用文库载体引物对两条链全长DNA序列进行测序。载体引物35’-GCA GAG CTC GTTTAG TGA ACC-3’；M13反向3’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’。
发现全长CUDR基因序列为2277个核苷酸(参见SEQ ID NO1)，其蛋白为123氨基酸(参见SEQ ID NO2)。
实施例3利用Northern印记分析不同人类癌症细胞株中CUDR的表达对不同人类癌症细胞株中CUDR的表达进行了检查。每一泳道加入10μg的总RNA。用TRI试剂(Molecular Research Center，USA)来裂解处于指数期的细胞。用1-溴-3-氯丙烷(BCP)试剂(Molecular Research Center，USA)抽提总RNA，用异丙醇沉淀并溶解在无RNase水中。将10μg的总RNA在1％琼脂糖/7M甲醛变性凝胶上电泳并转印至Hybond N膜上(Amersham PharmaciaBiotech，England)。利用PCR扩增方法获得CUDR的cDNA探针并溶解在1.5％琼脂糖凝胶中。随后回收该cDNA并用QIAEX凝胶提取试剂盒(Qiagen，USA)纯化。用[alpha-32P]dCTP通过Redprime II随机标记系统(AmershamPharmacia Biotech，England)标记该cDNA探针。使用Rapid-hyb缓冲液(Amersham Pharmacia Biotech，England)在65℃杂交2h。经严格的洗涤后，在-80℃用曝光盒将印记在X-射线底片上曝光。通过18S rRNA和28S rRNA的水平来验证凝胶上加载了等量的总RNA。
如图3所示的结果显示CUDR可在不同组织来源的较宽范围的人癌症细胞中表达。此外，当与其母细胞比较时，在DOX抗性HepG2细胞中CUDR的表达增加。这些资料表明CUDR的过表达可诱导HepG2细胞的抗药性。图3中，泳道1人肝细胞癌HepG2细胞；泳道2阿霉素抗性HepG2细胞；泳道3人肝细胞癌Hep3B细胞；泳道4人乳腺癌MCF-7细胞；泳道5人乳腺癌MDA-468细胞；泳道6人宫颈癌HeLa细胞；泳道7人前列腺癌PC-3细胞；泳道8人结肠癌HT-29细胞；泳道9人结肠癌Caco-2细胞；泳道10人肺癌Calu-6细胞。其18S和28S rRNA证明每一泳道加载了等量的总RNA。
实施例4CUDR的抗药性作用本实施例检测了CUDR在细胞对阿霉素敏感性中的作用。用加载了全长CUDR cDNA或CUDR反义寡核苷酸的质粒分别转染人鳞状癌A431细胞。在将细胞接种在96孔培养板上4小时后，将其与全长CUDR质粒DNA或CUDR反义寡核苷酸分别孵育24h或4h。转染后，该细胞与DOX孵育48h。用MTT分析检测细胞的存活。此外，利用Northern印记来检测转染后CUDRmRNA的水平。
用全长CUDR质粒DNA或CUDR反义寡核苷酸转染的结果分别如图4A和图4B所示。图4A中，---○---(C)未转染细胞；—■—(CUDR)用全长CUDR cDNA转染的细胞。图4B中，---○---(C)未转染的细胞；—●—(S)用CUDR有义寡核苷酸转染的细胞；—■—(AS)用CUDR反义寡核苷酸转染的细胞。
CUDR的反义序列为5’-CAA GGT GCC AGT TAG CGT AT-3’(nt1347-1367)，且所述寡核苷酸有义序列与其反义序列互补。图中其18S和28S rRNA证明在Northern印记分析中每一泳道加载了等量的总RNA。
如图4所示，全长CUDR转染可增加A431细胞对阿霉素的抗药性，而CUDR反义寡核苷酸转染可增加细胞对DOX的敏感性。这些结果有力地支持了CUDR在细胞抗药性中的作用，并且说明CUDR可用作癌症治疗反应的生物标志物。此外，这些结果也支持了靶向CUDR可增加细胞对药物的敏感性。
实施例5CUDR抗药性的机制本实施例检测了稳定转染CUDR的人鳞状细胞癌A431细胞对阿霉素和Taxol的反应。
用全长CUDR cDNA载体或空载体转染A431细胞。转染后，用G418来挑选细胞，并且挑选单克隆来建立稳定转染株。该稳定转染株维持在附加了G418的培养液中。用MTT分析和DNA片段分析同时检测细胞对药物的反应。
在MTT分析中，将所述细胞接种在96孔培养板上2天后，与不同浓度的DOX或Taxol孵育5天。孵育结束后，将细胞与50μl的0.1mg/ml MTT溶液在37℃孵育3h，并用150μl的二甲基亚砜在室温裂解30min。利用酶标仪在580nm处测定每孔的吸光度。用经药物处理的细胞与未经药物处理的细胞间的比值来计算细胞存活的百分比。所述MTT对DOX和Taxol的检测结果分别如图5A和5C所示。○对照细胞，即用空载体转染的A431细胞；▲A431的CUDR稳定转染细胞。误差线标准差。如图中所示，与对照细胞比较，所述CUDR稳定转染细胞对DOX和Taxol的抗药性更强。
抗癌药的作用机制之一是对人癌细胞凋亡的诱导，通常，凋亡诱导的越多，该药物杀伤癌细胞的效果越强。另一方面，对凋亡的耐受也被认为是癌症发展的可能原因。
DNA片段分析是评价细胞对抗癌药物治疗凋亡反应的常用方法。将细胞接种在60mm Petri培养皿2天后，暴露在不同浓度的DOX或Taxol中3天。孵育后，在45℃将细胞孵育在含有Tris-HCl、SDS、EDTA和蛋白酶K的裂解缓冲液中2h以裂解细胞。用苯酚/氯仿抽提后，用乙酸钠和100％乙醇沉淀DNA。在37℃用RNase A过夜消化后，在含有1.5％EtBr着色的琼脂糖凝胶上电泳分离40μg的DNA样本。利用UV光线盒来观察DNA片段的图形。“DNA梯状带(laddering)”图形的出现表明细胞中存在凋亡的诱导；梯状带的图形越广泛，凋亡诱导越明显。DOX和Taxol处理对细胞凋亡的反应分别如图5B和5D所示。AN对照细胞，即用空载体转染的A431细胞；AGA431的CUDR稳定转染细胞；及M100bp标记物。
上述实验重复至少3次，并给出了具有代表性的一个结果。如图5所示，与对照细胞比较，CUDR稳定转染细胞对DOX和Taxol诱导凋亡的耐受性更强。这些结果表明CUDR在细胞的凋亡诱导和凋亡基因表达中可能具有主要的作用。
此外，利用软琼脂分析检测了A431的CUDR转染株和对照细胞的集落形成能力。该软琼脂分析是通过在软琼脂培养基上生长癌细胞来对癌细胞恶性程度进行离体评价的一种方法。比较结果发现A431的CUDR转染株的集落形成能力高于对照细胞的能力＞5倍。这些结果表明CUDR可增加细胞的恶性程度。
实施例6不同人类组织中CUDR mRNA的表达通过CUDR探针与人12-泳道多组织Northern印记(ClonTech，USA)的杂交来进行CUDR mRNA在12种不同人类组织中分布的Northern印记分析。如图6所示，每一泳道含有1μg的12种人类组织poly-A+RNA中的一种，其从泳道1-泳道12分别以如下顺序排列脑、心脏、骨骼肌、结肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺、外周血淋巴细胞。每一泳道样品中RNA的完整性通过变性电泳来验证并且其等量加载由β-actin的水平(厂商提供)来进行验证。在购自ClonTech的ExpressHyb杂交缓冲液中用随机最初标记的CUDR进行杂交。在说明书指导下在暴露于X射线底片之前对印记进行杂交和严格的洗涤。
图6中的结果表明CUDR几乎不能在11种人的组织中检测到，而在胎盘中有高表达。单链mRNA条带的大小大约为2.2kb。用厂商提供的对人β-actin水平的检测来对印记上人组织中RNA的量进行标准化。
实施例7-9在正常组织与肿瘤组织cDNA匹配对中CUDR cDNA的表达实施例7人宫颈组织与人结肠组织利用CUDR基因特异引物对从人宫颈组织与人结肠组织中获得的7.5ng第一条cDNA链进行扩增。正向引物为5’-GCA CCC TAG ACC CGAAA-3’(见SEQ ID NO3)，反向引物为5’-GCC ACC TGG ACG GAT AT-3’(见SEQ ID NO4)。有5对人结肠组织和一对人宫颈组织cDNA对(ClonTech，USA)。
每对cDNA样品来自同一个体的肿瘤和临近的正常组织。组织中的cDNA样品标准化为两种看家基因β-actin和23-kDa高基础蛋白(厂商提供)。PCR参数94℃、1min，随后的35个循环在94℃、30sec，58℃、30sec，72℃、30sec，最后在72℃延伸5min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳。
图7中的结果(N正常组织；T肿瘤组织；M分子量标准)表明，与邻近的正常组织比较，在人结肠癌和宫颈癌组织中CUDR表达上调。这支持了CUDR作为结肠癌和宫颈癌的生物标志物的作用。
实施例8人肺组织利用CUDR基因特异引物对从人肺组织中获得的7.5ng第一条cDNA链进行扩增。有5对人肺组织cDNA对(ClonTech，USA)。每对cDNA样品来自同一个体的肿瘤和临近的正常组织。组织中的cDNA样品标准化为两种看家基因β-actin和23-kDa高基础蛋白(厂商提供)。PCR参数94℃、1min，随后的35个循环在94℃、30sec，58℃、30sec，72℃、30sec，最后在72℃延伸5min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳。
图8中的结果(N正常组织；T肿瘤组织；M分子量标准)表明，除病人E外，与邻近的正常组织比较，在人肺癌组织中CUDR表达上调。这支持了CUDR作为肺癌的生物标志物的作用。
实施例9人乳腺组织利用CUDR基因特异引物对从人乳腺中获得的7.5ng第一条cDNA链进行扩增。有5对人乳腺组织cDNA对(ClonTech，USA)。每对cDNA样品来自同一个体的肿瘤和临近的正常组织。组织中的cDNA样品标准化为两种看家基因β-actin和23-kDa高基础蛋白(厂商提供)。PCR参数94℃、1min，随后的35个循环在94℃、30sec，58℃、30sec，72℃、30sec，，最后在72℃延伸5min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳。
结果如图9A所示，N正常组织；T肿瘤组织；M分子量标准。
人乳腺组织中雌激素受体αcDNA的表达利用ER-α基因特异引物通过PCR扩增对雌激素受体αcDNA的表达进行检测。正向引物为5’-AGC ACC CAG TGA AGC TAC T-3’，反向引物为5’-TGA ACC CAG TGA AGC TAC T-3’。使用与上述检测CUDR相同的从人乳腺组织中获得的7.5ng第一条cDNA链进行PCR扩增(ClonTech，USA)。PCR参数94℃、1min，随后的35个循环在94℃、30sec，57℃、30sec，72℃、30sec，最后在72℃延伸5min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳。
图9B中的结果(N正常组织；T肿瘤组织；M分子量标准)表明，患者A、D、E乳腺组织为ER-α阳性，而患者B、C乳腺组织为ER-α阴性，结合上述乳腺组织中CUDR的表达结果(图9A)，这些资料表明，在ER-α阴性乳腺组织中CUDR表达上调，而在ER-α阳性乳腺组织中CUDR表达下调，这支持了CUDR作为ER-α阴性乳腺癌生物标志物的作用。
在不偏离本发明范围的情况下可对本发明的实施方案做出多种修改和变化，这对本领域所属技术人员是显而易见的。本发明的特定实施方案仅以序列表SEQUENCE LISTING<110>香港中文大学<120>癌症病程及治疗反应的标志物CUDR<150>US 60/541,863<151>2004-02-04<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2277<212>DNA<213>CUDR cDNA<400>1agtataaagc tgcctctctc ctaactccct tcgctgactc tcttttcaga actcagccca 60cttgcaccca agtgaattaa cagccttgtt gctcacacaa agcctgttta ggtggtcttc 120tatacggaca tgcttgacac ttggtgccaa aatctgggcc agggggactc cttcgtgaga 180ccggccccct gtcctggccc tcattccgtg aagagatcca cctgcgacct cgggtcctca 240
gaccagccca aggaacatct caccaatttc aaatcggatc tcctcggctt agtggctgaa300gactgatgct gcccgatcgc ctcagaagcc ccttggacca tcacagatgc cgagcttcgg360gtaactctta cggtggagga ttcccagcca tatgaagaca ccctagctgg acgatcagtc420cttgtcaaaa gtctgacccc tcaaactcta cagcctcaat ggaccagacc ctacccggtc480atttatagca caccaactgc cgtccatctg caggaccctc tccattgggt tcaccattcc540agaataaagc catgcccatc agacagccag cttgatctct cctcttcctc ctggaagcca600caagattagg ccgagagccg atcagacaaa caacctacaa cccttaagct cctggcagcg660cccagccaag gccatgcttc cttgcaacac tccttccaaa tggccatccc agcatgcttc720caagcaggct tcatccgttc ctctggaccc tcatctctta agacctgccg cctataaaaa780ggattatatc ttgagaccct atcctctaaa attttttcca cacccaaaac aaaaaatctc840tgggtcaaaa gtctaaaacg cttaggctgg caaccatcag atccttgccc atggtgtcct900caagcctact ctcatgaaat ggacaacagt acacgcatat ggggccagtt ccacatattt960ggcaaccaga ccagcatcca ggacaacaca aagtatgttg tttgttgtta gagggcttgg 1020gacatttcac tctttgccag cctcagctta atccaggaga caaagattat tttccttatt 1080atctcttctg cataggatct gcaatcagaa ctattgaact tctccattca gaccgccact 1140
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gcgtgacagg aacctcaacc caaaggcagt ctgatgaggt gtctaagata aaagtagcgg2100cacaaaggct tttgtaaaca gaggcgtttc atgtggtttt cctttccttt ccttatatgt2160gaaaaggtga cagaaaagaa atcttcctaa aagagtcagc cactgctgtg aaaaaaaaaa2220aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2277<210>2<211>123<212>PRT<213>CUDR多肽<400>2Met Leu Pro Cys Asn Thr Pro Ser Lys Trp Pro Ser Gln His Ala Ser1 5 10 15Lys Gln Ala Ser Ser Val Pro Leu Asp Pro His Leu Leu Arg Pro Ala20 25 30Ala Tyr Lys Lys Asp Tyr Ile Leu Arg Pro Tyr Pro Leu Lys Phe Phe35 40 45Pro His Pro Lys Gln Lys Ile Ser Gly Ser Lys Val Asn Ala Ala Gly50 55 60
Asn His Gln Ile Leu Ala His Gly Val Leu Lys Pro Thr Leu Met Lys65 70 75 80Trp Thr Thr Val His Ala Tyr Gly Ala Ser Ser Thr Tyr Leu Ala Thr85 90 95Arg Pro Ala Ser Arg Thr Thr Gln Ser Met Leu Phe Val Val Arg Gly100 105 110Leu Gly Thr Phe His Ser Leu Pro Ala Ser Ala115 120<210>3<211>17<212>DNA<213>正向引物<400>3gcaccctaga cccgaaa 17<210>4<211>17
<212>DNA<213>反向引物<400>4gccacctgga cggatat 1权利要求
1.分离的编码具有SEQ ID NO2氨基酸序列多肽的核酸。
2.如权利要求1所述的核酸，其中所述的核酸具有SEQ IDNO1序列。
3.分离的具有氨基酸序列SEQ ID NO2的多肽。
4.与具有氨基酸序列SEQ ID NO2的多肽特异结合的抗体。
5.治疗肿瘤的药物组合物，包括有效剂量的与具有氨基酸序列SEQ IDNO2的多肽特异结合的抗体、或者具有SEQ ID NO1的反义寡核苷酸序列的核酸或其片段、以及药物可接受的载体，所述的肿瘤不包括雌激素受体α阳性乳腺癌。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述的肿瘤选自肺癌、肝细胞癌、宫颈癌、结肠癌及雌激素受体α阴性乳腺癌。
7.诊断个体是否患有肿瘤或评价患有肿瘤个体对抗癌试剂的治疗效果的试剂盒，其中所述的肿瘤不包括雌激素受体α阳性乳腺癌，所述试剂盒包括用于扩增个体生物样本中编码具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的核酸的cDNA的一对引物或用于与所述核酸的cDNA杂交的探针；及使用所述引物或探针测定所述生物样本中所述cDNA的存在与否的指导性材料。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其中所述的核酸具有SEQ ID NO1序列。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其中所述的肿瘤选自肺癌、肝细胞癌、宫颈癌、结肠癌及雌激素受体α阴性乳腺癌。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述的肿瘤选自肺癌、肝细胞癌、宫颈癌、结肠癌及雌激素受体α阴性乳腺癌。
11.如权利要求7所述的试剂盒，其中所述的生物样本选自血清、血浆和组织样本。
12.诊断个体是否患有肿瘤或评价患有肿瘤个体对抗癌试剂的治疗效果的试剂盒，其中所述的肿瘤不包括雌激素受体α阳性乳腺癌，所述试剂盒包括与所述个体生物样本中具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽特异结合的抗体；及使用所述抗体测定所述生物样本中所述多肽的存在与否的指导性材料。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其中所述的肿瘤选自肺癌、肝细胞癌、宫颈癌、结肠癌及雌激素受体α阴性乳腺癌。
14.如权利要求12所述的试剂盒，其中所述的生物样本选自血清、血浆和组织样本。
15.如权利要求13所述的试剂盒，其中所述的生物样本选自血清、血浆和组织样本。
16.一种检测个体患有或怀疑患有肿瘤、或者评价患有肿瘤的个体对抗癌剂的治疗效果的方法，其中所述的肿瘤不包括雌激素受体α阳性乳腺癌，所述的方法包括提供来自所述个体的生物样本；及检测所述样本中编码具有SEQ ID NO2氨基酸序列多肽的核酸的cDNA，其中，所述样品中所述cDNA的存在表明所述个体患有肿瘤或对所述的抗癌剂具有抗药性。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述核酸具有SEQ ID NO1序列。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述的肿瘤选自肺癌、肝细胞癌、结肠癌、宫颈癌及雌激素受体α阴性乳腺癌。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述的肿瘤选自肺癌、肝细胞癌、结肠癌、宫颈癌及雌激素受体α阴性乳腺癌。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述的生物样品选自血清、血浆及组织。
21.一种检测个体患有或怀疑患有肿瘤、或者评价患有肿瘤的个体对抗癌剂的治疗效果的方法，其中所述的肿瘤不包括雌激素受体α阳性乳腺癌，所述的方法包括提供来自所述个体的生物样本；及检测所述样本中具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽，其中，所述样品中所述多肽的存在表明所述个体患有肿瘤或对所述的抗癌剂具有抗药性。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述的肿瘤选自肺癌、肝细胞癌、结肠癌、宫颈癌及雌激素受体α阴性乳腺癌。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述的生物样品选自血清、血浆及组织。
24.将核酸以读码框架形式克隆至载体的方法，所述的核酸编码具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽，所述方法包括扩增所述核酸的全长cDNA；及将所述全长cDNA克隆至适合的载体。
25.如权利要求24所述方法，其中所述的载体为pENTR-SD/D-TOPO。
26.含有编码具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的核酸的载体。
27.如权利要求26所述的载体，包括pcDNA-DEST40。
28.通过向细胞中转染核酸来制备的具有获得性药物抗性的癌细胞或细胞株的离体模型，所述核酸编码具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
全文摘要
本发明公开了命名为CUDR的新的人类基因。本发明提供了以CUDR基因作为生物标志物在人类癌症的诊断和治疗中的应用。
文档编号C07K16/30GK1660900SQ20051000164
公开日2005年8月31日 申请日期2005年2月3日 优先权日2004年2月4日
发明者郭添德 申请人:香港中文大学