专利名称：膜超滤法提纯葡萄籽中的低聚原花青素的方法
技术领域：
本发明属于天然产物提取技术领域，特别是从葡萄皮和葡萄籽中分离提取高纯低聚原花青素的方法。
背景技术：
原花青素是植物王国中广泛存在的多酚类化合物，属生物类黄烷醇(flavanols)。1967年，美国Joslyn等从葡萄皮和葡萄籽中分离出多酚化合物。因这类物质在酸性介质中加热均可产生花色素(cyanidins)，故将其命名为原花青素。它们是儿茶素、表儿茶素、表儿茶没食子酸酯等单体，以及由这些单体组成的二聚体、三聚体、四聚体，直至十聚体，其中单体儿茶素((+)-catechin)及一种二聚体的结构及相对分子质量如下 依聚合度的大小，通常将二至四聚体称为低聚体物，而五聚体以上的称为高聚体物。研究表明，随着原花青素聚合度的增加，溶解性相应降低，且高聚物在人体肠道内很难被吸收，相比较而言低聚原花青素具有更强的生理活性，能清除人体内过剩的自由基，提高人体的免疫力，可作为防癌、抗突变、防治心血管疾病药物的主要有效成分和用作安全无毒的新型天然抗氧化剂等，在医药、保健、食品、日用化工等领域具有广泛的用途。因此，研究低聚原花青素的提取技术意义重大。
目前，国内外提取低聚原花青素主要采取溶剂萃取法及色谱柱分离法。魏福祥等以粉碎的葡萄籽、石油醚脱脂干燥后的葡萄籽壳为原料乙酸乙酯加水为提取剂，提取率为0.4％～0.6％。波兰Oszmianski Jan，1996年申请专利，以丙酮为溶剂，采用超声波从葡萄籽中提取OPC’s，乙酸乙酯在-18℃萃取，三氯甲烷沉淀产物。日本Akio Yanagida等利用分子排阻色谱分离得到不同聚合度的原花青素。不过，溶剂萃取法大都提取率不高，其中低聚物的含量不能保证，而色谱法效率不高，且流出组分多，操作技术难度大，不利用于大规模生产。
超滤膜技术根据分子的形状和相对分子质量的大小，通过膜孔的筛分、吸附等作用，对体系中的不同组分实现选择性分离，达到分子水半上的分离、纯化和浓缩、同时操作简单易行。超滤已经广泛应用于食品、医药、工业废水处理、超纯水制备及生物技术工业。
发明内容本发明的目的是解决上述已有方法提取率不高、其中低聚物的含量不能保证、或效率不高、操作技术难度大，不利用于大规模生产的问题，提供一种膜超滤法提纯葡萄籽中的低聚原花青素的方法。
本发明提供的膜超滤法提纯葡萄籽中的低聚原花青素的方法，包括1)将原花青素含量≥95％的原花青素精提物按重量体积比g/ml为1∶1的比例溶于双蒸水，加到连续洗滤的超滤装置的料液瓶中；2)采用间歇法、使用低蛋白吸附的改性聚醚砜平板超滤膜，首先进行5K膜超滤，于室温下，调节回流阀，控制压力在25～35psig，收集过滤液；3)将上步收集的过滤液，真空薄膜蒸发，冷冻干燥，得5K以下的低聚原花青素。
——将上述2)步中收集的过滤液，加到连续洗滤的超滤装置的料液瓶中；——继续进行1K膜超滤，于室温下，调节回流阀，控制压力在15～25psig，收集过滤液，真空薄膜蒸发，冷冻干燥，得1K以下的低聚原花青素。
其中原花青素含量≥95％的原花青素精提物可由如下方法获得——采用AB-8型大孔吸附树脂，对含有原花青素的粗提物进行吸附、解吸，去除粗提物中的多糖、蛋白及某些小分子杂质，其步骤为1)、上样将含有原花青素的粗提物上样吸附至AB-8型大孔吸附树脂柱，上样量80mg/g干树脂，首先用双蒸水洗脱直至无浑浊液流出，流速≤5ml/min，且PH值稳定在7左右；2)、解吸用浓度为50％～70％的乙醇进行洗脱，流速≤2ml/min，洗脱至流出液无色，PH在6左右；3)、将经步骤2)得到的溶液真空薄膜蒸发，冷冻干燥，得原花青素精提物。经过大孔吸附精制的葡萄籽提取物，去除了粗提物中的多糖、蛋白等杂质，其原花青素含量可达95％以上。
含有原花青素的粗提物可由如下方法获得1)、原料预处理葡萄籽清洗，烘箱中60～80℃烘干，粉碎，将粉末过10～30目筛；(20目效果最佳)2)、过筛后粉末按照料液比1∶20～30，温度50～70℃，50～80％乙醇，热回流法浸提50～80分钟；3)、将上述浸提液布氏抽滤，真空薄膜蒸发得粗提液，冷冻干燥后含有原花青素的粗提物。
本发明的优点和积极效果本发明利用截流相对分子质量(MWCO)为5K和1K的低蛋白吸附的改性聚醚砜平板超滤膜提纯葡萄籽精提物(原花青素含量≥95％)中的低聚原花青素，并进行高效液相检测。其中5K膜超滤原花青素得率为25.18％，单体儿茶素得率为74.11％；1K膜超滤原花青素得率为34.76％，儿茶素得率为48.58％。经过5K和1K膜超滤得到的干粉其儿茶素含量分别为过膜前的6.6和7.7倍，可见超滤对低聚原花青素的提纯起到了很好的效果。超滤时选择20～30psig的操作压力，温度室温为宜。
本发明工艺流程简便，低聚原花青素得率高，且易于保持其活性，无环境污染，无溶剂残留。同时本发明也可以应用于其它低分子量活性物质的分离提取。
图1是切向流超滤工作流程示意图。
具体实施方式
实施例1一、原花青素的粗提取(1)原料预处理葡萄籽清洗，烘箱中60℃烘干，粉碎，将粉末过20目筛；(2)过筛后粉末按照料液比1∶20，温度50℃，60％乙醇，热回流法浸提50分钟；(3)将上述浸提液布氏抽滤，真空薄膜蒸发得粗提液，冷冻干燥后得粗提样。
二、AB-8大孔吸附树脂柱精提(1)上样将步骤一得到的粗提样上样吸附至AB-8型大孔吸附树脂柱，上样量80mg/g干树脂，首先用双蒸水水洗脱直至无浑浊液流出，流速≤5ml/min且PH值稳定在7左右；(2)解吸用浓度为70％乙醇进行洗脱，流速≤2ml/min，洗脱至流出液无色PH在6左右；(3)将上步得到的溶液真空薄膜蒸发，冷冻干燥，得原花青素精提物。经过大孔吸附精制的葡萄籽提取物，去除了粗提物中的多糖、蛋白等杂质，其原花青素含量可达95％以上。
三、超滤法提纯低聚原花青素1.超滤装置和流程见图1，用于连续洗滤的UltralabTM系统超滤装置包括进料瓶、料液瓶1、蠕动泵2(最大压力2.8bar(40psi)(间歇操作)1.8bar(25psi)(连续操作))、压力表、板式切向流膜包3、截流阀、回流装置、过滤液收集瓶等。
UltrasettleTM的实验室切向流膜包，大的过滤面积提高了样品的操作速度，两种流体通道结构可最大限度控制浓差极化。切向流超滤使原料液流入方向与膜成一个夹角，使得在膜表面形成高剪切力，可使沉积在膜表面的颗粒扩散回主体流，从而被带出超滤组件，使该污染层不再无限增厚而保持在一个较薄的稳定水平。因此一旦污染层达到稳定，膜渗透流率就将在较长一段时间内保持在相对高的水平。其整个工艺流程见图1。
2.不同相对截流分子量(5K，1K)的膜超滤(1)称取经AB-8大孔吸附树脂柱精提的原花青素1.000g(注，原花青素精提物作为本发明的原料物，也可通过其它方法获得)，溶于双蒸水，定容至1000ml，加到超滤装置的料液瓶中；(2)采用间歇法首先进行5K膜超滤，于室温下，调节回流阀以控制压力至30psig，收集过滤液，真空薄膜蒸发，冷冻干燥，得5K以下的低聚原花青素。
(3)将上述(2)步中的过滤液定容至1000ml，定容后的过滤液继续进行1K膜超滤，于室温下，调节回流阀以控制压力至20psig，收集过滤液，真空薄膜蒸发，冷冻干燥，得1K以下的低聚原花青素。
权利要求
1.一种膜超滤法提纯葡萄籽中的低聚原花青素的方法，其特征是该方法包括1)将原花青素提取物按重量体积比g/ml为1∶1的比例溶于双蒸水，加到连续洗滤的超滤装置的料液瓶中；2)采用间歇法、使用低蛋白吸附的改性聚醚砜平板超滤膜，首先进行5K膜超滤，于室温下，调节回流阀，控制压力在25～35psig，收集过滤液；3)将上步收集的过滤液，真空薄膜蒸发，冷冻干燥，得5K以下的低聚原花青素。
2.根据权利要求1所述的膜超滤法提纯葡萄籽中的低聚原花青素的方法，其特征是——将上述2)步中收集的过滤液定容后加到连续洗滤的超滤装置的料液瓶中；——继续进行1K膜超滤，于室温下，调节回流阀，控制压力15～25psig，收集过滤液，真空薄膜蒸发，冷冻干燥，得1K以下的低聚原花青素。
3.根据权利要求1或2所述的膜超滤法提纯葡萄籽中的低聚原花青素的方法，其特征是原花青素含量≥95％的原花青素精提物可由如下方法获得——采用AB-8型大孔吸附树脂，对含有原花青素的粗提物进行吸附、解吸，去除粗提物中的多糖、蛋白及某些小分子杂质，其步骤为1)、上样将含有原花青素的粗提物上样吸附至AB-8型大孔吸附树脂柱，上样量80mg/g干树脂，首先用双蒸水洗脱直至无浑浊液流出，流速≤5ml/min，且PH值稳定在7左右；2)、解吸用浓度为50％～70％乙醇进行洗脱，流速≤2ml/min，洗脱至流出液无色，PH在6左右；3)、将经步骤2)得到的溶液真空薄膜蒸发，冷冻干燥，得原花青素精提物。
4.根据权利要求3所述的膜超滤法提纯葡萄籽中的低聚原花青素的方法，其特征是含有原花青素的粗提物可由如下方法获得1)、原料预处理葡萄籽清洗，烘箱中60～80℃烘干，粉碎，将粉末过10～30目筛；2)、过筛后粉末按照料液比1∶20～30，温度50～70℃，50～80％乙醇，热回流法浸提50～80分钟；3)、将上述浸提液布氏抽滤，真空薄膜蒸发得粗提液，冷冻干燥后含有原花青素的粗提物。
全文摘要
膜超滤法提纯葡萄籽中的低聚原花青素的方法。包括将原花青素精提物按重量体积比g/ml为1∶1的比例溶于双蒸水，加到连续洗滤的超滤装置中；采用间歇法先进行5K膜超滤，收集过滤液；将过滤液，真空薄膜蒸发，冷冻干燥，得5K以下的低聚原花青素。将上步中收集的过滤液，继续进行1K膜超滤，过滤液真空薄膜蒸发，冷冻干燥，得1K以下的低聚原花青素。本发明利用截流相对分子质量为5K和1K的低蛋白吸附的改性聚醚砜平板超滤膜提纯葡萄籽精提物中的低聚原花青素，其中5K膜超滤原花青素得率为25.18％，单体儿茶素得率为74.11％；1K膜超滤原花青素得率为34.76％，儿茶素得率为48.58％。经过5K和1K膜超滤得到的干粉其儿茶素含量分别为过膜前的6.6和7.7倍。
文档编号C07D311/62GK1680359SQ20051001308
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月12日 优先权日2005年1月12日
发明者张泽生, 罗冠中 申请人:天津科技大学