专利名称：猪肉质性状基因foxo3a的克隆及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及猪肉质性状相关基因FOXO3A基因的克隆以及作为猪肉质性状分子标记的应用。
背景技术：
过去几十年的育种实践中，猪的生长速度、饲料报酬和瘦肉率等都有了很大的提高。与此同时，由于肉质性状与生长性状或胴体性状间常常表现为负的遗传相关，因而在提高生长速度和瘦肉率的选择中，常伴随着肉质的下降，即肉质变劣、风味变差。严重影响了养猪生产和猪肉加工与消费，引起了消费者和猪育种学家的高度重视。为了探明肉质的遗传规律，国内外对肉质进行了多方面的研究工作(吴金亮等.猪肉质性状的研究进展.云南农业科技.2004年增刊，20-24)。
肉质是一个综合性状，它包括一系列的评价指标。在猪的育种中，度量肉质性状的主要指标包括以下内容pH值(pH1、pH2)、系水力(失水率、滴水损失、贮存损失、熟肉率)、肌内脂肪含量、嫩度(剪切力)、大理石纹、肉色、肌纤维直径等。肉质性状的遗传行为不是孤立的，肉质性状之间往往也存在着表型和遗传上的相关。
Lo等(Lo等，Genetic analyses of growth，real-time ultrasound，carcass，and pork quality traits in Duroc andLandrace pigs，II.Heritabilities and correlation，J Anim Sci.，1992 Aug，70(8)2387-96)对猪肉品质的研究表明背最长肌的含水量与肉的嫩度、风味、整体可接受性呈负相关，而保水性与这三个性状呈正相关；肌肉剪切力值与所有感观品质呈较强的负遗传相关；肌内脂肪含量与所有感观品质呈较强的遗传相关，说明了肌内脂肪对感观品质有重要的作用。Gregory等(Gregory等，Genetic and phenotypic(co)variances forgrowth and carcass traits of purebred and composite populations of beef cattle，J Anim Sci.1995 Jul，73(7)1920-6)发现肉的大理石纹评分与背最长肌脂肪含量呈高度正遗传相关(rg＝0.98)，与嫩度呈较高的负遗传相关(rg＝-1.00)。
近10年来，分子遗传学和分子生物技术有了突飞猛进的发展，利用基因组扫描和候选基因策略在不同的资源家系里，已经鉴别了一些影响猪肉质性状的主效基因及QTLs等分子遗标标记。例如1)HAL基因、猪氟烷基因，是猪第6号染色体上影响肉质的主效基因(major gene)，Webb等(webb等，Role of the halothane test in pig improvement，Pig News and Information 1981，2(1)17-23)、Nystrom等(Nystrom等，Halothane gene effects on reproduction，production and organ weights inpigs，Acta Agric，Scandinavica Section A-Animal Sci，1993，43(4)201～206)；蒋思文等(蒋思文等.氟烷敏感性与繁殖性能关系的研究，中国畜牧杂志，1995年，第33卷，第5期，20-21)均有报道，氟烷基因型NN、Nn和nn之间在肉色、pH值、保水性都存在显著或极显著的差异，Nn的生产性能均介于NN和nn之间。
2)RN基因影响腌制火腿产量(Rendernent Napole yield)的肉质主效基因，包括突变的显性RN-和正常的隐性rn+两个等位基因，其中RN-对肉质具有显著的影响Le Roy等(Le Roy等，Evidence for a newmajor gene influencing meat quality in pigs，Genet Res，1990，Feb，55(1)33-40)，RN基因现已定位于猪的第15号染色体上。
3)CAST基因、钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)是一种特异的内源性钙激活蛋白酶(钙蛋白酶)抑制因子，参与肌肉生长和蛋白质更新过程，在各肉畜中显著影响肉嫩度。Ernst等(Ernst等，Mapping ofcalpastatin and three microsatellites to porcine chromosome 2q2.1-q2.4，Anim Genet，1998，Jun，29(3)212-5)在猪的2号染色体上发现5个与CAST基因连锁的微卫星标记(S0010、S0226、SW395、SW776和SW14)，进一步将其定位于2q2-q2.4。
4)其他基因，例如Paszek等(Paszek等，Livestock variation of linked microsatellite markers in diverseswine breeds，Anim Biotechnol，1998，9(1)55-66)初步认为15号染色体上存在肌肉嫩度的假定QTL，4号染色体上有与肉色和肉的硬度相关的基因区域(Rothschild，.Association of PIT1 polymorphisms with growth andcarcass traits in pigs，J Anim Sci，1995，May，73(5)1282-8)。
Fox基因即Forkhead，此名称来源于果蝇的“叉头突变”，这种突变导致肠的前后部发育缺陷。目前已发现90多个Fox基因，都具有Forkhead保守区，广泛存在于从酵母到哺乳类的真核生物中，形成了庞大的转录因子家族。位于PI3K/AKT信号通路下游的一系列的Foxo转录因子可以调节IGF-1的作用，它们属于forkhead转录因子的一部分.哺乳动物细胞含有该家族的三个成员，FOXO1(FKHR)，FOXO3A(FKHRLl)、FOXO4(AFX)(参见文献Tran等，The many forks in FOXO’s road.Science’s STKE，10.1126/stke，2003，172.re5)。AKT通过三个保守的氨基酸残基的磷酸化使这三个基因丧失功能，并使它们位于细胞质远离目标基因(Brunet等，Akt promotes cell survival by phosphorylating and inhibiting a Forkhead transcription factor，Cell 1999，96857-868)。Foxo因子的去磷酸化可以使它们进入核内，进而使细胞生长受阻，凋亡(Ramaswamy et al.A novel mechanism of gene regulation and tumor suppression by the transcriptionfactor FKHR.Cancer Cell 2002 281-91).目前，人、小鼠和大鼠FOXO3A基因的cDNA全长已被克隆和测序。人的FOXO3A基因，也就是forkhead box O3A它有两个不同的转录本，它被定位于人的6q21，基因组序列全长120，943bp。小鼠FOXO3A基因定位于10号染色体，cDNA序列长2,889bp，有4个外显子。大鼠FOXO3A基因cDNA全长为3,058bp。FOXO3A基因在人的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、子宫、胎盘、卵巢中都表达，在肌肉、卵巢、脾中表达量颇高；FOXO3A基因在小鼠的脾、胸腺中表达较高；该基因在大鼠中仅在胎盘和结肠中表达；对人、小鼠、大鼠的FOXO1、FOXO3A和FOXO4三个基因的氨基酸序列的比较分析结果表明这三个基因有很高的序列同源性，说明这三个基因是由一个祖先基因的重复(Duplication)产生的。
肉质性状的遗传力的估计除了受群体规模的影响外，还与群体的结构有很大关系，更重要的是肉质分析中肉质指标缺乏统一的分析标准，因此，各种肉质性状遗传力的估计值在国内外研究中都存在一定的差异。但从总体上看，不同肉质性状的遗传力差异明显，且基本上属于中等或偏低的遗传特性，从遗传上改良肉质品质是可行的。而且肉质性状间的遗传相关较高，在对肉质性状进行选择时，必须考虑它们之间的内在联系。
由于肉质的研究需要结合屠宰后的表型数据，使得这种研究相对生长性状和繁殖性状显得更为困难。但由于这种研究的结果一旦应用于实际生产将获得巨大的经济效益和社会效益。利用猪的生化指标和蛋白质的多态性与肉质性状间的相关，可以寻找有用的辅助选择遗传标记，从而为动物的早期选择及间接选择提供科学的参考依据。但生化指标因受环境和个体体况等多种偶然因素影响非常大，这就使得人们转向寻求更可靠遗传标记。
近年来，利用DNA标记定位畜禽经济性状的研究已全面展开，尤其在猪的生长、胴体品质等方面的研究已取得了重大的进展，但是利用分子标记对影响肌肉品质的QTL的研究还较少。因此，构建畜禽的基因图谱并寻找出与肉质性状QTL相连锁的分子遗传标记将是今后从分子水平研究肉质遗传行为的重要内容。综上所述，国内外育种工作者对猪肉质的遗传特性、遗传规律等方面都作了较全面的研究，尤其是进入九十年代以来，由于现代生物技术的不断发展，使得人们对重要经济性状的基因定位、寻找与经济性状相连锁的DNA标记以及利用DNA标记辅助选择成为可能。然而肉质的研究是一个十分复杂的问题，它受很多因素的影响，因此，我们必须深入研究猪肉肉质的遗传机制，探明它的遗传特性、遗传规律，才能在生产中培育出品质优良、经济性能良好的猪新品种或新品系。
发明内容
本发明的目的在于克隆猪肉质性状基因FOXO3A，寻找FOXO3A基因的突变位点以及作为猪肉质性状基因多态性的检测方法，为标记辅助育种提供一种有用的分子标记。
本发明是这样实现的一种猪肉质性状基因FOXO3A，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所述，该序列全长为1153bp，编码383个氨基酸。
所获得的FOXO3A基因cDNA序列中有1个如序列表SEQ ID NO1所述的T77-C77的碱基突变，导致AvaII-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)多态性。
一种制备猪肉质性状FOXO3A基因DNA序列的方法，它按照以下步骤用人FOXO3A基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得相似性90％以上的表达序列标签(EST)；然后拼接猪EST-重叠群；根据EST-重叠群设计2对引物，其中1对引物用于3’RACE扩增；另外1对引物用于PCR扩增，对获得的PCR产物纯化、克隆和测序，进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO1所述的DNA序列。
本申请人应用上述PCR-RFLP方法对猪FOXO3A基因第77位的碱基突变进行了检测。
以下对本发明作进一步的描述1、FOXO3A基因的3’非翻译区的克隆(1)引物设计用人FOXO3A基因cDNA(GenBank收录号NM_001455)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列相似性为90％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查询相应序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序构建猪EST-重叠群。根据EST拼接序列设计3’RACE引物，序列如下
外侧引物3’-RACE-F15’GACTTGGACCTGGACATGTTCAACGAG 3’巢式引物3’-RACE-F25’TCCATTATCCGTAGCGAACTCA 3’(2)RACE反应1)cDNA第一链的合成在0.5ml管中加入3′RACE cDNA第一链的合成的试剂，具体如下3′RACE3μl(1μg)总RNA，1μl 3′-CDS引物和1μl去离子水将上述试剂混匀后稍加离心，于70℃温育2min使总RNA二级结构消除，迅速置于冰上冷却2min，稍加离心将试剂集中到管底；往上述管中分别加入2μl 5×第一链缓冲液、1μl 20mmol/L DTT、1μl 10mmol/LdNTP和1μl PowerScript反转录酶，混匀并离心，于42℃温育1.5hr进行第一链的合成。反应结束后，加入100μl Tricine-EDTA缓冲液，在72℃加热7min，然后置于-20℃保存。
2)RACE-PCR方法建立在干净的0.5ml管中按表1所示的体系加入PCR主要试剂、引物及PCR模板DNA，总体积50μl。将所有成分混匀即可进行RACE-PCR。PCR扩增采用降落PCR程序，如下5个循环(94℃ 5s，72℃ 3min)，5个循环(94℃ 5s，70℃ 10s，72℃ 3min)，25个循环(94℃ 5s，68℃ 10s，72℃ 3min)。产物通过1.2％琼脂糖电泳检测。
表1PCR反应体系
(3)3’RACE产物的纯化、克隆和测序RACE产物的纯化在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml Ependorff管中，于70℃温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自Promega公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300μl融化的凝胶中加入1ml Resin(树脂)，混匀20s，将Resin/DNA混合物装入注射器，使浆液通过Minicolumn(装有树脂的小过滤柱)挤出。再在注射器中加入80％的异丙醇2ml，轻推活塞使异丙醇通过Minicolumn挤出，取下Minicolumn装入1.5ml Ependorff管中，10,000g离心2min以干燥Resin，将Minicolumn装入另一个干净的1.5ml Ependorff管中，加入30-50μl灭菌水，静置1min，10,000g离心20s，以洗脱DNA存于Ependorff管中。
连接反应将纯化PCR产物与pGEM-T载体(购自Promega公司)连接，连接反应总体积是5μl，其中包括2.5μl 2×buffer，0.5μl的T载体，0.5μl的纯化PCR产物，0.5μl的T4连接酶，最后加入1μl灭菌水置4℃水浴过夜。
感受态细胞的制备从37℃培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有30ml LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600达到0.3-0.4时，将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4℃ 4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30 min，重复4℃ 4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，置4℃保存备用。
转化无菌状态下取100-120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3-4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。
(4)DNA序列同源性检索鉴定通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。
2.物理定位(1)用于物理定位的引物序列是FOXO3A-PPL 5′-TGTTCATCCTCCTTCCCGTTGC-3′PR 5′-CACAGGCGTGAACGCTTGAGA-3′该引物扩增片段长度为95bp。
(2)用于物理定位的实验材料用猪×啮齿类体细胞杂种板(Pig×rodent somatic cell hybrid panel，SCHP)进行染色体区域定位，用美国Minnesota大学共同构建的猪辐射杂种板(INRA-Minnesota porcine radiation hybrid panel，IMpRH)进行染色体精确定位，两套体细胞杂种板均由法国Martin Yerle博士(Laboratoire de GénétiqueCellulaire，INRA，Castanet-Tolosan，France)惠赠。
其中SCHP包括27个体细胞杂种细胞系，1-19号是猪×仓鼠体细胞杂种细胞系，20-27号是猪×小鼠体细胞杂种细胞系，并以仓鼠、小鼠和猪基因组DNA作为阳性对照。经细胞遗传学鉴定该杂种板保留了猪的除Y染色体外的全部18条常染色体以及X染色体，其中含有127个非重叠的染色体区域，各细胞系中所包含的猪染色体及染色体片段信息可从WWW(http://www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/per/pcr.htm)获得。
IMpRH使用的辐射剂量是7,000-rad。IMpRH包括118个猪×仓鼠辐射杂种细胞系，以及仓鼠和猪基因组DNA阳性对照，用757个标记的鉴定结果表明IMpRH中的平均标记存留率为29.3％，包含有128个连锁群，覆盖了18对常染色体及X染色体，用于估计标记间距离的kb/cR比值是～70kb/cR(1Ray＝100cR)，理论分辨率是145kb。
(3)PCR分型条件进行扩增的PCR反应总体积为15μl，其中模板DNA为20ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.4μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是94℃ 3min，循环35次94℃ 30s，60℃ 30s，然后72℃ 20s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用3％琼脂糖凝胶电泳检测。
3.PCR-RFLP诊断方法建立(1)引物序列FOXO3APL1 5′-GGAGGTGATGTTGGAGTTGG-3′PR2 5′-CTGATATGATGAGCCGAAGG-3′该引物扩增片段长度423 bp。
(2)PCR扩增条件PCR反应总体积20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是94℃ 4min，循环34次94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 20s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。
(3)RFLP检测条件PCR产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 1μl，PCR产物3-5μl，限制性内切酶AvaII为0.5μl(5U)，用H2O补足10μl，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用3％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。
4.标记性状关联分析在利用我室组建的通城猪群做性状关联分析，219个DNA样品用于基因型检测。所分析的性状有部分生产性能，部分肉质性状。运用SAS Vergion8.1软件中GLM程序按以下模型进行基因型和性状间的关联分析，分析有两个步骤，先建立如下模型剔除所有系统效应Yijkl＝μ+Bi+Sj+Ck+εijkl其中，Yijkl是性状观察值，μ为总体均数，Bi为批次效应，Sj为性别效应，Ck为组合效应，εijkl为随机误差，假定服从N(0，σ2)分布。用最小二乘分析获得每一个体的残差，以残差做为新的性状值进一步进行基因型的单因素方差分析及多重比较检验。
Yij＝μ+GENOTYPEi+eij其中，Yij是性状观察值，μ为总体均数，GENOTYPEi为基因型效应，eij为随机误差本发明的效果是1、猪FOXO3A基因的3′RACE克隆结果以cDNA第一链为模板，用3′RACE外侧引物进行PCR扩增，再用第一轮的扩增产物做模板，用3′RACE巢式引物进行扩增，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果显述为特异的PCR产物(如图4所述)。将3′RACE产物回收纯化后克隆测序，测序结果显示该片段长度为1042bp。
2、猪FOXO3A基因的定位结果用FOXO3A-P引物在SCHP中分型结果表明，19个猪×中国仓鼠体细胞杂种细胞系(1-19号)中，2、4、7-9、16、18、19号出现与猪基因组DNA阳性对照扩增一致的95bp的目的片段，而在8个猪×小鼠体细胞杂种细胞系(20-27号)中，22、24、25号杂种细胞系均扩增得到95bp的目的片段。将上述实际观测的PCR分型数据提交给HybWeb(http://www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/pcr/pcr.htm)进行统计分析以获得区域定位信息，数据分析结果是FOXO3A基因定位于猪1号染色体上(P＝1.000)，进一步的区域定位结果为SSC 1p13(P＝0.8901，与该区域标记间的相关系数为0.8528，P＜0.1％)。
用FOXO3A-P引物在IMpRH分型结果是0000000011 0100000110 0010101001 0000000001 00000010000100000111 0100000010 1010000000 0000101011 0001000011 0010100010 11011111(其中0和1分别表述扩增结果为阴性和阳性)。统计分析结果，FOXO3A基因与猪1号染色体上的SW301紧密连锁，LOD值为14.72，RH图距是0.26Ray，其次与SW781紧密连锁，LOD值为10.08，RH图距是0.42Ray，进一步证实该基因位于猪1号染色体上。
3、PCR-RFLP诊断方法建立用FOXO3A-PL1和FOXO3A-PR1扩增猪基因组DNA得到1153bp特异扩增片段，包括部分外显子2序列(详见图3)。测序的结果发现在该1153bp片段中存在AvaII酶切位点(G*G(A/T)CC)，其中第77bp处为多态性切点，位于外显子2中，其编码氨基酸为苏氨酸，用FOXO3A-PL1和FOXO3A-PR2扩增猪的FOXO3A基因获得长度为423bp的PCR产物，酶切产生三种基因型，基因型BB型有347bp和76bp两条带，AA型只有423bp的一条带，杂合子AB型有423bp，347bp和76bp三条带。(其中76bp的条带在图中看不到)4、标记性状关联分析对猪FOXO3A基因第2外显子AvaII-RFLP多态性位点与部分胴体、肉质性状进行关联分析，基因型检测结果表明在219个个体中AA基因型有93个，AB基因型有108个，BB基因型有17个(由于个别测定性状的数据缺失，因此得到的实际值如表2所示)，所得到相关的性状是胴体斜长、6-7膘厚、滴水损失。
由表2可知，A等位基因是胴体斜长和6-7膘厚性状的有利标记(胴体长、背膘薄)，M基因型标记可用于同时提高体长和降低背膘厚的选择标记。
表2FOXO3A基因多态性对胴体斜长、6-7膘厚、滴水损失的影响
注小写字母表不5％水平差异显著，大写字母表不1％水平差异极显著
序列表SEQ ID NO1是本发明与猪肉质性状相关的FOXO3A基因cDNA序列。
图1是本发明关于FOXO3A基因制备的流程图。
图2是本发明中猪FOXO3A基因3’非翻译区序列。图中定位引物FOXO3A-PPL，PR的序列用边框显示。
图3是本发明中猪FOXO3A基因DNA序列，扩增引物序列FOXO3APL1，PR1，PR2用下划线标注。
图4是本发明中猪FOXO3A基因3’RACE的扩增结果的电泳图谱(琼脂糖胶浓度为1.5％)。图中M泳道DNA分子量标记(2000bp ladder)图5是本发明中猪FOXO3A基因第二外显子的扩增序列的电泳图谱，片段大小为1153bp。图中M泳道DNA分子量标记(100bp ladder)图6是本发明中猪FOXO3A基因第二外显子的AvaII-RFLP的三种基因型(AA AB BB)电泳图谱。图中M泳道DNA分子量标准(100bp ladder)具体实施方式
实施例1PCR-RFLP-AvaII多态性在各猪品种中的分布情况利用PCR-AvaII-RFLP检测了六个猪种其中属于中国地方血缘的猪种分别是小梅山，通城猪，大花自猪，江西玉山猪，属于外来的例如欧美血缘的猪种分别是杜洛克猪和大白猪，这些猪种基本涵盖各猪种的基因型。试验使用的猪种的基因频率如表3所示，发现玉山猪中等位基因A和等位基因B的频率接近，其余几个猪种均等位基因A占优势。
表3FOXO3A基因PCR产物基因型频率及基因频率
几个品种间基因型频率的卡方检验结果如表4。x2检验六个猪种间基因型频率差异性发现，通城猪和玉山猪存在显著差异与大花白存在极显著差异，大白和小梅山存在显著差异与杜洛克存在极显著差异！表4FOXO3A基因的PCR-AvaII-RFLP基因型分布x2检验结果
注肩注*表述P＜0.05；肩注**表述P＜0.01Note*indicates P＜0.05；**indicates P＜0.01实施例2猪标记性状关联分析对猪FOXO3A基因第2外显子AvaII-RFLP多态性位点与部分胴体、肉质性状进行关联分析，基因型检测结果表明在219个个体中AA基因型有93个，AB基因型有108个个体，BB基因型有17个(由于个别测定性状的数据缺失，因此得到的实际值如表5所示)，在与部分生产性状进行关联分析中，所分析的性状有部分生产性状和肉质性状，所相关的性状是胴体斜长、6-7膘厚、滴水损失。
由表5可知，A等位基因是胴体斜长和6-7膘厚性状的有利标记(胴体长、背膘薄)，AA基因型标记可用于同时提高体长和降低背膘厚的选择标记。
表5FOXO3A基因多态性对胴体斜长、6-7膘厚、滴水损失的影响
注小写字母表示5％水平差异显著，大写字母表示1％水平差异极显著序列表<110>华中农业大学<120>猪肉质性状FOXO3A基因的克隆及其应用<130>
<141>2005-11-28<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1153<212>DNA<213>猪(Sus scrofa)<220>
<221>CDS<222>(3)..(1151)<223>
<220>
<221>mutation<222>(77)..(77)<223>
<400>1ca gac gac agt ccc tcc cag ctc tcc aag tgg ccc ggc agc ccc acg47Asp Asp Ser Pro Ser Gln Leu Ser Lys Trp Pro Gly Ser Pro Thr1 5 10 15tcc cgc agc agc gat gag ctg gac gcc tgg aca gac ttc cgc tcg cgc 95Ser Arg Ser Ser Asp Glu Leu Asp Ala Trp Thr Asp Phe Arg Ser Arg20 25 30acc aat tcc aac gcc agc acg gtc agc ggc cgc ctg tcc ccc arc ctg 143Thr Asn Ser Asn Ala Ser Thr Val Ser Gly Arg Leu Ser Pro Ile Leu35 40 45gcc agc aca gag ttg gat gac gtc cag gat gac gac gcg ccg crc tcc 191Ala Ser Thr Glu Leu Asp Asp Val Gin Asp Asp Asp Ala Pro Leu Ser50 55 60ccc atg ctc tac agc agc tcg gcc agc ctg tcc ccc tcg gtc agt aag 239Pro Met Leu Tyr Ser Ser Ser Ala Ser Leu Ser Pro Ser Val Ser Lys65 70 75ccc tgc acc gtg gag ctg ccc cgg ctg acc gac atg gcc gga acc atg 287Pro Cys Thr Val Glu Leu Pro Arg Leu Thr Asp Met Ala Gly Thr Met80 85 90 95
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权利要求
1.一种猪肉质性状基因FOXO3A，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
2.根据权利要求1所述的基因，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
3.根据权利要求1所述的cDNA序列，其特征在于所获得的FOXO3A基因序列长度为1153bp，编码383个氨基酸。
4.根据权利要求1所述的cDNA序列，其特征在于所获得的FOXO3A基因cDNA序列中有1个如序列表SEQ ID NO1所述的T77-C77的碱基突变，导致AvaII-RFLP多态性。
5.制备如权利要求1或2所述的DNA序列的方法，按照以下步骤用人FOXOSA基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得相似性90％以上的表达序列标签(EST)，然后拼接猪EST-重叠群，根据EST-重叠群设计2对引物，其中1对引物用于3’RACE扩增；另外1对引物用于PCR扩增，对获得的PCR产物纯化、克隆和测序，进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO1所述的DNA序列。
6.应用PCR-RFLP方法检测猪FOXO3A基因第77位的碱基突变。
全文摘要
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及猪FOXO3A基因的克隆以及作为分子标记的应用。本发明克隆的猪肉质性状基因FOXO3A序列如SEQ ID NO1所示，序列长度为1153bp，编码383个氨基酸。在SEQ ID NO1序列中有1个如序列表所示的T77－C77的碱基突变，从而导致AvaII－RFLP多态性，可以应用于猪肉质性状的关联分析。本发明克隆的基因为猪的标记辅助育种提供了新的分子标记。
文档编号C07K14/47GK1978641SQ20051001991
公开日2007年6月13日 申请日期2005年11月29日 优先权日2005年11月29日
发明者赵书红, 于晶, 朱猛进, 李奎, 刘榜, 樊斌, 余梅, 李长春 申请人:华中农业大学