专利名称：一种用栀子果实制备高纯度栀子苷的方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是一种从栀子果实中制备高纯度栀子苷的方法。
背景技术：
栀子又名山栀子，是茜草科植物山栀Gardenia jasminoides Ellis.的果实，性苦寒，无毒。栀子始载于《神农本草经》，具有利胆、促胰腺分泌、降压、镇静、降温、抗菌抗炎作用。栀子的主要化学成分为环烯醚萜、黄酮、三萜、有机酸酯等，此外还有d-甘露醇、甾醇类、三萜皂苷类、长链烷烃、醇以及色素等，其中环烯醚萜苷类化合物为其主要活性成分如栀子苷、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、羟异栀子苷、栀子新苷、鸡矢藤次苷甲酯、去乙酰基车前草酸甲酯、栀子苷酸、栀子素等[王钢力，陈德昌等.栀子属植物化学成分研究进展.中国中药杂志，1996，21(2)67；黄胜阳.中国栀子属植物的研究概况.江西中医学院学报，1991，3(1)59]。栀子苷(geniposide)是主要的环烯醚萜苷化合物，是栀子的重要有效成分，结构式如下 栀子苷目前，国内外用栀子果实制备栀子苷时多采用柱层析、重结晶等传统方法分离纯化栀子苷，如硅胶柱层析、氧化铝柱层析和薄层色谱等[Inouye H，et al.Chem Pharm Bull.1970，18(5)1066；Inouye H，et al.Phytochemistry.1974，132219；Endo T，et al.Chem Pharm Bull.1973，21(12)2684；李立荣.TLC及柱层析分离栀子苷的比较.中成药.1999，21(12)645]，这类方法或需使用有毒有机溶剂，如氯仿、甲醇，会造成环境污染；或成本高且操作繁琐，如中性氧化铝填料，价格昂贵。虽然也可以采用制备液相色谱法制备栀子苷[王兰，张鉴.RP-HPLC制备色谱法分离栀子苷单体.2003，25(9)764]，但其前处理方法操作繁琐，不适合大规模工业生产。有文献报道采用大孔吸附树脂分离栀子苷成本低，不造成环境污染[吕茂平，乔庆彬等.大孔树脂对栀子苷分离效果的研究.2002，33(9)794；CN 1546507A“一种栀子提取物及其制备工艺和它的应用”；金日显，郭春燕等.大孔吸附树脂法富集栀子中栀子苷的工艺研究.2005，11(3)1]，但目前常用的洗脱方式有两种，一为以水洗脱后直接以高浓度乙醇洗脱，不仅无法去除极性稍强于栀子苷的环烯醚萜苷类成分，而且弱极性杂质残留较多；二为不经水洗直接以低浓度乙醇洗脱后再用高浓度乙醇洗脱，不仅无法去除水溶性杂质，而且同样会引入较多弱极性杂质。因此，现有方法获得的栀子苷纯度较低，仍需借助上述传统的分离方法进一步纯化，在生产上的应用有一定的局限性。
发明内容
本发明提供一种制备工艺简单、低成本且对环境无污染的从栀子果实中制备高纯度栀子苷的方法。
本发明根据栀子苷在环烯醚萜苷类成分中相对极性较弱的特点，用大孔吸附树脂纯化栀子果实粗提物时，先用大量水和10％乙醇洗去杂质及极性大的环烯醚萜苷类成分，再用20％～30％乙醇选择性洗脱栀子苷以减少高浓度乙醇洗脱所引入的弱极性杂质及其它环烯醚萜苷类成分。事实证明，这种简单的制备方法所获得的栀子苷纯度很高，避免了借助其它方法分离纯化而造成的环境污染。
本发明方法包括如下步骤(1)制备栀子果实粗提物按常规将干燥栀子果实粗粉以水或乙醇水溶液浸泡或回流提取1～3次，过滤，将滤液减压浓缩至稀浸膏，再真空干燥得栀子果实粗提物，得率为25％～30％。
(2)制备栀子苷将上述制得的栀子果实粗提物加适量水混悬后，过大孔吸附树脂柱。先分别用水及10％乙醇充分洗脱至洗脱液无色，水和10％乙醇的洗脱体积通常不少于4倍树脂量，弃去洗脱液，再用20％～30％低浓度乙醇洗脱，收集此洗脱液，减压浓缩干燥，即得栀子苷粉末。采用高效液相色谱(HPLC)法对该粉末进行纯度检测(峰而积归一化法)测得栀子苷纯度高于98％，得率为0.5％～1.5％。并进行MS、1HNMR和13CNMR分析，根据所得数据进行结构确认，证明为栀子苷。
本发明采用大孔吸附树脂仅以水和低浓度乙醇洗脱，成本低廉，对环境不造成污染，在洗脱过程中通过水及10％乙醇梯度洗脱，按极性大小依次除去极性强于栀子苷的环烯醚萜苷类化合物及杂质，最后以不高于30％的低浓度乙醇选择性洗脱栀子苷，减少弱极性杂质的干扰，无需进一步纯化即可得到纯度高于98％的栀子苷，制备工艺简单，适合工业化生产。
图1为本发明栀子苷的高效液相色谱(HPLC)的色谱图
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明进行详细描述。
实施例11.制备栀子果实粗提物取干燥栀子果实药材粗粉500g，用10倍量50％乙醇回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至稀浸膏，真空干燥得栀子果实粗提物，得率为26.6％。
2.纯化取上述栀子果实粗提物，加水混悬后总体积为2000ml。加入到装有1500g经预处理过的1300大孔吸附树脂层析柱上，上样完毕后吸附2小时。用6000ml水洗脱(弃去)。再用8000ml 10％乙醇洗脱(弃去)，最后用6000ml 20％乙醇洗脱，20％乙醇洗脱流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得栀子苷棕色粉末6.42g，得率为1.3％。采用高效液相色谱(HPLC)法对该粉末进行纯度检测(峰面积归一化法)测得栀子苷纯度为98.9％。并进行MS、1HNMR和13CNMR分析，根据所得数据进行结构确认。HPLC分析条件为色谱柱Lichrospher C18(4.6×250mm i.d.5μm)；流动相为乙腈∶1％醋酸水溶液＝10∶90；流速0.9ml/min；柱温25℃，检测波长238nm。在此条件下栀子苷的高效液相色谱图见图1，峰1为栀子苷。结构鉴定对分离得到的栀子苷在Varian INOVA-500型核磁共振仪和Varian MAT-212型质谱仪上，进行MS、1HNMR和13CNMR分析，结果为UVλmax(nm MeOH)239。ESI-MS389(M+1)，227，209(M-glu)。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ5.12(1H，d，J＝7.0Hz，H-1)，7.5(1H，brs，H-3)，5.6(1H，brs，H-7)，4.2(1H，d，J＝15.0Hz，H-10)，4.0(1H，d，J＝14.0Hz，H-10)，3.6(3H，s，H-12)，4.53(1H，d，J＝8.0Hz，H-1′)。13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ95.7(C-1)，151.5(C-3)，110.9(C-4)，45.9(C-5)，37.9(C-6)，125.4(C-7)，144.1(C-8)，51(C-9)，59.3(C-10)，166.9(C-11)，34.4(C-12)，98.6(C-1′)，73.3(C-2′)，77.2(C-3′)，70(C-4′)，76.6(C-5′)，61(C-6′)。经结构解析确认为栀子苷。
实施例21.制备栀子果实粗提物取干燥栀子果实药材粗粉500g，用10倍量水回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至稀浸膏，真空干燥得栀子果实粗提物，得率为28.7％。
2.纯化取上述栀子果实粗提物，加水混悬后总体积为2000ml。加入到装有1500g经预处理过的1300大孔吸附树脂层析柱上，上样完毕后吸附2小时。用6000ml水洗脱(弃去)。再用8000ml 10％乙醇洗脱(弃去)，最后用4000ml 30％乙醇洗脱，30％乙醇洗脱流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得栀子苷棕色粉末7.48g，得率为1.5％。采用高效液相色谱(HPLC)法对该粉末进行纯度检测(峰面积归一化法)测得栀子苷纯度为98.0％。栀子苷结构鉴定方法、步骤及其结果同实施例1。
实施例31.制备栀子果实粗提物取干燥栀子果实药材粗粉500g，用10倍量50％乙醇浸泡提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至稀浸膏，真空干燥得栀子果实粗提物，得率为20.3％。
2.纯化取上述栀子果实粗提物，加水混悬后总体积为2000ml。加入到装有1500g经预处理过的AB-8大孔吸附树脂层析柱上，上样完毕后吸附2小时。用6000ml水洗脱(弃去)。再用8000ml 10％乙醇洗脱(弃去)，最后用6000ml 20％乙醇洗脱，20％乙醇洗脱流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得栀子苷棕色粉末5.36g，得率为1.1％。采用高效液相色谱(HPLC)法对该粉末进行纯度检测(峰面积归一化法)测得栀子苷纯度为98.7％。栀子苷结构鉴定方法、步骤及其结果同实施例1。
实施例41.制备栀子果实粗提物取干燥栀子果实药材粗粉500g，用10倍量50％乙醇回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至稀浸膏，真空干燥得栀子果实粗提物，得率为26.6％。
2.纯化取上述栀子果实粗提物，加水混悬后总体积为2000ml。加入到装有1500g经预处理过的D101大孔吸附树脂层析柱上，上样完毕后吸附2小时。用7000ml水洗脱(弃去)。再用8000ml 10％乙醇洗脱(弃去)，最后用5000ml 20％乙醇洗脱，20％乙醇洗脱流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得栀子苷棕色粉末6.23g，得率为1.2％。采用高效液相色谱(HPLC)法对该粉末进行纯度检测(峰面积归一化法)测得栀子苷纯度为98.8％。栀子苷结构鉴定方法、步骤及其结果同实施例1。
权利要求
1.一种用栀子果实制备栀子苷的方法，包括如下步骤(1)制备栀子果实粗提物按常规将干燥栀子果实粗粉以水或乙醇水溶液浸泡或回流提取1～3次，过滤，将滤液减压浓缩至稀浸膏，再真空干燥得栀子果实粗提物；(2)纯化将上述制得的栀子果实粗提物加适量水混悬后，过大孔吸附树脂，先分别用水及10％乙醇充分洗脱至洗脱液无色，弃去洗脱液，再用20％～30％低浓度乙醇洗脱，收集此洗脱液，减压浓缩干燥，即得栀子苷。
2.按权利要求1所述的用栀子果实制备栀子苷的方法，其特征在于制备栀子果实粗提物时，用50％乙醇回流提取。
3.按权利要求1或2所述的用栀子果实制备栀子苷的方法，其特征在于纯化时，水和10％乙醇的洗脱体积均不少于4倍树脂量。
4.按权利要求1或2所述的用栀子果实制备栀子苷的方法，其特征在于纯化时，所说的低浓度乙醇为20％乙醇。
5.按权利要求3所述的用栀子果实制备栀子苷的方法，其特征在于纯化时，所说的低浓度乙醇为20％乙醇。
6.按权利要求1或2或5所述的用栀子果实制备栀子苷的方法，其特征在于所说的大孔吸附树脂为1300或D101或AB-8型大孔吸附树脂。
7.按权利要求3所述的用栀子果实制备栀子苷的方法，其特征在于所说的大孔吸附树脂为1300或D101或AB-8型大孔吸附树脂。
8.按权利要求4所述的用栀子果实制备栀子苷的方法，其特征在于所说的大孔吸附树脂为1300或D101或AB-8型大孔吸附树脂。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是一种用栀子果实制备栀子苷的方法，包括用水或乙醇水溶液浸泡或回流制备栀子果实粗提物，再采用大孔吸附树脂分别用大量水及10％乙醇充分洗脱除去强极性环烯醚萜苷类成分及杂质，再用低浓度乙醇选择性洗脱栀子苷，减压浓缩后得高纯度栀子苷。本发明制备方法操作简便，成本低廉，产品纯度高、得率高，不污染环境，适于工业化生产。
文档编号C07H17/04GK1706859SQ20051002614
公开日2005年12月14日 申请日期2005年5月24日 优先权日2005年5月24日
发明者范国荣, 周婷婷, 柴逸峰, 吴玉田, 洪战英 申请人:中国人民解放军第二军医大学