专利名称：Sars病毒抗原s6－1的高特异性抗体的快速制备方法
技术领域：
本发明涉及一种高特异性抗体快速制备的方法，特别涉及一种SARS病毒抗原S6-1的抗体的快速制备方法。它是，并以蛋白A亲和层析柱为分离方式，属分子生物学及抗体制备技术领域。。
背景技术：
烟草花叶病毒——TMV由6395个碱基组成的3种亚基因组mRNA至少编码4种蛋白病毒复制必需的两个非结构蛋白——126K和180K蛋白；参与病毒在宿主细胞间运输的30K蛋白和与病毒组装、在宿主体内长距离运输及与寄生间相互作用有关的17.6K外壳蛋白(Coat Protein，CP)。烟草花叶病毒能在侵染植物细胞中大量积累，其外壳蛋白(CP)在烟草总蛋白中具有高达7％的表达量，因此烟草花叶病毒具有作为表达载体的强大潜力。在利用烟草花叶病毒表达外源肽的策略中，大多是在烟草花叶病毒的外壳蛋白羧端151到155之间的某一位点采取融合的方式表达抗原短肽。提取融合后的烟草花叶病毒外壳蛋白，通过动物的静脉注射，获得多克隆抗体。
SARS病毒是一种新近发现的冠状病毒，其表面蛋白可与细胞上的相应受体结合，导致人类发生严重急性呼吸道综合征(SARS)。S6-1为SARS病毒表面蛋白上的一段长为12个氨基酸的肽段，其序列为SARS病毒上一个抗原决定簇。通过将S6-1序列融合到烟草花叶病毒外壳蛋白上，通过免疫动物，纯化多克隆抗体等实验，进而得到相对应的S6-1的抗体。
目前最常用的高特异性抗体制备方法是采用杂交瘤技术制备单克隆抗体将目的抗原免疫注射动物，使之产生致敏B淋巴细胞后，采用细胞融合技术形成杂交瘤细胞；将融合的杂交瘤细胞进行筛选，得到杂交瘤阳性克隆再进一步筛选与克隆化，最终采用动物体内诱生法或体外培养法大量制备单克隆抗体。相对来说这样通过制备单克隆抗体得到的高特异性抗体，具有操作步骤多，操作技术要求高，周期长等不利因素。同时造成了单克隆抗体的制备成本增高。
发明内容
本发明的目的在于通过将融合了外源序列的TMV CP-S6-1免疫动物得到多克隆抗体，多克隆抗体通过交叉吸附实验的方法提供一种经济、快捷、准确并且易于普及推广的SARS病毒抗原S6-1的抗体的快速制备方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案本发明一种SARS病毒抗原S6-1的抗体的快速制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤a)多克隆抗体的制备i.融合SARS病毒抗原S6-1的TMV重组病毒的构建；ii.抗原的制备采用TMV-S6-1重组病毒的融合S6-1的CP制备抗原TMVCP-S6-1；iii.将抗原TMV CP-S6-1免疫家兔，免疫后，抽取兔抗血清备用b)通过交叉吸附实验获得高特异性抗体，具体步骤如下i.制备交叉吸附需要的蛋白丙酮粉，制备蛋白丙酮粉的蛋白来源有两个烟草总蛋白和野生型烟草花叶病毒外壳蛋白，分别得到烟草蛋白丙酮粉和野生型烟草花叶病毒外壳蛋蛋白丙酮粉；ii.蛋白丙酮粉吸附兔抗血清(1)取步骤A中c所得到的兔抗血清置入eppendorf管中，加入烟草蛋白丙酮粉均匀混合，烟草蛋白丙酮粉与兔抗血清的重量体积比为1∶50-1∶25；然后在冰上轻弹30min-45min，静置于冰箱内过夜；之后，于4℃下离心分离，将上清移至新的eppendorf管中，得到烟草蛋白丙酮粉处理后的抗体X；(2)取经过上述步骤(1)烟草蛋白丙酮粉处理后的抗体X置入eppendorf管中，加入野生型烟草花叶病毒外壳蛋白丙酮粉均匀混合，野生型烟草花叶病毒外壳蛋白丙酮粉与抗体的重量体积比为1∶50-1∶25；在冰上轻弹30min-45min，静置于冰箱内过夜；之后，于4℃下离心分离，将上清移至新的eppendorf管中，得到另一种抗体Y；iii.Protein A亲和层析柱纯化抗体Y，得到抗体Anti-S6-1。
上述的抗原的制备的具体步骤为a.TMV重组病毒粒子经稀释后，混以金刚砂，采用机械摩擦法接种烟草Nicotiana tabacum cv.samsun幼苗；病毒接种烟草14-21天后，收获烟草叶片用于大量病毒粒子提取；b.将上述的烟草叶片加入病毒提取液，即0.5M磷酸缓冲液，1mM EDTA，pH7.2，经研磨后，过滤除渣，于4℃离心分离；
c.取上清液，在上清中加入正丁醇或氯仿至终体积浓度为8％±0.1％，控制溶液温度为3℃-5℃，搅拌30min-45min，于4℃离心分离；d.取水相，加入PEG 6000至浓度5％±0.1％，NaCl至浓度5％±0.1％，控制溶液温度为3℃-5℃，混匀30min-45min，于4℃离心分离；e.取沉淀物，将该沉淀的病毒粒子悬浮于病毒储存液，即50mM磷酸缓冲液，1mM EDTA，pH7.2中，于4℃离心分离；f.取上清液，加入PEG 6000至终浓度5％，NaCl至5％，3℃-5℃静置30min-45min，离心分离；将沉淀物悬浮于病毒储存液，即50mM磷酸缓冲液，1mM EDTA，pH7.2中，于4℃离心分离；取上清液，即为纯化的病毒粒子，即抗原TMVCP，可于4℃下长期保存；g.取上述步骤f中所得抗原TMV CP-S6-1，加入2倍体积冰醋酸解离，混匀后冰上放置10min-15min，于4℃，离心分离10min-15min。上清加入等体积蒸馏水，0℃±0.5℃放置1hr。
h.蒸馏水透析2天，其间换水三次；在透析后的样品中加入少量3M NaAc，pH为4.7，使抗原TMV CP进一步聚集，于4℃，36,000rpm离心分离10hr。
i.取沉淀悬浮于pH8.0，I＝0.1的Tris-Cl溶液中，悬浮液在pH5.0，I＝0.1的NaAc溶液中再次透析过夜；析得到的抗原TMV CP-S6-1悬液可于4℃下长期保存备用。
上述的抗原TMV CP-S6-1免疫家兔的方法是取10mg±0.5mg抗原TMV CP-S6-1皮下注射一头家兔，以后的20天内，每隔10天采用同样的免疫方法和剂量加强免疫该家兔两次；第三次免疫后两周，抽取兔血清备用。
上述的蛋白丙酮粉的制备方法是取烟草叶片碾磨成泥状，移至离心管内；或者取野生型烟草花叶病毒粒子溶液移至离心管内；加入5倍体积的-20℃预冷的冷丙酮，在漩涡振荡器上振荡20s-30s，使得丙酮和样品充分混合，于4℃下以12000g的速度离心，取其沉淀物，反复上述操作数次至沉淀物呈白色，将沉淀物在通风橱内干燥，最后制成粉状，即为烟草蛋白丙酮粉或者野生型烟草花叶病毒外壳蛋蛋白丙酮粉。
上述的Protein A亲和层析柱纯化抗体Y的方法是Protein A亲和层析柱和各种缓冲器buffer，缓慢升至室温，同时将抗体Y与Binding Buffer按1∶1-1∶2的比例混匀；取5-6倍体积的Binding Buffer注入Protein A亲和层析柱以平衡Protein A柱；将抗体Y注入Protein A亲和层析柱，静置5min-6min；取10～15倍体积Binding Buffer洗去柱上未结合的杂抗体，用eppendorf管收集洗液；取3～5倍体积的Elution Buffer洗脱柱上的抗体，用eppendorf管收集洗液，所得洗液即为Anti-S6-1。
同现有技术相比，本发明方法具有如下显而易见的特点和突出的优点本发明方法具有快捷、经济，产量高，准确度高等并且易于推广普及。本发明方法操作简单，实验需要的周期短，同时由于以TMV为载体可以融合表达多种外源肽，因此，采用此方法可以有效地应用于其他抗体的制备。
图1SDS-PAGE及Western免疫杂交结果图1A为SDS-PAGE凝胶电泳结果，lane2为wtCP，lane3为CP-S6-1，lane4为wtCP与CP-S6-1的混合蛋白；图1B为以Anti-wtCP为一抗的western杂交结果，lane1为wtCP，lane2为CP-S6-1，lane3为混合蛋白；图1C为以经俩次交叉吸附得到的抗体Anti-S6-1为一抗的western杂交结果，lane1为wtCP，lane2为CP-S6-1，lane3为混合蛋白。
具体实施例方式实施例一一.多克隆抗体的制备1.融合外源肽S6-1的TMV重组病毒的构建TMV-S6-1重组病毒的构建方法见ZL00111491.3号专利。
2.抗原的制备本发明使用TMV-S6-1重组病毒的融合S6-1的CP作为抗原免疫动物以得到多克隆抗体。
(1).TMV-S6-1重组病毒粒子经适当稀释后，混以少量金刚砂，采用机械摩擦法接种一定数量的烟草Nicotiana tabacum cv.samsun幼苗。病毒接种烟草约2周后，收获烟草叶片用于大量病毒粒子提取。
(2)取100g±5g上述处理后的烟草叶片加入100ml病毒提取液(0.5M磷酸缓冲液，1mM EDTA，pH7.2)，研磨后，以4层纱布过滤除渣。5000g离心15min。
(3).在上清中加入氯仿至终体积8％±0.1％，3℃-5℃下，搅拌30min-45min。于4℃，8000g离心30min-35min。
(4).取水相，加入PEG 6000至终浓度5％±0.1％，NaCl至5％±0.1％，4℃，混匀30min。于4℃，8000g离心15min。
(5).沉淀的病毒粒子悬浮于20ml病毒储存液(50mM磷酸缓冲液，1mMEDTA，pH7.2)中。于4℃，8000g离心15min。
(6).上清中加入PEG 6000至终浓度5％±0.1％，NaCl至5％±0.1％，4℃静置30min。沉淀悬浮于约2ml病毒储存液(50mM磷酸缓冲液，1mM EDTA，pH7.2)中。于4℃，8000g离心15min。上清即为纯化的病毒粒子，即抗原(可于4℃下长期保存)。
(7).取50μg左右TMV-S6-1样品，加入2倍体积冰醋酸解离，混匀后冰上放置10min，于4℃，3000g离心10min。上清加入等体积蒸馏水，0℃±0.5℃放置1hrr。
(8).蒸馏水透析2天，其间换水三次。在透析后的样品中加入少量3MNaAc(pH4.7)使TMV CP-S6-1进一步聚集。4℃，36,000rpm离心10hr。
(9).沉淀悬浮于pH8.0，I＝0.1的Tris-Cl溶液中，悬浮液在pH5.0，I＝0.1的NaAc溶液中再次透析过夜。透析得到的CP-S6-1悬液可于4℃下长期保存备用。
3.抗原免疫家兔(1)取约10mg±0.5mg CP-S6-1皮下注射一头家兔。
(2)以后的20天内，每隔10天采用同样的免疫方法和剂量加强免疫该家兔两次。
(3)第三次免疫后两周，抽取兔血清备用。
二.通过交叉吸附实验获得高特异性抗体1.制备交叉吸附需要的蛋白丙酮粉，制备蛋白丙酮粉的蛋白来源有俩个——烟草总蛋白和野生型烟草花叶病毒外壳蛋白(1).烟草蛋白丙酮粉的制备取烟草叶片若干克，碾磨成泥状，取5ml±0.5ml的烟草泥状样品移至50ml的离心管内，加入5倍体积的冷丙酮(-20℃预冷)，在漩涡振荡器上振荡20s，使得丙酮和样品充分混合，于4℃下以12000g的速度离心，取其沉淀物，反复上述操作数次至沉淀物呈白色，将沉淀物在通风橱内干燥，最后制成粉状。
(2).野生型烟草花叶病毒外壳蛋白丙酮粉的制备取浓度为50μg/μl野生型烟草花叶病毒粒子溶液5ml±0.5ml，移至50ml的离心管内，加入5倍体积的冷丙酮(-20℃预冷)，在漩涡振荡器上振荡20s，使得丙酮和样品充分混合，于4℃下以12000g的速度离心，其沉淀物为白色，将沉淀物在通风橱内干燥，最后制成粉状。
2.蛋白丙酮粉吸附兔抗血清(1).烟草蛋白丙酮粉进行交叉吸附实验取约1ml兔抗血清置入1.5μl eppendorf管中，加入2％(w/v)的烟草蛋白丙酮粉均匀混合后，于在冰上轻弹30min，静置于4℃冰箱内过夜；之后，于4℃下以12000g的速度离心，将上清移至新的eppendorf管中，得到烟草蛋白丙酮粉处理后的抗体X。
(2).野生型烟草花叶病毒外壳蛋白丙酮粉进行交叉吸附实验取经过烟草蛋白丙酮粉处理后的抗体约1ml，置入1.5μl eppendorf管中，加入2％(w/v)的野生型烟草花叶病毒外壳蛋蛋白丙酮粉均匀混合后，于在冰上轻弹30min，静置于4℃冰箱内过夜；之后，于4℃下以12000g的速度离心，将上清移至新的eppendorf管中，得到另一种抗体Y。
3.Protein A亲和层析柱纯化抗体，本实验使用的ImmunoPure ImmobilizedProtein A购自PIERCE公司(1).使用亲和层析柱纯化抗体YProtein A亲和层析柱和各种buffer(缓慢升至室温)，同时将抗体样品与Binding Buffer按1∶1的比例混匀；取5倍体积的Binding Buffer注入Protein A亲和层析柱以平衡Protein A柱；将样品注入Protein A亲和层析柱，静置5min；取10倍体积Binding Buffer洗去柱上未结合的抗体，用1.5μleppendorf管收集洗液；取3倍体积的Elution Buffer洗脱柱上的抗体，用1.5μl eppendorf管收集洗液。
(2).亲和层析柱的回收于Protein A亲和层析柱中加入6倍体积的Elution Buffer，待其快流干时加入5ml±0.5ml Storage Buffer，当只剩3ml±0.1ml Storage Buffer处于Protein A柱上端时，先封底盖，后封顶盖；三.高特异性抗体的效果测定；兔抗血清经过蛋白丙酮粉的交叉吸附，以及Protein A亲和层析柱纯化后得到抗体Anti-S6-1。采用ELISA间接法测定该种抗体的效价，western杂交实验对抗体的特异性进行检测。
1.ELISA间接法(1).预处理抗原样品用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)包被液将样品抗原配置成5.0±0.1ng/ul的浓度，样品抗原为野生型烟草花叶病毒外壳蛋白以及融合S6-1肽段的融合外壳蛋白；(2).包被在96孔酶标板中的位置设定好样品以及相应的阳性、阴性对照和空白，加样，37℃下孵育约2小时后取出酶标板，倒出包被液后用0.05M PBS/Tween20洗5-6次，倒扣拍干；(3).封闭每孔加入一定量封闭液，37℃下封闭约1小时，倒出封闭液后用0.05M PBS/Tween20洗5-6次，倒扣拍干；(4).按一定比例加入第一抗体，37℃孵育约1小时，倒出杂交液后用0.05MPBS/Tween20洗5-6次，倒扣拍干；(5).以1/10000的比例加入第二抗体羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标抗体，37℃下孵育约1小时，倒出杂交液后用0.05M PBS/Tween20洗几次，倒扣拍干；(6).显色加入辣根过氧化物酶的显色底物邻苯二胺二盐酸(OPD)，37℃孵育10min-15min。往酶标板孔中加入一定量2M H2SO4终止液，置于Beckman500型酶标仪中测定OD492值，测得结果如表1所示。
表1ELISA-酶标检测仪测得OD492值Table 1.ELISA-OD492read by Microplat Reader
2.Western免疫杂交(1).SDS-PAGE配置15％的凝胶，BIO-RAD电泳电转仪中以65v电压电泳3～3.5小时；(2).电转BIO-RAD电泳电转泳仪中200mA±5mA的电流强度下，于4℃冰箱中电转60min；(3).封闭从电转槽中取出NC膜置于杂交瓶中，正面向上，加入封闭液，室温下封闭约1小时，PBS/Tween20清洗5-6次；(4).按一定的比例往杂交瓶中加入第一抗体，室温下置于杂交炉中杂交约1小时，PBS/Tween20清洗5-6次；(5).以1/10000的比例加入第二抗体羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标抗体，室温下置于杂交炉中杂交约1小时，PBS/Tween20清洗5-6次；(6).压片显影取出NC膜，取150μl荧光底物均匀浸润于滤膜正面，在暗室中剪一片与滤膜大小相仿的胶片，重叠于NC膜上曝光5-10分钟后显影，western杂交实验结果见图1。
从测定结果可以得出，抗体分别与wtCP、CP-S6-1这俩种抗原发生酶标反应，在稀释度为1/1000具有最大OD492值。当抗体稀释度为1/2500时P/N值仍大于2，此浓度下的抗体仍有较高的IgG效价；同时，最初的兔抗血清经过俩种蛋白丙酮粉对它的烟草总蛋白以及野生型烟草花叶病毒的外壳蛋白的抗原决定簇的交叉吸附后，得到特异性的高特异性抗体Anti-S6-1，该抗体仅对外源肽段S6-1产生特异性反应，说明通过交叉吸附得到的高特异性抗体Anti-S6-1完全可以应用于S6-1肽段的鉴定。
权利要求
1.一种SARS病毒抗原S6-1的抗体的快速制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤A.多克隆抗体的制备a.融合SARS病毒抗原S6-1的TMV重组病毒的构建；b.抗原的制备采用TMV-S6-1重组病毒的融合S6-1的CP制备抗原TMVCP-S6-1；c.将抗原TMV CP-S6-1免疫家兔，免疫后，抽取兔抗血清备用B.通过交叉吸附实验获得高特异性抗体，具体步骤如下a.制备交叉吸附需要的蛋白丙酮粉，制备蛋白丙酮粉的蛋白来源有两个烟草总蛋白和野生型烟草花叶病毒外壳蛋白，分别得到烟草蛋白丙酮粉和野生型烟草花叶病毒外壳蛋蛋白丙酮粉；b.蛋白丙酮粉吸附兔抗血清，具体步骤如下(1)取步骤A中c所得到的兔抗血清置入eppendorf管中，加入烟草蛋白丙酮粉均匀混合，烟草蛋白丙酮粉与兔抗血清的重量体积比为1∶50-1∶25；然后在冰上轻弹30min-45min，静置于冰箱内过夜；之后，于4℃下离心分离，将上清移至新的eppendorf管中，得到烟草蛋白丙酮粉处理后的抗体X；(2)取经过上述步骤(1)烟草蛋白丙酮粉处理后的抗体X置入eppendorf管中，加入野生型烟草花叶病毒外壳蛋蛋白丙酮粉均匀混合，野生型烟草花叶病毒外壳蛋蛋白丙酮粉与抗体的重量体积比为1∶50-1∶25；在冰上轻弹30min-45min，静置于冰箱内过夜；之后，于4℃下离心分离，将上清移至新的eppendorf管中，得到抗体Y；c.Protein A亲和层析柱纯化抗体Y，得到抗体Anti-S6-1。
2.根据权利要求1所述的一种SARS病毒抗原S6-1的抗体的快速制备方法，其特征在于所述的抗原的制备的具体步骤为a.TMV重组病毒粒子经稀释后，混以金刚砂，采用机械摩擦法接种烟草Nicotiana tabacum cv.samsun幼苗；病毒接种烟草14-21天后，收获烟草叶片用于大量病毒粒子提取；b.将上述的烟草叶片加入病毒提取液，即0.5M磷酸缓冲液，1mM EDTA，pH7.2，经研磨后，过滤除渣，离心分离；c.取上清液，在上清中加入正丁醇或氯仿至终体积浓度为8％±0.1％，控制溶液温度为3℃-5℃，搅拌30min-45min，于4℃离心分离；d.取水相，加入PEG 6000至浓度5％±0.1％，NaCl至浓度5％±0.1％，控制溶液温度为3℃-5℃，混匀30min-45min，于4℃离心分离；e.取沉淀物，将该沉淀的病毒粒子悬浮于病毒储存液，即50mM磷酸缓冲液，1mM EDTA，pH 7.2中，于4℃离心分离；f.取上清液，加入PEG 6000至终浓度5％，NaCl至5％，3℃-5℃静置30min-45min，离心分离；将沉淀物悬浮于病毒储存液，即50mM磷酸缓冲液，1mM EDTA，pH7.2中，于4℃离心分离；取上清液，即为纯化的病毒粒子，即抗原TMVCP，可于4℃下长期保存；g.取上述步骤f中所得抗原TMV CP-S6-1，加入2倍体积冰醋酸解离，混匀后冰上放置10min-15min，于4℃，离心分离10min-15min。上清加入等体积蒸馏水，0℃±0.5℃放置1hr-1.5hr。h.蒸馏水透析2天，其间换水三次；在透析后的样品中加入少量3M NaAc，pH为4.7，使抗原TMV CP进一步聚集，于4℃，36,000rpm离心分离10hr。i.取沉淀悬浮于pH8.0，I＝0.1的Tris-Cl溶液中，悬浮液在pH 5.0，I＝0.1的NaAc溶液中再次透析过夜；析得到的抗原TMV CP-S6-1悬液可于4℃下长期保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种SARS病毒抗原S6-1的抗体的快速制备方法，其特征在于所述抗原TMV CP-S6-1免疫家兔的方法是取10mg±0.5mg抗原TMVCP-S6-1皮下注射一头家兔，以后的20天内，每隔10天采用同样的免疫方法和剂量加强免疫该家兔两次；第三次免疫后两周，抽取兔血清备用。
4.根据权利要求1所述的一种SARS病毒抗原S6-1的抗体的快速制备方法，其特征在于所述蛋白丙酮粉的制备方法是取烟草叶片碾磨成泥状，移至离心管内；或者取野生型烟草花叶病毒粒子溶液移至离心管内；加入5倍体积的-20℃预冷的冷丙酮，在漩涡振荡器上振荡20s-30s，使得丙酮和样品充分混合，于4℃下以12000g的速度离心，取其沉淀物，反复上述操作数次至沉淀物呈白色，将沉淀物在通风橱内干燥，最后制成粉状，即为烟草蛋白丙酮粉或者野生型烟草花叶病毒外壳蛋蛋白丙酮粉。
5.根据权利要求1所述的一种SARS病毒抗原S6-1的抗体的快速制备方法，其特征在于所述Protein A亲和层析柱纯化抗体Y的方法是Protein A亲和层析柱和各种缓冲器buffer，缓慢升至室温，同时将抗体Y与Binding Buffer按1∶1-1∶2的比例混匀；取5-6倍体积的Binding Buffer注入Protein A亲和层析柱以平衡Protein A柱；将抗体Y注入Protein A亲和层析柱，静置5min-6min；取10-15倍体积Binding Buffer洗去柱上未结合的杂抗体，用eppendorf管收集洗液；取3-5倍体积的Elution Buffer洗脱柱上的抗体，用eppendorf管收集洗液，所得洗液即为Anti-S6-1。
全文摘要
提供一种高特异性抗体快速制备的方法，包括融合外源序列的TMV CP－S6－1免疫动物得到多克隆抗体，使用烟草总蛋白和烟草花叶病毒外壳蛋白的蛋白丙酮粉多克隆抗体通过交叉吸附实验，并以蛋白A亲和层析柱为分离方式，然后做抗体的效果的免疫鉴定，属分子生物学及抗体制备技术领域。本发明的方法操作简单，经济快捷，重复性好，是一种准确并且易于普及推广的病毒抗原抗体的快速制备方法。
文档编号C07K16/08GK1699421SQ20051002658
公开日2005年11月23日 申请日期2005年6月9日 优先权日2005年6月9日
发明者许政暟, 宋任涛, 许寅琦 申请人:上海大学