专利名称：β－淀粉样肽结合蛋白及其编码聚核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的聚核苷酸及其编码的蛋白质，还涉及所述聚核苷酸及蛋白质在治疗、预防和研究方面的用途。具体地说，本发明所涉及的聚核苷酸所编码的蛋白质结合β-淀粉样肽，这种肽是与早老性痴呆症(早老性痴呆病)有关的淀粉样蛋白沉积物的主要成份之一。
背景技术：
早老性痴呆病(AD)是一种进行性老年痴呆症，以一系列脑结构异常为特征。中枢神经系统(CNS)许多区域内的神经元发生功能障碍或死亡，导致突触输入的交迭(alterations)。这些脆弱的神经元细胞体和邻近的树突含有成对的螺旋状长丝构成的神经纤维缠绕，其中的主要成份是磷酸化的微管结合蛋白，又称tau蛋白。该病的特征之一是脑内含淀粉样蛋白沉淀的积累，称为衰老(神经)斑。淀粉样蛋白斑的主要成份是β-淀粉样肽(后文以“BAP”表示，在文献中又称Aβ、βAP等)，它在AD的病程中形成致密的聚集体。
BAP是一种39-43氨基酸的肽，由淀粉样前体蛋白(后文以“APP”表示)经蛋白酶剪切而得，具有APP的跨膜域和鲁米诺(luminal)/胞外域。包含42个氨基酸的BAP肽(BAP42)被认为可能是人体内更毒的聚集体。APP以数种含BAP的同种型形式出现。主要形式包含695、751和770个氨基酸，后两种APP含有的一个结构域在结构及功能具有与Kunitz丝氨酸蛋白酶抑制剂的同源性。在正常个体内，BAP不积累，而且被从循环体液中迅速清除。但是，这种肽会在营养不良的树突和轴突表面、小微神经胶质细胞和活性星形细胞上形成斑。神经斑内BAP的聚集和沉积被认为可能是AD的早期活动之一。研究导致BAP表达及其后果以及它们各自在AD中的作用是神经科学研究的一个主要焦点。尤其是，结合BAP的蛋白的发现对于促进理解该疾病的病理和可能引入新的治疗目标是关键性的。
在本发明之前，还没有鉴定到结合人BAP以及可能涉及BAP在AD中作用的蛋白质及其片段。
发明概述本发明提供了一种新的分离的聚核苷酸，它编码选择性结合β-淀粉样肽(BAP)氨基酸序列的基因产物。
在实施例之一中，本发明提供了一种组合物，其中所含的分离的聚核苷酸选自(a)包含核苷酸序列SEQ ID NO1的聚核苷酸；(b)包含β-淀粉样肽结合蛋白(BBP)核苷酸序列的聚核苷酸，所述的BBP来自保藏号为ATCC98617的克隆BBP-fl；(c)编码β-淀粉样肽结合蛋白(BBP)的聚核苷酸，所述的BBP由保藏号为ATCC98617的克隆BBP-f1内的cDNA插入片段编码；(d)包含序列SEQ ID NO1中核苷酸202至核苷酸807的聚核苷酸；(e)包含β-淀粉样肽结合蛋白(BBP)核苷酸序列的聚核苷酸，所述的BBP来自保藏号为ATCC98399的克隆pEK196；(f)编码β-淀粉样肽结合蛋白(BBP)的聚核苷酸，所述的BBP由保藏号ATCC98399的克隆pEK196的cDNA插入片段编码；(g)编码含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白质的聚核苷酸；(h)编码如下蛋白质的聚核苷酸，该蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO2的片段，具有结合人β-淀粉样肽的活性，所述片段包含氨基酸序列SEQ ID NO2中氨基酸68至氨基酸269；(j)聚核苷酸，是以上聚核苷酸(a)-(f)的等位基因变异体；(k)编码上述蛋白质(g)-(h)的种族同系物的聚核苷酸；(l)在严谨条件下能够与(a)-(h)中任一聚核苷酸杂交的聚核苷酸。
较好的是，所述的聚核苷酸包含核苷酸序列SEQ ID NO1；保藏号为ATCC98617的克隆BBP-f1的β-淀粉样肽结合蛋白(BBP)的核苷酸序列；或由保藏号为ATCC98617的克隆BBP-f1的cDNA插入片段编码的β-淀粉样肽结合蛋白(BBP)的聚核苷酸。另一实施例提供的基因对应于序列SEQ ID NO1的cDNA。
在另一实施例中，本发明提供了一种包含蛋白质的组合物，其中所述的蛋白质所含的氨基酸序列选自(a)氨基酸序列SEQ ID NO2(b)氨基酸序列SEQ ID NO2中的氨基酸68至氨基酸269；
(c)由保藏号为ATCC98617的克隆BBP-f1的cDNA插入片段编码的氨基酸序列；(d)氨基酸序列SEQ ID NO2的片段，包含氨基酸序列SEQ ID NO2中氨基酸185至氨基酸217的氨基酸序列。
较好的是，所述的蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO2，或其中的氨基酸68至氨基酸269。本发明还包括融合蛋白。
在某些优选实施例中，所述的聚核苷酸与表达调控序列操作性连接。本发明还提供用这种聚核苷酸组合物转化的宿主细胞，包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。
本发明还提供制备BBP的方法，它包括(a)在合适的培养基中培养权利要求3所述的宿主细胞培养物；和(b)从培养基中纯化蛋白质。
本发明还提供包含与所述BBP特异性反应的抗体的组合物。
本发明还提供了一些方法和诊断方法，用来检测以人BAP的表达为特征的疾病，和鉴定调节BBP活性的化合物的方法。
本发明的另一实施例还包括转基因动物，它们含有与表达调控序列操作性连接的编码BBP的聚核苷酸。
附图简述附图显示了本发明的某些实施例。它们只用来说明本发明，而不是对本发明的限定。
图1酵母2-杂交筛选的设计。Y2H宿主菌株表达与BAP42(BAP BD；含TRP1标志的质粒)及非融合BAP42(BAP；含URA3标志的质粒)融合的Gal4 DNA-结合结构域，用表达所述Gal4活化结构域融合蛋白(未知AD)的人胎脑cDNA文库(含LEU2标志的质粒)转化该菌株。所以，菌株含有表达所示蛋白的(用圆环表示的)三种附加型质粒。蛋白质-蛋白质的正相互作用恢复了上游活化序列(GALUAS)的Gal4活性，由此诱导报道基因HIS3的转录。
图2BBP/BAP结合的展示。分析Y2H菌株的组氨酸原养型制备10倍的连续稀释液，在没有色氨酸、亮氨酸、组氨酸但含有25mM 3-氨基噻唑的合成琼脂培养基上点加5μl。所有菌株都含有BAP融合蛋白的表达质粒pEK162，如标记BAP所示。第一列(载体)包含相互独立的衍生菌株，携有pEK162和表达一种非相关融合蛋白的载体pACT2，。以此作为衡量背景来与表达靶蛋白的菌株比较。以BBPDtm标示的各列表达来自pEK198的截短BBP，如本文所述。BAP与BBPDtm融合蛋白之间的相互作用恢复了Gal4活性，因此诱导报道基因HIS3的转录(参见图1)，可以观察到原养型生长比对照菌株加强了。
图3证明BBP与Gα蛋白相互作用的生物试验。估计的BBP的胞外域表达成为Gal4 DNA结合结构域，具有表达为Gal4活化结构域融合蛋白的大鼠Gas，Gao或Gai2部分。由各自菌株分别衍生得到的两克隆的Y2H应答与没有G蛋白成份(载体)的细胞的应答相比较。图2的图例中说明了方法。
图4BBP与BAP间相互作用的位置。BBPΔtm如本文所述分成重叠的两段。分析BBPΔC或BBPΔN这两种蛋白质与BAP的相互作用。图2的图例中说明了试验方法和以载体或BBPΔtm标示的菌株。以BBPΔC或BBPΔN标示的菌株表达融合蛋白形式的所示的BBP片段。
图5人组织内(A)和脑部(B)内BBP mRNA的表达。分离自所述组织的经大小分离的2μg点印在聚ARNA的尼龙薄膜是，这些来自CLONTECH。它们与经放射性标记的BBP cDNA探针杂交。在所有泳道中都观察到一条突出的1.25kb(根据分子量标准物确定，标准物未显示)的条带。分子量更大的条带可能对应于异核RNA；BBP基因含有数个内含子。剥下斑点并用β肌动蛋白作为加载和RNA完整性对照再次检测；所有的泳道都表现出同等的信号(数据未显示)。
图6海马细胞内BBP和APP的表达。原位杂交放射自显影图显示了人海马皮层和entorihnal皮层内BBP(A)和APP(B)的表达方式。用来产生这些造影的切片来自两患者的死后验尸样本。缩写DG＝齿状脑回；CA1＝海马体下区；EC＝entorihnal皮层。
图7BBP与人或鼠的BAP相互作用的比较。如本发明所述，鼠BAP经基因工程改造表达成融合蛋白。以人BAP标示的菌株与图2中所示的相同。以鼠BAP标示的菌株表达的是Gal4 DNA结合结构域融合体形式的鼠BAP。载体指只含载体而不含BAP融合蛋白的对照菌株；BBP标示表达BBPΔtm融合蛋白的菌株本发明的详细说明本发明涉及人β-淀粉样肽结合蛋白(BBP)的分离和克隆。经酵母2杂交试验进行的特征分析，BBP是一种融合蛋白，结合BAP的42氨基酸片段(BAP42)。已发现，BBP在人组织和特定的脑局部区域内表达(图5)。重要的是，在酵母2杂交系统中，BBP被证明更具选择性地结合人BAP而非鼠BAP。这些发现支持以下假定，即，本发明的BBP可以用于诊断和治疗早老性痴呆病，并用于评价和筛选调节脑内含淀粉样蛋白斑积累的药物。
BBP编码序列初始人BBP克隆(称为克隆14)是利用酵母2杂交(Y2H)基因筛选法得到的，该方法用于检定与人BAP42作用的蛋白质，BAP42是BAP的潜在性更高毒性形式。表达出的BAP42与酵母的Gal4 DNA结合结构域融合，也有表达为游离肽的(图1)。用人胎脑cDNA Y2H文库转化该菌株。约106个独立转化体中，只有第14号克隆产生稳定的报道基因活性，并含有与GAL4功能区连续的主开放读码框。cDNA插入片段包含984碱基对，以一段聚A结尾。这段序列编码201个氨基酸(SEQ ID NO2中的氨基酸68至269)，其中包括两个具有足够长度和疏水性来穿越细胞膜的区域。还有潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点。克隆14被命名为克隆pEK196，保藏号为ATCC 98399。
从克隆14分离文库衍生质粒，用于构建Y2H试验菌。对这些菌株的检查显示，虽然是弱应答，但是BAP融合蛋白特异性作用于克隆14蛋白。因为强疏水性蛋白结构域(例如跨膜区)抑制Y2H应答(Ozenberger，未公开)，所以截短克隆14插入片段去除疏水性最强的区域(BBPΔtm；有关进一步的说明，参见后文表2)，再次测试其与BAP的相互作用。观察到BBPΔtm用Y2H的应答强烈得多，这支持了这样的说法，即被截去的序列编码着潜在的跨膜(“tm”)锚位。克隆14定义了一种新的融合蛋白形式的BAP结合蛋白。
克隆14所含的BBP cDNA序列经鉴定缺失蛋白编码区的5’末端，因为没有潜在的起始甲硫氨酸密码子。使用标准逆转录酶进行常规5’RACE(cDNA末端快速扩增)的多种尝试只增加了27个核苷酸。所以，使用后文实施例2所述的一种基因组克隆法来分离5’末端。
因为编码序列的5’末端来自基因组文库，所以可能该区域含有内含子。后文实施例2用两种方法检测了这一可能性。结果证实了该区域内和上游序列(都来自基因组和cDNA来源)都没有内含子。质粒BBP-f1含有编码全长BBP蛋白编码区的cDNA插入片段，该质粒保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为98617。SEQID NO1和2所显示的是完整的编码区和推定蛋白序列。原始克隆14(pEK196)含有3’非翻译核苷酸序列。
根据本发明，编码BBP及其片段、融合蛋白或功能对等物的核苷酸序列可以用来产生重组DNA分子，在合适的宿主细胞内表达BBP或功能活性肽。或者，与BBP序列某些部分杂交的核苷酸序列可用于核酸杂交试验，Southern和Northern印迹试验等。
本发明还包括序列与本发明所描述的聚核苷酸序列互补的聚核苷酸。
本发明还包括能够在降低严谨度条件下，更好的是在严谨条件下，最好是在高严谨条件下与本发明聚核苷酸杂交的聚核苷酸。严谨条件的实例可参见下表高严谨条件至少如条件例A至F一样严谨；严谨条件至少如条件例G至L一样严谨；低严谨条件则至少如条件例M至R一样严谨。
严谨条件
1杂交体长度是对发生杂交的聚核苷酸杂交区的估计。当一段聚核苷酸与一段未知序列的靶聚核苷酸杂交时，杂交体长度被假设为杂交d聚核苷酸的长度。当已知序列的聚核苷酸杂交时，可以通过排列聚核苷酸序列和检定序列互补性最佳的区域来确定杂交体长度。
H杂交缓冲液和洗涤缓冲液中的SSPE(1XSSPE即0.15M NaCl，10mMNaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)可用SSC((1XSSC即0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)代替；杂交完成后，洗涤15分钟。
*TB-TR估计长度小于50碱基对的杂交体的杂交温度应该比杂交体的熔点(Tm)低5至10EC，Tm是根据以下公式计算的对于少于18碱基对的杂交体而言Tm(EC)＝2(A+T碱基数)+4(G+C碱基数)；对于18至49碱基对的杂交体而言，Tm(EC)＝81.5+16.6(log10[Na+]+0.41(G+C)％-(600/N)，N是杂交体的碱基数，[Na+]是杂交缓冲液中的钠离子浓度(1XSSC的[Na+]=0.165M)。
聚核苷酸杂交严谨条件的其它例子可参见Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第9章和第11章，以及Current Protocolsin Molecular Biology，1995，F.M.Ausubel等编，John Wiley & Sons，Inc.，第2.10和6.3-6.4节，在此纳为参考。
较好的是，这些杂交用聚核苷酸的长度都至少为待杂交的本发明聚核苷酸的25％(至少50％更好，至少75％最好)，而且，与待杂交的本发明聚核苷酸的序列相同性至少为60％(至少75％更好，至少90％或95％最好)，序列相同性是如下测定的排列比较杂交聚核苷酸的序列，排列时尽可能重叠和一致，同时尽可能减少序列间隙。
BBP的表达为了重组生产蛋白质，可以将本发明的分离聚核苷酸与例如Kaufman等Nucleic Acids Res.19，4485-4490(1991)中的pMT2或pED表达载体之类表达调控序列操作性连接。本领域已知有许多合适的表达调控序列。表达重组蛋白的一般方法也是已知的，可参见R.Kaufman，Methods in Enzymology185，537-566(1990)中的例子。“操作性连接”在此表示本发明分离的聚核苷酸与表达调控序列在同一载体或细胞内，使得被连接在一起的聚核苷酸/表达调控序列所转化(转染)的宿主细胞表达该蛋白。
BBP的表达系统许多种细胞可作为合适的宿主细胞来表达本发明蛋白。哺乳动物细胞包括例如猴COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人肾293细胞，人A431上皮细胞、人Colo205细胞，3T3细胞，CV-1细胞，其它被转化的灵长动物细胞系，正常双倍体细胞，来自原代组织体外培养物的细胞株、原代外植体，HeLa细胞，小鼠细胞，BHK，HL-60，U937，HaK或Jurkat细胞。
或者，可以在低级真核细胞例如酵母，或在原核细胞例如细菌中生产蛋白质。可能合适的酵母菌株是酿酒酵母、pombe裂殖酵母、克鲁维酵母、念珠菌或能够表达异源蛋白的任何其它酵母菌。可能合适的细菌包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或能够表达异源蛋白的其它任何细菌。如果是在酵母或细菌中生产蛋白质，为了获得具有功能的蛋白，可能有必要通过例如合适位点的磷酸化或糖基化来修饰其中产生的蛋白。此类共价连接可用已知的化学方法或酶法来完成。
还可以如下生产蛋白质将本发明的分离聚核苷酸与一个或多个昆虫表达载体内的合适调控序列操作性连接，并采用昆虫表达系统。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以以试剂盒的形式购自例如Invitrogen，San Diego，California，USA(MaxBac7试剂盒)，这类方法在本领域是众所周知的，参见在此纳为参考的Summers & Smith Texas Agricultual Experiment Station Bulletin No.1555(1987)。在此，能够表达本发明聚核苷酸的昆虫细胞就是“被转化的”。
本发明蛋白可以通过在表达重组蛋白的适宜条件下培养被转化宿主细胞来制备。然后，可以采用已知纯化方法(例如凝胶过滤和离子交换层析)从培养物(例如培养基或细胞提取物)中纯化表达得到的蛋白。蛋白的纯化可能还包括亲和性柱层析，柱中包含与该蛋白结合的物质；一步或多步下列亲和树脂上的柱层析伴刀豆蛋白A-琼脂糖，肝素-toyopearl7或Cibacrom蓝3GA Sepharose7；一步或多步使用下列树脂的疏水作用层析苯醚、丁醚或丙醚；或免疫亲和层析。
或者，本发明蛋白可以表达成有助于纯化操作的形式。例如，可以表达为融合蛋白，例如与麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)或硫氧还蛋白(TRX)等。表达和纯化这些融合蛋白的试剂盒可以购自New EnglandBiolab(Beverly，MA)，Pharmacia(Piscataway，NJ)和InVitrogen。还可以给蛋白加上表位标签，然后用针对该表位的特异性抗体来纯化蛋白。此类表位之一(“Flag”)可向Kodak(New Haven，CT)购买。
最后，可用一步或多步反相高效液相层析(RP-HPLC)步骤进一步纯化蛋白，所用的是疏水性RP-HPLC介质，例如侧链为甲基或其它脂族基团的二氧化硅凝胶。为了提供基本均匀的分离重组蛋白，可以以各种形式组合使用以上纯化步骤中的几种或全部。如此纯化后的蛋白基本上没有其它哺乳动物蛋白，根据本发明，即为“分离蛋白”。
本发明蛋白还可以表达为转基因动物产物，例如转基因奶牛、山羊、猪或羊的乳汁组份之一，这些动物的特征在于其体细胞或胚细胞含有编码该蛋白的核苷酸序列。
本发明蛋白还可以通过已知的常规化学合成法生产。利用合成法构建本发明蛋白质的方法是本领域技术人员已知的。合成法构建的蛋白序列，因为具有相同的蛋白质一级、二级或三级结构和/或构象特征，所以可能具有与之相同的生物特性，包括蛋白质活性。所以，它们可以作为天然、纯化蛋白的生物活性或免疫性替代品用于筛选治疗药物和研制抗体的免疫方法中。
本发明蛋白还包括氨基酸序列与纯化蛋白相似但是含有自发或基因工程特定加入的修饰的蛋白质。例如，本领域技术人员可以利用已知技术来修饰肽或DNA序列。蛋白质序列内有意义的修饰包括编码序列内某选定氨基酸残基的改变、取代、置换、插入或缺失。例如可以通过一个或多个半胱氨酸的缺失或被其它氨基酸置换来改变分子的构象。这些改变、取代、置换、插入或缺失技术是本领域技术人员众所周知的(参见USP No.4,518,584)。较好的是，上述改变、取代、置换、插入或缺失保留了蛋白质的所需活性。
蛋白质序列的其它片段和衍生物可能保留蛋白质活性的全部或部分，所以可以用于筛选或其它免疫学方法，参照本发明内容，也是本领域技术人员容易制得的。这类修饰被认为包涵在本发明之内。
酵母2杂交试验Y2H试验显示，BAP与BBP融合蛋白的结合是特异性的。BBP与BAP的结合提示BBP活性可能在早老性痴呆病的病理中具有一定的作用。
利用碱基局部排列搜索工具(BLAST；Altschul等，1990)将BBP序列与Genbank相比较。对BBP蛋白和所得的表达出的序列标签进行了排列，查找保守片段，并利用MoST(Tatusov等，1994)蛋白质基序搜索算法进行评价。以上分析揭示了与G蛋白偶联受体(GPCR)家族存在着潜在的进化关系。具体地说，以上分析显示，BBP含有两个潜在跨膜(tm)结构域，相当于G蛋白偶联受体的第3和第4跨膜结构域。间插亲水环含有特征明显的3氨基酸基序天冬氨酸酯(D)或谷氨酸，后接精氨酸(R)和一个芳香族残基(Y或F)(一般称为DRY序列)，这在该家族几乎所有成员内保守，而且已知起着G蛋白活性的触发分子作用(Acharya& Karnik，1996).
Y2H试验得出的数据(见图2至4)显示，BBP代表了一种新的蛋白质，可能具有一个与G蛋白偶联受体超家族各成员相同的功能性模块。具体地说，BBP似乎保留了位于两个预计tm结构域之间的关键性DRF序列(SEQ ID NO2中的氨基酸199至201)，而且可能；连接受G蛋白调控的信号通路的能力。
APP已知在功能上与Gαo相关(Nishnoto等，1993；Yamatsuji等，1996)，而BBP具有的一个结构基序已知是相关的G蛋白偶联受体中的一段Gα蛋白活化序列。此外，基于BBPtm结构域的推定位置和取向所做的假设称蛋白质内与BAP相作用的区域在拓扑结构上可能局限于和APP内BAP相同的位置。
对Y2H试验株进行基因工程改造，用来评价BBP胞内区与Gα蛋白的结合。推定的BBP胞内序列表达成融合蛋白，并分析其与三种Gα蛋白C末端的相互作用。表2列出了这些试验中所用的蛋白质片段。BBP胞内环与三种Gα蛋白都反应(图3)，这支持了这样的假设BBP可能起着G蛋白活性调节剂的作用。以上各Y2H试验提示，引人注意的该多蛋白复合物模型起码由完整的膜蛋白BBP和与异三聚体G蛋白偶联的APP构成。
表2酵母2杂交试验中使用的质粒
用Y2H进一步分析BBP。BBPΔtm克隆所含的BBP序列的两个重叠部分扩增并克隆到Y2H载体pACT2(表2中的表达质粒pEK216和pEK219，对应于蛋白质BBPΔN和BBPΔC(图4))中。ΔC结构内两个tm结构域都缺失；ΔN结构编码第一个tm结构域和前面的52个氨基酸。用BAP融合蛋白对这些融合蛋白进行了试验，并将其应答与表达较大BBPΔtm蛋白的菌株的应答进行了比较。BBPΔC蛋白诱导弱Y2H应答(将BBPΔC与载体相比，图4)，但含有第一个tm结构域和相邻的近氨基序列BBPΔN产生的应答只比用BBPΔtm观察到的略弱(图4)。以上结果提示，导致与BAP结合的主要决定基包含于据推定在拓扑结构上与野生型APP蛋白内BAP类似的BBP区。
用Y2H系统来证明BBP结合人BAP(与鼠BAP相比)的选择性和特异性。与人序列相比，鼠BAP序列内有3处氨基酸取代(G5R，F10Y，R13H)。在实施例6所述的Y2H试验中，鼠肽表现为神经毒性降低和结合人脑浆能力的丧失(Maggio等，1992)。所以，在Y2H系统中评价BAP与BBP的结合是有意义的。利用寡核苷酸引导的诱变经PCR将pEK162中的人BAP序列改成编码鼠肽。所得的质粒pEK240除了三个密码子发生鼠肽序列的氨基酸取代之外与本报告所用的人BAP融合蛋白表达质粒相同。利用Y2H生物试验来比较BBP融合蛋白与鼠和人BAP融合蛋白的相互作用。表达BBP和鼠BAP的菌株不能产生生长应答(图7)。这一发现支持假设BBP可能是BAP神经毒性效应的特异性介导者，并提供了解释鼠BAP神经毒性降低的机制。重要的是，以上数据还显示了Y2H试验中BBP/BAP相互作用的高度特异性，因为三个氨基酸的取代足以完全抑制结合作用(图7)。
分离的BBP多肽本发明的蛋白质和蛋白片段包括氨基酸序列长度为在此揭示的蛋白质的长度的至少25％(至少50％更好，至少75％最好)，而且与在此揭示的蛋白质的序列相同性至少为60％(至少75％更好，至少90％或95％最好)，序列相同性是通过排列比较氨基酸序列来确定的，排列时尽可能重叠和一致、尽可能减小序列间隙。本发明还包括如下蛋白质和蛋白片段，它们包含的片段包含本发明所揭示的任何蛋白质片段的8个以上(20个以上更好，30个以上最好)、且序列相同性至少75％(至少85％更好，至少95％最好)的相邻氨基酸。
本发明还提供所揭示的聚核苷酸和蛋白质的种族同系物(specieshomologues)。种族同系物在此指物种来源与给定蛋白质或聚核苷酸不同，但是具有明显序列相似性的的蛋白质或聚核苷酸。较好的是，聚核苷酸种族同系物与给定聚核苷酸的序列相同性至少60％(至少75％相同性更好，至少90％相同性最好)，蛋白质种族同系物与给定蛋白质的序列相同性至少为30％(至少45％更好，至少60％最好)，序列相同性是通过排列比较聚核苷酸的核苷酸序列和蛋白质的氨基酸序列来确定的，排列时尽可能取得重叠和一致、尽可能减小序列间隙。可以利用在此提供的序列制备合适的探针或引物，并从所需的物种中筛选合适的核酸源来分离和鉴定种族同系物。较好的是自各种哺乳动物分离得到的种族同系物。最好的是那些分离自特定哺乳动物的种族同系物，这些种类例如黑猩猩、大猩猩、Pongo pygmaeus、长臂猿、猕猴、狒狒、Papio hamadryas、非洲弥猴、卷尾猴、Aotus trivirgatus、Sanguinus oedipus、短尾猴、台湾鼷鼠、褐鼠、仓鼠、公猫、鼬鼠、家犬、家兔、黄牛、Ovis aries、野猪和野马，它们的基因图谱已知，所以能够确定一物种内基因的基因组组织方式与另一物种内相关基因的基因组组织方式之间的关系(O’Brien & Seuanez，1988，Ann.Rev.Genet.22323-351；O’Brien等，1993，Nature Genetics 3103-112；Johansson等，1995，Genomics25682-690；Lyons等，1997，Nature Genetics 1547-56；O’Brien等，1997，Trendsin Genetics 13(10)393-399；Carver&Stubbs，1997，Genome Research 71123-1137；以上文献均在此纳为参考。)本发明还包括所揭示聚核苷酸或蛋白质的等位基因变异体；即，天然存在的分离聚核苷酸的其它形式，它们所编码的蛋白质与在此揭示的聚核苷酸所编码的完全相同或具有明显的序列相似性。较好的是，等位变异体与给出聚核苷酸的序列相同性至少为60％(至少75％为佳，至少90％最好)，序列相同性是通过核苷酸的排列比较来确定的，排列时尽可能重叠和一致，同时尽可能减少序列间隙。可以如下分离和鉴定等位变异体根据在此提供的序列制备合适的探针或引物，从相应物种的个体中筛选合适的核酸源。
本发明还包括序列与在此揭示的聚核苷酸序列互补的聚核苷酸。
应用本发明的BBP蛋白可用于各种用途，这些用途是本领域技术人员根据本文内容可常规实现的。具体地说，BBP可用作产生抗体的免疫原，该抗体对克隆的多肽有特异性。可采用本领域已知的各种方法来生产抗BBP蛋白的抗体。这些抗体包括，但不局限于，多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段和Fab表达文库。为产生抗体，用BBP注射各种宿主动物(包括但不局限于家兔、小鼠、和大鼠)。在一个实例中，将该多肽或能特异性免疫反应的该多肽的片段与免疫原性载体偶联。还可给予佐剂与多肽组合，以提高宿主动物的免疫应答。可采用的佐剂的例子包括，但不局限于，完全和不完全弗氏佐剂、矿物胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多聚醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白和二硝基苯酚。
抗本发明BBP蛋白的单克隆抗体可用通过传代细胞系培养来产生抗体的任何技术来制得。这些技术是本领域技术人员所熟知的，包括但不局限于，Kohler和Milstein最初在Nature 1975，256，4202-497中描述的杂交瘤技术，Kosbor等人在Immunology Today 1983，4，72中描述的人B细胞杂交瘤技术，以及Cole等人在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，77-96页中描述的EBV-杂交瘤技术。
然后，可用与本发明多肽起免疫反应的抗体来筛选生物样品中类似多肽的存在和亚细胞分布。此外，对于本发明的BBP蛋白的特异性单克隆抗体可用作治疗剂。
BBP蛋白还可作为固相试验中的抗原来测定与所述肽起免疫反应的抗体的存在。可用固相竞争性试验来测定生物样品中克隆14-相关抗原的免疫量。这一测定不仅可用来促进完整地鉴定本发明多肽的细胞功能，而且还可用来确定具有异常量的这些蛋白的患者。
本发明的BBP蛋白还可用作亲和层析中的捕获试剂，检测作为AD标记的BAP和BAP聚集物。
另外，这些BBP可用作试验中的试剂来确定影响BAP和克隆蛋白相互作用的候选分子。特异性封闭该结合的化合物可用来治疗或预防AD。
这些BBP还可用于无细胞体外结合试验，该试验是测定化合物对这些β-淀粉样肽相关蛋白与BAP或BAP聚集物的结合的改变情况。无细胞试验非常适用于筛选适当数量的化合物，因为这些试验比采用活细胞的试验费用实在并更容易进行。在公开了本发明的多肽后，这些试验的发展对于本领域技术人员来说是常规的。在这些试验中，对BBP或BAP作标记。这些标记包括，但不局限于，放射性标记、抗体、和荧光或紫外线标记。首先在任何测试化合物不存在下测定BBP与BAP或BAP聚集物的结合。然后将待测试化合物加入试验中以确定这些化合物是否改变了这一相互作用。
实施例本发明参照下列实施例作进一步描述。实施例只是通过参照具体实例来描述本发明。尽管这些例子描述了本发明的某些具体方面，但并没有说明界限或限定本发明的范围。
酵母双杂交系统(后称“Y2H”)在载体pAS2和pACT2(WadeHarper等人，1993)和pCUP(在Ozenberger和Young，1995中有所描述)中构建Y2H表达质粒。酵母菌株CY770(Ozenberger和Young，1995)作为所有Y2H试验的宿主。
基因筛选用聚合酶链反应(PCR)扩增和修饰BAP编码序列。用pCLL621-一种修饰的人APP克隆(Jacobsen等人，1994)作为模板，用寡核苷酸#1(5′-CCATG GAT GCA GAA TTC CGA C)和#3(5′-AAGCTTGTCGAC TTA CGCTATGAC AAC ACC GC)来扩增BAP，用pCLL621，一种修饰过的人APP克隆(Jacobsen等1994)作模板。扩增的DNA包括具有下列修饰的APP前体蛋白的密码子389至430(编码BAP42)。有义链引物在pAS2中与NcoI位点相同的翻译读框中加入了5′NcoI限制性位点。反义链引物加入了终止密码子和HindIII和SalI位点以便克隆。将该扩增产物连接到TA克隆系统(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)中，随后通过NcoI和SalI消化除去。将该片段克隆到经NcoI和SalI切割的pAS2中。DNA测序了整个GAL4/BAP接头，确认所得质粒pEK162。pEK162表达的蛋白(BApBD；图1)包含了一个融合蛋白，该融合蛋白含有酵母转录激活蛋白Gal4(缺少功能性激活序列)的DNA结合结构域，羧基端还加入了BAP的42个氨基酸。开发了一种表达质粒来介导未修饰BAP42的表达。用寡核苷酸#2(5-AAGCTTAAG ATG GAT GCA GAA TTC CGA C)与上述PCR中的寡核苷酸#3配对。该扩增产物含有5′HindIII位点以及最适合在酿酒酵母菌中表达的翻译起始信号。再次将DNA片段克隆到TA系统中。然后在HindIII片段上分离并克隆到经HindIII切割的pCUP中。用DNA测序确认所得质粒pEK149(BAP；图1)中BAP基因的取向。将BAP表达质粒pEK149(用URA3作为选择标记)和pEK162(用TRP1作为选择标记)转化到酵母宿主CY770(Ozenberger和Young，1995)中。含有两种质粒的菌株命名为CY2091。酵母2-杂交表达载体pACT2(用LEU2作为选择标记)购自Clontech Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)，在该载体中克隆入从人胎脑中分离获得的cDNA片段组成的质粒文库。文库衍生的蛋白显示为图1中的UnkownAD。用该文库转化CY2091。将样品展开在合成的完全(SC)酵母生长培养基上，该培养基缺少尿嘧啶、色氨酸和亮氨酸，以便选择含有所有三种质粒的细胞。该培养基还缺少组氨酸，并含有浓度为25mM的3-氨基-三唑(酵母HIS3基因产物的抑制剂)。用3-氨基-三唑来减少HIS3报道基因的低水平组成型表达的活性。30℃培育平板12天。分离获得24个表现出组氨酸原养型增加的菌落。转化对照表明该筛选测定了106个单独克隆。用PCR方法迅速测定阳性克隆的含量。用标准方法从每个阳性菌株中分离出总RNA。用该物质作为PCR的模板，PCR采用侧接文库载体pACT2的克隆区的寡核苷酸#4(5′-TTTAATACCACTACAATGGA T)以及#5(5′-TTTTCAGTAT CTACGATTCA T)。将DNA片段连接到TA系统中并用DNA测序检查。通过穿梭到大肠杆菌中，分离出克隆#14(如上所述)中含有的文库质粒。测定人cDNA序列的核苷酸序列，确认初始PCR产物的序列。
生物试验使菌株在在缺少亮氨酸和色氨酸的2毫升SC培养基中生长过夜至密度约为7×107个细胞/毫升。计数细胞，用无菌水从108个细胞/毫升至104个细胞/毫升作10倍连续稀释。将这些样品的5μl等份滴在含有25mM 3-氨基-三唑的缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸的SC培养基上。30℃培育平板2至3天。通过原养型生长的增加(与表达Gal4 DNA结合结构域融合蛋白以及不相关转录激活结构域融合蛋白(或简单地含有pACT载体而不含有插入序列))的对照株相比)确定了阳性的蛋白/蛋白相互作用。这些对照菌株在上述附图中用标记“载体”表示。该试验方法的重现性高，并证明能检测到受靶蛋白之间特异性相互作用介导的细微的生长诱导作用。最初的BBP克隆命名为pEK196并保存为ATCC98399(它在本文中称为克隆14)，用其作为PCR模板来截短蛋白产物以表达BBPΔtm。使有义引物#6(5′-TTTAATACCA CTACAATGGA T)与pACT2中的GAL4序列退火。反义引物#7(5′-CTCGAG TTA AAA TCG ATC TGC TCC CAA CC)在编码BBP的DRF基序的序列的3′端加入3′终止密码子和XhoI位点。将PCR产物连接到TA克隆载体中，随后用EcoRI和XhoI消化并克隆到pACT2中。该质粒(pEK198)表达的杂交产物命名为BBPΔtm。同样，使引物#7与引物#8(5′-GAATT CCA AAA ATA AATGAC GCT ACG)配对，以工程改造BBPΔN表达质粒pEK216。再次将PCR产物连接到TA系统中，最后将经EcoRI和XhoI消化的含有BBP片段(密码子123-202)的所得质粒连接到经相同酶消化的pACT2中。BBPΔC用pACT-2特异性寡核苷酸#6以及反义寡核苷酸#9(5′-CTCGAG TCA AGA TAT GGG CTT GAA AAA AC)制得。在TA克隆后，分离EcoRI-XhoI片段，并克隆到pACT2中，所得质粒pEK219表达BBP的残基68-175。用寡核苷酸#10(5′-CCTTCC ATG GAA GTGGCA GTC GCA TTG TCT)以及#11(5′-AACACTCGAG TCA AAA CCC TAC AGTGCA AAA C)扩增编码BBP胞内环的序列。用NcoI和XhoI消化含有BBP密码子185-217的该产物，并克隆到经NcoI+SalI切割的pAS2中，产生pOZ339。所有Gα蛋白表达质粒的构建利用靠近每个大鼠cDNA序列(Kang等人，1990)中心的BamHI位点作为pACT2中的融合位点。有义引物与BamHI位点的5′端序列退火；反义引物与终止密码子的3′端序列退火，并包括一个Sall限制性位点。引物是Gα0，有义(#17)＝5′-GTGGATCCAC TGCTTCGAGG AT，反义(#18)＝5′-GTCGACGGTT GCTATACAGG ACAAGAGG；Gas，有义(#19)＝5′-GTGGATCCAG TGCTTCAATG AT，反义(#20)＝5′-GTCGACTAAATTTGGGCGTT CCCTTCTT；Gai2，有义(#21)＝5′-GTGGATCCAC TGCTTTGAGGGT，反义(#22)＝5′-GTCGACGGTC TTCTTGCCCC CATCTTCC。将PCR产物克隆到TA载体中。分离出Gα序列(BamHI-SalI片段)并克隆到经BamHI+SalI消化的pACT2中。见表2的质粒消化。最后，合成寡核苷酸#23，以便将人BAP转化成鼠序列。该引物的序列为5′-ATATGGCCATG GAT GCA GAA TTCGGA CATGAC TCA GGA TTT GAA GTT CGT。三联体表示BAP的前13个密码子；用来改变产生鼠序列的三个核苷酸用下划线表示。在用pEK162作为模板的PCR中，使寡核苷酸#23与寡核苷酸#24(5′-TGACCTACAG GAAAGAGTTA)(其与Y2H载体中克隆位点的3′端区域退火)配对。产物用NcoI+SalI切割并连接到pAS2中产生pEK240。确认编码鼠BAP的节段的核苷酸序列。
基因组克隆；RACE(cDNA末端的快速扩增)用对应于核苷酸187-600的随机引导的EcoRI/ClaL片段探针筛选对应于a2.0×106pfu的人基因组λ文库(Stratagene)(图2)。用T7QuickPrimer试剂盒按照生产商说明书用[32P]-CTP标记探针。使滤膜在高度严谨性下杂交40℃，在50％甲酰胺、0.12M NaHPO4、0.25MNaCl、7％SDS和25mg/ml超声处理的鲑精DNA中，并在65℃、用含有0.1％十二烷基硫酸钠的0.1×SSC清洗，并暴光于Kodak BioMax MS胶片。用逐步铺平板和重新筛选对与探针杂交的λ噬菌体克隆进行噬斑纯化。纯化了10个阳性克隆，并与45个核苷酸的寡核苷酸探针(该探针针对原始cDNA克隆已知的大多数5′序列)杂交以作进一步分析。该寡核苷酸是核苷酸157-201的反向补体(图2)，序列为5′-CCAGGCGGCC GCCATCTTGG AGACCGACAC TTTCTCGCCA CTTCC。用标准分子生物学技术分离λ噬菌体DNA，并用在ABI373测序仪上用荧光双脱氧循环测序法来测序。
RACE用rTth热稳定聚合酶系统(Perkin Elmer)进行DNA第一链合成。将下列试剂混合到1.5毫升试管中，产生10微升体积1X逆转录缓冲液、1mMMnCl2、1.6mM dNTP混合物、2.5U rTth聚合酶、100ng人海马聚A+RNA(Clontech)、10mM寡核苷酸(核苷酸429-452，图2；5′-GTTATGTTGGGTGCTGGAAA ACAG)。反应物于70℃培育15分钟，立即置于冰上。用Marathon cDNA合成试剂盒(Clontech)来产生cDNA第二链。将第一链反应物的全部10μl与下列试剂混合1X第二链缓冲液、0.8mM dNTP混合物、4X第二链混合物(大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA连接酶、大肠杆菌RNA酶H)以及dH2O加至体积为80μl。试管于16℃培育1.5小时，随后加入T4 DNA聚合酶(10U)，再16℃培育45分钟。为了终止反应，在反应混合物中加入4μl 20XEDTA/糖元(0.2M EDTA/2mg/ml糖元)，然后进行苯酚/氯仿/异戊醇抽提，除去酶和其它杂质。加入0.1X体积3M醋酸钠(pH5.2)和2.5X体积试剂级乙醇，并置于-70℃下使DNA沉淀。用70℃乙醇洗涤DNA一次，干燥并重悬于10μl dH2O中。一半DNA用于Marathon衔接子连接，以用于随后的RACE PCR反应，该反应按照下述Clontech方法进行在2μl(10mM)Marathon(5′-CTAATACGACTCACTATAGG GCTCGAGCGG CCGCCCGGGC AGGT)、1X DNA连接缓冲液和1μl(1U)T4 DNA连接酶中加入5μl cDNA。16℃培育反应混合物过夜。对于最初的RACE反应，1∶50稀释混合物，并和下列物质一起混合到0.2ml PCR试管中40μl dH2O、1μl 10X Klentaq DNA聚合酶(Clontech)、1μl(10mM)AP1引物(5′-CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC)、1μl(10mM)BBP-特异性引物(对应于核苷酸187-209，图2；5′-CCAGACGGCCAGGCGGCCGCC AT)、5μl 10XKlentaq聚合酶缓冲液、1μl 10mM dNTP混合物、1μl上述反应的稀释的cDNA。用Perking Elmer GeneAmp PCR系统2400热循环仪实施下列循环条件94℃变性1分钟，然后94℃30″，72℃3′进行5轮，94℃30″，70℃3′进行5轮，然后94℃30″，68℃ 3′进行25轮，最后72℃延伸7′。然后如下进行嵌套式PCR反应40μldH2O，1μl(1U)10X AmplitaqGold DNA聚合酶(Perkin Elmer)，1μl(10mM)AP2引物(5′-ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC)，1μl(10mM)BBP-1特异性引物(对应于核苷酸172-194，图2；5′-GCCGCCATCT TGGAGACCGA CAC)，5μl 10XAmplitaq聚合酶缓冲液，1μl 10mM dNTP混合物，1μl初步的RACE产物。PCR循环条件是最初94℃变性9′，94℃30″，68℃30″，72℃2′进行25轮，然后72℃延伸7′。PCR产物在1XTBE缓冲液中1％琼脂糖上跑电泳。凝胶纯化得到350碱基对产物，并用TA克隆试剂盒(Invitrogen)直接克隆。将连接混合物转化到OneShot细胞(Invitrogen)中并置于含有X-gal的LB-氨苄青霉素(100μg/ml)琼脂板上。获得DNA微量制备物，在ABI373测序仪上用荧光双脱氧循环测序法测定。
Northern分析。从Clontech(Palo Alto，CA)获得人多个组织和多个大脑组织mRNA Northern印迹。在pEK196衍生的TA克隆的EcoRI片段上分离出BBP序列，该序列从原始的融合接界处延伸至聚A区。β-肌动蛋白DNA由生产商提供。用随机引导方法掺入32P-dCTP(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，从这些DNA产生放射性标记的探针。按照生产商(Clontech)说明书，在Express Hyb溶液中68℃下进行杂交。在室温下，用2X SSC(1×SSC是0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸钠)、0.05％SDS洗涤印迹，然后于50℃下在0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤两次。暴光Kodak BioMax胶片，使杂交信号显影。
原位杂交。用含有全长人BBP cDNA的质粒克隆作PCR制备核糖核酸探针合成的DNA模板。采用靶向cDNA的3′UTR的单个核糖核酸探针。对照GenBank数据库核查探针序列，以确保它们只识别保藏的所有序列中的合适的靶。为了产生用于BBP的核糖核酸探针，设计一对寡核苷酸引物来扩增从BBP cDNA的3′UTR的275碱基对区域再加上T7(有义)和T3(反义)聚合酶的启动子序列。这些引物含有下列序列5′-TAATACGACT CACTATAGGG TTAGAAGAAACAGATTTGAG(正向)；5′-ATTAACCCTC ACTAAAGGGA CAAGTGGCAACTTGCCTTTG(反向)。在1.5％低熔点琼脂糖凝胶上凝胶纯化PCR产物，切下含有产物的条带，进行苯酚和苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀。干燥沉淀并重悬于1X TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.4)中。APP核糖核酸探针模板由来自蛋白编码区的DdeI-XhoI片段组成(如Jacobsen等人(1991)中所述)。50ng DNA模板用于转录反应，反应采用(35S)-CTP(New England Nuclear，Boston，MA)和Riboprobe GeminiTM系统(Promega，Madison，WI)。
如前所述(Rhodes，1996)用死后人海马切片进行原位杂交组织化学。在Hacker-Brights冷冻切片机上作10μm切片，并将解冻的切片置于的涂覆了Vectabond试剂(Vector Labs，Burlingame，CA)的致冷(-20℃)玻片上。所有溶液以dH2O制备，用0.1％(v/v)二乙基焦碳酸盐处理并高压灭菌。将切片浸在PBS(pH7.4)配的4％多聚甲醛中，然后依次浸在2X SSC、dH2O、和0.1M三乙醇胺(pH8.0)中进行固定。然后将切片浸在含0.25％(v/v)乙酸酐的0.1M三乙醇胺中进行乙酰化，再在0.2×SSC清洗，在50、70和90％乙醇中脱水，并迅速干燥。将1毫升预杂交溶液移液到各玻片上，预杂交溶液含有0.9M NaCl、1mM EDTA、5X Denhardt′s试剂、0.25mg/ml单链鲱精DNA(GIBCO/BRL，Gaithersberg，MD)、50％去离子甲酰胺(EM Sciences，Gibbstown，NJ)(以10mM Tris，pH7.6配)，使玻片在增湿箱中50℃培育3小时。然后将切片浸在50、70和90％乙醇中使其脱水，并空气干燥。在杂交溶液中加入标记的核糖核酸探针至最后浓度为50,000cpm/μl，该杂交溶液含有0.9M NaCl、1mM EDTA、1X Denhardt′s试剂、0.1mg/ml酵母tRNA、0.1mg/ml单链鲑精DNA、葡聚糖硫酸酯(10％)、0.08％BSA、10mM DTT(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)和50％去离子甲酰胺(以10mM Tris，pH7.6配)。然后使探针于95℃变性1分钟，置于冰上5分钟，移液到切片上并使其在增湿箱内55℃下杂交过夜。随后使切片在含有10mM DTT的2×SSC中37℃清洗1次45分钟，然后在37℃含50％甲酰胺的1×SSC中清洗1次30分钟，在37℃2×SSC中清洗1次30分钟。单链和非特异性杂交的核糖核酸探针通过浸在含有牛胰腺RNA酶A(Boehringer Mannheim；40mg/ml)、0.5MNaCl和1mM EDTA的10mM Tris(pH8.0)中进行消化。使切片在2×SSC中60℃洗1小时，然后在含有0.5％(w/v)硫代硫酸钠的0.1×SSC中60℃洗2小时。然后使切片在含有0.3M醋酸铵的50、70和90％乙醇中脱水，并干燥。将玻片装入X射线盒中，暴露于Hyperfilm b-Max(Amersham)下14-30天。一旦获得了令人满意的曝光，就用核轨迹乳剂(NTB-2；Kodak)涂覆玻片并4℃下暴露7-21天。按照生产商说明书，使乳剂放射自显影并冲印，用苏木精对下层组织切片染色。为了评价非特异性的标记，从Riboprobe GeminiTM系统试剂盒(Promega)中提供的模板产生对照探针。用ScaI使该载体线性化，并用T3聚合酶转录。所致转录反应产生两个产物，一个250碱基和一个1525碱基的核糖核酸探针，只含有载体序列。如上所述对该对照探针混合物作标记，并加入到杂交溶液中至最终浓度为50,000cpm/μl。在对照切片中没有观察到特异性的杂交，即这些切片提供了非常弱的均一的杂交信号，该信号并未按照神经解剖学界标(数据未显示)。
实施例1BAP结合蛋白(BBP)的克隆和分离发展了酵母双杂交(Y2H)基因筛选法来鉴定与人BAP42(APP的42个氨基酸的蛋白水解片段，被认为可能是更具毒性的BAP聚集形式)相互作用的蛋白质。BAP42与酵母Gal4 DNA-结合结构域融合表达，也作为游离肽表达(图1)。用人胎脑cDNA Y2H文库转化该菌株。从大约106个独立转化体中有一个克隆(上文命名为克隆14)产生了始终一致的报道基因活性，并含有与GAL4结构域相连续的重要的开放读码框。cDNA插入物包含984个碱基对，终止于聚A序列。该序列编码201个氨基酸(SEQ ID NO2；氨基酸残基68-269)，其具有的两个区域有足够的长度和疏水性来跨越细胞膜。
从克隆14分离出从文库中衍生的质粒，并用来重新构建Y2H试验株。检测这些株证实，BAP融合蛋白与克隆14蛋白特异性相互作用，尽管该反应很弱。由于疏水性强的蛋白结构域(如跨膜区)抑制了Y2H反应(Ozenberger，未公开的数据)，截短克隆14插入物(后称BBPΔtm)除去疏水性最强的区域，重新测试与BAP的相互作用。观察到与BBPΔtm有强得多的Y2H反应(图2)，这支持了以下见解，即缺失的序列编码了潜在的跨膜(tm)锚位。在GenBank中搜索克隆14的核苷酸序列；这样确定的BAP结合蛋白(BBP)看来是新的。
实施例2BBP 5′末端的分离和确认上述实施例1所述克隆14中所含的BBP cDNA序列缺少蛋白编码区域的5′端，因为没有潜在的起始密码子甲硫氨酸存在。用标准的逆转录酶进行常规的5′端RACE(cDNA末端的快速扩增)多次尝试只添加了27个核苷酸。这些序列包括一个ATG，但是在同一的翻译读框内，没有上游终止密码子以相信这是是起始密码子。启动基因组克隆方法来分离BBP基因的5′末端。
使人基因组λ文库与对应于克隆14的5′序列的400碱基对(bp)随机引导的探针杂交，从而鉴定出10个阳性克隆。用对应于克隆14最上游BBP序列(以及对应于400碱基对探针的5′上游序列)的45碱基核苷酸探针对这些克隆作进一步的特性分析，揭示了10个克隆中有6个包括了前面确定的序列中所含的5′端序列。经测定，其它4个λ克隆代表了其它外显子，这些外显子包含在起初400碱基对随机引导的cDNA衍生的探针内(数据未显示)。对相应于BBP 5′端的代表性克隆的λ噬菌体DNA进行直接循环测序，结果揭示了上游有a500个核苷酸并与克隆14的已知序列重叠。该附加的序列可能在(到达)前面有一个读框内终止密码子的MET之前编码了位于已弄清特性的MET的上游62个附加氨基酸。尽管在最远上游的MET下游有两个MET残基，但是根据标准常规，我们暂时假定人BBP基因的氨基端序列包括了后面有一个读框内终止密码子的第一个5′MET。整个编码区和推导出的蛋白序列显示在SEQ ID NO1和2中。含有该氨基酸序列的质粒(命名为BBP-f1)已经保藏在美国典型培养物保藏中心内，保藏号为98617。
由于5′编码序列从基因组文库获得，因此该区域有可能含有内含子。用两种方法研究这一可能性。首先，用针对5′MET区的正向引物和在原始克隆14内的反向引物扩增脑cDNA以及基因组DNA的序列。两个样品产生的产物大小相同，表明该区域内没有内含子，并确认上游序列与原始序列相连。第二，在改进的5′RACE试验(见上文的材料和方法)中分离出的cDNA序列与从基因组克隆获得的序列相同。这些发现确认了上游序列(来自基因组以及cDNA来源)以及该区域中缺少内含子。
实施例3BBP的特性分析用碱基局部排列对比搜索工具(BLAST；Altschul等人，1990)将BBP序列与Genbank比较。鉴定出两个Caenorhabditis elegans和一个Drosophilamelanogaster基因组序列和大量人、小鼠和其它哺乳动物表达的序列标记。然而，没有获得完全的cDNA序列，也没有获得基因赋予的功能性数据。将BBP蛋白以及获得的表达序列标记的翻译产物进行序列对比，搜索保守性节段，并用MoST(蛋白质基序搜索算法)(Tatusov等人，1994)评价。这些分析揭示了与G蛋白偶联的受体家族之间的潜在进化关系。具体地说，这些分析表明BBP含有两个潜在的跨膜(tm)结构域，这两个结构域与G蛋白偶联受体的tm结构域3和4相当。中间的亲水性环含有特性清楚的三氨基酸基序一天冬氨酸(D)或谷氨酸，其后是精氨酸(R)和芳香族残基(Y或F)(通常称为DRY序列)，这在该受体家族的几乎所有成员中是保守的，并已表明是G蛋白激活的分子触发物(Acharya和Karnik，1996)。这些资料表明BBP代表了一种新的蛋白，它可能含有G蛋白偶联受体超家族成员所共同具有的功能性模件。具体地说，BBP看来保留了两个预测tm结构域之间关键的DRF序列，因此可能具有与G蛋白调节信号通道连接的潜力。
BBP的结构分析表明，它含有一个结构基序，已知该基序是相关的G蛋白偶联受体中的Gα蛋白激活序列。Y2H试验证明了BBBP与G蛋白偶联受体的不同成员之间的相互作用，在图3中有所描述。根据结构预测，BBP被描述成横跨膜两次，其两个末端在腔区室内。不能完全排出其它取向。在Y2H试验中研究了上述潜在的蛋白相互作用。扩增BBPΔtm克隆内含有的BBP序列的两个重叠部分，并克隆到Y2H载体pACT2(表2中的表达质粒pEK216和pEK219以及图4中相应的蛋白质BBPΔN和BBPΔC)中。ΔC构建物缺少两个tm结构域；ΔN构建物编码第一个tm结构域加上前面的52个氨基酸。这些融合蛋白与BAP融合蛋白一起作测定，将其反应与更大BBPΔtm蛋白质表达株的反应作比较。这些结果提示，与BAP关联的主要决定簇包含在BBP区内，预计在拓扑学上与野生型APP蛋白质中的BAP相似。
实施例4人BBP表达的组织分布在描述基因及其产物活性时，第一步是评价BBP mRNA的表达。在所有组织中观察1.25kb的主要转录物(图5A)。在心脏内的表达水平很高。全脑表现出中等水平的表达。从分开的脑区获得的样品均显示出BBP表达(图5B)。令人感兴趣的是，边缘区域含有相对较大量的BBP mRNA。这些是最初产生BAP聚集以及相关神经毒性的脑区域。用BBP-1特异性核糖核酸探针获得的原位杂交放射自显影分析结果表明，在人海马和视网膜内(entorhinal)皮层中，BBP mRNA在中等至大的细胞中表达，表达方式与在神经元中的表达相符，与胶质神经细胞相反(图6)。而且，BBP mRNA在几乎所有海马和视网膜内层神经元中表达，即在杂交信号强度上没有呈现出任何真实或分层的差别。令人感兴趣的是，BBP的表达方式与用针对淀粉样前体蛋白APP的mRNA的核糖核酸探针所观察到的方式(图6)有惊人的相似。总之，在检查的所有组织和所有脑区域中都观察到BBP mRNA。BBPmRNA表达的原位分析还揭示了海马区有广泛的表达。
实施例5BBP表达的细胞系分布还研究了BBP在多种细胞系中的表达，数据从dbEST(生物技术信息国家中心表达序列标记委员会)获得。用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法来定量评价在常用于重组蛋白表达的细胞系以及各种癌细胞系中的BBP mRNA表达。在仓鼠CHO和人HEK293细胞中观察到BBP。在胚胎干细胞系Ntera-2和成神经细胞瘤细胞系IMR32和SK-N-SH中观察到信号。在代表了下列组织来源的癌细胞系中观察到BBP表达结肠(Cx-1，Colo205，MIP101，SW948，CaCo，SW620，LS174T)、卵巢(A2780S，A2780DDP)、乳房(MCF-7，SKBr-3，T47-D，B7474)、肺(Lx-1，A5439)、黑色素瘤(Lox，Skmel30)、白血病(HL60，CEM)、前列腺(LNCAP，Du145，PC-3)。从下列癌细胞系中分离出Northern印迹探测的mRNA，证实BBP表达存在于所有样品中早幼粒细胞性白血病(HL-60)、癌(HeLa S3)、慢性粒细胞性白血病(K-562)、成淋巴细胞性白血病(MOLT-4)、Burkitt′s淋巴瘤(Raji)、结肠直肠腺癌(SW480)、肺癌(A549)和黑色素瘤(G361)。
实施例6BBP与人的选择性相互作用BAP对啮齿类BAP鼠类BAP序列与人序列相比有三个氨基酸取代(G5R、F10Y和R13H)。鼠类肽证明神经毒性减少，且不与人脑匀浆结合(Maggio等人，1992)。因此，感兴趣的是在Y2H系统中评价鼠类BAP与BBP的结合。用上述PCR法进行寡核苷酸定点诱变，使pEK162中的人BAP序列变成编码鼠类肽。所得质粒pEK240与本发明中所用的人BAP融合蛋白表达质粒相同，只是这三个密码子产生了鼠类肽序列的替代氨基酸。用Y2H生物试验比较了BBP融合蛋白与鼠和人BAP融合蛋白之间的相互作用。表达BBP和鼠BAP的菌株不能产生生长反应(图7)。这一发现支持了以下假设，即BBP可能作为BAP神经毒性效应的特异性介质而起作用，该发现还提供了一仲机制来解释鼠BAP神经毒性减少的原因。重要的是，这些资料也描述了Y2H试验中BBP/BAP相互作用的高度特异性，因为三个氨基酸的取代足以完全消除这种结合(图7)。
很明显，本发明除前面所述和实施例中具体描述外还可用其它方式来实施。根据上述理论可对本发明作各种改动和变化，因此，这些变化均在所附权利要求范围内。
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序列表(1)一般信息(i)申请人Ozenberger，Brad A.
Jaxobsen，J.S.
Kajkowski，Eileen(ii)发明名称β-淀粉样肽结合蛋白及其编码聚核苷酸(iii)序列数量2(iv)联系地址(A)收件人America Home Products(B)街道One Campus Drive(C)城市Parsippany(D)州NJ(E)国家USA(F)邮编07054(v)计算机可读形式(A)媒质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本1.30(vi)本申请信息(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)律师/代理人信息(A)姓名Walsh，Andrea C.
(B)注册号34,988(C)文献/卷宗编号98126(ix)电讯信息(A)电话973-683-2169(B)电传973-683-4117(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度810碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子种类mRNA(ix)特征(A)名称/代码CDS(B)位置1..807(xi)序列描述SEQ ID NO1ATG CAT ATT TTA AAA GGG TCT CCC AAT GTG ATT CCA CGG GCT CAC GGG48Met His Ile Leu Lys Gly Ser Pro Asn Val Ile Pro Arg Ala His Gly1 5 10 l5CAG AAG AAC ACG CGA AGA GAC GGA ACT GGC CTC TAT CCT ATG CGA GGT96Gln Lys Asn Thr Arg Arg Asp Gly Thr Gly Leu Tyr Pro Met Arg Gly20 25 30CCC TTT AAG AAC CTC GCC CTG TTG CCC TTC TCC CTC CCG CTC CTG GGC144Pro Phe Lys Asn Leu Ala Leu Leu Pro Phe Ser Leu Pro Leu Leu Gly35 40 45GGA GGC GGA AGC GGA AGT GGC GAG AAA GTG TCG GTC TCC AAG ATG GCG192Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Glu Lys Val Ser Val Ser Lys Met Ala50 55 60
GCC GCC TGG CCG TCT GGT CCG TCT GCT CCG GAG GCC GTG ACG GCC AGA240Ala Ala Trp Pro Ser Gly Pro Ser Ala Pro Glu Ala Va1 Thr Ala Arg65 70 75 80CTC GTT GGT GTC CTG TGG TTC GTC TCA GTC ACT ACA GGA CCC TGG GGG288Leu Val Gly Val Leu Trp Phe Val Ser Val Thr Thr Gly Pro Trp Gly85 90 95GCT GTT GCC ACC TCC GCC GGG GGC GAG GAG TCG CTT AAG TGC GAG GAC336Ala Val Ala Thr Ser Ala Gly Gly Glu Glu Ser Leu Lys Cys Glu Asp100 105 110CTC AAA GTG GGA CAA TAT ATT TGT AAA GAT CCA AAA ATA AAT GAC GCT384Leu Lys Val Gly Gln Tyr Ile Cys Lys Asp Pro Lys Ile Asn Asp Ala115 120 125ACG CAA GAA CCA GTT AAC TGT ACA AAC TAC ACA GCT CAT GTT TCC TGT432Thr Gln Glu Pro Val Asn Cys Thr Asn Tyr Thr Ala His Va1 Ser Cys130 135 140TTT CCA GCA CCC AAC ATA ACT TGT AAG GAT TCC AGT GGC AAT GAA ACA480Phe Pro Ala Pro Asn Ile Thr Cys Lys Asp Ser Ser Gly Asn Glu Thr145 150 155 150CAT TTT ACT GGG AAC GAA GTT GGT TTT TTC AAG CCC ATA TCT TGC CGA528His Phe Thr Gly Asn Glu Va1 Gly Phe Phe Lys Pro Ile Ser Cys Arg165 17O 175AAT GTA AAT GGC TAT TCC TAC AAA GTG GCA GTC GCA TTG TCT CTT TTT576Asn Val Asn Gly Tyr Ser Tyr Lys Val Ala Val Ala Leu Ser Leu Phe180 185 190CTT GGA TGG TTG GGA GCA GAT CGA TTT TAC CTT GGA TAC CCT GCT TTG624Leu Gly Trp Leu Gly Ala Asp Arg Phe Tyr Leu Gly Tyr Pro Ala Leu195 200 205GGT TTG TTA AAG TTT TGC ACT GTA GGG TTT TGT GGA ATT GGG AGC CTA672Gly Leu Leu Lys Phe Cys Thr Val Gly Phe Cys Gly Ile Gly Ser Leu210 215 220ATT GAT TTC ATT CTT ATT TCA ATG CAG ATT GTT GGA CCT TCA GAT GGA720Ile Asp Phe Ile Leu Ile Ser Met Gln Ile Val Gly Pro Ser Asp Gly225 230 235 240AGT AGT TAC ATT ATA GAT TAC TAT GGA ACC AGA CTT ACA AGA CTG AGT768Ser Ser Tyr Ile Ile Asp Tyr Tyr Gly Thr Arg Leu Thr Arg Leu Ser245 250 255ATT ACT AAT GAA ACA TTT AGA AAA ACG CAA TTA TAT CCA TAA810Ile Thr Asn Glu Thr Phe Arg Lys Thr Gln Leu Tyr Pro260 265
(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度269氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子种类蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met His Ile Leu Lys Gly Ser Pro Asn Val Ile Pro Arg Ala His Gly1 5 10 15Gln Lys Asn Thr Arg Arg Asp Gly Thr Gly Leu Tyr Pro Met Arg Gly20 25 30Pro Phe Lys Asn Leu Ala Leu Leu Pro Phe Ser Leu Pro Leu Leu Gly35 40 45Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Glu Lys Val Ser Val Ser Lys Met Ala50 55 60Ala Ala Trp Pro Ser Gly Pro Ser Ala Pro Glu Ala Val Thr Ala Arg65 70 75 80Leu Val Gly Val Leu Trp Phe Val Ser Val Thr Thr Gly Pro Trp Gly85 90 95Ala Val Ala Thr Ser Ala Gly Gly Glu Glu Ser Leu Lys Cys Glu AsP100 105 110Leu Lys Val Gly Gln Tyr Ile Cys Lys Asp Pro Lys Ile Asn Asp Ala115 120 125Thr Gln Glu Pro Val Asn Cys Thr Asn Tyr Thr Ala His Val Ser Cys130 135 140Phe Pro Ala Pro Asn Ile Thr Cys Lys Asp Ser Ser Gly Asn Glu Thr145 150 155 160His Phe Thr Gly Asn Glu Val Gly Phe Phe Lys Pro Ile Ser Cys Arg165 170 175Asn Val Asn Gly Tyr Ser Tyr Lys Val Ala Val Ala Leu Ser Leu Phe180 185 190
Leu Gly Trp Leu Gly Ala Asp Arg Phe Tyr Leu Gly Tyr Pro Ala Leu195 200 205Gly Leu Leu Lys Phe Cys Thr Val Gly Phe Cys Gly Ile Gly Ser Leu210 215 220Ile Asp Phe Ile Leu Ile Ser Mec Gln Ile Val Gly Pro Ser Asp Gly225 230 235 240Ser Ser Tyr Ile Ile Asp Tyr Tyr Gly Thr Arg Leu Thr Arg Leu Ser245 250 255Ile Thr Asn Glu Thr Phe Arg Lys Thr Gln Leu Tyr Pro260 26权利要求
1.一种分离的聚核苷酸，选自(a)包含β-淀粉样肽结合蛋白BBP的核苷酸序列的聚核苷酸，所述的BBP来自保藏号为ATCC98617的克隆BBP1-f1；(b)编码β-淀粉样肽结合蛋白BBP的聚核苷酸，所述的BBP由保藏号为ATCC98617的克隆BBP1-f1内cDNA插入片段编码；(c)包含β-淀粉样肽结合蛋白BBP的核苷酸序列的聚核苷酸，所述的BBP来自保藏号为ATCC98399的克隆pEK196；(d)编码β-淀粉样肽结合蛋白BBP的聚核苷酸，所述的BBP由保藏号为ATCC98399的克隆pEK196内cDNA插入片段编码；(e)聚核苷酸，是以上聚核苷酸(a)-(d)的等位基因变异体；(f)在严谨条件下能够与(a)-(d)中任一聚核苷酸杂交的聚核苷酸。
2.根据权利要求1所述的聚核苷酸，其中所述的聚核苷酸与至少一段表达调控序列操作性连接。
3.一种宿主细胞，是被权利要求2所述的聚核苷酸转化的。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其中所述细胞是真核细胞或原核细胞。
5.一种生产权利要求2所述聚核苷酸所编码的蛋白质的方法，它包括(a)在合适的培养基内培养权利要求3所述宿主细胞培养物；和(b)从培养基中纯化蛋白。
6.一种蛋白质，是用权利要求5所述的方法制得的。
7.一种蛋白质，所含的氨基酸序列由保藏号为ATCC98617的克隆BBP1-f1内cDNA插入片段编码。
8.根据权利要求7所述的蛋白质，其中所述的蛋白质包含氨基酸序列SEQ IDNO2。
9.一种融合蛋白，包含与异源的蛋白或肽序列连接的BBP1。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中的BBP1具有氨基酸序列SEQ IDNO2。
11.一段寡核苷酸，它编码与BBP1序列SEQ ID NO1中部分序列互补的反义序列，并抑制BBP1基因的表达。
12.一种检测样品中编码β-淀粉样肽结合蛋白BBP1的聚核苷酸的方法，它包括(a)用所述聚核苷酸的特异性探针与样品杂交，杂交调节适合所述探针特异性地与所述聚核苷酸杂交；(b)检测所述探针与样品内所述聚核苷酸的杂交情况，其中所述探针含有一段20个以上碱基对的区域，其与聚核苷酸序列SEQ ID NO1的相同性至少为90％。
13.一种抗体，它特异性结合所含的一段区域与SEQ ID NO2的氨基酸序列相同性至少为90％的多肽。
14.检测样品中一段区域与SEQ ID NO2的氨基酸序列相同性至少为90％的多肽的方法，所述方法包括(a)将特异性结合所述多肽的试剂与样品一起培育，培育条件对特异性结合有效；(b)检测所述试剂与样品中所述多肽的结合情况。
15.检测检测样品所含的中一段区域与ATCC98617内cDNA插入片段所编码的β-淀粉样肽结合蛋白的氨基酸序列相同性至少为90％的多肽的方法，所述方法包括(a)将特异性结合所述多肽的试剂与样品一起培育，培育条件对特异性结合有效；(b)检测所述试剂与样品中所述多肽的结合情况。
16.诊断以人β-淀粉样肽BAP表达异常为特征的疾病的方法，包括(a)将表现出人β-淀粉样肽表达异常的样品与所含多肽某区域与SEQ ID NO2的氨基酸序列相同性至少为90％的试剂一起培育，培育条件对所述试剂与所述人β-淀粉样肽的特异性结合有效；(b)检测所述试剂与样品中所述肽的结合情况。
17.诊断以人β-淀粉样肽BAP表达异常为特征的疾病的方法，包括(a)将表现出人β-淀粉样肽表达异常的样品与所含多肽某区域与ATCC98617内cDNA插入片段所编码的β-淀粉样肽结合蛋白的氨基酸序列相同性至少为90％的试剂一起培育，培育条件对所述试剂于所述人β-淀粉样肽的特异性结合有效；(b)检测所述试剂与样品中所述肽的结合情况。
18.一种诊断方法，包括分析来自宿主的样品中有否权利要求1所述的聚核苷酸。
19.鉴定调节β-淀粉样肽结合蛋白活性的化合物的方法，包括(a)在测试培养基中培育包含人β-淀粉样肽的样品，所述的培养基包含所述的待测化合物和一种试剂，该试剂包含的多肽含有与SEQ ID NO2的氨基酸序列相同性至少为90％的区域，培育条件对所述试剂与所述人β-淀粉样肽特异性结合有效；(b)比较所述待测化合物存在和不存在时所述试剂与所述肽的结合情况；和(c)建立步骤(b)中结合差异与调节β-淀粉样肽结合蛋白活性的待测化合物的关联。
20.治疗需要抑制β-淀粉样肽脑内积累的患者的方法，包括给予患者治疗有效量的权利要求7所述的多肽。
21.一种转基因或嵌合动物，含有权利要求2所述的聚核苷酸。
全文摘要
本发明提供结合人β－淀粉样肽的新蛋白质，编码这类蛋白质的聚核苷酸，以及生产这类蛋白质的方法。此外还提供利用本发明聚核苷酸和多肽的诊断、治疗和筛选方法。
文档编号C07K14/47GK1690203SQ20051005297
公开日2005年11月2日 申请日期1998年4月14日 优先权日1997年4月16日
发明者B·A·奥藏伯格, E·M·卡科斯基, J·S·雅各布森, J·A·巴德, S·G·沃克, H·索菲娅 申请人:惠氏