专利名称：胸腺五肽纯化工艺方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域中多肽粗制品的纯化，具体说是涉及用反相制备液相色谱法纯化胸腺五肽的工艺方法。
背景技术：
胸腺五肽(TP-5)是胸腺生成素II第32～36位的氨基残基片段，保留了胸腺生成素的有效生物活性，为细胞免疫的调节药物。具有诱导细胞分化、促进T淋巴细胞亚群发育并活化以及增强巨噬细胞吞噬功能等功能，用于治疗乙型肝炎及肿瘤的辅助治疗。
TP-5的纯化国内外均有报导，国外报导较多，常采用C18柱的制备液相分离纯化方法，流动相均采用0.1V/V％三氟乙酸—甲醇的梯度洗脱，如文献John P.eta Journal ofChromatography，1982.236237～243及Huber.Kalbccher eta.Peptides，1990.31-33中报导。国内有关纯化方法的报导不多，有采用Sephadex G25纯化，如杨国玲等在《甘肃科学学报》1994.Vol.6135～139中所披露，也有采用C18纯化，如张春莉等在《中国生物制品杂志》2003.Vol 16.No.287～89中所披露，但均无详细说明。从公开的资料看，流动相采用梯度洗脱，存在分离因子α较低的不足，一般低于1.11，因而分离效果有待进一步提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种分离效果更好的胸腺五肽纯化工艺方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为该胸腺五肽纯化工艺方法，其先采用反相制备液相色谱法分离胸腺五肽得胸腺五肽洗脱液，浓缩洗脱液，然后去盐，再经浓缩后冻干即得纯品；其中，反相制备液相色谱法分离胸腺五肽所用的色谱柱为C18柱，流动相由甲醇与缓冲溶液组成，其特征在于所述流动相为恒组成流动相，即甲醇在流动相中的含量恒定。
所述缓冲溶液为三乙胺磷酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或三氟乙酸溶液。
所述三乙胺磷酸缓冲溶液的浓度为0.08～0.15M。
所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.04～0.06M。
于所述流动相中甲醇的体积含量为8～12％。
所述C18柱为Waters Delta-Pak C18300 40mm×100mm×3节，每次进样量为来100～200mg。
所述去盐步骤为先调节胸腺五肽洗脱液的PH值至7.5～8.0，然后上Sephadex G25柱，收集有紫外吸收部分。
与现有技术相比，本发明的优点在于1、采用恒组成洗脱液，相对于现有梯度洗脱而言，分离效果更好；2、分离过程中的保留时间短，生产效率高，尤其是采用三乙胺磷酸缓冲溶液与甲醇组成恒组成流动相时，保留时间仅需12分钟左右，生产效率显著提高。
具体实施例方式
图1为流动相组成是体积比为0.1V/V％三氟乙酸溶液∶甲醇＝90∶10时的液相色谱；图2为流动相组成是体积比为0.05M磷酸盐缓冲液∶甲醇＝90∶10时的液相色谱；图3为流动相组成是体积比为0.1M三乙胺磷酸缓冲液∶甲醇＝90∶10时的液相色谱。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一、研究试验(一)、所用仪器、检验条件、试药及对照品1.仪器制备液相色谱仪Wate Prep LC4000；检测器Waters 2487二通道；三锐色谱工作站。
2.制备色谱柱Waters Delta-Pak C18 40mm×100mm×3节；3.试药甲醇 色谱级 黄岩有机化工厂Sephadex G25 法玛西公司三氟乙酸 分析纯 Meco公司磷酸、三乙胺、醋酸铵 分析纯 上海试剂厂4.分析对照品胸腺五肽规格纯度99％ 有效成分含量89％生产公司Sigma公司5.检测方法按胸腺五肽国家标准中的检测方法。
(二)、恒组成洗脱与梯度洗脱的比较以0.1M三乙胺磷酸缓冲液与甲醇体系为流动相，进样量以完全分离为标准。采用以下三种方式比较恒组成时的主峰和主峰前一杂峰的分离因子α，结果见表1。
表1.不同洗脱方式对分离因子α的影响
从表1中可以看出，恒组成洗脱的分离效果明显好于梯度洗脱的分离效果。
(三)、不同恒组成流动相分离效果比较流动相1体积比为0.1V/V％三氟乙酸溶液∶甲醇＝90∶10；流动相2体积比为0.05M磷酸盐缓冲液∶甲醇＝90∶10；流动相3体积比为0.1M三乙胺磷酸缓冲液∶甲醇＝90∶10。
试验中采用少量进样(相当于2mg有效成分)达到完全分离的方法，结果分别见图1、图2、图3。
由图1～图3可知，三乙胺磷酸甲醇体系在三者中分离效果最好，磷酸盐甲醇体系的分离效果次之，三氟乙酸溶液甲醇体系的分离效果较差，可见多肽峰叠合在一起。
(四)、进样样品过载状况下，洗脱时间长短对产品纯度的影响洗脱方式为恒组成洗脱，流动相为三乙胺磷酸甲醇体系，试验选择中度过载(100mg有效成分，约200mg粗制品)进样。采用不同甲醇浓度使洗脱时间不一，主峰部分均分为五段，对五段收集液检测有效成分的纯度，结果见表2。
表2.洗脱时间长短对纯度的影响
从表2中可以看出，同样进样量情况下，洗脱时间长短对产品的纯度有着重大的影响，分离时间过长产品纯度反而不理想。其原因是，随着时间的延长，峰的峰形变宽，峰的拖尾现象加重，而由于主峰前杂峰的拖尾现象，从而导致主峰产品收集液纯度下降。而时间太短则达不到完全分离的目的，各种峰都合并在一起。
(五)、进样量大小对有效成分回收率的影响流动相为三乙胺磷酸甲醇体系，甲醇浓度为10V/V％。同样采用主峰部分均分为五段，对五段收集液检测有效成分的纯度的方法，分别对轻度过载(50mg有效成分，约100mg粗制品)、中度过载(100mg有效成分，约200mg粗制品)、高度过载(200mg有效成分，约400mg粗制品)，其结果见表3。
表3.不同进样量对有效成分回收率的影响
从表3可以看出，轻度过载虽然回收率高，但生产效率不高，中度过载虽然回收率稍低，但生产效率高，而高度过载则不足取。
(六)、去盐方法纯度合格的收集液经旋转蒸发仪浓缩后，用0.1M NaOH调节PH至7.5～8.0，最好是调节至7.5，然后上Sephadex G25柱(80×800mm)，收集有紫外吸收部分，再经浓缩后冻干，即得纯品。利用Sephadex G25去盐虽然处理量小，但处理时间短，可反复上样，工作效率高。
总上所述，本发明方法分离纯化胸腺五肽，相较于现有梯度洗脱而言，分离效果更好。就流动相而言，三乙胺磷酸缓冲液与甲醇组成的体系的分离效果突出，且有利于提高生产效率。保留时间长短对分离效果的影响也很大，在本试验条件下，采用三乙胺磷酸甲醇体系的恒组成洗脱，保留时间以12分钟左右为宜。
为更充分地描述本发明，提供以下具体实施例(见表4)
表4.实施例(表中a、b分别表示流动相为三乙胺磷酸甲醇体系和磷酸盐甲醇体系，进样量为约200mg粗制品，含100mg有效成分。)
权利要求
1.一种胸腺五肽纯化工艺方法，其先采用反相制备液相色谱法分离胸腺五肽得胸腺五肽洗脱液，浓缩洗脱液，然后去盐，再经浓缩后冻干即得纯品；其中，反相制备液相色谱法分离胸腺五肽所用的色谱柱为C18柱，流动相由甲醇与缓冲溶液组成，其特征在于所述流动相为恒组成流动相，即甲醇在流动相中的含量恒定。
2.根据权利要求1所述的胸腺五肽纯化工艺方法，其特征在于所述缓冲溶液为三乙胺磷酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或三氟乙酸溶液。
3.根据权利要求2所述的胸腺五肽纯化工艺方法，其特征在于所述三乙胺磷酸缓冲溶液的浓度为0.08～0.15M。
4.根据权利要求2所述的胸腺五肽纯化工艺方法，其特征在于所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.04～0.06M。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的胸腺五肽纯化工艺方法，其特征在于所述流动相中甲醇的体积含量为8～12％。
6.根据权利要求5所述的胸腺五肽纯化工艺方法，其特征在于所述C18柱为WatersDelta-Pak C1840mm×100mm×3节。
7.根据权利要求5所述的胸腺五肽纯化工艺方法，其特征在于所述去盐步骤为先调节胸腺五肽洗脱液的PH值至7.5～8.0，然后上Sephadex G25柱，收集有紫外吸收部分。
全文摘要
本发明公开了一种胸腺五肽纯化工艺方法，属于生物化学领域中多肽技术领域，其先采用反相制备液相色谱法分离胸腺五肽得胸腺五肽洗脱液，浓缩洗脱液，然后去盐，再经浓缩后冻干即得纯品；其中，反相制备液相色谱法分离胸腺五肽所用的色谱柱为C18柱，流动相由甲醇与缓冲溶液组成，其特征在于所述流动相为恒组成流动相，即甲醇在流动相中的含量恒定。相对于现有梯度洗脱而言，分离效果更好，且分离过程中的保留时间短，生产效率高，尤其是采用三乙胺磷酸缓冲溶液与甲醇组成恒流动相时，保留时间仅需12分钟左右，生产效率显著提高。
文档编号C07K1/20GK1733797SQ200510060559
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月30日 优先权日2005年8月30日
发明者翁士乔, 俞通泰, 张红晖 申请人:宁波市激素制品有限公司