专利名称：真菌分生孢子形状与致病性相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物基因工程和植物保护领域中真菌分生孢子形状与致病性相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
梨孢菌(Magnaporthe，grisea)是子囊菌亚门的真菌，能侵染水稻、小麦、大麦、粟以及其它多种禾本科植物，导致瘟病。尤其是该菌侵染水稻引起的稻瘟病在世界各个栽培稻区每年均有发生，危害广泛、严重。一般情况下，稻瘟病地危害可使水稻减产5-10％，重病田可导致水稻绝收。稻瘟病在我国曾多次流行，也是我国水稻的主要病害之一。1993年，稻瘟病在我国发生大流行，在全面防治的情况下仍然减产上百亿斤。梨孢菌还可侵染钝叶草、狗牙草、假俭草等属的草坪草，造成大面积枯死，是草坪草常见病害。
梨孢菌的分生孢子呈梨形，由三个细胞组成。一般3至5个分生孢子以合轴的方式从一个分生孢子梗的顶端产生。分生孢子释放后，在分生孢子梗上留下屈膝状的疤痕。梨孢菌对植物的侵染起始于分生孢子的形成，其过程包括分生孢子附着到植物叶片上后，经过萌发，附着胞形成与成熟，附着胞内膨胀压的产生与累积，侵染钉产生与植物表皮的直接穿透，植物细胞内侵染性菌丝的形成、分支，侵染性菌丝在植物细胞间和组织间的扩展与定植等几个步骤。梨孢菌侵染感病寄主时，侵染性菌丝在植物组织间的扩展形成直径2-3毫米以上的灰色或灰褐色病斑，这些病斑中的侵染菌丝穿透植物组织向空中分化形成分生孢子梗，进一步形成分生孢子。分生孢子在风、雨的冲刷下释放、附着，引起植物的再侵染。梨孢菌从分生孢子附着到分生孢子再产生的周期一般所需时间为3-5天；在植物的生长季节，如果条件适宜，能够多次侵染，造成危害。因此，梨孢菌的分生孢子是主要的初侵染源和再侵染源，在病害侵染循环中不可缺少。稻瘟病的严重度与梨孢菌形成分生孢子的多少直接相关，所以，人们常通过监测空气中分生孢子量来预测预报病害将要发生的情况。研究梨孢菌分生孢子形成和形态建成的分子遗传不仅对于揭示梨孢菌致病性的分子机制具有重要的理论意义，而且对于指导稻瘟病的防治具有重要应用价值。
目前在梨孢菌分生孢子形成及变异方面的报道比较少，即使有报道一般也都没有关于基因克隆与分子机理的内容。
1989年Hamer等报道了Smo-突变体(Hamer，J.E.，Valent，B.，and Chumley，F.G.，Mutations at the SMO genetic locus affect the shape of diversecell types in the rice blast fungus，Genetics，1989(122)351-361.)是有关梨孢菌分生孢子形态变异方面较早的报道。这个突变体是他们在运用Teflon膜来筛选和获得在附着胞形成上有缺陷的梨孢菌突变体的过程中获得的，这一类型的突变体不能形成正常形态的分生孢子和子囊，但是能形成正常形态的子囊孢子(尽管有一些Smo-的子囊孢子不能萌发)。Smo-突变并不影响菌株正常的营养生长、形成分生孢子、减数分裂以及对寄主植物的侵染。
1993年Shi和Leung报道他们用电穿孔法处理70-15菌株，从可存活的菌中分离到Con1-突变体(Shi，Z.X.，and Leung，H.Genetic analysis and rapidmapping of a sporulation mutation in Magnaporthe grisea，MPMI，Vol.7，No.1，1993，pp.113-120.)，这种突变体与野生型形成分生孢子的形式不同，在每一个分生孢子梗上，只产生一个端生的伸长的三个细胞的分生孢子。Con1-突变体在培养基上的生长和分生孢子的形成分别只有野生型的73％和2.3％，在载玻片或洋葱表皮上不能形成正常的附着胞，并且在原来感病的水稻品种上没有致病性。两年后，Shi和leung报道他们运用REMI获得了一系列的与分生孢子形成有关的突变体Con2--Con7-(Shi，Z.X.，and Leung，H.Genetic analysis of sporulationin Magnaporthe grisea by chemical and insertional mutagenesis，MPMI，Vol.8，No.6，1995，pp.949-959.)。CON1-7(包括1993报道的CON1)分别控制着产生气生菌丝、分生孢子梗、形成分生孢子、形成形态正常分生孢子等一系列过程。
突变体con5-and con6-完全丧失了分生孢子形成能力，con1-、con2-、con4-和con7-作用于con5-和con6-的下游影响产孢能力和分生孢子的发育，con4-和con7-产孢量减少约35％。con1-和con7-不能形成附着胞，因而丧失了对水稻的致病性，con2-和con4-附着胞形成率明显减少，因而致病性明显减弱。通过它们之间的遗传关系分析表明，Con1和Con2连锁，Con5和Con6连锁，并且有Con5＞Con6＞Con7和Con2＞Con1的上位关系。
1998年，Lau等报道他们通过REMI获得了一种形成分生孢子的形式变异的梨孢菌突变体，他们把它称为ACR1-(Lau，G.W.，and Hamer，J.E.AcropetalAgenetic locus required for conidiophore architecture and pathogenicity inthe rice blast fungus，Fungal Genetics and Biology，1998(24)228-239.)。梨孢菌正常从一个分生孢子梗的顶端产生三至五个分生孢子，与此合轴方式不同，ACR1-的分生孢子以成串的方式着生于一个分生孢子梗上，这些分生孢子的顶端细胞不能产生顶端孢子粘液(STM)，因此不能粘附到疏水性的表面。ACR1-的分生孢子产生附着胞的能力也大大减小，能萌发产生芽管的分生孢子中只有5％能形成附着胞，因此致病力也大大减弱。Lau等也克隆了相应的基因，其开放阅读框包括编码633个氨基酸的转录区域，3′端包括长的大约1.3kb的非编码区。研究发现，这个包含633个氨基酸开放阅读框大约2kb，包括多个短的ORFs，与目前数据库中的已知蛋白都缺少同源性。
以上研究报道表明梨孢菌分生孢子的形成及其形态构建是一个很复杂的事件，包括许多与之有关的遗传基因。克隆这些基因，解明它们的分子功能和在梨孢菌分生孢子的形成和形态建成中的作用，从而研究它们对梨孢菌致病性的影响，将有助于搞清楚梨孢菌致病性的分子机制，并有可能从中发现可以作为杀菌剂靶标的蛋白及其基因与启动子，为开发稻瘟病以及其它植物瘟病的有效化学控制途径奠定理论和技术基础。
发明内容
本发明的目的是提供真菌分生孢子形状与致病性相关蛋白及其编码基因。
本发明所提供的真菌分生孢子形状与致病性相关蛋白，名称为MgCOM1，来源于梨孢菌，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质
1)序列表中的SEQ ID №3；
2)将序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与真菌分生孢子形状及致病性相关的蛋白质。
序列表中的序列3由774个氨基酸残基组成。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
MgCOM1的编码基因(MgCOM1)也属于本发明的保护范围。
MgCOM1的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；
3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的序列1由4276个碱基组成，包括三个外显子和两个内含子，自序列1的5′端第786位至956位碱基为第一外显子，自序列1的5′端第957位至1222位碱基为第一内含子，自序列1的5′端第1223位至1485位碱基为第二外显子，自序列1的5′端第1486位至1556位碱基为第二内含子，自序列1的5′端第1557位至3447位碱基为第三外显子；其编码区位于序列1的5′端第786位至3447位碱基之间。自序列1的5′端第1位至785位碱基为启动子序列。
MgCOM1的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；
3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4)与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的序列2由2591个碱基组成，其编码序列为自序列1的5′端第101位至2425位碱基。
所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
含有MgCOM1基因的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增MgCOM1基因中任一片段的引物也在本发明的保护范围之内。
实验证明MgCOM1基因的突变导致梨孢菌产生细长的分生孢子，形成侵染钉和侵染性菌丝的能力减弱，并且在亲和性水稻品种上的致病力减弱。筛选能够破坏掉该基因表达、剪切及其产物的表达、修饰与定位的药物，是本发明的一个重要用途。MgCOM1的核苷酸序列和MgCOM1的氨基酸序列可以作为靶位点应用于抗真菌药剂(特别是抗梨孢菌药剂)的筛选和设计中，也可以以该核苷酸序列的某一区段作为探针在梨孢菌中再分离该序列，也可以用于筛选、分离其它真菌的与该基因具有一定序列同源性的序列。
本发明证明梨孢菌MgCOM1的变异可使分生孢子由梨型变成细长型，并导致致病力显著减弱。因此，可利用该分生孢子的形态变异与致病性变异的相关性筛选杀菌剂。
图1为野生菌株70-15与三个MgCom1的插入突变体的分生孢子形态比较
图2A为野生菌株70-15与MgCom1的插入突变体X54在洋葱表皮上分生孢子的萌发率比较
图2B为野生菌株70-15与MgCom1的插入突变体X54在洋葱表皮上附着胞的形成率比较
图2C为野生菌株70-15与MgCom1的插入突变体X54在洋葱表皮上侵染钉的形成率比较
图2D为野生菌株70-15与MgCom1的插入突变体X54在洋葱表皮上侵染性菌丝的形成率比较
图3为野生菌株70-15与三个MgCom1的插入突变体X54、H3035和H3587在亲和性水稻CO39叶片上形成病斑比较
图4A为互补载体pKNS的示意图
图4B为基因置换载体pPSH的示意图
图5为互补转化体CX54与野生菌株70-15的分生孢子形态比较
图6A为互补转化体CX54与野生菌株70-15和MgCom1的插入突变体X54在洋葱表皮上分生孢子的萌发率比较
图6B为互补转化体CX54与野生菌株70-15和MgCom1的插入突变体X54在洋葱表皮上附着胞的形成率比较
图6C为互补转化体CX54与野生菌株70-15和MgCom1的插入突变体X54在洋葱表皮上侵染钉的形成率比较
图6D为互补转化体CX54与野生菌株70-15和MgCom1的插入突变体X54在洋葱表皮上侵染性菌丝的形成率比较
图7为野生菌株70-15和三个MgCom1的插入突变体X54、H3035、H3587和相应的互补转化体CX54、CH3035、CH3587对亲和性的水稻品种CO39的致病性比较
图8为基因置换转化体K204与野生菌株70-15的分生孢子形态比较
图9A为野生菌株70-15与基因置换转化体K204在洋葱表皮上侵染钉形成率的比较
图9B为野生菌株70-15与基因置换转化体K204在洋葱表皮上侵染性菌丝形成率的比较
图10为野生菌株70-15与基因置换转化体K204在洋葱表皮上接种后24小时时形成侵染钉和侵染性菌丝的差异
图11为野生菌株70-15与突变体X54，H3035，H3587及基因置换转化体K204对亲和性的水稻品种CO39的致病性比较
图12Aa为互补载体pKNSP1.8的结构示意图
图12Ab为用pKNSP1.8转化基因置换转化体K204后得到的转化体的分生孢子形态
图12Ba为互补载体pKNSP1.0的结构示意图
图12Bb为用pKNSP1.0转化基因置换转化体K204后得到的转化体的分生孢子形态
图12Ca为互补载体pKNSP0.8的结构示意图
图12Cb为用pKNSP0.8转化基因置换转化体K204后得到的转化体的分生孢子形态
具体实施例方式
为了更好的理解本发明，以下通过实施例予以进一步地说明，但并非对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、真菌分生孢子形状与致病性相关蛋白MgCOM1及其编码基因的获得
一、突变体的筛选与鉴定
1、梨孢菌菌株70-15的REMI转化体库的构建
通过碱裂解法大量提取pUCATPH(Lu，S.，Lyngholm，L.，Yang，G.，Bronson，C.，Yoder，O.C.1994.Tagged mutant s at the Toxl locus of Cochliobolusheterostrophus by restriction enzyme-mediated integration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA911264-12653)的质粒DNA，分别用限制性内切酶HindIII、KpnI、SacI和SmaI酶切将其线性化，按REMI转化的方法(Shi Z.，Christian D.，& LeungH.，Enhanced transformation in Magnaporthe grisea by restriction enzymemediated integration of plasmid DNA.Phytopathology，1995，85329-333.)转化野生型的梨孢菌菌株70-15。每个转化体系中加入2微克线性化的质粒和相应的限制性内切酶，其中KpnI、HindIII、SacI和SmaI分别采用30U、45U、30U和15U。具体的步骤见实施例二的第二部分梨孢菌的转化。
2、分生孢子的制备
将梨孢菌菌株70-15的各REMI转化体的菌丝充分打断，均匀地涂布到西红柿汁燕麦片培养基(每升含150ml西红柿汁、30-50克燕麦片煮沸30分钟过滤取滤液、20克琼脂)平板上，26℃-28℃培养，当肉眼可见新生菌丝长出培养基表面时，用棉签轻轻将菌丝洗下，并用水冲洗干净，盖上单层纱布，于26℃-28℃光照培养48小时，在培养基表面即可见大量的梨孢菌孢子。
3、分生孢子形态变异突变体的筛选
在放大倍数为10×40的显微镜下观察梨孢菌菌株成熟分生孢子的形态，每个菌株分别测量50个成熟分生孢子的长和宽。结果共获得三个类似形状变异的突变体X54，H3035，H3587。这三个突变体的分生孢子比野生型的梨孢菌70-15的分生孢子在形状上要长而且窄(图1，A为70-15，B为X54，C为H3035，D为H3587)。三个突变体与野生型菌在分生孢子的长度和宽度上的差异比较如表1。
表1.三个突变体与野生型菌的分生孢子的长度和宽度
注差异显著性均为B的两组之间在5％的显著范围内没有差异，差异显著性为A和B的两组之间在5％的显著范围内差异显著。
4、致病性的测定
采用步骤2所述的方法培养梨孢菌的分生孢子，孢子洗下后用双层擦镜纸过滤于50毫升的离心管中，4000转/分室温离心5分钟收集孢子，然后悬浮于0.25‰(体积比)的吐温20中。调整分生孢子浓度到每毫升5×104个孢子，均匀地喷雾接种于五叶一心期的亲和性水稻品种CO39幼苗的叶片正面。用同样的方法制备分生孢子的悬浮液，调整分生孢子浓度到每毫升5×105个孢子，均匀地喷雾接种于新鲜的洋葱内表皮的正面。分别在接种后2小时，6小时，12小时，24小时，36小时，48小时和72小时于显微镜下观察分生孢子的萌发，附着胞、侵染钉及侵染性菌丝的形成等过程，并计算分生孢子的萌发率和附着胞、侵染钉及侵染性菌丝的形成率。
结果表明在洋葱表皮上三个突变体形成侵染钉和侵染性菌丝的比率比野生型的低，其中野生型70-15和突变体X54在洋葱表皮上形成侵染钉和侵染性菌丝的比率如图2A-图2D和表2所示。
表2.70-15和X54在接种洋葱表皮后24、36和48小时形成侵染钉和侵染性菌丝的比率
在亲和性水稻品种CO39叶片上，三个突变体的致病力也比野生型的低，其中，三个突变体与野生型菌株在CO39叶片上形成扩展性病斑和褐斑的数的比较结果如表3所示；野生菌株70-15与三个突变体X54、H3035和H3587在亲和性水稻CO39叶片上形成病斑如图3所示，图中A为70-15，B为X54，C为H3035，D为H3587。
表3.三个突变体与野生型菌株在CO39叶片上形成扩展性病斑和褐斑的数的比较
二、突变体表型变化与插入标记共分离分析
用遗传杂交的方法对突变体中插入标记潮霉素抗性基因与突变表型的共分离进行分析，将此三个突变体分别与一个不具有突变表型和潮霉素抗性，并且交配型相反的梨孢菌菌株GUY11进行杂交，分析其子囊孢子后代的分生孢子形状及潮霉素抗性情况，具体方法如下
将上述突变体X54、H3035和H3587分别与不具有潮霉素抗性，分生孢子形态正常的梨孢菌菌株Guy11在西红柿燕麦片培养基上进行对峙培养。首先于25℃培养至菌落边缘即将接到一起，然后将其移至20℃光照培养，约20天左右在菌落的交界处形成黑色突起的子囊壳。挑取成熟的子囊壳，于无菌水中轻轻挤破，释放壳内的子囊，将子囊悬浮液涂在水琼脂平板上，24小时后挑取子囊内子囊孢子萌发的单根菌丝于西红柿燕麦片培养基上培养。统计这些子囊孢子后代的潮霉素抗性和分生孢子形态。结果如表4所示，表明在测定的子囊孢子后代中，分生孢子形状突变的后代都具有潮霉素抗性，说明这三个突变体的分生孢子形状突变的表型与插入标记潮霉素抗性基因是共分离的。在突变体X54与Guy11的杂交后代中，抗潮霉素的后代全是突变表型，而突变体H3035和H3587与Guy11的杂交后代中，抗潮霉素的后代有些是突变表型的，有些则是野生型表型的，说明在突变体X54中插入标记潮霉素抗性基因只插入在基因组的一个位点，而在突变体H3035和H3587中插入标记潮霉素抗性基因可能插入在基因组的两个或两个以上不同的位点。
表4.Guy11与三个突变体杂交后代的潮霉素抗性和分生孢子形态
三、与梨孢菌分生孢子形状有关的MgCOM1基因的克隆
1.质粒拯救及基因组TAC文库的筛选
分别通过对三个突变体中插入质粒的拯救，获得了相应的插入位点侧端的基因组序列，并确定了三个突变体中质粒的插入位置。具体方法如下选取插入质粒pUCATPH(Lu，S.，Lyngholm，L.，Yang，G.，Bronson，C.，Yoder，O.C.1994.Tagged mutants at the Toxl locus of Cochliobolus heterostrophusby restriction enzyme-mediated integration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA911264-12653)中pUC18部分没有酶切位点的限制性内切酶完全消解突变体的基因组，突变体X54和H3587选用限制性内切酶BamHI消解，突变体H3035选用限制性内切酶EcoRV消解。乙醇沉淀精制后用T4DNA连接酶进行自连接，转化大肠杆菌的感受态细胞JM109。提取转化体的质粒，并进行酶切鉴定。酶切鉴定正确的质粒中除含有pUCATPH中pUC18部分的序列外，还含有部分插入位点侧端的基因组的序列。对鉴定正确的质粒进行测序然后到数据库中检索，分析插入位点附近的基因的范围和可能的外显子。结果表明在突变体X54中，质粒插入在一个限制型内切酶SmaI的酶切位点处，对应于SEQ ID NO.1中的第174位；在突变体H3035和H3587中，质粒插入在一个限制型内切酶HindIII的酶切位点处，对应于SEQ ID NO.1的第2120位和SEQ ID NO.2中的第1098位。将获得的侧端序列与国际稻瘟菌基因组协会的官方网站(http//www.riceblast.org/)已公布的梨孢菌的基因组数据库比较，这两个插入位点都位于第I号染色体的contig2.217。以这两个位点之间的一段1392bp的DNA片断(序列4)为探针，筛选梨孢菌70-15的基因组TAC文库(其平均克隆片段大小为50kb，共覆盖全基因组的16-18倍，该基因组TAC文库按照文献魏士平等(Construction and Evaluation of a TAC Library of Magnaporthe grisea，植物病理学报，2003，3357-62)描述的方法构建)，获得四个阳性克隆，它们都包括MgCOM1的基因组基因(SEQ ID NO.1所示的第1位到第4276位的核苷酸序列)。
质粒拯救过程中涉及到的限制性内切酶和T4DNA连接酶由宝生物工程(大连)有限公司生产，参照使用说明书使用。
2、RT-PCR和5’RACE获得MgCOM1的cDNA基因
按照步骤一中2所提到的制备分生孢子的方法收集产孢时间为24小时的梨孢菌菌株70-15的分生孢子，异硫氰酸胍(GT)法抽取总RNA，消解其中的DNA，然后以poly(T)为引物用SuperscriptIITM的反转录酶进行反转录，得到分生孢子总cDNA的第一条链。利用英国Exeter大学的建立的植物病原真菌的EST数据库(http//cogeme.ex.ac.uk/)，从3’非翻译区和两个不同外显子中设计如下两对RT-PCR引物609’5’-CTTTTGCCATAACTCTGAGC-3’和down64285’-GGTGCCCTGACAGTAGTTTCC-3’；20695’-ACACCACTTGCTAAGAAGTTC-3’和prepoly35’-CACCTGGTATAGGAGATCCG-3’，扩增基因的3’端cDNA序列。将扩增得到的cDNA片段连接到T-载体上后测序，利用测序得到的5’端的序列设计5’RACE引物包括基因特异性反转录引物RT primer5’-CTCATCTTCGTC-3’，和如下两对PCR引物A15’-TTCGGATCGGTAACGTAGAGG-3’和S15’-CAACCCGACGATGCCAATA-3’；A25’-CTGTGTTGCCGCCGTAGAGGA-3’和S25’-CAAGAAGCCCAAGTACATGCC-3’，扩增基因5’端的cDNA序列。5’RACE的实验方法参照宝生物工程(大连)有限公司的5’Full RACE Core Set。同样将所获得的cDNA片段连接到T-载体上后测序，并拼接分别测得的基因的3’端和5’端的cDNA序列。结果表明MgCOM1的cDNA基因具有SEQ ID NO.2所示的第1位到第2591位的碱基对。其编码序列为自SEQ ID NO.2的第101位到第2425位碱基，编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的蛋白质MgCOM1。将MgCOM1与NCBI的蛋白质数据库进行比较，该蛋白质属于一种新的蛋白质，它与所有已知的蛋白质的相似性都很低，只与赤霉菌的一个假定蛋白(登录号为EAA67862.1)有36％的一致性，与粗糙脉胞霉的一个预测蛋白(登录号为EAA35776.1)有33％的一致性。
将序列1的基因组基因的核苷酸序列与序列2的cDNA序列进行比较，结果表明MgCOM1的基因组基因中包含两个内含子，这两个内含子的剪切都符合“GT-AG”原则，自序列1的5′端第786位至956位碱基为第一外显子，自序列1的5′端第957位至1222位碱基为第一内含子，自序列1的5′端第1223位至1485位碱基为第二外显子，自序列1的5′端第1486位至1556位碱基为第二内含子，自序列1的5′端第1557位至3447位碱基为第三外显子；其编码区位于序列1的5′端第786位至3447位碱基之间。
实施例2、MgCOM1及其编码基因功能的确认
包括互补实验和基因置换实验。在这部分内容中包括互补载体和基因置换载体的构建以及将上述两类载体导入梨孢菌中，得到梨孢菌的重组转化体。互补载体的构建是指将包含预测的MgCOM1的全长的基因组基因(梨孢菌基因组数据库中contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)的DNA片断与一个带有新霉素抗性基因的载体相连，在这里新霉素抗性基因并不是对本发明的限制，其他能导致抗生素抗性的基因，即潮霉素抗性基因之外的导致真菌抗性的基因都可以达到同样的效果。互补载体所导入的梨孢菌受体菌株是三个突变体为梨孢菌X54、H3035和H3587。基因置换载体的构建是指将包括预测的MgCOM1的全长的基因组基因(梨孢菌基因组数据库中contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)连入一个载体中，然后用潮霉素抗性基因替换掉MgCOM1的基因组基因的大部分。基因置换载体所导入的梨孢菌菌株是野生型梨孢菌70-15，基因置换载体通过基因两侧的侧翼序列与野生型菌株基因组的相应序列发生同源重组，从而将基因组中相应位点MgCOM1的基因组基因部分序列与潮霉素基因置换。
一、互补载体和敲除载体的构建
1.基因的预测
首先将三个突变体X54、H3035和H3587中质粒插入位点所在的contig2.217的序列用软件GENESCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)进行预测，结合国际稻瘟菌基因组协会的官方网站(http//www.riceblast.org/)中对梨孢菌基因组中基因的预测，三个突变体X54、H3035和H3587中质粒的插入位点都包括在负链上同一个预测的MgCOM1的基因组基因(梨孢菌基因组数据库中contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)中。尽管GENESCAN中三种预测模式(Arabidopsis、Maize和Vertebrate)和国际稻瘟菌基因组协会的官方网站中对这个基因的定位和外显子-内含子结构不一致，但是contig2.217中两个限制性内切酶SphI位点(从contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)之间的序列都能包含这几种模式对这个基因所预测的范围，而且除了这个基因外不再包括别的基因。
2.互补载体的构建
首先合成带有限制性内切酶XbaI识别序列的引物从克隆质粒载体pS65T-C1(gi1019893)中扩增出新霉素磷酸转移酶基因连入pBlueScriptKS(+)的限制性内切酶切位点XbaI间，得到的质粒载体命名为KN。然后从实施例1中步骤三的1中所得到的阳性克隆中用限制性内切酶SphI切下包含有预测的MgCOM1的基因组基因(梨孢菌基因组数据库中contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)的DNA片断，末端补平后与限制性内切酶EcoRV酶切的KN连接，得到包含有预测的MgCOM1的基因组基因(梨孢菌基因组数据库中contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)和选择标记新霉素磷酸转移酶基因的互补载体pKNS(图4A)。构建过程中涉及到的限制性内切酶和连接酶，末端补平酶由宝生物工程(大连)有限公司生产，参照使用说明书使用。
3.敲除载体(基因置换载体)的构建。
参照GENESCAN中三种预测模式(Arabidopsis、Maize和Vertebrate)和国际稻瘟菌基因组协会的官方网站中所预测的MgCOM1的基因组基因的外显子-内含子的结构，两个限制性内切酶XhoI和ApaI位点(从contig2.217的第6332位的核苷酸至第13228位的核苷酸)之间的序列能包括MgCOM1的基因组基因的大部分(包括序列1的1-2847位，和基因组中这段序列上游的约4049bp的序列)而不包括任何别的基因。一方面从实施例1中步骤三的1中所得到的阳性克隆中用限制性内切酶SphI切下包含有预测的MgCOM1的基因组基因(梨孢菌基因组数据库中contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)的DNA片断，与同样限制性内切酶SphI酶切的pUC18连接，命名为PS2；另一方面用限制性内切酶XbaI从质粒载体pUCATPH中切下潮霉素磷酸转移酶基因与同样限制性内切酶切的pGEM7zf(+)连接，得到的质粒载体命名为p7h6；然后用限制性内切酶XhoI和ApaI从质粒p7h6中切下潮霉素磷酸转移酶基因与同样酶切的PS2连接，得到基因置换载体pPSH(图4B)，这样质粒载体pKNS中的预测的MgCOM1的基因组基因(梨孢菌基因组数据库中contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)的XhoI和ApaI位点之间的序列就被潮霉素磷酸转移酶基因所代替，在潮霉素磷酸转移酶基因的两侧分别留下1958bp和1657bp的MgCOM1的基因组基因的侧端序列。
二、梨孢菌的转化。
梨孢菌的转化首选REMI的方法。REMI的原意为限制性内切酶介导的整合，采用不破坏载体内基因的限制性内切酶将载体线性化，在限制性内切酶的介导下转化梨孢菌的原生质体，被转化的质粒随机的整合到基因组中相应的限制性内切酶的切点处。在本发明中，梨孢菌的转化中省略了限制性内切酶的应用，转化效率会比添加限制性内切酶的方法低，但不影响被转化质粒整合到基因组中。原生质体的制备和转化方法如下
1.原生质体的制备
500毫升三角瓶装入150毫升液体CM培养基(酵母提取物0.1％，酶水解干酪素0.05％，葡萄糖1％，硝酸钙0.1％，磷酸二氢钾0.02％，硫酸镁0.025％，氯化钠0.015％)，分别接入梨孢菌70-15、X54、H3035和H3587的1×106个分生孢子，在26-28℃、100转/分条件下摇培30-32小时，三层灭菌擦镜纸过滤收集菌丝体，菌丝体用0.7M氯化钠溶液洗涤后转移至灭菌的50毫升离心管中，每1克菌丝加入1毫升的酶渗透液(含20毫克/毫升崩溃酶，用0.7M氯化钠配制)，26-28℃、100转/分条件下酶解3-4小时后，用0.7M氯化钠洗涤菌丝体，经三层灭菌擦镜纸过滤，收集原生质体，4,000转/分离心15分钟，先用25毫升STC(1.2M山梨醇，10mM Tris-Cl，pH 7.5，50mM氯化钙)洗涤原生质体一次，然后分别用10毫升STC洗2次，离心沉淀后用STC将原生质体浓度调至0.5-1×108个/毫升。
2.梨孢菌转化
分别将梨孢菌70-15、X54、H3035和H3587原生质体分装于灭菌的50毫升离心管中，每管150微升，分别加入等体积的线性化的载体(约2微克，梨孢菌70-15的离心管中加入用限制性内切酶SmaI线性化的基因置换载体pPSH，梨孢菌X54、H3035和H3587的离心管中分别加用限制性内切酶NotI线性化的互补载体pKNS)和STC混合液，冰上放置20分钟，然后逐滴缓慢加入2毫升/管PTC溶液(60％聚己二醇3350，10mM Tris-pH 7.5，50mM氯化钙)，冰上静止20分钟，加入25毫升/管冰冷的STC，缓慢混匀，4,000转/分、4℃离心15分钟，去上清，然后每管加入3毫升的LR培养基(0.1％酵母提取物，0.1％酶水解干酪素，1M蔗糖)，室温静置培养12-13小时后，转入培养皿，加入12毫升冷却至50℃的SR(LR+1.6％琼脂)，混匀，待其凝固吹干后，上面铺一层12毫升的0.7％上层琼脂(冷却至50℃，含400微克/毫升的G418(互补实验)或300微克/毫升的潮霉素(美国Roche公司生产，基因置换试验)。28℃培养4-6天，将出现的转化体(梨孢菌三个突变体X54、H3035和H3587的互补转化体分别为CX54、CH3035和CH3587；梨孢菌70-15的基因置换转化体K204)转至固体CM培养基(0.6％酵母提取物，0.3％酶水解干酪素，0.3％酸水解干酪素，1％的蔗糖，1.6％琼脂)(含400微克/毫升的G418(互补实验)或250微克/毫升的潮霉素(基因置换试验)上，二次筛选后将单个菌落转入燕麦片番茄培养基上培养，并进行单孢分离。
互补实验的结果表明互补载体在梨孢菌三个突变体X54、H3035和H3587基因组中的异位整合使这三个突变体的分生孢子的形状恢复野生形态。三个突变体的互补转化体CX54、CH3035和CH3587的分生孢子的长度和宽度与野生型菌70-15的比较如表5所示。突变体X54的互补转化体CX54和野生型菌70-15的分生孢子形态如图5所示，图中标尺为5微米。
表5.互补转化体与野生型菌70-15的分生孢子的长度和宽度
注差异显著性均为A的两组之间在5％的显著范围内没有差异。
互补载体在三个突变体基因组中的异位整合使这三个突变体的致病力也恢复到野生型的水平，包括在洋葱表皮上的侵染钉和侵染性菌丝的形成率，以及在亲和性水稻品种CO39叶片上形成病斑的数。其中，突变体X54和相应的互补转化体CX54在接种后24小时、36小时和48小时在洋葱表皮上形成侵染钉和侵染性菌丝的比率及与野生型菌的比较如表6和图6A-图6D所示；野生菌株70-15和三个MgCom1插入突变体X54、H3035、H3587和相应的互补转化体CX54、CH3035、CH3587在亲和性水稻品种CO39叶片上形成病斑的数如图7所示。图7中，A为70-15，B为X54，C为H3035，D为H3587，E为CX54，F为CH3035，G为CH3587。
表6.70-15，X54和CX54在洋葱表皮上形成侵染钉和侵染性菌丝的比率
基因置换试验的结果表明MgCOM1的部分基因组基因序列与潮霉素基因序列的置换导致转化体K204所产生的分生孢子的形状具有与本发明中的三个突变体X54、H3035和H3587一样的变异。基因置换转化体K204的分生孢子的长度和宽度及与野生型菌70-15、突变体X54、H3035、H3587的比较结果如表7所示。其中，基因置换转化体K204与野生菌株70-15的分生孢子形态比较如图8所示，图中，A为70-15，B为K204，标尺为25微米。MgCOM1的部分基因组基因序列与潮霉素基因序列的置换也导致转化体的致病力减弱，包括在洋葱表皮上的侵染钉和侵染性菌丝的形成率，以及在亲和性水稻品种CO39叶片上形成病斑的数。其中，基因置换转化体K204与野生型菌70-15在洋葱表皮上接种后24小时、36小时和48小时形成侵染钉和侵染性菌丝的比率如表8和图9A和图9B所示。野生菌株70-15与基因置换转化体K204在洋葱表皮上接种后24小时时形成侵染钉和侵染性菌丝的差异如图10所示，图中A为70-15，B为K204，标尺为30微米。基因置换转化体K204与野生型菌70-15在CO39叶片上形成扩展性病斑和褐斑的数量如表9所示。野生菌株70-15与突变体X54，H3035，H3587及基因置换转化体K204对亲和性的水稻品种CO39的致病性比较如图11所示，图中A为70-15、B为X54、C为H3035、D为H3587、E为K204。
表7.转化体K204与野生型菌70-15、突变体X54、H3035和H3587的分生孢
子的长度和宽度比较
注差异显著性均为B的两组之间在5％的显著范围内没有差异，差异显著性为A和B的两组之间在5％的显著范围内差异显著。
表8.基因置换转化体K204与野生型菌70-15在接种后24小时、36小时和48小
时形成侵染钉和侵染性菌丝的比率
表9.基因置换转化体K204与野生型菌70-15在CO39叶片上形成扩展性病斑和褐
斑的数量
实施例3、启动子区域的确定
一、启动子区域的确定
通过将序列2的MgCOM1的cDNA基因序列和预测的MgCOM1基因组基因的全长(梨孢菌基因组数据库中contig2.217的第4370位的核苷酸至第14885位的核苷酸)进行比较，后者包括基因起始密码子前约6.4kb的序列，而这段序列中基因起始密码子前约2kb的序列中没有预测到保守的启动子序列和顺式作用元件(http//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/proscan/)。因此通过寻找能够互补基因置换转化体的最短的序列来确定启动子序列。在该实施例中，共构建了包括基因起始密码子之前1814bp，983bp和785bp等三种不同长度的序列作为启动子序列和MgCOM1基因相连的互补载体。
本实施例中首先构建了两个限制性内切酶PstI位点之间5299bp的片断(从contig2.217的第4912位的核苷酸至第10211位的核苷酸)和新霉素磷酸转移酶标记相连的互补载体pKNSP1.8(图12Aa，从互补载体pKNS中用PstI切下5299bp的片断与同样酶切的KN连接得到)，这个载体包括MgCOM1的基因组基因起始密码子前1814bp的启动子序列和终止密码子后829bp的终止序列。用pKNSP1.8转化基因置换转化体K204，结果表明所得的转化体的分生孢子形态(图12Ab)和致病力能够恢复到野生型的水平。
本实施例在互补载体pKNSP1.8的基础上，选用限制性内切酶切逐步缺失掉831bp(HindIII和EcoRI酶切pKNSP1.8回收919bp的包含启动子部分，与EcoRI和PstI酶切pKNSP1.8回收3553bp的MgCOM1基因部分，共同连入HindIII和PstI酶切的KN连接)和1029bp(KpnI酶切pKNSP1.8，除要缺失掉的PstI和KpnI之间1029bp的部分外，回收其他的部分连接)，分别得到包括MgCOM1的基因组基因起始密码子前983bp和785bp的启动子序列的互补载体pKNSP1.0(图12Ba)和pKNSP0.8(图12Ca)。用这两个载体分别转化基因置换转化体K204，结果表明这两个载体转化所得到的转化体的分生孢子形态(图12Bb和图12Cb)和致病力都能够恢复到野生型的水平。证明能够正常启动MgCOM1的基因组基因的启动子至少应包括从翻译起始密码子上游的785bp的序列，即如SEQ ID NO.1所示的第1位到第785位的核苷酸序列。
二、两种不同长度启动子序列所启动的基因在梨孢菌侵然过程中不同发育阶段的表达
首先合成分别带有限制性内切酶EcoRI识别序列的引物从克隆质粒载体phGFP-S65T(gi1289374)中扩增出绿色荧光蛋白基因(GFP)连入pBlueScriptKS(+)的限制性内切酶切位点EcoRI间，得到的质粒载体命名为KSG。合成分别带有限制性内切酶HindIII和EcoRV酶切位点的引物从pKNSP1.8中扩增983bp的启动子部分连至KSG的HindIII和EcoRV酶切位点间，得到包含有983bp启动子和GFP基因的载体pNpSal；合成分别带有限制性内切酶KpnI和EcoRV酶切位点的引物从pKNSP1.8中扩增的785bp启动子序列部分连至KSG的KpnI和EcoRV酶切位点间，得到包含有785bp启动子和GFP基因的载体pKPG；将pNpSal和pKPG分别转化野生型菌株70-15，结果表明pNpSal和pKPG分别转化野生型菌株70-15得到的转化体在分生孢子，芽管，附着胞及侵染性菌丝中都有不同强度GFP的表达。
序列表
<160>1
<210>1
<211>4276
<212>DNA
<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)
<400>1
ggtacccggc cggaacgcct ggcccctgca actcaccaac tccgccctcc actgacgttc60
ccactccatt tctcgtgcct ctttcgttgc tcgctccacc cacccatcca ttctttgcct120
gcgtgcgtgt cggggcgatc ccaggtgcat cttccgtacg acctctttcg ccccgggttt180
gctttgtact gcctttgctc tgcttgctca tcactgcttg cgagtgagtg tggtgtctgt240
acgccctctt tggaaacaac tgttggatca cttcttgctc cgtccttctt ttttcccggc300
cattgttctt tggatctgcc aatttacttg ttacctcatc actgaactgg caaccccctg360
ttcctctcgt ttctttgctt tactctaccc gctctgcatc ctgctcccag ttattcggtt420
ttctttggac cgacattaac actttccctt tcgatatcga ccgcctcctt agctcgccag480
gaacctccag aagatctatc ggcatacaat gaggtgaaga gtgctgcacc acggaaggat540
actggcagca ttgaaagcct gaagaacgtc tgtcggcttc ggccgcccgc caccctcggc600
tggtctgaca actgacgtcc tcttaccccc tttactctct tgacgaaacc aacaacaacc660
cattcttttt cgactaatgc caatcgacct gaccacgacc gaccacgata acgagccagc720
ggaattctcg ttgtgaattg aactcggacg aaaagcaaga cggccgagcc gagttgccca780
tcaagatgtc tctcgtcatt ccggcagggg gtctggagct ggagacgtcg gtcgacaaga840
tgaccagtct cccgctccag gcttttgcca taaccctgag cgatgacatg cttgaggacc900
tgatagacag cttccaaaat ggccaggaga tcgagttgtc cctggggcag tcaccggtag960
gtttattttg gatcgaaccc caatagtgat gcctctttgg aggtaccttg ctgtttgcct1020
ttgcccatca attgcctgga tacaatcaga ataattcttg tgattgtgaa caatagcttt1080
agaagaaaag ctggtctctg tgcgctcccg caacctgctt ggcgaagata gcatttagcc1140
ctaaatctcg accatgcatg aaccataact cacctatccg tcaacttacg atccactgac1200
actattctgt tcgtatctca aggctttcct ctacggcggc aacacagcac ccatcactcg1260
aatccccgag aatttctcct acgacctcta cgttaccgat ccgaactcgc ccgaaacggc1320
tagccttgca cccaacccga cgatgccaat attcaagaaa caacacctca acttggtcaa1380
gaagcccaag tacatgccaa agggcttcat tgacgaagat gaggccccgg agctgggagc1440
tttagagatc atcgagaacc cggaaaagtc tcagacgtcc tcacagtatg cattctgtgt1500
ccaactgacc tttttaccca gtggtcaggt aactaacggt agagctcact ttaaaggtcc1560
aagagctctt cacttcaacc tcagtctgcg ctgaacaaga agccgaagtc tgcgacggcc1620
gggaagaaga cggcggctag taatgcgata accatgtcca cacaggctcg ctcgcgtccg1680
acaagcccgg caatcagcgc cgttggctct cctcttcccg agtcgtcgat cgaatcttcg1740
caccagcaaa tcgtgaagga ggctaaagaa ctacgcgcac cgctcatcca cgccctcgct1800
gttcgggaga tgacatatga cgaactctgg gagaagtggg gcaagggtga tgatgacgag1860
tcgaggcggg agttccgtaa tattctgagc aaggtcgccg agcaggtcaa gaactctaac1920
aagtacatga tgaagaagaa ccactggaag gagttggatg tctggaatca caattacgac1980
tcggattcgg accgccaaac cgccatcgac aatgctgtgc ggcactttga caagatgcga2040
attggtgcct cggagccaga gtggcagaag ctgttgccgt ttgacgaccg tggaaagggc2100
aagtgtctga gcaagcttca agcttcgtta gccaggggcc cgaaaggact cactgttcac2160
gttcagaatg cagacgatac gagcggagct ggttcgccag acacggacaa ccgctctatc2220
agcgggtcgc agcccatgtc caggtcgagc tcacaaaaca agccaaagaa ggcagtcgaa2280
aagaaaccag ctgtttcagc accgaaaaag ccgaccgctc ccaaggtttc tccctccaag2340
cccgccgcca agccggcagc caagacagga gccagaggtc cgctatcaaa agaaatcatc2400
accgattctg acgaatccag tgacgagatc ccgctttcgc agacaaagaa cgtggtcaaa2460
aaacaagcgg cacctgcggt gagggctccc aagcctccaa tatctgcacc agtttcgggt2520
ccttcgtccc ttcccaagaa gcccccgcca cctgcggcac gcgagccagc caagccgcag2580
atcacagcaa agccgccggt gaagagacca cgcgaggagg aggacagcag ttccagctcg2640
ggcacaccac ttgctaagaa gttcaaggtc aaggagccag tgagggcacc aaaagagccc2700
atcagggcac cgaaagaacc tatcagggcg ccaaaggaaa ctactgtcag ggcacccaag2760
gaggtcatcc gtgcgccacg agagacgaag ccgaccaagg aacccaaggc tgcgcctttg2820
cctgtcagca agccccgtcc cgcagactcg agtcagagca cgtcgaggac cggaagctcg2880
aatatatcgt tcaaccggtc gaagaacaca tcgcctgcca agtcttcgcc tcttgcatca2940
tcgcccccaa ccaatgcttc cgatatcgat ccggctgagg aggccatgat tgctaatgcc3000
aatcgcaaac gcaaggctga cgcatactac aacgactcat cgtcgaccac tagcagcagc3060
agcagcaacg tacaaacttc gggcaagaac tcgattaaaa agcgcaccca cgacgatgac3120
gtgagcgtga gcagaagagg cgctggtagc aagcttcctc cggatgttgt agccaaagca3180
cgccgcttca aagaggcgta ctcggattac gagcgactgc actatgagct ttcgggaatg3240
aacaaccccg aggagagcaa gctcaatgag ctcatgaaca tgcaccgcag gttggaaaag3300
atgaagaagg agatatactc gaccacaggt gctacttaca atggggaccg tgaccgtgct3360
cacaagtctg gagagcagaa gcggagtagc gccgtggcca gcagccgccg cgagcgcgac3420
gagtacaacg actatggccg gcattgagat ttgaggaggc gatcaaagtt gagcgatact3480
gcgccgataa tattattctt ggcagcgatt cgctccttcg catctcgaac ctgttgctga3540
aacaagtcga ttgactcggt gtgcttctgc tcccaagact cggatcgcaa aggcggatct3600
cctataccag gtggccgatg tgtcttgatt atttcccgag aagtgttctt tttttaacac3660
aactttgttt tgcttttcaa tgatcgttat actgcatatt tctcaagttt taccccggag3720
tgctccacag aagcaactct tgcacatctc attccatcat tttatggcgc accttggttc3780
tggagttcat gggcggcata taacaaatga cagcatcttt tgtcttgatg gaaaatggtc3840
ttttggatta actactcccc ttgtcctctc tttcctttgc attaatcata tacaaacacc3900
tggggagcat atcatgatcc tttatcgttt actcttcggg acaggcaggg gcatttgaaa3960
ttaagcgata ccacaccagg atatacttgg tatttcagtc ccactaggag aactgaatgg4020
cggagggggt cgaaaacagg actggaaaga ttgtgaggga tgacgatagg ggtttcaaag4080
gttgctacta tgcttaacta gttgacagtt tgaatcagct acctgacgtt ttggttcctt4140
tgcttgcatt tgactcaagg actcttgttg gttttcatgt agtctttttt tcaacgtctc4200
tagcaggttt agagcaaggg ttcatttagc taccgaattg aacacagaaa gttaagctca4260
cgaccgcgaa ctgcag4276
<210>2
<211>2591
<212>DNA
<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)
<220>
<221>CDS
<222>(101)..(2425)
<400>2
gacctgacca cgaccgacca cgataacgag ccagcggaat tctcgttgtg aattgaactc60
ggacgaaaag caagacggcc gagccgagtt gcccatcaag atgtctctcg tcattccggc120
agggggtctg gagctggaga cgtcggtcga caagatgacc agtctcccgc tccaggcttt180
tgccataacc ctgagcgatg acatgcttga ggacctgata gacagcttcc aaaatggcca240
ggagatcgag ttgtccctgg ggcagtcacc ggctttcctc tacggcggca acacagcacc300
catcactcga atccccgaga atttctccta cgacctctac gttaccgatc cgaactcgcc360
cgaaacggct agccttgcac ccaacccgac gatgccaata ttcaagaaac aacacctcaa420
cttggtcaag aagcccaagt acatgccaaa gggcttcatt gacgaagatg aggccccgga480
gctgggagct ttagagatca tcgagaaccc ggaaaagtct cagacgtcct cacagtccaa540
gagctcttca cttcaacctc agtctgcgct gaacaagaag ccgaagtctg cgacggccgg600
gaagaagacg gcggctagta atgcgataac catgtccaca caggctcgct cgcgtccgac660
aagcccggca atcagcgccg ttggctctcc tcttcccgag tcgtcgatcg aatcttcgca720
ccagcaaatc gtgaaggagg ctaaagaact acgcgcaccg ctcatccacg ccctcgctgt780
tcgggagatg acatatgacg aactctggga gaagtggggc aagggtgatg atgacgagtc840
gaggcgggag ttccgtaata ttctgagcaa ggtcgccgag caggtcaaga actctaacaa900
gtacatgatg aagaagaacc actggaagga gttggatgtc tggaatcaca attacgactc960
ggattcggac cgccaaaccg ccatcgacaa tgctgtgcgg cactttgaca agatgcgaat1020
tggtgcctcg gagccagagt ggcagaagct gttgccgttt gacgaccgtg gaaagggcaa1080
gtgtctgagc aagcttcaag cttcgttagc caggggcccg aaaggactca ctgttcacgt1140
tcagaatgca gacgatacga gcggagctgg ttcgccagac acggacaacc gctctatcag1200
cgggtcgcag cccatgtcca ggtcgagctc acaaaacaag ccaaagaagg cagtcgaaaa1260
gaaaccagct gtttcagcac cgaaaaagcc gaccgctccc aaggtttctc cctccaagcc1320
cgccgccaag ccggcagcca agacaggagc cagaggtccg ctatcaaaag aaatcatcac1380
cgattctgac gaatccagtg acgagatccc gctttcgcag acaaagaacg tggtcaaaaa1440
acaagcggca cctgcggtga gggctcccaa gcctccaata tctgcaccag tttcgggtcc1500
ttcgtccctt cccaagaagc ccccgccacc tgcggcacgc gagccagcca agccgcagat1560
cacagcaaag ccgccggtga agagaccacg cgaggaggag gacagcagtt ccagctcggg1620
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tgtcagcaag ccccgtcccg cagactcgag tcagagcacg tcgaggaccg gaagctcgaa1860
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gcccccaacc aatgcttccg atatcgatcc ggctgaggag gccatgattg ctaatgccaa1980
tcgcaaacgc aaggctgacg catactacaa cgactcatcg tcgaccacta gcagcagcag2040
cagcaacgta caaacttcgg gcaagaactc gattaaaaag cgcacccacg acgatgacgt2100
gagcgtgagc agaagaggcg ctggtagcaa gcttcctccg gatgttgtag ccaaagcacg2160
ccgcttcaaa gaggcgtact cggattacga gcgactgcac tatgagcttt cgggaatgaa2220
caaccccgag gagagcaagc tcaatgagct catgaacatg caccgcaggt tggaaaagat2280
gaagaaggag atatactcga ccacaggtgc tacttacaat ggggaccgtg accgtgctca2340
caagtctgga gagcagaagc ggagtagcgc cgtggccagc agccgccgcg agcgcgacga2400
gtacaacgac tatggccggc attgagattt gaggaggcga tcaaagttga gcgatactgc2460
gccgataata ttattcttgg cagcgattcg ctccttcgca tctcgaacct gttgctgaaa2520
caagtcgatt gactcggtgt gcttctgctc ccaagactcg gatcgcaaag gcggatctcc2580
tataccaggt g 2591
<210>3
<211>774
<212>PRT
<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)
<400>3
Met Ser Leu Val Ile Pro Ala Gly Gly Leu Glu Leu Glu Thr Ser Val
1 5 10 15
Asp Lys Met Thr Ser Leu Pro Leu Gln Ala Phe Ala Ile Thr Leu Ser
20 25 30
Asp Asp Met Leu Glu Asp Leu Ile Asp Ser Phe Gln Asn Gly Gln Glu
35 40 45
Ile Glu Leu Ser Leu Gly Gln Ser Pro Ala Phe Leu Tyr Gly Gly Asn
50 55 60
Thr Ala Pro Ile Thr Arg Ile Pro Glu Asn Phe Ser Tyr Asp Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Asp Pro Asn Ser Pro Glu Thr Ala Ser Leu Ala Pro Asn Pro
85 90 95
Thr Met Pro Ile Phe Lys Lys Gln His Leu Asn Leu Val Lys Lys Pro
100 105 110
Lys Tyr Met Pro Lys Gly Phe Ile Asp Glu Asp Glu Ala Pro Glu Leu
115 120 125
Gly Ala Leu Glu Ile Ile Glu Asn Pro Glu Lys Ser Gln Thr Ser Ser
130 135 140
Gln Ser Lys Ser Ser Ser Leu Gln Pro Gln Ser Ala Leu Asn Lys Lys
145 150 155 160
Pro Lys Ser Ala Thr Ala Gly Lys Lys Thr Ala Ala Ser Asn Ala Ile
165 170 175
Thr Met Ser Thr Gln Ala Arg Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ala Ile Ser
180 185 190
Ala Val Gly Ser Pro Leu Pro Glu Ser Ser Ile Glu Ser Ser His Gln
195 200 205
Gln Ile Val Lys Glu Ala Lys Glu Leu Arg Ala Pro Leu Ile His Ala
210 215 220
Leu Ala Val Arg Glu Met Thr Tyr Asp Glu Leu Trp Glu Lys Trp Gly
225 230 235 240
Lys Gly Asp Asp Asp Glu Ser Arg Arg Glu Phe Arg Asn Ile Leu Ser
245 250 255
Lys Val Ala Glu Gln Val Lys Asn Ser Asn Lys Tyr Met Met Lys Lys
260 265 270
Asn His Trp Lys Glu Leu Asp Val Trp Asn His Asn Tyr Asp Ser Asp
275 280 285
Ser Asp Arg Gln Thr Ala Ile Asp Asn Ala Val Arg His Phe Asp Lys
290 295 300
Met Arg Ile Gly Ala Ser Glu Pro Glu Trp Gln Lys Leu Leu Pro Phe
305 310 315 320
Asp Asp Arg Gly Lys Gly Lys Cys Leu Ser Lys Leu Gln Ala Ser Leu
325 330 335
Ala Arg Gly Pro Lys Gly Leu Thr Val His Val Gln Asn Ala Asp Asp
340 345 350
Thr Ser Gly Ala Gly Ser Pro Asp Thr Asp Asn Arg Ser Ile Ser Gly
355 360 365
Ser Gln Pro Met Ser Arg Ser Ser Ser Gln Asn Lys Pro Lys Lys Ala
370 375 380
Val Glu Lys Lys Pro Ala Val Ser Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ala Pro
385 390 395 400
Lys Val Ser Pro Ser Lys Pro Ala Ala Lys Pro Ala Ala Lys Thr Gly
405 410 415
Ala Arg Gly Pro Leu Ser Lys Glu Ile Ile Thr Asp Ser Asp Glu Ser
420 425 430
Ser Asp Glu Ile Pro Leu Ser Gln Thr Lys Asn Val Val Lys Lys Gln
435 440 445
Ala Ala Pro Ala Val Arg Ala Pro Lys Pro Pro Ile Ser Ala Pro Val
450 455 460
Ser Gly Pro Ser Ser Leu Pro Lys Lys Pro Pro Pro Pro Ala Ala Arg
465 470 475 480
Glu Pro Ala Lys Pro Gln Ile Thr Ala Lys Pro Pro Val Lys Arg Pro
485 490 495
Arg Glu Glu Glu Asp Ser Ser Ser Ser Ser Gly Thr Pro Leu Ala Lys
500 505 510
Lys Phe Lys Val Lys Glu Pro Val Arg Ala Pro Lys Glu Pro Ile Arg
515 520 525
Ala Pro Lys Glu Pro Ile Arg Ala Pro Lys Glu Thr Thr Val Arg Ala
530 535 540
Pro Lys Glu Val Ile Arg Ala Pro Arg Glu Thr Lys Pro Thr Lys Glu
545 550 555 560
Pro Lys Ala Ala Pro Leu Pro Val Ser Lys Pro Arg Pro Ala Asp Ser
565 570 575
Ser Gln Ser Thr Ser Arg Thr Gly Ser Ser Asn Ile Ser Phe Asn Arg
580 585 590
Ser Lys Asn Thr Ser Pro Ala Lys Ser Ser Pro Leu Ala Ser Ser Pro
595 600 605
Pro Thr Asn Ala Ser Asp Ile Asp Pro Ala Glu Glu Ala Met Ile Ala
610 615 620
Asn Ala Asn Arg Lys Arg Lys Ala Asp Ala Tyr Tyr Asn Asp Ser Ser
625 630 635 640
Ser Thr Thr Ser Ser Ser Ser Ser Asn Val Gln Thr Ser Gly Lys Asn
645 650 655
Ser Ile Lys Lys Arg Thr His Asp Asp Asp Val Ser Val Ser Arg Arg
660 665 670
Gly Ala Gly Ser Lys Leu Pro Pro Asp Val Val Ala Lys Ala Arg Arg
675 680 685
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705 710 715 720
His Arg Arg Leu Glu Lys Met Lys Lys Glu Ile Tyr Ser Thr Thr Gly
725 730 735
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Asn Asp Tyr Gly Arg His
770
<210>4
<211>1392
<212>DNA
<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)
<400>4
gaattctcgt tgtgaattga actcggacga aaagcaagac ggccgagccg agttgcccat60
caagatgtct ctcgtcattc cggcaggggg tctggagctg gagacgtcgg tcgacaagat120
gaccagtctc ccgctccagg cttttgccat aaccctgagc gatgacatgc ttgaggacct180
gatagacagc ttccaaaatg gccaggagat cgagttgtcc ctggggcagt caccggtagg240
tttattttgg atcgaacccc aatagtgatg cctctttgga ggtaccttgc tgtttgcctt300
tgcccatcaa ttgcctggat acaatcagaa taattcttgt gattgtgaac aatagcttta360
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ctattctgtt cgtatctcaa ggctttcctc tacggcggca acacagcacc catcactcga540
atccccgaga atttctccta cgacctctac gttaccgatc cgaactcgcc cgaaacggct600
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ttagagatca tcgagaaccc ggaaaagtct cagacgtcct cacagtatgc attctgtgtc780
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agagctcttc acttcaacct cagtctgcgc tgaacaagaa gccgaagtct gcgacggccg900
ggaagaagac ggcggctagt aatgcgataa ccatgtccac acaggctcgc tcgcgtccga960
caagcccggc aatcagcgcc gttggctctc ctcttcccga gtcgtcgatc gaatcttcgc1020
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cggattcgga ccgccaaacc gccatcgaca atgctgtgcg gcactttgac aagatgcgaa1320
ttggtgcctc ggagccagag tggcagaagc tgttgccgtt tgacgaccgt ggaaagggca1380
agtgtctgag ca139权利要求
1、真菌分生孢子形状与致病性相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质
1)序列表中的SEQ ID №3；
2)将序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与真菌分生孢子形状及致病性相关的蛋白质。
2、权利要求1所述的真菌分生孢子形状与致病性相关蛋白的编码基因。
3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述真菌分生孢子形状与致病性相关蛋白的基因组基因，具有下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；
3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述真菌分生孢子形状与致病性相关蛋白的基因组基因的编码区位于自序列1的5′端第786位至3447位碱基之间。
5、根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述真菌分生孢子形状与致病性相关蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；
3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4)与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
6、根据权利要求5所述的基因，其特征在于所述真菌分生孢子形状与致病性相关蛋白的cDNA基因的编码序列为自序列2的5′端第101位至2425位碱基。
7、含有权利要求1所述的真菌分生孢子形状与致病性相关蛋白的编码基因的表达载体，细胞系和宿主菌。
8、真菌分生孢子形状与致病性相关蛋白的编码基因的启动子，具有自序列1的5′端第1位至785位碱基的核苷酸序列。
9、权利要求1所述的真菌分生孢子形状与致病性相关蛋白及其编码基因在筛选抗真菌药剂中的应用。
10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述抗真菌药剂为抗梨孢菌药剂。
全文摘要
本发明公开了真菌分生孢子形状与致病性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明的真菌分生孢子形状与致病性相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №3；2)将序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与真菌分生孢子形状及致病性相关的蛋白质。真菌分生孢子形状与致病性相关蛋白的氨基酸序列和其编码基因的核苷酸序列可以作为靶位点应用于抗真菌药剂的筛选和设计中，也可以以该核苷酸序列的某一区段作为探针在梨孢菌中再分离该序列，也可以用于筛选、分离其它真菌的与该基因具有一定序列同源性的序列。
文档编号C07K14/37GK1699411SQ20051007492
公开日2005年11月23日 申请日期2005年6月6日 优先权日2005年6月6日
发明者彭友良, 魏士平, 赵晓燕 申请人:中国农业大学