专利名称：一种高温引发并捕集和测定羟自由基的方法
技术领域：
本发明涉及一种引发羟自由基(HO·)产生的方法，并同时对其进行捕集和进一步的测定。具体是指利用较高的温度和合适的碱性条件引发过氧化氢分解，产生羟自由基，同时在较高温度下用二甲基亚砜作为捕集剂与羟自由基反应，生成的产物甲基亚磺酸通过与重氮盐反应生成有色的重氮砜衍生物，再用分光光度法测定重氮砜衍生物从而间接测定羟自由基。
背景技术：
羟自由基(OH·)是寿命极短而瞬间存在的物质，在某些条件下羟自由基在人体或动物体内产生较多，导致疾病发生，衰老加速等现象。为了寻找、开发、生产和研制能抑制或消除羟自由基的食物和药物，往往需要人为引发羟自由基产生，然后验证效果。生物和医学领域报道的引发羟自由基产生的方法主要有(1)Fenton反应法；(2)水的γ射线辐射方法；(3)过氧化氢紫外光分解法。这些引发羟自由基产生的方法适合在较低的温度(如室温)下应用，例如Fenton反应的活化能比较低，二价铁离子的存在使过氧化氢在室温下短时间内就能分解完毕，所以引发羟自由基不需高温也不适合应用于高温条件。由于较低温度下的引发和捕集条件与生物体内的温度条件相接近，因此上述方法可适用于生物和医学领域。
然而在某些高温的环境中也会产生羟自由基，例如在纸浆的高温过氧化氢漂白和氧脱木素过程中，羟自由基的产生会对漂白及脱木素结果造成重要影响，为了获得合理控制和利用羟自由基的工艺条件使之有利于漂白结果，有必要获得在高温下引发和捕集羟自由基的方法。但目前在高温下人为引发羟自由基并对其进行捕集测定的方法还未见报道。
为了对引发产生的羟自由基进行分离和检测，需要在引发反应的同时用捕集剂捕获生成的羟自由基，使之生成比较稳定的反应产物，然后对产物进行测定。虽然对羟自由基的捕集已有多种方法，如利用二甲基亚砜、水杨酸、异丙醇、苯丙氨酸、酚类物质等作为捕集剂，但这些方法均非在高温条件下捕集。在已知的多种捕集剂中，二甲基亚砜的应用效果较好，美国Steiner和Babbs等人在常温下用二甲基亚砜(DMSO)作为羟自由基的捕集剂，(CharlesF.Babbs et al，Analytical Biochemistry，1987，16367～73；Melissa G.Steiner et al，Archives ofBiochemistry and Biophysics，1990，278(2)478～481)，结果表明二甲基亚砜可以灵敏有效地应用于羟自由基的定性和定量检测。二甲基亚砜捕集羟自由基的反应原理如下
1.二甲基亚砜捕捉体系中产生的羟自由基，生成甲基亚磺酸(1)(二甲基亚砜，DMSO) (甲基亚磺酸)2.用芳香族重氮盐与甲基亚磺酸反应，生成有色的重氮砜衍生物(2)(重氮盐) (重氮砜衍生物)Ar——代表芳基或取代芳基反应式(2)中的产物重氮砜衍生物可利用分光光度法测定。Babbs等根据对二十多种重氮盐的比较实验，筛选出效果最好的坚牢蓝BB盐(Fast Blue BB Salt)用于分光光度法分析，其与羟自由基相关的特征吸收在420nm附近。与理论转化率比较，羟自由基被二甲基亚砜捕集转化为甲基亚磺酸进而与坚牢蓝BB盐反应生成重氮砜衍生物后，用分光光度法检测到的效率为80.0％～90.8％。在上述反应中，反应物之间和反应物与产物之间的摩尔比均为1∶1的关系，因此可以根据重氮砜衍生物的特征吸收判断羟自由基的产生，并可根据其吸收强度测定重氮砜衍生物的浓度，从而推算所产生羟自由基的浓度。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术在高温下的不足，提供一种利用合适的较高温度条件和碱性条件引发过氧化氢分解产生羟自由基的方法，以及在较高温度下利用二甲基亚砜捕集羟自由基并进一步进行测定的方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现一种高温引发并捕集羟自由基的方法，其特征在于，将过氧化氢水溶液与氢氧化钠水溶液混合均匀后，加入到温度为70℃～130℃的二甲基亚砜溶液中；或将过氧化氢水溶液、氢氧化钠水溶液和二甲基亚砜溶液混合，并将混合溶液升温至70℃～130℃；所述过氧化氢、氢氧化钠和二甲基亚砜的加入量为过氧化氢与氢氧化钠的摩尔比为140∶1～1∶1，二甲基亚砜与过氧化氢的摩尔比为20∶1～0.5∶1。
为进一步实现本发明目的，过氧化氢与氢氧化钠的加入量为过氧化氢与氢氧化钠的摩尔比优选70∶1～1.5∶1。二甲基亚砜的加入量为二甲基亚砜与过氧化氢的摩尔比优选10∶1～2∶1。二甲基亚砜水溶液或过氧化氢水溶液、氢氧化钠水溶液和二甲基亚砜水溶液的混合液温度优选80℃～120℃。
将过氧化氢与氢氧化钠的混合液加入70℃～130℃的二甲基亚砜溶液中，保持保温15分钟之内；或将过氧化氢水溶液、氢氧化钠水溶液和二甲基亚砜溶液混合，并将混合溶液升温至70℃～130℃，保持保温15分钟之内。
高温引发并捕集的羟自由基测定的方法，包括下述步骤和工艺条件(1)将过氧化氢水溶液与氢氧化钠水溶液混合均匀，过氧化氢与氢氧化钠的加入量为过氧化氢与氢氧化钠的摩尔比为140∶1～1∶1，量取2mL～40mL混合溶液；(2)配制浓度为2mol/L～12.8mol/L的二甲基亚砜水溶液；(3)引发及捕集反应按捕集反应体系中二甲基亚砜与过氧化氢的摩尔比为0.5∶1～20∶1的量，量取步骤(2)配置的二甲基亚砜水溶液置于内壁为非金属耐高温材料的反应容器中，优选玻璃或聚四氟乙烯，将反应容器内溶液升温至70℃～130℃，将步骤(1)制备的溶液以2mL/min～8mL/min的速度滴入到反应器中；滴加过程不断进行搅拌或摇荡反应器，滴加完成后保持温度继续反应0～15分钟；或者将所量取步骤(2)配置的二甲基亚砜溶液与步骤(1)配置的溶液混合后，置入内壁为非金属耐高温材料的反应容器中，将反应容器快速升温至70℃～130℃；(4)将步骤(3)的反应容器内溶液迅速冷却至室温，用盐酸调节溶液的pH值至4；用去离子水稀释，使稀释液中甲基亚磺酸的浓度在0.5μmol/L～60μmol/L；(5)取出1mL步骤(4)所得的稀释液于离心管或试管中，加入1mL pH＝4的磷酸盐缓冲溶液和2mL浓度不超过25mmol/L的坚牢蓝BB盐溶液，混合均匀后在室温下置于暗处反应10分钟，再加入4mL乙酸乙酯；充分摇荡萃取至少5分钟，然后离心或静置分层，取上层含有重氮砜衍生物有机相作为待分析试样；(6)用紫外—可见分光光度计测定步骤(5)所得的有机相试样中的重氮砜衍生物(定量分析需在3小时以内测定)，由410～420nm的特征吸收峰表征羟自由基的捕集，根据由甲基亚磺酸浓度对410～420nm吸收值所做的标准曲线计算羟自由基的浓度。
从步骤(3)捕集反应产物甲基亚磺酸与坚牢蓝BB盐开始反应到步骤(6)用分光光度计测定的操作，对于羟自由基浓度计算需控制在3小时内完成。
本发明引发羟自由基产生的原理为在合适的碱性条件下过氧化氢分解，产生氢过氧阴离子(HOO-)(碱性条件)(3)提高温度使氢过氧阴离子进一步分解，引发产生羟自由基(温度接近70℃明显开始发生)(4)高温下过氧化氢发生均裂反应，引发产生羟自由基
由于二甲基亚砜具有沸点高、高温下稳定、能与水混溶等特点，本发明在高温引发羟自由基的同时，将二甲基亚砜用作高温条件下的羟自由基捕集剂。本发明的捕集条件与Steiner和Babbs等人的捕集条件相比较，采用的高温条件(70℃～130℃)和碱性条件都与之不同，克服了现有技术是在常温和非碱性条件下应用的不足，由此提供了一种能结合制浆造纸生产实际中高温过氧化氢漂白和纸浆氧脱木素工艺的捕集方法。
与现有的引发羟自由基的技术相比，本发明提供了在高温下引发和捕集羟自由基的方法，引发反应体系中不需加入过渡金属离子引发羟自由基(如经典的Fenton反应引发)，也不需借助产生γ射线辐射或紫外光的设备(如Steiner和Babbs等人的引发)，这种引发与捕集羟自由基的温度条件和碱性环境与实际生产中的高温过氧化氢漂白和纸浆氧脱木素工艺条件相近，因此很适合应用于制浆化学的领域。同时本发明具有引发捕集设备简单和操作容易、快速的特点。此外在测定过程中，本发明采用乙酸乙酯萃取重氮砜衍生物，而不采用含苯类化合物的有机溶剂萃取，因而有利于减轻测定操作中有害物质对操作人员的影响。
图1是实施例1中60℃至70℃条件下引发羟自由基的测定结果。
图2是实施例1中70℃至100℃条件下引发羟自由基的测定结果。
图3是实施例2中100℃至140℃条件下引发羟自由基的测定结果图4是实施例5中120℃条件下引发羟自由基经不同保温时间后的结果图5是实施例6中120℃条件下不同过氧化氢加入量时引发羟自由基的测定结果图6是实施例7中用于羟自由基定量测定的甲基亚磺酸浓度与415nm处吸收值关系的标准曲线具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施方式表示的范围。
实施例1100℃以下羟自由基的引发及测定(1)量取20mL浓度为7moL/L的过氧化氢溶液和1mL浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液置一烧杯中混合均匀；(混合溶液中过氧化氢与氢氧化钠的摩尔比为140∶1)(2)量取20mL浓度为3.5mol/L的二甲基亚砜水溶液置入250mL反应瓶中，将反应瓶置于已调好温度的恒温水浴锅中(同样的操作分别在60℃、65℃、70℃、80℃、90℃和100℃的恒温水浴锅中进行)，预热升温3～5min，然后用5mL/min的速度向反应瓶中的二甲基亚砜水溶液内滴加过氧化氢和氢氧化钠的混合液，滴加过程不断摇荡反应瓶，滴加完后继续反应10min，然后取出反应瓶迅速用冷水冷却；(二甲基亚砜与过氧化氢的摩尔比为0.5∶1)(3)用稀盐酸调节瓶中溶液至pH＝4，用去离子水稀释定容至100mL，用移液管取出1mL溶液置于10mL的有刻度具塞离心管中，加入1mL磷酸盐缓冲液(pH＝4)和2mL新配制的浓度为25mmol/L的坚牢蓝BB盐溶液，在室温下置暗处反应10min，然后加入4mL乙酸乙酯，充分摇荡萃取5min，离心分层，分离完全后取上层有机相作为分析试样，用乙酸乙酯作为参比，用分光光度计测定试样的吸收曲线，在415nm处的吸收峰是二甲基亚砜捕捉羟自由基的产物甲基亚磺酸与坚牢蓝BB盐生成的重氮砜衍生物所产生的特征吸收。
图1和图2为60℃至100℃条件下引发羟自由基的测定结果，表明引发羟自由基的温度条件需要在65℃以上，70℃附近，所产生羟自由基的浓度随着温度的上升而增加。图中A表示紫外—可见分光光度计测定所得吸收值的数值(以下图中A同)。
实施例2100℃以上高温条件下羟自由基的引发及测定(1)量取3mL浓度为7moL/L的过氧化氢溶液和1mL浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液置一烧杯中混合均匀；(混合溶液中过氧化氢与氢氧化钠的摩尔比为21∶1)(2)量取20mL浓度为3.5mol/L的二甲基亚砜水溶液置入250mL反应瓶中。先将反应瓶置于已调好温度的油浴中(同样的操作分别在110℃、120℃、130℃和140℃的油浴中进行)，预热升温1～2min，然后用2mL/min的速度向反应瓶中的二甲基亚砜溶液内滴加过氧化氢和氢氧化钠的混合液，滴加过程不断摇荡反应瓶，滴加完后继续反应5min。然后取出反应瓶迅速用冷水冷却；(二甲基亚砜与过氧化氢的摩尔比为3.3∶1)后续步骤中加入4mL乙酸乙酯后，充分摇荡萃取10min，采用离心分层，其它与实施例1中步骤(3)相同。
图3为110℃～140℃条件下引发羟自由基产生的测定结果，表明在110℃～130℃范围内产生羟自由基的浓度随着引发反应温度的增加而上升，但130℃后再继续升高温度羟自由基浓度不再变化。
实施例3100℃以下改变试剂摩尔比的引发及测定(1)量取10mL浓度为7moL/L的过氧化氢溶液和1mL浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液置一烧杯中混合均匀；(混合溶液中过氧化氢与氢氧化钠的摩尔比为70∶1)(2)量取80mL浓度为7mol/L的二甲基亚砜水溶液置入250mL反应瓶中，将反应瓶置于已调好温度为90℃的恒温水浴锅中，预热升温5min，然后用5mL/min的速度向反应瓶中的二甲基亚砜水溶液内滴加过氧化氢和氢氧化钠的混合液，滴加过程不断摇荡反应瓶，滴加完后继续反应10min，然后取出反应瓶迅速用冷水冷却；(二甲基亚砜与过氧化氢的摩尔比为8∶1)后续步骤与实施例1中步骤(3)相同。
实施例4100℃以上改变试剂摩尔比的引发及测定(1)量取2mL浓度为3moL/L的过氧化氢溶液和2mL浓度为3mol/L的氢氧化钠溶液置一烧杯中混合均匀；(混合溶液中过氧化氢与氢氧化钠的摩尔比为1∶1)(2)量取20mL浓度为6mol/L的二甲基亚砜水溶液置入250mL反应瓶中，将反应瓶置于已调好温度为120℃的油浴中，预热升温1min，然后用2mL/min的速度向反应瓶中的二甲基亚砜水溶液内滴加过氧化氢和氢氧化钠的混合液，滴加过程不断摇荡反应瓶，滴加完后继续反应5min，然后取出反应瓶迅速用冷水冷却；(二甲基亚砜与过氧化氢的摩尔比为20∶1)后续步骤中加入4mL乙酸乙酯后，充分摇荡萃取20min，采用静置分层，其它与实施例1中步骤(3)相同。
实施例5高温下引发保温不同时间后的结果油浴的反应温度为120℃，滴加完后继续保温反应的时间分别取0min、5min、10min和15min作为对比，其余操作及条件与实施例2中所述相同。图4为对所得分析试样的测定结果，图中可见引发反应保温10min和15min的吸收曲线几乎重合，表明在120℃高温下继续反应的时间不需要超过10min。
实施例6过氧化氢加入量对引发羟自由基产生的影响油浴的反应温度为120℃，量取7moL/L过氧化氢溶液的体积分别为1mL、2mL、3mL和4mL，其余操作及条件与上述示例2中所述相同。图5为对所得分析试样的测定结果，图中表明在同样的温度及反应条件下，随着过氧化氢加入量的增加，产生的羟基自由基浓度相应增加。
实施例7羟自由基的定量测定先用纯甲基亚磺酸试剂(与羟自由基被二甲基亚砜捕集后的产物等同，见背景技术中反应式(1)。)作为标准物质，将其与坚牢蓝BB盐反应后对产物进行测定，获得图6中甲基亚磺酸浓度(C)与415nm处吸收值(A)的关系(A＝0.0142C+0.0466；R2＝0.9901)，以此为依据可对引发反应产生的羟自由基浓度进行定量分析。
权利要求
1.一种高温引发并捕集羟自由基的方法，其特征在于，将过氧化氢水溶液与氢氧化钠水溶液混合均匀后，加入到温度为70℃～130℃的二甲基亚砜溶液中；或将过氧化氢水溶液、氢氧化钠水溶液和二甲基亚砜溶液混合，并将混合溶液升温至70℃～130℃；所述过氧化氢、氢氧化钠和二甲基亚砜的加入量为过氧化氢与氢氧化钠的摩尔比为140∶1～1∶1，二甲基亚砜与过氧化氢的摩尔比为20∶1～0.5∶1。
2.根据权利要求1所述的高温引发并捕集羟自由基的方法，其特征在于，过氧化氢与氢氧化钠的加入量为过氧化氢与氢氧化钠的摩尔比为70∶1～1.5∶1。
3.根据权利要求1所述的高温引发并捕集羟自由基的方法，其特征在于，二甲基亚砜的加入量为二甲基亚砜与过氧化氢的摩尔比为10∶1～2∶1。
4.根据权利要求1所述的高温引发并捕集羟自由基的方法，其特征在于，二甲基亚砜水溶液或过氧化氢水溶液、氢氧化钠水溶液和二甲基亚砜水溶液的混合液温度为80～120℃。
5.根据权利要求1所述的高温下引发捕集羟自由基的方法，其特征在于，将过氧化氢与氢氧化钠的混合液加入70℃～130℃的二甲基亚砜溶液中，保持保温15分钟之内；或将过氧化氢水溶液、氢氧化钠水溶液和二甲基亚砜溶液混合，并将混合溶液升温至70℃～130℃，保持保温15分钟之内。
6.一种对权利要求1～5任意项所述高温引发并捕集的羟自由基测定的方法，其特征在于，该测定方法包括下述步骤和工艺条件(1)将过氧化氢水溶液与氢氧化钠水溶液混合均匀，过氧化氢与氢氧化钠的加入量为过氧化氢与氢氧化钠的摩尔比为140∶1～1∶1，量取2mL～40mL混合溶液；(2)配制浓度为2mol/L～12.8mol/L的二甲基亚砜水溶液；(3)引发及捕集反应按捕集反应体系中二甲基亚砜与过氧化氢的摩尔比为0.5∶1～20∶1的量，量取步骤(2)配置的二甲基亚砜水溶液置于内壁为非金属耐高温材料的反应容器中，将反应容器内溶液升温至70℃～130℃，将步骤(1)制备的溶液以2mL/min～8mL/min的速度滴入到反应器中；滴加过程不断进行搅拌或摇荡反应器，滴加完成后保持温度继续反应0～15分钟；或者将所量取步骤(2)配置的二甲基亚砜溶液与步骤(1)配置的溶液混合后，置入内壁为非金属耐高温材料的反应容器中，将反应容器快速升温至70℃～130℃；(4)将步骤(3)的反应容器内溶液迅速冷却至室温，用盐酸调节溶液的pH值至4；用去离子水稀释，使稀释液中甲基亚磺酸的浓度在0.5μmol/L～60μmol/L；(5)取出1mL步骤(4)所得的稀释液于离心管或试管中，加入1mL pH＝4的磷酸盐缓冲溶液和2mL浓度不超过25mmol/L的坚牢蓝BB盐溶液，混合均匀后在室温下置于暗处反应10分钟，再加入4mL乙酸乙酯；充分摇荡萃取至少5分钟，然后离心或静置分层，取上层含有重氮砜衍生物有机相作为待分析试样；(6)用紫外-可见分光光度计测定步骤(5)所得的有机相试样中的重氮砜衍生物(定量分析需在3小时以内测定)，由410～420nm的特征吸收峰表征羟自由基的捕集，根据由甲基亚磺酸浓度对410～420nm吸收值所做的标准曲线计算羟自由基的浓度。
7.根据权利要求6所述羟自由基捕集与测定的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的反应容器内壁为玻璃或聚四氟乙烯。
8.根据权利要求6所述羟自由基捕集与测定的方法，其特征在于，从步骤(3)捕集反应产物甲基亚磺酸与坚牢蓝BB盐开始反应到步骤(6)用分光光度计测定的操作，对于羟自由基浓度计算需控制在3小时内完成。
全文摘要
本发明涉及一种高温引发并捕集和测定羟自由基的方法，该方法是将过氧化氢水溶液与氢氧化钠水溶液混合均匀后，加入到温度为70℃～130℃的二甲基亚砜溶液中；或将过氧化氢水溶液、氢氧化钠水溶液和二甲基亚砜溶液混合，并将混合溶液升温至70℃～130℃。过氧化氢、氢氧化钠和二甲基亚砜的加入量为过氧化氢与氢氧化钠的摩尔比为140∶1～1∶1，二甲基亚砜与过氧化氢的摩尔比为20∶1～0.5∶1。这种引发与捕集羟自由基的温度条件和碱性环境与实际生产中的高温过氧化氢漂白和纸浆氧脱木素工艺条件相近，因此很适合应用于制浆化学的领域。同时本发明具有引发捕集设备简单和操作容易、快速的特点。
文档编号C07B60/00GK1789219SQ20051010219
公开日2006年6月21日 申请日期2005年12月9日 优先权日2005年12月9日
发明者张曾 申请人:华南理工大学