专利名称：从小麦线粒体中提取核糖核酸rna的方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术，具体地说是从植物线粒体中提取核糖核酸(RNA)的方法，特别是从小麦中提取线粒体核糖核酸的方法。
背景技术：
小麦核糖核酸(RNA)是遗传物质的重要载体。线粒体是植物机体内普遍存在的特别细胞器，它与细胞核一样包含遗传信息。目前没有发现从小麦线立体中提取核糖核酸的方法。现有技术从其他植物提取线粒体中核糖核酸的方法一般流程很长，使得线粒体中核糖核酸在提取过程中降解，很难保证所获得的高质量的核糖核酸用于分子生物学研究。
与本发明较相关的现有技术是《植物分子生物学》2001年第19期刊登的“从马铃薯组织中分离线粒体核糖核酸”该文献提到了从马铃薯组织中分离线粒体核糖核酸(RNA)的提取方法，将1-15克新鲜马铃薯组织加液氮研磨，加入4℃预冷的25毫升提取液A(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，1.3M NaCl，25mM EDTA(pH8.0)，0.2％BSA)，过25目的纱布，4℃条件下500g离心10分钟去除大片段，再2600g离心15分钟，10分钟去除大分子物质。用14500g离心15分钟沉淀线粒体，并用提取液A洗涤重悬，离心14500g离心15分钟沉淀线粒体。获得的线粒体采用异硫氰胍方法加入5毫升提取液B(4M异硫氰胍，25mM柠檬酸钠(pH 7.0)，0.5％桂酸钠)65℃ 2分钟，而后加入十分之一体积的2M乙酸钠溶液，混悬加入等体积的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)离心3000g×5分钟，取出水相并加入等体积的异丙醇，-20℃放置2小时，18,000g离心20分钟沉淀得到线粒体核糖核酸，70％乙醇洗涤沉淀2次，干燥沉淀物，4℃保存备用。
上述方法过程概括如下提取液A去除杂质----分级分离得到完整线粒体----通过溶液B来使线粒体裂解----水饱和酚∶氯仿∶异戊醇提取抽提----异丙醇沉淀----乙醇洗涤线粒体核糖核酸。
由此可见，该技术所提及的方法较为繁琐，更主要的是提取的线粒体核糖核酸效率和质量都很一般，受叶绿体和核糖核酸的污染机率很高，有时候影响后面的实验继续进行，因此有必要提供一个简单，有效的从线粒体中提取线粒体核糖核酸的方法，应用于小麦线立体核糖核酸RNA的提取。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从小麦线粒体中提取核糖核酸RNA的方法，应用这种方法，可有效地从小麦组织中提取线粒体核糖核酸，以利于随后的分析检测，该方法能够有效地克服现有技术中存在的上述缺陷。
本发明的目的是这样实现的一种从小麦线立体中提取核糖核酸RNA的方法，具有如下步骤步骤1)、首先在低温预留的提取液中加入一定量的蛋白酶K，并分离出含完整线粒体的水相；步骤2)、然后增加一步用蛋白酶K降解线粒体内的复合蛋白，使核糖核酸尽可能多的从这些复合物中释放出来；步骤3)、最后用异丙醇沉淀，乙醇洗涤线粒体核糖核酸。
本发明的一个优选方案，在上述步骤1)和2)所述的抽提过程中加入蛋白酶K的处理过程，并分别分离出完整线粒体和线粒体核糖核酸。
本发明的另一种优选方案，整个过程在4℃低温下进行操作。
这种从植物组织中提取核糖核酸，不受其它物质污染的方法，其关键在于分离过程严格低温和加上适当分解蛋白的试剂，提取方法采用如下具体步骤A、首先新鲜组织中加入液氮研磨粉碎，加入4℃预冷的25毫升改良的提取液A(加入3‰巯基乙醇和1％体积的10毫克/毫升蛋白酶K)。过25目的纱布。
B、4℃条件下500g离心10分钟去除大片段，再2600g离心15分钟，10分钟去除大分子物质。用14500g离心15分钟沉淀线粒体，并用改良提取液A洗涤重悬，离心14500g离心15分钟沉淀线粒体。
C、获得的线粒体采用异硫氰胍方法加入5毫升提取液B 65℃ 2分钟，加入1％体积的10毫克/毫升蛋白酶K 37℃ 2分钟。
D、冰浴，而后加入十分之一体积的2M乙酸钠溶液，混悬加入等体积的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)离心3000g×5分钟，取出水相并加入等体积的氯仿抽提2次，加入等体积的异丙醇，-20℃放置2小时，18,000g离心20分钟沉淀得到线粒体核糖核酸，70％乙醇洗涤沉淀2次，干燥沉淀物，4℃保存备用。
本发明方法，首先采用不含叶绿体污染的组织，第二，在分离到线粒体前，用有蛋白酶K的提取液，使得部分大分子蛋白被分解为较小分子，易于与线粒体分离，第三在分离到线粒体后，用脱氧核糖核酸酶来分解可能来自核脱氧核糖核酸的污染，第四，获得线粒体后，裂解线粒体中加入蛋白酶K，使得核糖核酸能完全从蛋白复合体中释放出来，提高提取效率和减少蛋白质污染。
在获得完整线粒体前，我们加入蛋白酶K使得那些不完整的线粒体被蛋白酶K降解，便于去除，脱氧核糖核酸酶分解核脱氧核糖核酸；在获得线粒体后，加入蛋白酶K使得杂蛋白被分解，便于被抽提。
本发明适宜于从小麦细胞器中提取到其中的核糖核酸。应用该方法提取到的线粒体核糖核酸，适宜于进行逆转录和文库构建。
按本发明所述的从线粒体中提取线粒体核糖核酸的方法，采用以下简单过程改良提取液A去除杂质和分解杂蛋白----分级分离得到完整线粒体----通过改良的溶液B来使线粒体裂解----水饱和酚∶氯仿∶异戊醇提取抽提----蛋白酶K的裂解----异丙醇沉淀----乙醇洗涤线粒体核糖核酸。
使用本提取方法，能够高效率，高质量地从小麦线粒体中获得高质量的线粒体核糖核酸。
下面，结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但它并非用于对本发明的限定。
具体实施例方式
实施例1取10克新鲜小麦花药，加入液氮研磨粉碎，加入4℃预冷的25毫升改良的提取液A(加入3‰巯基乙醇和1％体积的10毫克/毫升蛋白酶K)。过25目的纱布。滤过液4℃条件下500g离心10分钟取上清，再2600g离心15分钟，10分钟取上清(去除大分子物质)。用14,500g离心15分钟取沉淀获得线粒体，并用改良提取液A洗涤重悬，离心14,500g离心15分钟沉淀线粒体。获得的线粒体加入5毫升提取液B 65℃ 2分钟，同时加入1％体积的10毫克/毫升蛋白酶K 37℃ 2分钟，而后置冰浴上1分钟，而后加入十分之一体积的2M乙酸钠溶液，混悬加入等体积的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)离心3000g×5分钟，取出水相并加入等体积的氯仿抽提2次，加入等体积的异丙醇，-20℃放置2小时，18000g离心20分钟沉淀得到线粒体核糖核酸，70％乙醇洗涤沉淀2次，干燥沉淀物，4℃保存备用。
实施例2取5克新鲜小麦黄花苗，加入液氮研磨粉碎，加入4℃预冷的25毫升改良的提取液A(加入3‰巯基乙醇和1％体积的10毫克/毫升蛋白酶K)。过25目的纱布。屡过液4℃条件下500g离心10分钟取上清，再2600g离心15分钟，10分钟取上清(去除大分子物质)。用14500g离心15分钟取沉淀获得线粒体，并用改良提取液A洗涤重悬，离心14500g离心15分钟沉淀线粒体。获得的线粒体加入5毫升提取液B 65℃ 2分钟，同时加入1％体积的10毫克/毫升蛋白酶K 37℃ 2分钟，而后置冰浴上1分钟，而后加入十分之一体积的2M乙酸钠溶液，混悬加入等体积的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)离心3000g×5分钟，取出水相并加入等体积的氯仿抽提2次，加入等体积的异丙醇，-20℃放置2小时，18000g离心20分钟沉淀得到线粒体核糖核酸，70％乙醇洗涤沉淀2次，干燥沉淀物，4℃保存备用。
实施例3取5克新鲜小麦须根，加入液氮研磨粉碎，加入4℃预冷的25毫升改良的提取液A(加入3‰巯基乙醇和1％体积的10毫克/毫升蛋白酶K)。过25目的纱布。滤过液4℃条件下500g离心10分钟取上清，再2600g离心15分钟，10分钟取上清(去除大分子物质)。用14500g离心15分钟取沉淀获得线粒体，并用改良提取液A洗涤重悬，离心14500g离心15分钟沉淀线粒体。获得的线粒体加入5毫升提取液B 65℃ 2分钟，同时加入1％体积的10毫克/毫升蛋白酶K 37℃ 2分钟，而后置冰浴上1分钟，而后加入十分之一体积的2M乙酸钠溶液，混悬加入等体积的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)离心3000g×5分钟，取出水相并加入等体积的氯仿抽提2次，加入等体积的异丙醇，-20℃放置2小时，18000g离心20分钟沉淀得到线粒体核糖核酸，70％乙醇洗涤沉淀2次，干燥沉淀物，4℃保存备用。
与现有技术相比，本发明具有的优点为高效率，高质量地从小麦组织中提取线粒体的核糖核酸。
权利要求
1.一种从小麦线立体中提取核糖核酸RNA的方法，其特征在于，所述提取方法具有如下步骤1)、首先在低温预留提取液中加入一定量的蛋白酶K，并分离出含完整线粒体的水相；2)、然后增加一步用蛋白酶K降解线粒体内的复合蛋白，使核糖核酸尽可能多的从这些复合物中释放出来；3)、最后用异丙醇沉淀，乙醇洗涤线粒体核糖核酸。
2.如权利要求1所述的从植物中提取线粒体核糖核酸的方法，其特征在于步骤1)和2)所述的抽提过程中加入蛋白酶K的处理过程，并分别分离出完整线粒体和线粒体核糖核酸。
3.如权利要求1或2所述的从植物中提取线粒体核糖核酸的方法，其特征在于整个过程在4℃低温下进行操作。
全文摘要
本发明提供了一种从小麦线粒体中提取核糖核酸RNA的方法。通过改良提取液，分别可以去除和降解大分子蛋白，同时使得核糖核酸(RNA)更容易从蛋白复合物中释放出来，并同时得到更高效率的提取；其使用方法是通过对小麦线粒体核糖核酸(RNA)的提取，得到高纯度小麦线粒体核糖核酸(RNA)，可以进行逆转录成双链脱氧核糖核酸(dscDNA)，进而可以进行其它的分子生物学操作，如PCR反应和建文库。
文档编号C07H21/02GK1733790SQ20051010244
公开日2006年2月15日 申请日期2005年9月9日 优先权日2005年9月9日
发明者杨典洱, 林晓怡 申请人:杨典洱