专利名称：水生动物粪样细菌dna提取试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种从水生动物粪样中提取细菌DNA的试剂盒及使用该试剂盒提取粪样细菌DNA的方法。
背景技术：
水生动物肠道细菌群落与其生长、免疫、病害发生有重要的关系，近年来逐渐受到重视。以往对于环境中包括动物肠道中细菌的研究都是基于传统的培养方法。这种方法首先要从样品分离培养大量菌株，然后分别做生化鉴定，因此费时费力。而且由于在自然环境中，据报道可以培养的细菌只占不到存在细菌种类的1％，依据培养对肠道细菌群落进行分析，往往不能反映其真实的组成情况。分子生物学技术的发展，也使得这门技术快速地应用到微生态研究中来，这种技术的明显优点就是不依赖于培养，可以获知存在的大多数细菌种类，包括不可培养的。
对于水生动物而言采用分子生物学方法来研究其肠道细菌群落，首先要进行的是粪样中细菌DNA提取。获取尽量完全的不同细菌种类DNA，以及基因组的完整性和产量，是从粪样中提取细菌DNA用于微生态研究的首要目标。水生动物粪样成分复杂，存在PCR反应的抑制物，采用常规的SDS/酚/氯仿提取，所得DNA纯度非常低，且仍然存在PCR抑制物，并且一些细菌并不能通过常规的方法来裂解，导致所得的细菌DNA不能反映原始粪样中细菌的真实组成情况。因此，需要一种适用于从水生动物粪样中提取细菌DNA的方法。
发明内容
本发明目的是提供一种能从水生动物粪样中快速、高效提取细菌基因组DNA的试剂盒及其细菌基因组DNA的提取方法，用以解决用分子手段研究水生动物肠道微生物群落时传统方法提取DNA杂质多、提取不全、含PCR抑制物等缺陷。
本发明所提供的水生动物粪样细菌DNA提取试剂盒，包括有以下试剂(a)试剂A为预处理液，含有体积分数60-80％的乙醇和体积分数0.1-1％的TritonX-100；(b)试剂B为裂解液，含有pH 8.0，50-200mM的Tris-Cl、50-200mM的EDTA、50-100mM的NaCl、质量浓度1-2％的PVP、质量浓度0.5-1％的CTAB和质量浓度2-4％的SDS；(c)试剂C为RNAase，其浓度为5-30mg/ml；(d)试剂D为DNA联接液，含有4-7.0M的GuSCN(异硫腈酸胍)和50-100mM的Tris，调整pH至5-6；(e)试剂E为DNA洗涤液，由pH 7.5，10-20mM的Tris-Cl与无水乙醇按1∶3-4的体积比混合而成；(f)试剂F为DNA洗脱液，采用ddH2O或pH 8.0，5-20mM的Tris-Cl。
本发明优选的试剂盒的配方如下(a)试剂A含有体积分数70％的乙醇和体积分数0.5％的Triton X-10；(b)试剂B含有pH 8.0，100mM的Tris-Cl、100mM的EDTA、100mM的NaCl、质量浓度1％的PVP、质量浓度0.5％的CTAB和质量浓度2％的SDS；(c)试剂C浓度为10mg/ml的RNAase；(d)试剂D含有6.5M的GuSCN和50mM的Tris，调整pH至6；(e)试剂E由pH 7.5，10mM的Tris-Cl与无水乙醇按1∶4的体积比混合而成；(f)试剂FpH为8.0，10mM的Tris-Cl。
在本试剂盒中，试剂A可以部分程度的破坏细菌细胞膜和细胞壁，并增加其对裂解液的敏感性。试剂B则提供一个细胞裂解的pH环境，并含裂解的主要成分及吸附PCR特制物的成分。试剂C则用于降解RNA，防止RNA对下游操作造成干扰。试剂D为DNA联接液，在高浓度GuSCN低pH下，DNA可与硅胶结合。试剂E用于冲洗掉DNA以外的成分，在一定浓度的乙醇存在下，冲洗过程中，DNA不会溶失。试剂F提供低盐稳定pH环境，用于洗脱DNA。
本发明的主要原理为环境中的细菌常常比单纯培养的细菌更难以裂解，采用试剂A预处理后，细菌的细胞膜及细胞壁受到一定程度的破坏，对于试剂B中的细胞裂解成分更加敏感。在试剂B处理后，绝大部分细菌细胞破裂，DNA逸出。试剂B的PCR抑制物吸附成分可以吸附粪样中的抑制物。试剂C则用于降解RNA。试剂D提供一种高离液、低pH环境，在这种环境下DNA可以与硅胶膜发生特异吸附，同时试剂D中SCN-能强烈变性蛋白质，增加蛋白质非极性集团的水溶性，从而使DNA能够保留，而其它成分首先洗脱。在低浓度的缓冲液或水中DNA又从硅胶膜释放，从而达到分离分离纯化目的。
使用本发明的试剂盒，用以提取水生动物粪样细菌DNA的方法包括以下步骤(1)样品预处理取粪样50-200mg，加入100-400μl试剂A，冰上放置10-30min，10000-12000g，离心3-6min；(2)细菌裂解弃上清，沉淀中加入试剂B 100-200μl，2-4μl试剂C，以移液枪头搅匀并吹打2-4min。65℃水浴20-30min，期间振摇数次。10000-12000g，离心5-10min；(3)DNA联接取上清于1.5ml离心管，加入300-600μl试剂D，室温下放置10-30min；(4)杂质沉淀10000-14000g，离心5-10min，取上清；(5)DNA吸附将DNA吸附柱放置在离心管中，将上述上清液全部吸入DNA吸附柱中，于室温静置1-2min。6000-9000g，离心0.5-1min；(6)杂质洗除弃滤液，重新将DNA吸附柱放置在离心管中，加入试剂E 300-600μl，6000-9000g，离心0.5-1min。弃滤液，重新将吸附柱放置在离心管中；
(7)重复步骤(5)1-2次。将吸附柱放置在离心管中，空管6000-9000g，离心0.5-1min；(8)DNA洗脱将吸附柱放置在新的离心管中，在吸附柱中加入预热至60℃的DNA洗脱液60-120μl(视样品中细菌量而定)，水浴60℃放置1-2min。6000-9000g，离心0.5-1min，将洗脱液重新加入到吸附柱中，放置1-3min，6000-9000g，离心0.5-1min。离心管中收集液体即为粪样细菌DNA溶液，-20℃保存；本发明的优点和积极效果在本发明中，利用了细菌胞膜和胞壁的特点，及DNA的性质，基于这些特点和性质创造了独特的从水生动物粪样中提取细菌DNA方法。与其它常规细菌DNA提取方法相比，本发明有几个明显的优点和积极效果①提取方法迅速。该方法及试剂盒能够在3小时内从粪样中提取较高质量的细菌基因组DNA，其它方法则在5小时以上。②具有针对性。本发明充分考虑了粪样具有与其它样品不同的理化性质，并针对粪样的特点，设计了适用于本类样品的DNA提取方法。而其它方法大多源于纯的细菌培养物DNA提取，不适用于粪样这一特殊环境样品。③提取过程不使用酚、氯仿，减少了对实验人员的身体健康伤害。④所获DNA完整，OD260/OD280在1.9以上，产量高，包含的细菌物种信息全面。⑤本发明除可用于水生动物粪样细菌DNA提取外，在一些情况下，同样可以用于其它动物粪样细菌DNA提取。
具体实施例方式
下列实施例是进一步对本发明的说明，不应该当作对本发明的限制。
实施例一按以下配方制作水生动物粪样细菌DNA提取试剂盒试剂A含有70％(V/V)的乙醇和0.5％(V/V)的Triton X-100。
试剂B含有50mM Tris-Cl(pH 8.0)、50mM EDTA、50mM NaCl、2％(W/V)的PVP、1％(W/V)的CTAB和3％(W/V)的SDS。
试剂CRNAase浓度为20mg/ml。
试剂D含有6.5M GuSCN(异硫腈酸胍)和100mM Tris，调整pH至6。
试剂E由10mM Tris-Cl(pH 7.5)与无水乙醇按1∶4混合而成。
试剂F10mM Tris-Cl(pH 8.0)。
DNA吸附柱硅胶柱按以下程序进行操作以提取水生动物粪样细菌DNA1.样品预处理取鱼粪样200mg，加入400μl试剂A，冰上放置30min，12000g，离心5min。
2.细菌裂解弃上清，沉淀中加入试剂B 200μl，4μl试剂C，以移液枪头搅匀并吹打2min。65℃水浴25min，期间振摇数次。12000g，离心10min。
3.DNA联接取上清于1.5ml离心管，加入600μl试剂D，室温下放置20min。
4.杂质沉淀12000g，离心10min，取上清。
5.DNA吸附将DNA吸附柱放置在离心管中，将上述上清液全部吸入DNA吸附柱中，补室温静置2min。6000g，离心0.5min。
6.杂质洗除弃滤液，重新将DNA吸附柱放置在离心管中，加入试剂E 500μl，8000g，离心0.5min。弃滤液，重新将吸附柱放置在离心管中。
7.重复步骤(5)2次。将吸附柱放置在离心管中，空管8000g，离心1min。
8.DNA洗脱将吸附柱放置在新的离心管中，在吸附柱中加入预热至60℃的DNA洗脱液100μl，水浴60℃放置2min。8000g，1min，将洗脱液重新加入到吸附柱中，放置2min，8000g，1min。离心管中收集液体即为粪样细菌DNA溶液，-20℃保存。
实施例二按以下配方配制各种试剂试剂A含有75％(V/V)的乙醇和0.1％(V/V)的Triton X-100。
试剂B含有200mM Tris-Cl(pH 8.0)、100mM EDTA、100mM NaCl、1％(W/V)的PVP，0.5％(W/V)的CTAB和2％(W/V)的SDS。
试剂CRNAase浓度为10mg/ml。
试剂D含有6.5M GuSCN(异硫腈酸胍)和50mM Tris，调整pH至6。
试剂E由10mM Tris-Cl(pH 7.5)与无水乙醇1∶4混合而成。
试剂FddH2O。
DNA吸附柱硅胶柱按以下程序进行操作以提取水生动物粪样细菌DNA1.样品预处理取对虾粪样100mg，加入200μl试剂A，冰上放置20min，12000g，离心5min。
2.细菌裂解弃上清，沉淀中加入试剂B 200μl，4μl试剂C，以移液枪头搅匀并吹打2min。65℃水浴20min，期间振摇数次。12000g，离心5min。
3.DNA联接取上清于1.5ml离心管，加入600μl试剂D，室温下放置30min。
4.杂质沉淀14000g，离心10min，取上清。
5.DNA吸附将DNA吸附柱放置在离心管中，将上述混合液全部吸入DNA吸附柱中，于室温静置2min。6000g，离心0.5min。
6.杂质洗除弃滤液，重新将DNA吸附柱放置在离心管中，加入试剂E 400μl，8000g，离心0.5min。弃滤液，重新将吸附柱放置在离心管中。
7.重复步骤(5)1次。将吸附柱放置在离心管中，空管8000g，离心1min。
8.DNA洗脱将吸附柱放置在新的离心管中，在吸附柱中加入预热至60℃的DNA洗脱液60μl，水浴60℃放置2min。8000g，离心1min，将洗脱液重新加入到吸附柱中，放置2min，8000g，离心1min。离心管中收集液体即为粪样细菌DNA溶液，-20℃保存。
权利要求
1.一种水生动物粪样中提取细菌DNA试剂盒，其特征在于包括以下试剂(a)试剂A为预处理液，含有体积分数60-80％的乙醇和体积分数0.1-1％的TritonX-100；(b)试剂B为裂解液，含有pH 8.0，50-200mM的Tris-Cl、50-200mM的EDTA、50-100mM的NaCl、质量浓度1-2％的PVP、质量浓度0.5-1％的CTAB和质量浓度2-4％的SDS；(c)试剂C为RNAase，其浓度为5-30mg/ml；(d)试剂D为DNA联接液，含有4-7.0M的GuSCN和50-100mM的Tris，调整pH至5-6；(e)试剂E为DNA洗涤液，由pH 7.5，10-20mM的Tris-Cl与无水乙醇按1∶3-4的体积比混合而成；(f)试剂F为DNA洗脱液，采用ddH2O或pH 8.0，5-20mM的Tris-Cl。
2.根据权利要求1所述一种水生动物粪样细菌DNA提取试剂盒，其特征在于各试剂分别为(a)试剂A含有体积分数70％的乙醇和体积分数0.5％的Triton X-10；(b)试剂B含有pH 8.0，100mM的Tris-Cl、100mM的EDTA、100mM的NaCl、质量浓度1％的PVP、质量浓度0.5％的CTAB和质量浓度2％的SDS；(c)试剂C浓度为10mg/ml的RNAase；(d)试剂D含有6.5M的GuSCN和50mM的Tris，调整pH至6；(e)试剂E由pH 7.5，10mM的Tris-Cl与无水乙醇按1∶4的体积比混合而成；(f)试剂FpH为8.0，10mM的Tris-Cl。
3.使用权利要求1或2中所述的试剂盒提取水生动物粪样细菌DNA的方法，其特征在于包括以下步骤(1)样品预处理取粪样50-200mg，加入加入100-400μl试剂A，冰上放置10-30min，10000-12000g，离心3-6min；(2)细菌裂解弃上清，沉淀中加入试剂B 100-200μl，2-4μl试剂C，以移液枪头搅匀并吹打2-4min，65℃水浴20-30min，期间振摇数次，10000-12000g，离心5-10min；(3)DNA联接取上清于1.5ml离心管，加入300-600μl试剂D，室温下放置10-30min；(4)杂质沉淀12000-14000g，离心5-10min，取上清；(e)DNA吸附将DNA吸附柱放置在离心管中，将上述上清液全部吸入DNA吸附柱中，于室温静置1-2min，6000-9000g，离心0.5-1min；(5)杂质洗除弃滤液，重新将DNA吸附柱放置在离心管中，加入试剂E 300-600μl，6000-9000g，离心0.5-1min，弃滤液，重新将吸附柱放置在离心管中；(6)重复步骤(5)1-2次。将吸附柱放置在离心管中，空管6000-9000g，离心0.5-1min；(7)DNA洗脱将吸附柱放置在新的离心管中，在吸附柱中加入预热至60℃的DNA洗脱液60-120μl，水浴60℃放置1-2min，6000-9000g，离心0.5-1min，将洗脱液重新加入到吸附柱中，放置1-3min，6000-9000g，离心0.5-1min，离心管中收集液体即为粪样细菌DNA溶液，-20℃保存。
全文摘要
本发提供了一种水生动物粪样细菌DNA提取试剂盒及其方法。在本发明的方法中，首先用乙醇及TritonX－100处理粪样，以增加粪样细菌对裂解液的敏感性。然后采用含SDS的裂解液裂解细胞，此裂解液同时含有对PCR抑制物有吸附作用PVP。此后提供一个含高浓度GuSCN、低pH环境，使溶液中蛋白质进一步变性增强水溶性，而DNA能够绑定在硅胶柱上。最后在低浓度的缓冲液或水中，DNA又从硅胶柱洗脱。采用本试剂盒及其提取方法，可以达到获取水生动物粪样中细菌群落最大量多样性信息、高质量和较高产量DNA的目的。所获得的DNA可以用于分子生态学、系统进化等研究。
文档编号C07H21/04GK1824809SQ20051012127
公开日2006年8月30日 申请日期2005年12月28日 优先权日2005年12月28日
发明者罗鹏, 胡超群, 张吕平 申请人:中国科学院南海海洋研究所